Ratlarda Mikrobiyolojik Deneysel Çalışmalar

Transkript

1 Bora Ekinci, Belma Durupınar Henüz ülkemizde programlı bir şekilde yapılmayan akciğer transplantasyonu özellikle son dönem pulmoner hastalıklarda tek tedavi seçeneğidir. Son dönem pulmoner amfizem, kistik fibroziz, diffüz intertisyel akciğer hastalığı ve pulmoner hipertansiyon başlıca cerrahi endikasyonlardır [1]. Deneysel akciğer transplantasyon modelleri ise transplantasyon cerahisinin gelişmesinde ve özellikle protokollerin şekillenmesinde en önemli basamağı oluşturmaktadır. Örneğin akciğerin korunması, hava yolu komplikasyonları, hiperakut ve akut rejeksiyon, iskemi zamanının değerlendirilmesi ve iskemi-reperfüzyon hasarı gibi bir çok sorunda bu basit tekrarlanabilir deneysel modeller bize yardımcı olur [2-6]. Rat kullanmanın en önemli avantajı transplantasyon sonrası ortaya çıkan immunolojik ve nonimmunolojik olayların ayrımına imkan vermesidir. Domuz ve köpek modelleri ile kıyaslandığında daha az maliyetli olması ve hayvan etik kurullarından daha kolay geçebilmesi transplant modellerinde rat kullanımını ön plana çıkarmıştır. Cerrahi Teknik Ratlar da ortotopik akciğer transplantasyonu ilk defa 1971 yılında Asimacopoulos ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir [7]. Yapılan işlem donör ratın sol akciğerinin sol hemitorakstan çıkartılıp, alıcı ratın sol hemitoraksına yerleştirilmesidir (Ortotropik sol akciğer transplantasyonu). Bu işlem genel olarak 1989 a kadar Asimacopoulos un tariflediği şekilde yapılmıştır. Bu işlemde pulmoner arter, pulmoner ven ve bronş anastomozu uç uca 8-0 veya 9-0 sütürler ile yapıldı. Ancak bu tekniğin 3-4 saati aşkın bir operasyon zamanı gerektirmesi, modelin yaygın şekilde kullanımını kısıtladı yılında Mizuta ve arkadaşları ratlarda akciğer transplantasyonu için, daha önce ratlarda karaciğer transplantasyonunda başarıyla uygulanan cuff tekniğini denediler [8]. Cuff tekniğinde Mizuta operasyon zamanını ± 4.8 dakika ve iskemi zamanını 13.5± 2.0 dakika olarak bildirdi. Anestezi ajanı doz aşımı ve teknik hatadan kaynaklanan 2 adet operatif ölümü hariç tutulduğunda geri kalan 9 rat ın hepsi transplantasyondan sonra 8 gün yaşadı. Bir hayvan postoperatif 9. günde piyotoraks ne- 283 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

2 deni ile öldü ancak diğer sekizi fonksiyonel çalışmalar nedeniyle öldürülene kadar yaşadılar. Göğüs röntgeni graft akciğerin tüm sağ kalan hayvanlarda iyi havalandığını gösterdi. Üç rat kontrolateral pnömonektomiyi tolere etti ve pnömonektomiden önce ve 30 dakika sonraki arteriyel kan gazlarında belirgin fark yoktu. Pulmoner arteriografide Pulmoner arter anastomoz hattında stenoz olmadığı teyit edildi. Histolojik olarak anastomozun endotelyal tarafında tromboz yoktu ancak PV cuff ı ile PV greftini dış kenarı arasında az miktarda trombüse rastlandı [8]. Sonuç olarak daha kısa operasyon zamanı ile birlikte, yeterli postoperatif sağ kalım elde edildiğinden, önemli bir dezavantajı olmayan bu teknik ratlarda ortotopik akciğer transplantasyonu için kabul gördü. Resim 1. Mikroskop altında cuff ın hazırlanışı (A), hazırlanmış bir cuff ın şematik çizimi (B). Anastomozlar için Cuff hazırlığı Mizutanın tarif ettiği teknikte sadece pulmoner arter ve ven cuff ile anastomoz edilmesine karşın bir çok laboratuvar bronşuda cuff tekniği yardımı ile anastomoz etmektedir. Biz de pulmoner arter ve venin yanı sıra bronşu da cuff tekniği ile anastomoz etmekteyiz. Bu nedenle işleme başlamadan önce 3 adet cuff hazırlığı gerekmektedir. Çap olarak küçük olan pulmoner arteri 18 G intraket (yeşil intraket) yardımı ile bronş ve pulmoner veni ise 14 G intraketten (gri intraket) oluşturduğumuz cuff ile hazırlıyoruz. Cuff hazırlığı için kullanılacak intraketlerin kayganlıklarının giderilebilmesi için zımpara edilmesi gerekmektedir. Aksi taktirde arter, ven ve bronş yapıları cuff ın üzerinden kayarak çıkabilirler. Her bir cuff ortalama mm uzunluğunda hazırlanır. İşlem mikroskop altında, 11 numara bisturi yardımı ile yapılır. İntraketlerin iğneleri çıkarılmadan kesme işlemi yapılır (Resim 1). Cuff lar kesilmeden önce mutlaka bisturi yardımı ile çepeçevre çizilerek sonradan kullanılacak bağlamalar için oluk oluşturulmalıdır. Aksi taktirde özellikle arter ve ven yapıları cuff ın içinden kayarak çıkabilirler. Cuff sapları uzun bırakıldığında transplantasyon sonrası toraks kavitesinde akciğer hasarına sebep olabilir, kısa bırakıldığında ise cuff lama ve anastomoz sırasında klemp ucundan kayabilir. Anastomozlar tamamlandıktan sonra cuff saplarının kesilmesi intratorasik vasküler yapıların ve akciğerin hasarlanma ihtimalini azaltır. 284 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

3 Anestezi Hazırlığı Bu modelde ağırlıkları gram arasında değişen Wistar-Albino türü ratlar tercih edilir. Daha küçük ratlar pulmoner arter ve ven çapı küçük olduğundan anastomoz sırasında teknik zorluklara neden olmaktadır, daha büyük ratlarda ise mediasten yağ dokusu çok fazladır. Abdomen ve göğüs tıraşı yapıldıktan sonra donör rat operasyon masasına supin pozisyonda yatırılır. Cerrahi hazırlık yapılır ve sonrasında anestezi premedikasyonu amacıyla 0.25mg/kg atropin intramusküler injeksiyon yapılır. Ardından intraperitoneal penobarbütal (20-50mg/kg) ve ketamin (25mg/kg) uygulanır. Anestezi premedikasyon sağlandıktan sonra otoskop ile orotrakeal entübasyon 12 guage kanül ile yapılabilir, biz 12G kanül (Turuncu intraket) ile trakeostomi açarak entübasyon yapmayı tercih ediyoruz. Trakeostomide vertikal bir insizyon yapılarak trakea üzerine düşülür, trakea ipek sütür ile askıya alınarak uygun alandan makas ile halkalara paralel kesi yapılır ve kanül yerleştirilir (Resim 2). Trakeostomi açı- Resim 2. Trakeanın serbestlenerek askıya alınması (A), trakeostomi sonrası entübasyon tüpünün trakeaya yerleştirilmiş hali (B). lırken özofagusu yaralamamaya dikkat edilmelidir. Orotrakeal entübasyon daha az invaziv olsa da ratın dilini dışarı çekmekte yaşanılan problemler ve trakeaya ulaşamama nedeniyle zorluklar olabilir. Trakeostomi açmak ise daha invaziv ancak trakea, özofagus ve boyun anatomisine daha iyi hakim olabilmek için tekrar tekrar pratik yapabilme imkanı sunmaktadır. Trakeostomi veya orotrakeal entübasyondan sonra entübasyon kanülü çok iyi sabitlenmelidir. Özellikle alıcı rat, lateral dekübit pozisyonuna getirilirken kanül çıkabilmektedir. Ventilatöre (Harvard Apparatus Mouse Ventilator Model 687) bağlanan rat için PEEP: 2, tidal volüm ortalama ml, frekans /dk ve oda havası veya FiO2: 1 olacak şekilde oksijen ile ventilasyon idame ettirilir. Premedikasyonunu takiben entübasyon sonrası anestezi aralıklı isofluran inhalasyonu ile devam ettirilir. İnhaler anesteziklerin dozu çok dikkatli ayarlanmalıdır. Ortalama MAC idame dozunu aşmamak gerekir. Prosedür için operasyon mikroskobu (Leica Wild M651 ) 5.5 büyütmede kullanılır. Operasyon tek cerrah ile temiz nonsteril şekilde devam ettirilir. Donör akciğerin çıkarılması Donör rat uygun anestezi premedikasyonu sonrası supin pozisyonda sabitlenir. Harvesting supin pozsiyonda yapılır. Kalp-akciğer enblok olarak çıkarılıp sonrasında sol akciğer ve hilus diseksiyonu yapılabileceği gibi sadece sol akciğer de çıkarılabilir. Donör rat öncelikle heparinize edilmelidir. Heparinizasyon işlemi kuyruk veninden Ü heparin verilerek yapılabileceği gibi, midline abdominal insizyon ile heparin direkt olarak vena kava inferiora (VKI) da verilebilir. Bu şekilde heparinizasyonun yapıl- 285 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

4 Resim 3. Mini laparotomi sonrası karaciğer (Kc) pamuklu kulak çubuğu ile inferiora çekilir ve inferior vena kavadan (VCI) insülin enjektörüne takılmış 28 G iğne ile heparin verilir. Resim 4. Sternotomi sonrası diyafram seviyesinden heriki yana doğru torakotomi yapılır, daha sonra kotlar posteriorda vertebraya yakın yerlerden kırılarak dışarı doğru bükülür, bu şekilde kalp ve akciğerler için geniş bir görüş alanı sağlanmış olur. Resim 5. Timus bezinin çıkarılması Resim 6. Venöz dönüş superior ve inferior vena kavalar klipslenerek engellenir dığından emin olunur. Abdomen insizyonu sonrası karaciğer kubbesi ve ligamanlar açılarak inferior vena kavaya ulaşılır. Karaciğer inferiora çekilir Ü heparin VKI ya 28 G iğne yardımı enjekte edilir (Resim 3). Sonrasında diyafram kotsal birleşim yerlerinden açılır. Sternotomi bipolar ve kalın makas yardımı ile yapılır. Tam eksplorasyon için sternotomi ekartörü koymak yerine biz kostaları kalın makas ile diyafram üzerinden başlayarak 1. kota kadar posteriorlarından kesip, dışarıya doğru kıvırıyoruz (Resim 4). Bu şekilde mediasten ve her iki akciğer net bir şekilde ortaya konur. Bu, sonraki işlemler için kolaylık sağlayacaktır. Toraks kavitesi tamamen açıldıktan sonra akciğerin, alıcı rata takılıncaya kadar geçen sürede korunması için, transplantasyon solüsyonu ile yıkanması gerekmektedir. Bir çok klinik bu işlem için, insanlarda da sıklıkla kullanılan Perfadex, Celsior, HTK veya Wisconsin solüsyonlarını tercih etmektedir. Hastanemizde olduğu için transplant solüsyonu olarak HTK kullandık. Harvesting işlemi öncesi inferior vena cava (IVC) ve süperior vena cavalar (SVC) ortaya konmalıdır. Bunun için önce mediastende büyük yer işgal eden timus diseke edilir ve çıkarılır (Resim 5). Sonrasında diseke edilen IVC ve SVC bağlanır veya klipsler yardımı ile klemplenir (Resim 6). Böylece venöz dönüş engellenir. Diyafram üzerinden ligate edilen IVC kalbe yakın yerden kesilir böylece kalp içindeki kan boşaltılır. Sol aurikulanın kesilmesi ile pulmoner artere verilecek olan yıkama solüsyonunun akciğerlerden toraks kavitesine tahliyesi sağlanır. Yıkama işlemi için 26G intraket (sarı 286 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

5 intraket) kalbin sağ ventrikülünden veya trunkus pulmonalis in kökünden yerleştirilir (Resim 7). Ortalama 10 cc yıkama solüsyonu enjektöre çekilir ve 20 cm yükseklikten kanül aracılığı ile akciğerler 5-10 dakikada yıkanır. Donör Akciğerin çıkarılması ve Cuff lama işlemi: Sol akciğer laterale retrakte edilerek sol hiler yapılar açığa çıkarılır. Bu sırada inferior ligaman serbestlenir ise yapılar daha net ortaya konur. Sol pulmoner arter, ven ve bronkus divize edilir. Akciğerler semiventile durumdayken bronkus mikrovasküler klemplerle akciğere yakın yerden ligate edilir. Makas ve forceps yardımı ile hilus diseksiyonuna pulmoner arter üzerinden başlanır. Pulmoner arter etrafındaki mediastinal yağ dokuları diseke edilir. Ana pulmoner arter seviyesine kadar diseksiyon devam eder. Sonra ana pulmoner arterin sol dalı verdiği yerlen pulmoner arter kesilir. Pulmoner arterin hemen inferiorunda sol ana bronş görülür. Bronşta benzer şekilde diseke edilir. Diseksiyon karinaya kadar yapılır. Özellikle membranöz kısım çok kolay yırtılabileceğinden burada diseksiyona dikkat edilmelidir. Bize göre hilus diseksiyonunda en çok dikkat edilmesi gerekilen yapı pulmoner vendir. Pulmoner ven diseksiyonuna inferior ligamandan başlamak doğru bir tercihtir. İnferiordan atriuma yakın alana doğru katlar dikkatli bir şekilde açılır. İnferior ven çok ince ve narindir. Mümkün olduğu kadar kalbe yakın olan noktadan kesilmelidir. Ven diseksiyonu sırasında meydana gelen küçük bir yırtık akciğerin alıcıya anastomozundan sonra klempleri açtığımızda major bir kanamaya sebep olarak ratın ölümüne neden olabilir. Diseksiyon işlemi başarı ile tamamlandıktan sonra sol akciğer çıkarılır. Cuff lama işleminde sırası ile bronkus, pulmoner arter ve ven önceden hazırlanmış olan cuff lardan geçirilerek 7-0 veya 8-0 sütürler (Dogsan, İpek ) ile sabitlenir (Resim 8). Biz cuff ları arter ve vene bağlamak için 8-0 ipek kullanıyoruz. Ancak bronş anastomuzunda 7-0 ipek tercih edilebilir. Diğer sütür çeşitleri ile kıyaslandığında ipek, cuff lara en iyi yapışan ve kaymayan sütür çeşididir. Böylece cuff lanmış olan sol akciğer implantasyon için hazır duruma getirilir. Akciğerler +4 C de solüsyonda saklanır. Resim 7. Yıkama solüsyonu 26G kanül(ok) ile pulmoner arterden (PA) verilir Resim 8. Pulmoner arter, ven ve bronş cuff lı, bronş semiventile durumda klipslenmiş Alıcının ratın hazırlanması: Anestezi premedikasyonu ve idamesi donör ratta olduğu gibi yapılır. Alıcı rat trakeal entübasyon ve gaz anestezisi yardımı ile uyutulur. Trakeostomi kanülü ratın kafasına bant yapıştırıcısı ile sabitlenir. Böylece rat sol dekübit pozisyona çevrilirken kanülün trakeadan çıkması önlenmiş olur. Rat sol torakotomi için uygun dekübit pozisyona alınır. Göğüs duvarı alkol veya betadin ile yıkanarak temizlik sağlanır. Torakoto- 287 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

6 mi insizyonu yapılır, kas tabakaları bipolar yardımı ile kesilir. Böylece göğüs duvarından kaynaklı kanama minimalize edilmiş olur. Göğüs duvarı kasları geçildikten sonra skapulanın hemen altından geçen kotun üzerinden yani 4. interkostal aralıktan toraksa girilir. İnterkotsal mesafe diseke edildikten sonra toraks ekartörünü koymadan önce portegü yardımı ile interkostal aralığı biraz açarak ekartörü yerleştirmek için yer açmaya çalışılır. Sonrasında anteriordan toraks ekartörü yerleştirilerek toraks açılır. Küçük torakotomiler her zaman zor hilus eksplorasyonu demektir. Bu nedenle küçük torakotomi yapılmaya çalışılmamalıdır. Akciğer klemplerin yardımı ile inferior ligaman serbestlendikten sonra posteriordan toraks dışına çıkartılır. Diseksiyon sırasında rahat çalışabilmek için alıcı ratın kendi akciğeri, posteriorda spanç yardımı ile örtülür. Hilus diseke edilerek pulmoner arter, ven ve bronş yapılarının etrafı diseke edilir (Resim 9). Pulmoner artere, vene ve bronşa Yaşargil mikrovasküler klempleri ( Peter Lazic, T) konularak her üç yapı da ligate edilir (Resim 10). Sonrasında bronş, arter ve vene konulacak sabitleme sütürleri hazırlanır. Resim 9. Toraks ekartörü konularak göğüs kafesi açılır, transplantasyon yapılacak ratın kendi akciğeri posteriordan toraks dışına çıkarılarak hiler diseksiyon yapılır İmplantasyon prosedürü: Alıcı ratın kendi akciğerini örttüğümüz spancın üzerine önceden hazırlanmış cuff lı donör akciğeri yerleştirilir. Önce pulmoner arter için hazırlanmış olan sabitleme sütürü arterin etrafından dolaştırılır ve bağlanmadan düğümü hazır hale getirilir. Sonra arterin anterior yüzüne makas yardımı ile kesi yapılır, kan aspire edilerek arter içi yıkama solüsyonu ile yıkanır ve donörün cuff lı arteri bu kesiden alıcı ratın kendi arterinin içine sokulur ve dışarıdan daha önce hazırlanmış olan 7-0 ipek sütür (Dogsan, İpek ) ile düğümlenir. Pulmoner arterin implantasyon sırasında burkulmamasına özen gösterilmelidir. Bir diğer önemli nokta pulmoner arter içinde hava görülmüşse, anastomozu yapmadan hava çıkarılmalı ve sonra anastomoz yapılmalıdır. Aynı işlem bronş ve ven için ayrı ayrı yapılır. Ancak ven ve bronş dışardan 6-0 ipek sütür (Dogsan, İpek ) ile sabitlenir. Sonrasında önce arter sonra ven klempi açılır. Bronş klempi açıldığında akciğerin havalandığı görülür. Artık alıcı rata donörün sol akciğeri implante edilmiştir (Resim 11). Daha önce posteriordan dışarı çıkartılarak spanç altına konulan alıcı ratın kendi akciğeri ise donör akciğeri anteriora alınarak posteriordan anastomoz hatlarına çok yaklaşmadan kesilerek uzaklaştırılır. Yeni akciğer toraksa tam yerleştirilir. Transplantasyon sonrası implante edilen akciğerde lase- 288 DERMAN MEDICAL PUBLISHING Resim 10. Hilus diseksiyonu sonrası pulmoner arter (PA), pulmoner ven (PV), ve bronş yaşargil klempleri ile ligate edilmiş, posteriordan toraks dışına alınmış olan alıcı ratın kendi akciğerinin üzeri spanç ile örtülmüş, spanç üzerinde hiler yapıları cuff lı alıcı rata takılacak olan akciğer görülmekte

7 rasyon olup olmadığına dikkat edilmelidir. Aksi taktirde postoperatif pnömotoraks en önemli mortalite sebebidir. İşlem sonrası kontroller yapılır ve pulmoner venden 30G iğne ile alınacak örnek kandan kan gazı bakılabilir. Böylece graftın erken dönem fonksiyonları değerlendirilmiş olur. Ardından toraksa göğüs tüpü konularak tüm kas katları 5-0 vicril sütür (Dogsan, Pegelak ) anatomik planda kapatılır (Resim 12). Resim 11. Transplante edilen yeni akciğerde bronş klempi açılmış, akciğer havalanıyor durumda, henüz pulmoner arter ve ven klempleri duruyor, ratın kendi (eski) akciğeri posteriorda spanç altında görülebiliyor. Resim 12. Toraks kapatıldıktan sonra göğüs tüpü çekilmeden ve ekstübasyon yapılmadan önce çekilen rontgenoğram Ratın ekstübasyonu: Gaz anestezisi kesildikten kısa bir süre sonra rat uyanır ve spontan solumaya başlar. Rat ekstübe edilmeden önce supin pozisyona alınır göğüs tüpü çekilir, ardından entübasyon tüpü çıkarılır. Trakeostomi kesisi 8-0 ipek sütür kullanılarak bir veya iki sütür ile kapatılır. Ratın maske yardımı ile oksijen verilerek kendine gelmesi sağlanır. Ardından daha önceden ısıtılmış olan oksijen destekli yoğun bakım ünitesine alınır (Resim 13). Bundan sonra rat için uygun analjezik kullanımı ile ağrı kontrolü en önemli basamağı oluşturmaktadır. Rat transplant sonrası dönemde ketoprofen 5mg/kg veya 5 mg/kg subkutan morfin 6 saatte tekrar edilerek yapılır. Proflaktik antibiyotik kullanımı ise çok önerilmemekle birlikte postoperatif IM gentamisin 5 mg/ kg dan 3 gün boyunca 2x1 olarak doz ayarlanabilir. Resim 13. Transplantasyon sonrası yoğun bakım ünitesine alınmış olan rat Değerlendirme Transplantasyon yapılan rat saatte iyileşir. Rat transplantasyonu sonrası takılan akciğerin fonksiyonlarını değerlendirmek için ortalama 7-10 gün sonra yapılan sağ pnömonektomi ve sonrasında alınacak kan gazı bize bilgi verir. Transplantasyon sonrası akciğer erken değerlendirilmesinde 30 G iğne ile pulmoner venden alınan 289 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

8 kan gazı alınabilir. Ayrıca sakrifikasyon sonrası implante edilen akciğerin patolojik incelemesinde inflamasyon bulguları, trombüs vs, graftın durumunu gösterir. Trombus genellikle harvesting sırasında düzgün yapılmamış yıkama (flushing) sonrası görülür. Bir çok yazara göre cuff yöntemi ile rat transplant tekniği mikrocerrahi deneyimi olan kişiler için dahi en az 50 hayvanda, tecrübeli bir cerrah eşliğinde denendikten sonra rahat bir şekilde uygulanılabilmektedir. Sonrasında % 0 perioperatif mortalite ile transplant yapılabilmektedir. Teşekkürler Çalışmalarımız sırasında bizlere her türlü desteği gösteren hocamız Sayın Prof. Dr. Ali Yener e, tecrübe ve deneyimlerini daima bizim ile paylaşan Sayın Dr. İlhan İnci ye, teşekkür ederiz. Kaynaklar 1. Maurer JR, Frost AE, Estenne M, Higenbottam T, Glanville AR. International guidelines for the selection of lung transplant candidates. The International Society for Heart and Lung Transplantation, th American Thoracic Society, the American Society of Transplant Physicians, the European Respiratory Society. Transplantation 1998; 66: Anvari F, Sharma AK, Fernandez LG, Hranjec T, Ravid K, Kron IL, et al. Tissue-derived proinflammatory effect of adenosine A2B receptor in lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010;140(4): Inci I, Erne B, Arni S, Jungraithmayr W, Inci D, Hillinger S, et al. Prevention of primary graft dysfunction in lung transplantation by N-acetylcysteine after prolonged cold ischemia. J Heart Lung Transplant. 2010;29(11): Pieróg J, Kubisa B, Droździk M, Wójcik J, Bielewicz M, Pankowski J, et al. Vancomycin lung concentration in acute and hyperacute rejection models of lung transplantation in rats. Eur J Cardiothorac Surg. 2010;38(4): Remund K, Rechsteiner T, Guo Z, Rentsch K, Boehler A. The macrolide clarithromycin inhibits experimental posttransplant bronchiolitis obliterans.exp Lung Res. 2009;35(10): Jungraithmayr W, Vogt P, Inci I, Hillinger S, Arni S, Korom S, et al. Amodel of chronic lung allograft rejection in the rat. Eur Respir J. 2010;35(6): Asimacopoulos PJ, Molokhia FA, Pegg CA, Norman JC. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 1971;3(1): Mizuta T., Kawaguchi A., Nakahara K., Kawashima Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1989: 97; DERMAN MEDICAL PUBLISHING