NKUBAP AR nolu proje. Mikroçoğaltım ile Elde Edilen Akzambak (Lilium candidum L.) Soğancıklarında Alkaloid Analizi

Transkript

1 NKUBAP AR nolu proje Mikroçoğaltım ile Elde Edilen Akzambak (Lilium candidum L.) Soğancıklarında Alkaloid Analizi Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Sheida DANESHVAR ROYANDAZAGH Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN 2016

2 Mikroçoğaltım ile Elde Edilen Akzambak (Lilium candidum L.) Soğancıklarında Alkaloid Analizi Proje No: NKUBAP AR Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Sheida DANESHVAR ROYANDAZAGH Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN Şubat 2016 Tekirdağ

3 ÖNSÖZ Bitkilerden elde edilen ekstraktların tüm dünyada alternatif tıp ve kozmetikte yaygın olarak kullanıldığı ve bu ürünlerin büyük bir pazar payının olduğu bilinmektedir. Ancak Türkiye bu pazarda gülyağı dışında diğer bitkilerde pazar payına sahip değildir Oysa Türkiye tıbbi ve aromatik bitki varlığı açısından dünyanın sayılı ülkeleri arasındadır. Bu yüzden bulunan kaynaklardan daha verimli yararlanılabilmek için generatif veya vejetatif yollarla çoğaltılması ve bunun yanı sıra alternatif teknikler özellikle biyoteknolojik yöntemlerin araştırılması ve uygulanması gerekmektedir. Miszambak bitkisinin çiçekçilik sektöründe ve bu bitkiden elde edilen ekstraktların alternatif tıp ve kozmetikte yaygın olarak kullanıldığı bilinmektedir. Türkiye de ticareti önem taşıyan bu tür soğanlı bitkilerin kültürü yapılarak sadece soğan veya çiçek ihracatı yapılmaktadır. Bu Proje kapsamında miszambak bitkisinin biyoteknolojik yöntemlerle hızlı bir şekilde ve fazla sayıda üretim çalışmalarının yansıra bu bitkilerden elde edilen ekstraktlar ve alkoloid analizlerinin yapılması Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri koordinatörlüğü (BAP) tarafından Proje No: NKUBAP AR numaralı proje olarak desteklenmiştir. Namık Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dekanlığına ve projenin her aşamasında destek ve yardımlarını esirgemeyen ve her zaman yanımızda olan bölüm başkanımız Prof. Dr. Sezen ARAT a (Namık Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi) ayrıca teşekkür ederim. Proje Yürütücüsü Yrd. Doç. Dr. Sheida DANESHVAR ROYANDAZAGH Şubat 2016 i

4 İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ. i İÇİNDEKİLER.. ii ÇİZELGELER DİZİNİ. iii ŞEKİLLER DİZİNİ.. iv SİMGELER VE KISALTMALAR. v EKLER DİZİNİ vi ÖZET vii ABSTRACT. viii 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Yöntem Eksplant sterilizasyonu Besin ortamı ve kültür koşulları L. candidum soğanlarının in vitro mikroçoğaltımı Alkoloid ektraksiyonu ve saflaştırılması GC-MS de alkaloidler profillerinin belirlenmesi BULGULAR Örnek alım zamanının kimyasal bileşen verilerine ve alkaloid profiline etkisi Kültür ortamının kimyasal bileşen verilerine ve alkaloid profiline etkisi Alkaloidler (Azotlu bileşikler) TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR EKLER. 32 ii

5 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çizelge 4.1 Çizelge 4.2 Çizelge 4.3 Çizelge 4.4 MS ortamında bulunan besin bileşikleri ve konsantrasyonları (Murashige ve Skoog 1962).. 11 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri. 17 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri. 19 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri. 20 Kontrol örneğinde belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri 23 iii

6 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1 Eksplantların in vitro mikroçoğaltım aşamaları. 12 Şekil 3.2 GC-MS için alkaloid ekstraksiyonu aşamaları Şekil 3.3 GC-MS enjeksiyonu için hazırlanmış örnekler ve GC-MS. 14 Şekil 4.1 Şekil 4.2 Şekil 4.3 Şekil 4.4 Şekil 4.5 Şekil 4.6 Şekil 4.7 Şekil 4.8 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 14 denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 3.bileşik, c. 4.bileşik, d. 5.bileşik, e. 7.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre). 18 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 2. örnek alımında belirlenen azotlu bileşik (a. 2.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre) ve 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (b. 1.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre) 18 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik ve d. 4.bileşik) (Çizelge 4.2 ye göre) 20 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik ve c. 3.bileşik) (Çizelge 4.2 ye göre). 20 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre) In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 2. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 2.bileşik, b. 4.bileşik, c. 5.bileşik ve d. 6.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre).. 22 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre) Kontrol örneğinde belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik, d. 4.bileşik ve e. 5.bileşik, f. 6.bileşik, g. 7.bileşik ve h. 8.bileşik) (Çizelge 4.4 e göre) iv

7 SİMGELER ve KISALTMALAR 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy asetik asit g, µm, µm Mikrogram, mikromolar, mikrometre BAP 6-Benzilaminopurin IBA Indol butirik asit cm, cm 2 Santimetre, santimetrekare dk Dakika DMSO Dimethylsulfoxide F F testi g, mg, kg Gram, miligram, kilogram GC-MS Gas chromatography mass spectrometry (Gaz kromotografisikütle spektrometresi) HCl Hidroklorik asit HPLC High-performance liquid chromatography (Yüksek performanslı sıvı kromotografisi) IP Isopentenyladenine L, ml, l Litre, mililitre, mikrolitre mm Milimetre M, Molar, mikromolar MJ Metil jasmonat MS Murashige ve Skoog besin ortamı N Normal (normalite) NAA Naftalen asetik asit NaOH Sodyum hidroksit NIST Natitional Institute of Standarts and Technology ph Power of hydrogen TDZ Thidiazuron (1 Phenyl 3-(1,2,3-thidiazol 5yL) urea) yy Yüzyıl v

8 EKLER LİSTESİ Ek-1 Ek-2 Ek-3 Ek-4 Ek-5 Ek-6 Ek-7 Ek-8 Ek-9 Ek-10 L. Candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 1. örnek alımı) 32 L. Candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 1. örnek alımı). 34 L. Candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.1 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 1. örnek alımı). 37 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 2. örnek alımı). 39 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA + 0.4mg/L TDZ ortamında yetişen soğancıkların 2. örnek alımı). 42 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 2. örnek alımı). 44 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 3. örnek alımı) 47 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 3. örnek alımı) 49 L. candidum soğancık ekstraktının GC-MS kimyasal bileşen verileri (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamında yetişen soğancıkların 3. örnek alımı). 52 L. candidum bitkisinin in vivoda yetişen soğanların ekstraktının GC- MS kimyasal bileşen verileri.. 54 vi

9 ÖZET Akzambak bitkisinin soğan ve çiçeklerinden elde edilen ekstraktlarda çeşitli organik asitler, flavonoidler, glikozitler, azotlu bileşikler (alkaloidler) ve steroidlerin olduğu tespit edilmiştir. Dünyada üretilen akzambak miktarının yapılan araştırmalar için yeterli olmamasının yanı sıra çok pahalı bir hammadde olması da hem araştırma yapılmasını sınırlamakta hem de araştırma maliyetlerini artırmaktadır. Türkiye de geleneksel yöntemler ile akzambak soğanları başarılı bir şekilde yetiştirilmektedir; fakat ana bitkiden yeni soğan oluşturulması için 1-1½ yıl kadar bir zaman gerekmektedir. Bu çalışmada in vitro koşullarda mikroçoğaltım yöntemleriyle üretilen soğanlardaki alkaloid profili GC-MS ile tanımlanıp in vivo da yetişen soğanlarla karşılaştırarak en uygun üretim yöntemi belirlenmiştir. Çalışmada L. candidum un soğan pul yaprakları eksplant olarak kullanılmış ve rejenerasyon sonucu elde edilen soğancıklarda yapılan GC-MS analiz sonucuna göre kontrole en yakın yüzde alana (%7.42) ve en yüksek azotlu bileşik yüzdesine sahip örnek 2. besin ortamının (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 3. ay örnek alımından elde edilmiştir. Anahtar kelime: Lilium candidum, mikroçoğaltım, alkaloid, GC-MS vii

10 ABSTRACT Extracts of Lilium candidum contains various organic acids, flavonoids, glycosides, nitrogen-containing compounds, saponins and steroid compounds. The amount of L. candidum production in the world are not sufficient and also are very expensive raw material. Therefore, researches are limited and research costs are also increasing. Bulblets of L. candidum are grown succesfully by conventional methods in Turkey; but obtaining of the active compounds of bulblets takes a long time. Under normal condition, white lily bulbs have produced 1 times over 1/ 1.5 years; but in this study it can be taken three times of the year with in vitro micropropagation technique. In this study is comparing in vitro micropropagation method for bulb produced in alkaloid profile, identified by GC-MS, with the one grown by in vivo production method for the purpose of determined the most appropriate method for production. In this study, twin scales of L. candidum were used as explant and the best results in GC-MS analysis were obtained from 2nd medium (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) and 3nd (months) sampling. Key words: Lilium candidum, micropropagation, alkaloid, GC-MS viii

11 1. GİRİŞ Bitkilerden elde edilen ekstraktların tüm dünyada alternatif tıp ve kozmetikte yaygın olarak kullanıldığı ve bu ürünlerin büyük bir pazar payının olduğu bilinmektedir. Kozmetik ve alternatif tıp için tüm dünyada yapılan harcama payının 300 milyar dolar olduğu bilinmektedir. Tıbbi ve aromatik bitkilerden elde edilen bitki ekstraktları ile fonksiyonel meyvelerin çekirdekleri ile tohumlardan elde edilen yağların payının da, bu tutarın % 50 si olan 150 milyar dolar olduğu bilinmektedir. Ancak Türkiye bu pazarda gülyağı dışında diğer bitkilerde pazar payına sahip değildir. Oysa Türkiye tıbbi ve aromatik bitki varlığı açısından dünyanın sayılı ülkeleri arasında yer almakta ve dünya çiçek soğanı ihracatında ise birinci sıradadır (Anonim 2011). Türkiye tıbbi ve aromatik bitki varlığı açısından dünyanın sayılı ülkeleri arasında yer almasına ve pek çok bitkinin de gen merkezi olma özelliğini taşımasına rağmen bu pazarda gülyağı dışında diğer tıbbi bitkilerin pazar payı yok denecek kadar azdır (Anonim 2011). Türkiye için gen kaynağı olan Akzambağın dağılım alanı Güneybatı Anadolu Bölgesi, Aydın, Muğla, Antalya çevresi ve genel dağılım alanı Balkanlar, Lübnan ve Filistin olarak belirlenmiştir (TÜBİVES 2012; Davis 1978,1984). Bu bitkiden elde edilen ekstraktlar son dönemlerde alternatif tıp ve kozmetik sektöründe yaygın olarak kullanılmaktadır. Akzambak anti-inflamatuvar etkisinden dolayı halk tıbbında kullanılan bir bitkidir. Bitkinin alkol ve yağ ekstreleri ülserde, iltihaplarda, çıbanlarda, on iki parmak ülserinde, deri kızarmasında, yanıklarda ve yaralanmalarda harici olarak kullanılmaktadır. Akzambak bitkisinin soğan ve çiçeklerinden elde edilen ekstraktlarda çeşitli organik asitler, flavonoidler, glikozitler, alkaloidler (azotlu bileşikler) ve steroidlerin olduğu tespit edilmiştir (Eisenreichova vd. 2004). Dünyada üretilen akzambak miktarının yapılan araştırmalar için yeterli olmamasının yanı sıra çok pahalı bir hammadde olması da hem araştırma yapılmasını sınırlamakta hem de araştırma maliyetlerini artırmaktadır. Türkiye de geleneksel yöntemler ile akzambak soğanları başarılı bir şekilde yetiştirilmektedir; fakat ana bitkiden yeni soğan oluşturulması için 1-1½ yıl kadar bir zaman gerekmektedir. Yapılan literatür araştırmalarında ekonomik değeri yüksek, süs, tıbbi ve aromatik bitki olarak kullanılan L. candidum türünde in vitro koşullarda doku kültürü ve mikroçoğaltım çalışmalarının yeterince bulunması, bu bitkide in vivo alkaloid tayini çalışmaları yapılmış olmasına rağmen L. candidum türünde in vitro mikroçoğaltım ile üretilen soğancıkların alkaloid miktarının belirlenmesi ile ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu proje kapsamında L. candidum türünde öncelikle in vitro koşullarda mikroçoğaltım yöntemi ile soğancık geliştirilecek ve daha sonra gelişen soğancıklardan farklı zamanlarda örnek alımı yapılarak alkaloid profilleri GC-MS ile tanımlanacaktır. İkinci aşamada tarla koşullarında yetiştirilen soğanlar ile in vitro koşullarda kısa sürede elde edilecek soğancıkların içermiş olduğu alkaloid profili karşılaştırılarak arasındaki farkın belirlenmesi düşünülmektedir. Proje kapsamında in vitro mikroçoğaltım çalışmalarında hem alkaloid profili belirlendiği hem de in vitro 1

12 mikroçoğaltım ile hızlı çoğaltım yapıldığında, doğaya zarar vermeden kısa sürede ve daha fazla miktarda ham madde sağlanmış olacaktır. Çalışmanın sonucunda uygun ham madde üretimi ve ticareti için etkili, hızlı ve güvenli bir yolun bulunması hedeflenmiştir. 2

13 2. GENEL BİLGİLER Soğanlı bitkiler ve Lilium candidum un önemi Türkiye gerek farklı iklimlere sahip olması gerekse üç floristik bölgenin kesişme noktasında bulunması sebebiyle bitki türlerinin çokluğu bakımından dünyanın zengin ülkelerinden birisidir. Türkiye de yaklaşık adet civarında bitki türü bulunmaktadır ve bunlardan 3000 kadarı endemiktir. Türkiye florasında bulunan bu endemik bitki türleri içinde 26 cinse bağlı 540 geofit türü olduğu bildirilmiştir (Özhatay 2005; Özel 2010). Eskiden beri Türkiye de doğal olarak yetişen bitkilerden hem ülke içinde yararlanılmakta hem de bir kısmı ihraç edilmektedir. Özhatay vd. (1997) tarafından yapılan bir araştırmaya göre doğadan toplanarak ihracatı yapılan tür sayısı 347 adettir. Bu tür zenginliği içinde yer alan ve ihraç edilen geofit (soğanlı, yumrulu, rizomlu) bitkilerin yeri büyüktür. Yurdumuz geofitlerinin büyük kısmı Zambakgiller (Liliaceae), Nergisgiller (Amaryllidaceae) ve Süsengiller (Irıdaceae) familyaları kapsamında bulunurken, bu familyalar endemik türler bakımından da oldukça zengindir (Titiz 2000). Liliaceae familyası yaklaşık 250 cins ve 3000 e yakın tür ile dünyada geniş bir yayılıma sahiptir. Yer altı organları soğanları, tuberleri ve rizomlarıdır. Çiçekleri dikkat çekici bir şekilde renkli ve kokulu, tek ya da toplu şekilde çiçek yapısına sahiptir (Eisenreichova vd. 2004). Biyolojik zenginliklerimiz içerisinde yer alan soğanlı bitkilerden birisi de ak zambak (Lilium candidum) dır. Lilium cinsi, orta Avrupa da yetişen, L. candidum un da içinde bulunduğu yüzlerce türü içerir. Yılın büyük bölümünü toprak altında soğan, yumru ve rizom halinde geçiren soğanlı bitkilerin çoğu ilkbaharda, bir kısmı ise sonbaharda güzel ve gösterişli çiçekler açar (Özuslu ve İskender 2009). Akzambak geniş, oval, pullu ve sarı soğanlara sahiptir (Eisenreichova vd. 2004). Soğanlı bitkilerin süs bitkisi olarak değerlendirilmelerinin yanında modern tıpta da bu bitkilerden faydalanılmaktadır. Lilium candidum L. soğanları, içerdiği saponinlerden dolayı yanık ve şişliklerin tedavisinde, anti-inflamatuar etkisinden dolayı halk tıbbında kullanılan bir bitkidir (Mimaki vd. 1999; Eisenreichova vd. 2004). Bitkilerinin alkol ve yağ ekstreleri ülserde, iltihaplarda, çıbanlarda, parmak ülserinde, deri kızarmasında, yanıklarda ve yaralanmalarda harici olarak kullanılmaktadır. Akzambak bitkisinin soğan ve çiçeklerinden elde edilen ekstraktlarda son yıllarda yapılan çalışmalara göre çeşitli organik asitler, flavonoidler, glikozitler, alkaloidler (azotlu bileşikler) ve steroidlerin olduğu tespit edilmiştir (Eisenreichova vd. 2004). Fritillaria bitkisinin alkaloidlerinin anti-inflamatuar, antikolinerjik, kolinesteraz önleyici, anti-hipertansiyon aktivitelere sahip olduğu ve anti-emetik potansiyelinin olduğu belirlenmiştir (Shunwan 2011). Pancratium maritimum, Leucojum aestivum ve Narcissus tazetta ssp. tazetta nın ekstrelerinden elde edilen dört farklı tipteki alkaloidin (lycorine, crinine, tazettine ve galanthamine) farklı potansiyellerde antimalaryal aktivite sergilediği (Şener vd. 2003), Leucojum vernum dan elde edilen homolycorine, trisphaeridine ve tazettine gibi bazı alkaloidlerin ise sitotoksisite ve antiretroviral etkilerinin olduğu tespit edilmiştir (Szlavik vd. 2004). 3

14 Soğanlı bitkilerde alkaloidlerin önemi İnsanlarda dahil olmak üzere bir çok organizmanın ürettiği alkaloidler amino asitlerden türeyen genelde temel azotlu bileşikleri içeren sekonder metabolitlerin büyük bir grubudur. Birçok alkaloid, azot içeren halka sistemine göre kimyasal olarak sınıflandırılır. Kromon ve flavonoid alkaloidler bir halkasına azot bağlı olan molekül yapısına sahiptirler (Khadem vd. 2012). Alkaloidlerin en önemli özellikleri bitki kökenli olup, farmakolojik açıdan etkili olmalarıdır (Mammadov 2014). In vivoda Amaryllidaceae ve Liliaceae familyasına ait soğanlı bitkilerde alkaloid miktarları belirlendiği ya da alkaloid profilinin tanımlandığı çalışmalar yapılmıştır. Amaryllidaceae familyasından Galanthus rizehensis Stern. bitkisinin 4 farklı örneğinde önemli biyolojik özelliklere sahip lycorine (anti-viral, anti-malaryal, antifungal, anti-parazitik, anti-inflamatuar ve anti-tümör etkilerine sahip) alkaloidinin miktar tayinin yapıldığı çalışmada materyal olarak çiçeklenme ve meyve bağlama döneminde ki soğanlar kullanılmıştır. G. Rizehensis de toplam alkaloid içeriği % oranları arasında saptanmıştır. Çiçeklenme ve meyve bağlama döneminde ki alkaloid yüzdeleri sırasıyla % ve % oranlarında belirlenmiştir (Sarıkaya vd. 2012). Ondra vd. (1995) Liliaceae familyasının 7 farklı Türk Colchicum cinsine ait yaptıkları çalışmada 31 alkaloidden 9 alkaloid çeşidi (3-demethylcolchicine, 2- demethylcolchicine, colchifoline, N-deacetyl-N-formylcolchicine, colchicine, cornigerine, 2-demethyldemecolcine, 3-demethyldemecolcine ve demecolcine) nötral ve temel alkaloid fraksiyonlarını ayırarak HPLC ile tespit etmişlerdir. Çin de binlerce yıldır geleneksel tıpta kullanılan ve çeşitli farmasötik aktif bileşiklerin kaynağı olan Liliaceae familyasına ait Fritillaria cinsinin farklı türlerinde yapılan bir çalışmada her türde farklı kimyasal bileşenler olduğunu, bunların içinde de en fazla oranda steroidal alkaloidlerin (puqiedine, puqienine D, puqiedinone-3-o-β-d-glucopyranoside, peimisine-3-o-β-d-glucopyranoside, lichuanine, (20S, 25R)-5α,14α-cevanine-3β, 6βdiol, pengbeimine B vb.) olduğunu ortaya koymuşlardır (Cheng vd. 2013). Lilium candidum alkaloidleri ve yapılan çalışmalar Bu çalışmada daha önceden in vivoda L. candidum un soğan, yaprak, petal gibi organlarında yapılmış alkaloid analizleri sonucunda ortaya konulan alkaloid profilleri ile çalışmamızda in vitroda mikroçoğaltımı yapılacak L. candidum soğanlarında ki alkaloid profilleri karşılaştırılmıştır. Bu amaçla önceki literatürlerde in vivo ortamdan elde edilen L. candidum alkaloidleri araştırılmıştır. Liliaceae familyasının steroidal bileşikleri oldukça iyi bilinmektedir. Bu bileşiklerde en fazla Lilium cinsinde bulunmaktadır. Lilium türlerinin içerdiği bazı steroidler ilk olarak 1940 lı yıllarda belirlenmiştir. Birçoğu spirostanol saponinler olarak L. candidum un soğan ve çiçeklerinden etanol ekstresi ile izole edilmiştir. İzole edilen saponinler iki glukoz ve bir ramnoz molekülünden oluşan saponinlerdir (Eisenreichova vd. 2004): (25S)-3β-{β-D-glucopyranosyl-(1 4)-[α-LO-rhamnopyranosyl-(1 2)]-β-D glucopyranosyloxy}spirost-5-en-27-ol, 4

15 (25R,26R)-3β-{β-D-glucopyranosyl-(1 4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1 2)]-β-Dglucopyranosyloxy}- 26-methoxyspirost-5-ene, (25R,26R)-3β-{β-D-glucopyranosyl-(1 4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1 2)]-β-Dglucopyranosyloxy}spirost-5-en-26-ol ve (25R,26R)-26-ethoxy-3β-{β-D-glucopyranosyl-(1 4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1 2)]- β-d-glucopyranosyloxy}spirost-5-ene. Erdoğan vd. (2001) çalışmalarında L. candidum soğanlarından etanol ile ekstre ettikleri örneklerde steroidal alkaloidin 22,26-epiminocholestane tipi olan etioline tespit edilmiştir. L. candidum un en önemli bileşikleri azotlu bileşiklerdir. Temelde daha çok monomerik pyrroline, dimerik pyrroline-pyrrolidine ve pyrrolinepyrroline bileşikleri izole edilmektedir (Eisenreichova vd. 2004). Monomerik pyrroline bileşikler; Jatropam, etiljatropam, Sitrakonik asit imidi ve Jatropam-5-5-O-β-D-glucopyranoside L. candidum petallerinden elde edilen dimerik alkaloidler; 3-methyl-1-(3-methyl-2-oxopyrrolidin-5-yl)-2,5-dihydropyrrol-2-, 3-methyl-1-(2-oxopyrrolidin-5-yl)-2,5-dihydropyrrol-2-one ve 5-hydroxy-3-methyl-1-(3-methyl-2-oxopyrrolidin-5 -yl)-2,5-dihydropyrrol-2-one L. candidum soğanlarından elde edilen pyrroline-pyrroline bileşikleri; 5,5 -oxybis(3-methyl-2,5-dihydropyrrol-2-one) ve 5-hydroxy-3-methyl-1-(3-methyl-2-oxo-2,5-dihydropyrrol-5-yl)-2,5-dihydropyrrol-2-one Bir diğer alkaloid türü ise bir flavon alkaloid olan lilaline (Eisenreichova vd. 1991) bileşiğidir: 3,5,7,4 -trihydroxy-8-(3-methyl-2-oxopyrrolidin-5-yl)-flavon, bu bileşik L. candidum un petallerinden izole edilmektedir (Eisenreichova vd. 2004). L. candidum soğanlarından, petallerinden ve yapraklarından elde edilen alkaloidler ile ilgili çalışmalar mevcuttur. Haladova vd. (1988), çalışmasında L.candidum petallerinden 1-(3 -Methyl-2 -oxo-5 -pyrrolidinyl)-3-methyl-3-pyrrolin-2- one, 1-(2 -oxo-5 -pyrrolidinyl)-3-meth-yl-3-pyrrolin-2-one ve 1-(3 -methyl-2 -oxo-5 - pyrrolidinyl)-5-hydroxy-3-methyl-3-pyrrolin-2-one alkaloidlerini, Eisenreichova vd. (1991) L. candidum petallerinde ethyl-jatropham ve soğanlarında ise jatropham ve citraconimide alkaloidlerini ve Eisenreichova vd. (1992) nin bir çalışmasında L. candidum soğanlarında 1-(2 -oxo-5 -pyrrolidinyl)-5-hydroxy-3-methyl-3-pyrrolin-2-one alkaloidinin izole edildiği bildirilmiştir. Erdoğan vd. (2001) ise L. candidum soğanlarında hava kurutmalı ve etanol maserasyonu ile yaptıkları ekstraksiyonlar sonucunda spektroskopik metodlar ile jatropham (0.1 g) ve etioline (0.006 g) alkaloidlerini tespit etmişlerdir. L. candidum un kanser önleyici potansiyelinin ve inhibitör aktivitesinin araştırıldığı bir çalışmada iki farklı spirostanol saponin, pirrolin türevi jatropham ve onun glikozitleri, flavonol-kaempferol gibi çeşitli bileşikler tespit edilmiştir. Çalışmanın sonucunda en fazla inhibitör aktivitesi olanlar %70 oranı ile spirostanol saponinler, daha sonra ise %66 oran ile jatropham yer almaktadır. En düşük inhibitör aktivite ise jatropham glukozitlerinde (%49) belirlendiği bildirilmiştir (Vachalkova vd. 2000). Haladova vd. (2011) tarafından yapılan çalışmada L. candidum un anti-inflamatuar etkilerinden dolayı soğanlarındaki alkaloid miktarı tayin edilmiştir. L. candidum un taze çiçeklerinden etanol ile elde edilen ekstraktta içerdiği flavonoidleri biyokimyasal 5

16 ve farmakolojik etkilerinin öneminden dolayı HPLC ile miktarının belirlendiği çalışmalar da mevcuttur. Bu çalışmanın sonucunda en yüksek orandaki kaempferol miktarı %60 lık etanol ekstraktında ki örneklerde (2.63 mg/ml) belirlenmiştir (Cupakova vd. 2012). Soğanlı bitkilerde in vitro mikroçoğaltım çalışmaları In vitro mikroçoğaltım çalışmalarında bitki büyüme düzenleyicilerin farklı kombinasyonlarının uygulanması ve sonuçlarının alınması in vivoya göre çok daha kısa sürede gerçekleşmektedir. Yaklaşık 30 yıldır uyku çiçeği, kardelen, göl soğanı ve anemon gibi geofitlerde yapılan in vitro çalışmalarda da MS bazal ortamı ve farklı büyüme düzenleyicilerinin kombinasyonları kullanılarak soğancık sayısı ve çapında artış sağlanmaya çalışılmıştır. Maene ve Debergh, (1981) Oxalis (uyku çiçeği) türlerinde en iyi sürgün gelişimi ve dallanmayı NAA, Zeatin, BA nın farklı kombinasyonlarından elde etmişlerdir. Anemonda (Manisa lalesi) yapılan doku kültürü çalışmasında bitkinin farklı organlarından kallus oluşumunun söz konusu olabildiği ve Nitsch besin ortamına aktif kömür ilave edilmesi ile anter kültürü uygulamasında embriyo oluşum oranının arttığı belirtilmiştir (Girmen vd. 1986). Galanthus (kardelen) türlerinin doku kültürü üretiminde NAA, BA, farklı şeker cinsi ve dozları ilave edilmiş MS ortamında, eksplant olarak soğan pul yaprağı, soğan parçaları kullanılarak başarılı organogenesis çalışmaları yapılmıştır (Nasırcılar ve Karagüzel, 2006; Tıpırdamaz vd. 1999). Sage vd. (2000) tarafından Narcissus pseudonarcissus Golden Harvest çeşidinde yapılan bir çalışmada 4 C de, 4.9 μm IBA içeren ortamda in vitro soğancıklar elde edildiği bildirilmiştir. Karaoğlu, (2004) Leucojum spp (göl soğanı) bitkisinde yapılan in vitro hızlı çoğaltım çalışmasında pul yapraklı soğan kısımlarının eksplant olarak kullanılabileceğini belirtmiştir. Büyüme düzenleyici olarak 1 mg/l BAP ve 1mg/L NAA konsantrasyonlarının en iyi sonucu verdiği, elde edilen soğancıkların ise 1mg/L NAA içeren MS besin ortamında köklendirildiği ve dış koşullara başarılı bir şekilde aktarıldığı bildirilmiştir. Fritillaria thunbergii nin soğan pul yaprakları ile yapılan rejenerasyon çalışmasında en iyi sonucun 1.62 μm NAA ve 4.65 μm kinetin içeren MS ortamından (%13.7) elde edildiği ve elde edilen soğanların kültür sonunda 5 C de 5 hafta bekletilerek kompost, vermikulit ve perlit (1:1:1) içeren ortama aktarıldığında 10 mm çapındaki soğanların %100 ünün sürgün verdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, rejenerasyon çalışmasına başlamadan önce soğanları 10 C de 6 hafta bekletmenin rejenerasyonu olumlu yönde etkilediği de Paek ve Murty, (2002) tarafından bildirilmiştir. Ayrıca F. imperialis ve F. persica türlerinde in vitro koşullarda soğan üretimi için olgunlaşmamış zigotik embriyo kullanılarak soğancık üretimi yapılmıştır (Gürlek 2011). Muscarinin (Arap sümbülü) soğan pulları, yaprakları ve çiçek kısımları eksplant olarak kullanılarak doku kültürü ile üretiminin kolaylıkla yapılacağı saptanmıştır (Zencirkıran vd. 2002). Nasırcılar vd. (2011) nin Muscari mirum türünde yaptıkları başka bir çalışmada soğan pul, skap, yaprak ve olgunlaşmamış embriyo 6

17 eksplantları farklı konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri (BAP, NAA, TDZ, Picloram, 2,4-D) ile desteklenmiş ve farklı besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Skap eksplantından yalnızca kallus oluşumu elde edilmiştir. Soğan pul yaprağı eksplantlarından embriyo eksplantlarına göre daha fazla soğancık elde edilmiştir. En yüksek soğancık oluşumu (eksplant başına adet) kültür başlangıcından 5 ay sonra, 4 pul yapraklı soğan eksplantlarından 4 mg/l BAP ve 0,25 mg/l NAA içeren MS ortamında elde edilmiştir. Arslan vd. (2003) in vitro hızlı çoğaltım için Sternbergia candida ve S. fischeriana türlerini öncelikle soğan pul yaprak eksplantları farklı oranlarda büyüme düzenleyicilerini içeren besin ortamlarında kültüre almışlardır. Soğancık oluşturan eksplant oranı (% 75.99) ve eksplant başına soğancık sayısı (3.30 adet) birlikte düşünüldüğünde en yüksek soğancık oluşumu S. candida türünde 4 mg/l BAP ve 0.50 mg/l KNA içeren besin ortamında 2 pul yapraklı soğan eksplantlarından elde edilmiştir. S. fischeriana da ise en yüksek soğancık oluşumu (% ve 2.59 adet) 2 mg/l BAP ve 0.50 mg/l KNA içeren ortamda yine 2 pul yapraklı eksplantlardan elde edildiği belirtilmiştir. Öte yandan, S. candida nın olgunlaşmamış zigotik embriyolarının 6 mg/l pikloram içeren besin ortamında kültüre alınmasıyla 1.5 yıl sonunda eksplant başına ortalama 80 adet soğancık üretimi sağlandığı bildirilmiştir. Mirici vd. (2005) nin Sternbergia fischeriana türünde olgunlaşmamış embriyo eksplantlarını farklı oranlarda büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarının denemelerini yapmışlar ve belirlemiş oldukları en iyi ortam olan 2mg/l BAP ve 0.5 mg/l NAA içeren MS besin ortamında kültüre almışlardır. Bu ortamda 3 haftada bir alt kültür yapılarak soğancıkların gelişmesi sağlanmıştır. Eksplant başına ortalama 80 adet soğancık üretimi sağlanmış ve kültür başlangıcından 6 ay sonra bol miktarda soğan elde edildiği bildirilmiştir. Hyacinthus bitkisinde çoğalma yeteneğini geliştirmek amacıyla değişik in vitro kültür sistemleri kullanılmıştır. Hyacinthus soğanlarının in vitro çoğaltılmasında bitki büyüme düzenleyicileri, eksplant kaynağı, bitkinin genotipi, sıcaklık, şeker içeriği vb. faktörlere bağlı olarak değişmektedir. Bununla birlikte Hyacinthus bitkisinde, soğan pullarının in vitro çoğaltımda en fazla kullanılan eksplant olduğu belirtilmiştir (Lee vd. 2007). Hippeastrum vittatum (şövalye yıldızı) türünde in vitro mikroçoğaltımda farklı elisitörler (metil jasmonat, spermine, kazein hidrolizat veya progesteron) uygulayarak soğan sayısı ve ağırlığındaki artış miktarlarının araştırıldığı bir çalışmada en yüksek çoğalma ve büyüme oranı 16 mg/l 2 ip+4 mg/l NAA içeren MS bazal ortamında tespit edilmiştir. Eksplant başına en yüksek soğancık sayısının (8.2 soğan/eksplant) 80 mg/l spermine içeren ortamda, en yüksek soğan taze ağırlığının (1.23 g/soğan) ise 4 mg/l MeJA içeren ortamda oluştuğu bildirilmiştir (Zayed vd. 2011). In vitro mikroçoğaltım yoluyla geliştirilen soğanlı bitkilerde alkaloid tayini çalışmaları Amaryllidaceae ve Liliaceae familyalarında in vitro mikroçoğaltım çalışmaları gerek bitki rejenerasyonuna gerekse soğan çapının büyütülmesine yöneliktir. Bu familyalara ait türlerde yapılan mikroçoğaltım çalışmalarının ışığında farklı doku kültürü teknikleri ile geliştirilen soğan ve çiçeklerin sahip olduğu bileşiklerin tayinine yönelik literatürler 7

18 mevcuttur. Fakat Liliaceae familyasına ait L. candidum türünde mikroçoğaltım çalışmalarının ardından sekonder bileşiklerin tayinine ya da bu bileşiklerin farklı büyüme düzenleyicileri, biyotik ve abiyotik elisitörler aracılığıyla artırılmasına yönelik bir çalışmaya rastlanmamıştır. In vitroda yetiştirilen soğanlı bitkilerden elde edilen ekstraktlardaki mevcut alkaloidlerin tayini ve bu alkaloidlerin miktarının çeşitli elisitörler aracılığıyla artırılması ile ilgili çalışmalar soğanlı bitkilerde en fazla oranda Amaryllidaceae familyasındaki Leucojum aestivum (Berkov vd. 2005; Pavlov vd. 2007; Bogdanova vd. 2009; Ivanov vd. 2011; Georgiev vd. 2012), Hippeastrum vittatum (Zayed vd. 2011) ve Pancratium maritimum L. (Georgiev vd. 2011; Bogdanova vd. 2014) türlerinde yapılmıştır. Bulgaristan da yapılan bir çalışmada Amaryllidaceae familyasına ait Leucojum aestivum (Göl soğanı) nın başlangıç materyali ve in vitroda çoğaltılan bitki materyalinin içermiş olduğu, antikolinesteraz aktivitesine sahip ve Alzheimer hastalığının tedavisinde kullanılan (Dal-Bianco vd. 1991; Marco ve Carreiras 2006; Bogdanova vd. 2009) galanthamine izomerleri ve N-formylnorgalanthamine alkaloidlerin miktarı GC-MS ile tayin edilmiştir. Berkov vd. (2005) nin çalışmasında başlangıç bitkisi için eksplant olarak in vivodan elde edilen tam çiçekli bir bitki ve in vitroda geliştirilen bitkilerden ise eksplant olarak tam bitki (soğan, yapraklar ve ovaryum) kullanılmıştır. In vitroda soğan eksplantları 2 mg/l BAP, 0.15 mg/l NAA, %3 sukroz, 6.5 g/l agarlı MS ortamında; sürgün yığınları ise sıvı MS ortamında 2 mg/l kinetin, 0.15 mg/l 2,4-D ve %3 sukroz içeriğinde yaklaşık +25 o C de ve 13 saat aydınlık/11 saat karanlık fotoperiyodunda kültüre alınmıştır. Çalışmanın sonucunda başlangıç bitkisinde 11 tip, in vitro kültürlerden 8 tip toplamda 14 tip alkaloid (galanthamine, lycorine, crinane ve türevleri) tanımlanmıştır (Berkov vd. 2005). Yine Bulgaristan da ticari öneme sahip Leucojum aestivum populasyonlarının bazı klonlarındaki galanthamine içeriğinin tayin edildiği bir çalışmada 27 doğal populasyondan 3500 adet birey toplanmıştır. In vitro klonlar için soğan eksplantlarında rejenerasyon yapılmıştır ve elde edilen soğanlarda ve yapraklarında iki temel alkaloid (galanthamine ve lycorine) tayini yapılmıştır. Farklı klonlarda 4 farklı tipte galanthamine (5.2, 4.45, 3.9 ve 5.9 mg/g) ve bir lycorine tipi tespit edildiği bildirilmiştir (Bogdanova vd. 2009). Geçici daldırma sisteminde Leucojum aestivum da sürgün kültürü ile galanthamine ve onunla ilişkili alkaloidlerin HPLC de tayinin yapıldığı bir çalışmada (Ivanov vd. 2011) lycorine ve galanthamine üretimleri üzerine daldırma frekansının etkisi araştırılmış ve 26 o C de 15 dk aralıklarla daldırılan ve 10 saat stabil durumda bekletilen kültürlerden en iyi sonuçlara rastlandığı bildirilmiştir. Göl soğanında (Leucojum aestivum) yapılan başka bir galanthamine miktarının tayini ise Georgiev vd. (2012) tarafından modifiye edilmiş baloncuk kolon biyoreaktörlerde sürgün kültüründen elde edilen sürgün hatlarının ekstrelerinde GC- MS kullanılarak yapılmıştır. Hücre içinde ve sıvı ortamda ki galanthamine miktarları ölçüldüğünde en fazla birikme 22 o C de 18 L akış hacminde 1,7 mg/l olarak tespit edilmiştir. Ptak vd. (2013) ise göl soğanında ki alkaloid birikimini somatik embriyogenezis yöntemi ile belirlemişlerdir. Embriyogenik kalluslara farklı oksin tipleri (2,4-D, picloram ve dicamba) ve konsantrasyonlarının (25 µm ve 50 µm) alkaloid birikimine etkisinin belirlendiği çalışmada in vivodan farklı olarak picloram tipi oksin 8

19 uygulanan soğanlarda iki alkaloid tipi (tazettine ve 11-hidroksivittatin) tespit edilmiştir. Lycorine tipi alkaloid ise in vivoda ve tüm uygulamalarda tespit edilmiştir. Amaryllidaceae familyasına ait Hippeastrum vittatum, insan hücre hatlarındaki sayıya karşı hücre büyümesini engelleyici aktivite gösterdiği bilinen montanine alkaloidi de dahil yaklaşık 15 farklı alkaloid türü içermektedir. Bu alkaloidler farmakolojik özelliklere sahiptir (Silva vd. 2006). H.vittatumun içerdiği bu alkaloidlerin mevcut miktarlarını artırmaya ve bitkinin oluşum ve gelişim özelliklerini artırmaya yönelik yapılan in vitro çalışmada farklı biyotik elisitörler (metil jasmonat, spermin, kazein hidrolizat ve progesteron) kullanılmıştır. Oluşan yaprak ve soğanların gelişim oranları belirlenmiştir. En yüksek taze soğan ağırlıkları sırasıyla; 4 mg/l MJ uygulamasında g, 40 mg/l spermin uygulamasında g, 2 mg/l kazein hidrolizat uygulamasında g ve 5 mg/l progesteron uygulamasında ise g şeklinde elde edilmiştir. 4mg/L MJ uygulanan 1,23 g taze ağırlığa sahip soğanlarda alkaloid tayini yapıldığında kontrol grubundan farklı olarak 16 tipte alkaloid (montanine, haemanthanine, lycorine, narciclasine ve galanthamine tipleri) saptandığı bildirilmiştir (Zayed vd. 2011). Pancratium maritimum da ise sıvı kültürde yetiştirilen sürgünlerdeki alkaloid profilini (Georgiev vd. 2011) incelenmiş ve direkt rejenerasyon ile kültüre alınan soğanlarda antiviral ve antitümör özellikleri iyi bilinen lycorine tipi alkaloidin biyosentezi (Bogdanova vd. 2014) yapılmıştır. 9

20 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmada kullanılacak materyal Balıkesir deki yerel soğan yetiştiriciliği yapan çiftçilerden temin edilmiştir. İlk önce soğanlarda yüzey sterilizasyonu uygulaması yapılmış, daha sonra pul yapraklar eksplant olarak kullanılarak, hızlı çoğaltım ve adventif soğan üretim çalışmaları başlatılmıştır (Khawar vd. 2005). 3.2 Yöntem Eksplant sterilizasyonu Balıkesir bölgesinde soğan üretimi yapan küçük üreticilerden temin edilen Akzambak soğanları 6 hafta boyunca kese kağıdına sarılı olarak ±4 o C de bekletilmiştir. Temin edilen L. candidum soğanları 2-3 damla ticari deterjan ile yıkandıktan sonra yaklaşık 3 saat boyunca akan çeşme suyu altında bırakılmıştır. Yıkanan soğanlar ilk önce %70 lik etil alkol içinde 10 sn süre ile tutulmuştur. Daha sonra steril kabin içinde %50 oranında seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisinde manyetik karıştırıcıda 10 dk süre ile steril edilmiştir. Son olarak 3 defa 5 er dakika süre ile otoklavlanmış distile sudan geçirilerek in vitro kültür ortamları için hazır hale getirilmiştir (Daneshvar vd. 2014) Besin ortamı ve kültür koşulları In vitro çalışmalarında besin ortamı olarak MS (Murashige ve Skoog 1962) (Çizelge 3.1) mineral tuzları ve vitaminlerini içeren ortamlar kullanılmıştır. Bu ortama % 3 sukroz katılarak ve ortam % 0.7 oranında bitki agarı ile katı hale getirilmiştir. Adventif ve aksiller soğan oluşumunu teşvik etmek için denemenin ihtiyacına göre ortama değişik oran ve kombinasyonlarda veya ayrı ayrı bitki büyüme düzenleyicileri (TDZ ve NAA) ilave edilmiştir. Bitki büyüme düzenleyicileri (TDZ ve NAA); NaOH, DMSO ya da %70 lik etanol gibi uygun çözücülerde çözülmüştür. Daha sonra saf su ile istenilen miktarda ve oranda stok solüsyonlar hazırlanarak ihtiyaçlarına uygun miktarlarda ilave edilmiştir. Besin ortamın ph sı, 1 N NaOH ya da HCl kullanılarak e ayarlanarak ve 121 C, 1,2 kg/cm 2 basınç altında 30 dk süreyle steril edilmiştir. Bütün kültürler 24±2 C de ve 16 saatlik aydınlık/8 saat karanlık fotoperiyod ile beyaz floresan ışık altında geliştirilmiştir. 10

21 Çizelge 3.1. MS ortamında bulunan besin bileşikleri ve konsantrasyonları (Murashige ve Skoog, 1962) Ortamda Bulunan Maddeler Konsantrasyonu (mg/l) Makro besin elementleri NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2.2H 2 O MgSO 4.7H 2 O KH 2 PO Mikro besin elementleri KI H 3 BO 3 MnSO 4.4H 2 O ZnSO 4.7H 2 O Na 2 MoO 4.2H 2 O CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O FeSO 4.7H 2 O Na 2 EDTA.2H 2 O Vitaminler Inositol Nicotinic Acid Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine L. candidum soğanlarının in vitro mikroçoğaltımı Doku kültürü tekniği Yüzey (eksplant) sterilizasyonundan sonra steril kabin içerisinde soğancıkların dış pul yaprakları çıkartılıp atıldıktan sonra eksplant olarak yaklaşık 1-2 cm çapında olacak şekilde hazırlanan sağlıklı ve genç pul yapraklar kullanılmıştır. Bu çalışmada öncelikli amaç bol miktarda in vitro soğancık oluşturmak olduğu için eksplantlar üç farklı konsantrasyondaki TDZ ve NAA kombinasyonunu içeren katı MS ortamlarına (0.2mg/l NAA ve 0.1, 0.4 ve 0.6 mg/l TDZ içeren MS ortamı) kültüre alınmıştır. Kültüre alınan eksplantlar 10 gün boyunca ±4 o C de bekletilmiştir. Soğuk uygulamasının ardından beyaz floresan ışığı altında 16 saat ışık ve 8 saatlik karanlık fotoperiyotta 24 C de 3 hafta süre inkübe edilmiştir. Başlangıçtan 21 gün sonra eksplant hacimleri artmış pul yapraklarının uç kısımlarında soğancıklar görülmüştür. Soğan sayısını artırmak amacı ile 21 gün sonra oluşan bu soğancıklar 0 MS katı besin ortamında alt kültüre alınmıştır. 4 hafta sonra sukroz konsantrasyonu 11

22 değiştirilerek yüksek konsantrasyonda sukroz içeren (50 g/l) 0 MS ortamlarına (bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen) alınmıştır. 28. günün sonunda 0 MS ortamında alt kültüre alınan soğancıklar 2 kısma ayrılmıştır. Bu aşamadan sonra her 4 haftada bir 3 kez örnek alımı yapılmıştır: Kültür ortamlarının 1. örnek alımı için 1/3 ü 0 MS ortamına, 2/3 ü ise 2. ve 3. örnek alımları için 50 g/l sukroz içeren 0 MS ortamına alınmıştır. 28 gün sonra 2. örnek alımı yapıldıktan sonra 3. örnek alımı için 50 g/l sukroz içeren 0 MS ortamına yeniden alınmıştır. 3 farklı zamanda toplanan soğancık örnekleri ekstraksiyon zamanına kadar -18 o C de muhafaza edilmiştir. Şekil 3.1. Eksplantların in vitro mikroçoğaltım aşamaları Alkaloid ektraksiyonu ve saflaştırılması In vitroda geliştirilen L.candidum kültürlerinden soğancık gelişimi teşvik edilmiştir. Soğancık gelişimi başladığı zamandan itibaren 3 farklı zamanda (1.ay, 2.ay ve 3.ay sonunda) örnek alımı yapılmıştır. Alınan örnekler üzerindeki besin ortamı uzaklaştırıldıktan sonra etiketlenerek -18 o C de ekstraksiyon işlemine kadar muhafaza edilmiştir. In vitro mikroçoğaltımı yapılan soğancıklardan alınan örnekler liyofilize edildikten sonra toz haline getirilmiştir. 150 mg toz soğancık örneği 24 saat boyunca 10 ml metanolde, oda koşullarında maserasyona bırakılmıştır. Ardından ultrasonik banyoda oda sıcaklığında 90 dk süresince sonikasyon uygulanmıştır. 20 dk boyunca (2540 x g) santrifüj edildikten sonra SPE (SCX 100mg/3 ml) kolon ile metanol ekstraksiyonu yapılmıştır. Kolonun filtre kartuşları filtrasyondan önce %1 lik formik asit içeren 3ml metanolden geçirilmiştir. Alkaloidler %5 lik amonyak içeren 2 ml metanol ile kartuşlu filtrede seyreltildikten sonra elde edilen örnekler 0.2 μm şırınga 12

23 filtreden geçirilerek 1μL örnek GC-MS analizleri için hazırlanmıştır(şekil 3.2, Şekil 3.3) (Ptak vd. 2013). 13

24 Şekil 3.2. GC-MS için ekstraksiyon aşamaları GC-MS de alkaloid profillerinin belirlenmesi Analizler QP2010-Shimadzu 5-Ms kolon (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm) ile yapılmıştır. Ekstraksiyon sonrasında elde edilen 1μL örnek enjekte edilmesi için QP2010- Shimadzu 30 dakika içinde 10 o C/dk artış ile sıcaklık 80 o C den 280 o C ye çıkarılarak ve 10 dk boyunca 280 o C de tutulmuştur. Enjeksiyon sıcaklığı 280 o C dir. Gaz akış hızı (helyum) 0.8 ml/dk ve seyreltme oranı 1:50 dir. Alkaloidlerin profili NIST veritabanının taranması ile oluşturulmuştur. Alkaloid profillerinin belirlenmesi GC-MS analizi sonucunda elde edilen verilerle daha önce L. candidum da yapılmış GC-MS analizinde belirlenen alkaloid profillerinin karşılaştırılması yoluyla yapılmıştır (Ptak vd. 2013). Şekil 3.3. GC-MS enjeksiyonu için hazırlanmış örnekler ve GC-MS 14

25 4. BULGULAR Lilium candidum un farklı besin ortamı ve örnek alım zamanına göre in vitro üretiminden elde edilen soğancıklarından GC-MS sonucunda ulaşılan kalitatif ve kantitatif çeşitlilik verileri Ekler kısmında gösterilmiştir. Soğancık örneklerinden in vitroda 3 farklı ortam ve 3 farklı örnek alım zamanında toplam 288 bileşik tespit edilmiştir. 9 uygulamada ve kontrolde ortak olarak 3 bileşik (Methyl palmitate; Methyl stearate ve Erucamide) tanımlanmıştır. Bunun yanında kontrol olarak tarladan alınan soğancık örneklerinde in vitro uygulamaları ile benzer 10 bileşik, toplamda 40 bileşik tespit edilmiştir (Ek-10). Örneklerin genel profilini bileşiklerin %50 sini karşılayan bileşikler oluşturmaktadır. 1. ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 1. örnek alımında %54 yüzde alanı ile tek başına Erucamide (Ek-1); 2. Örnek alımında %24.87 Erucamide, %6.35 Methyl palmitate, %6.24 Octadecanoic acid, methyl ester, % Hydroxy-3- (1,1-dimethylprop-2-enyl)coumarin ve % Octanol, 2-butyl- bileşikleri oluşturmuştur (Ek-4). Aynı ortamda 3. örnek alımında ise %36.21 Erucamide, %5.10 Methyl palmitate, %4.23 Octadecanoic acid, methyl ester, %3.36 N-(2- Methylbutylidene)isobutylami ve % alpha.-Androstan-12-one, cyclic ethylene mercaptole bileşikleri oluşturmuştur (Ek- 7). 2.ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 1. örnek alımında %35.31 Erucamide, %10.57 Pent-3-en-2-one, 4-methyl-, oxime, %3.74 Hexadecanoic acid, 1-(hydroxymethyl)-1,2-ethanediyl ester, %3.28 Methyl palmitate ve %2.85 Methyl stearate (Ek-2); 2. örnek alımında %24.28 Erucamide, %4.93 Spiro[4.5]dec-9-en-1- ol,1,6,6,10-tetramethyl-, 4-nitrobenzoate, %4.29 Deoxynivalenol, %2.93 Cyclopentene, trichloro-, %2.81 Cyclopentane-trans-1,2-dicarboxamide, %2.68 Hexanoic acid, 6-amino-, %2.63 Methyl palmitate, %2.55 Propenoic acid, 2- (bromomethyl)-, ethyl ester, %2.47 Phenyl-1-thio-.alpha.-d-glucofuranoside ve %2.33 1,6-Hexanediol bileşikleri oluşturmuştur (Ek-5). Aynı ortamda 3. örnek alımında ise yine tek başına Erucamide (%54.83) (Ek-8) oluşturmuştur. 3. ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 1. örnek alımında bileşiklerin %50 sini %21.33 Erucamide, %6.06 Methyl palmitate, %4.90 Methyl stearate, %4.77 Hexadecanoic acid, 1-(hydroxymethyl)-1,2-ethanediyl ester, %4.12 Acetylcarbromal, %3.16 N(5)-[[3,4-Dichlorophenyl]methylene]-2,4,5-pyrimidinetriamine, %2.37 N,N'- (2-METHYL-1,3-PHENYLENE)BIS(4-NITROBENZAMIDE), % methyl-1- tridecanol methanesulfonate ve % O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-14,15-epoxy-14,15- dihydro-13.beta.-hydroxymilbemycin D bileşikleri oluşturmuştur (Ek-3). 2. örnek alımında %34.98 Erucamide, %4.92 Octadecanoic acid, methyl ester, %4.66 Methyl palmitate, Dimethyl 2-ethylpentane-1,5-dioate, %2.34 cis-aconitic anhydride ve %2.43 2,6-Lutidine 3,5-dichloro-4-dodecylthio- bileşikleri (Ek-6) ve 3. örnek alımında ise %47.07 Erucamide ve %4.40 Ethenol,2-ethoxy-,acetate bileşikleri genel profilin %50 sini oluşturmuştur (Ek-9). Kontrol örneğinde genel profilin %50 sini %27.59 oranında Erucamide, %6.04 Tetrakis(2,3-ditert-butylphenyl)-4,4'-biphenylene diphosphonate, %5.94 Methyl stearate, %5.05 Methyl palmitate, %2.69 N1,N1-Dimethyl-N2-(1-15

26 adamantyl)formamidine, %2.14 Securinol B ve %2.01 1,3-Dioxolane, 4-ethyl-5-hexyl- 2,2-bis(trifluoromethyl)-, trans- bileşikleri oluşturmuştur (Ek-10) Örnek alım zamanının kimyasal bileşen verilerine ve alkaloid profiline etkisi Çalışmamızda üç farklı ortamda üç farklı örnek alım zamanında alınan kimyasal bileşen verileri birbirinden farklılık göstermiştir. 1. ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 3 farklı örnek alım zamanına ilişkin her 3 örnek alım zamanında ortak olarak Methyl stearate; Erucamide (13-Docosenamide, (Z)-) ve Tetradecane bileşikleri, 1. ve 2. örnek alım zamanında benzer Methyl palmitate bileşiği ve son olarak 2. ve 3. örnek alım zamanında benzer Caprolactam bileşiği saptanmıştır. 2. ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 3 farklı örnek alım zamanına ilişkin her 3 örnek alım zamanında ortak olarak Methyl palmitate; Methyl stearate; Erucamide bileşikleri bulunmuştur. 1. ve 3. örnek alım zamanında benzer Caprolactam ve 2- Monopalmitin bileşikleri saptanmıştır. 3. ortamda (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) ise 3 farklı örnek alım zamanına ilişkin her 3 örnek alım zamanında ortak olarak Methyl palmitate; Methyl stearate; Erucamide bileşikleri bulunmuştur. Bu bileşiklerin içinde tüm uygulamalarda (%) yüzde olarak en büyük alana sahip bileşik Erucamide bileşiğidir. Erucamide yani erusik asit bir yağ asididir Kültür ortamının kimyasal bileşen verilerine ve alkaloid profiline etkisi 1.örnek alımına ilişkin GC-MS de tanımlanan kimyasal bileşenler (Ek-1, 4 ve 7) incelendiğinde 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ve 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ içeren 1. ve 2. besin ortamlarında benzer olarak Pent-3-en-2-one, 4-methyl-, oxime; 1,3- DIPHENYL-1,3,5,5-TETRAMETHYL-CYCLOTRSILOXANE; Methyl palmitate; Methyl stearate; 4H-1,3,4-Triazol-3-amine,N-dimethylaminomethylene- ve Erucamide bileşikleri bulunmuştur. 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ve 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ içeren 2. ve 3. besin ortamlarında benzer olarak Methyl palmitate; Methyl stearate; Erucamide; Trichloroacetic acid,undecyl ester (C 13 H 23 Cl 3 O 2 ) ve Oxiranecarboxamide, Oxanamide (C 9 H 9 NO 2 ) bileşikleri bulunmuştur. Her üç ortamda da ortak olarak Methyl palmitate; Methyl stearate ve Erucamide bileşikleri bulunmuştur. 2.örnek alımına ilişkin GC-MS de tanımlanan kimyasal bileşenler (Ek-2, 5 ve 8) incelendiğinde her üç ortamda bulunan ortak bileşikler Methyl palmitate; Methyl stearate ve Erucamide olarak belirlenmiştir. 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ve 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ içeren 1. ve 3. besin ortamlarında benzer olarak Methyl palmitate; Methyl stearate ve Erucamide bileşiklerinin yanında ek olarak 2- NONADECANONE 2,4-D.N.P.H. bileşiği de saptanmıştır. 3. örnek alımına ilişkin GC-MS de tanımlanan kimyasal bileşenler (Ek-3, 6 ve 9) incelendiğinde her üç ortamda bulunan ortak bileşikler Tetradecane; Methyl palmitate; Methyl stearate; 2-Monopalmitin; Erucamide ve Caprolactam olarak belirlenmiştir. 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ve 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ içeren 2. ve 3. besin ortamlarında benzer olarak Tetradecane; Methyl palmitate; Methyl stearate; 2-Monopalmitin; Erucamide ve Caprolactam bileşiklerinin yanında Octadecane, 1,1'-[1,3-propanediylbis(oxy)]bis-; Methyl linoleate ve 2-Furancarboxylic acid, octadec-9-enyl ester bileşikleri de saptanmıştır. 16

27 Tarladan alınan Kontrol soğancıklardaki ekstraktın kimyasal bileşenleri daha çok 3. örnek alımındaki uygulamalar ile benzerlik göstermektedir. En fazla benzerlik gösteren uygulama grubu ise 3. örnek alımındaki 2. ortamdan (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) elde edilmiştir (Ek-6 ve 10). 4.3 Alkaloidler (Azotlu bileşikler) Tüm in vitro uygulamalarda ve kontrol örneğinde ki esktraktlardan elde edilen GC-MS analizinde % yüzde alanı en yüksek bulunan bileşik Erucamide olarak belirlenmiştir (Ek-1 ve 10 arası). Çizelge 4.1 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri Örnek alımı Bileşiğin adı Yüzde alan (%) 1.örnek alımı 0.67 Quinoline-8-carbonitrile, fluorophenoxy)- 3-[(Cyclohexyl-methyl-amino)-methyl]-3Hbenzooxazol-2-one 2-trifluoromethyl-4-( Isoxazolecarboperoxoic acid, 4,5-dihydro-5-phenyl-, 1,1-dimethylethyl ester H-1,3,4-Triazol-3-amine, N-dimethylaminomethylene Haloxazolam 1.06 Butanoic acid, 4-(4-amino-6-hydroxy-5- pyrimidinylamino)-4-oxo ,4(1H,3H)-Pyrimidinedione, 5-nitro örnek alımı Ethyl 1-Hexyl-4-Hydroxy-2(1h)-Oxo-3- Quınolınecarboxylate 2.58 Pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione, 3-(2- hydroxybenzylidenamino)-6-methyl- 1,24 Furan-2-carboxylic acid [1-(5-ethylsulfanyl- [1,3,4]thiadiazol-2-ylamino)-2,2,2-trifluoro-1-trifluor 1,36 3.örnek alımı 1H-Pyrazole-3-carboxylic acid, 4-nitro- 1,05 17

28 1. besin ortamında azotlu bileşikler 1., 2. ve 3. örnek alımında sırasıyla profilin %5.25, %5.18 ve %1.05 ini oluşturmaktadır. Bu ortamda yüzde olarak en yüksek azotlu bileşik ise %2.58 ile Ethyl 1-Hexyl-4-Hydroxy-2(1h)-Oxo-3-Quınolınecarboxylate bileşiğidir (Çizelge 4.1, Şekil 4.1). a) b) c) d) e) Şekil 4.1 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 3.bileşik, c. 4.bileşik, d. 5.bileşik, e. 7.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre) a) b) Şekil 4.2 In vitroda 1. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 2. örnek alımında belirlenen azotlu bileşik (a. 2.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre) ve 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (b. 1.bileşik) (Çizelge 4.1 e göre) 18

29 Çizelge 4.2 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri Örnek alımı Bileşiğin adı Yüzde alan (%) 1.Örnek alımı 4-Bromo-N-(piperidinomethyl)phthalimide 0,95 1-(4-Acetamidoanilino)-3,7- dimethylbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyridine-4- carbonitrile 0,88 Ethanone, piperazinylsulfonyl]phenyl]- 0,93 5-Aminoisoxazole 1,21 2.örnek alımı 1-[4-[4-(2-hydroxyethyl)-1-1-[2-Deoxy-.beta.-d-erythro-pentofuranosyl]pyrrole- 2,4-bishydroxamidine örnek alımı 1H-Pyrrole, 2,5-dihydro-1-nitroso- 5,77 4-Pyrimidinol, 5-(aminomethyl)-2-methyl-, 0,60 Piperidine, 3-methyl- 1,05 2. besin ortamında azotlu bileşikler 1., 2. ve 3. örnek alımında sırasıyla profilin %3.97, %1.42 ve %7.42 sini oluşturmaktadır. Bu ortamda ki 1H-Pyrrole, 2,5-dihydro- 1-nitroso- (C 4 H 6 N 2 O) in vitro ve kontrol uygulamalarındaki en yüksek yüzde alana (%5.57) sahip azotlu bileşiktir (Çizelge 4.2). a) b) 19

30 c) d) Şekil 4.3 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik ve d. 4.bileşik) (Çizelge 4.2 ye göre). a) b) c) Şekil 4.4 In vitroda 2. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik ve c. 3.bileşik) (Çizelge 4.2 ye göre). Çizelge 4.3 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1., 2. ve 3. örnek alımlarında belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri Örnek alımı Bileşiğin adı Yüzde alan (%) 1.örnek alımı 2-t-Butyl-7,7-dimethyltetrahydropyrano[2,3-d]oxazole- 3,5-dicarboxylic acid, dimethyl ester 1,83 N(5)-[[3,4-Dichlorophenyl]methylene]-2,4,5- pyrimidinetriamine 3,16 3-Chloro-6-[[2-[cyclohexylamino]ethyl]thio]pyridazine 1,34 2.örnek 3-(1-Methyl-2,5-dioxo-4-pyrrolidinyl)-7-methyl-3,7-1,13 20

31 alımı diaza-4 oxabicyclo[3.3.0]octane-6,8-dione-2-sp Piperidine N-ethyl-4-[1-aminoethyl]- 1,40 3-(3,5-Dimethyl-4-nitro-pyrazol-1-yl)-4H-[1,2,4]triazole 1,08 Isoxazole (CAS) 1-Oxa-2-azacyclopentadiene 1,80 2-[2-Aminothiazol-4-yl]-2-hydroxyiminoacetic acid 1,58 Imidazolo[4,5-d]imidazole-2,5(1H,3H)-dione, tetrahydro-1-ethyl- 1,40 3.örnek alımı 2,5-Pyrrolidinedione, 3-methyl- 1,35 Carbonothioic acid, O-(6-chloro-3-phenyl-4- pyridazinyl) S-octyl ester 0,95 Oxamide, imidazolyl)propyl]- N-(4-butoxyphenyl)-N'-[3-(1-1,56 3. besin ortamında azotlu bileşikler 1., 2. ve 3. örnek alımında sırasıyla profilin %6.33, %8.39 ve % 3.86 sını oluşturmaktadır. Çalışmada in vitro denemelerde en yüksek azotlu bileşik yüzdesine sahip uygulama 3. ortamdaki (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) 2. örnek alımında bulunmuştur (Çizelge 4.3). Bu ortamda yüzde olarak en yüksek (%3.16) azotlu bileşik ise N(5)-[[3,4-Dichlorophenyl]methylene]-2,4,5- pyrimidinetriamine (C 4 H 7 N 5 ) bileşiğidir. a) b) c) Şekil 4.5 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 1. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre) 21

32 a) b) c) d) Şekil 4.6 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 2. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 2.bileşik, b. 4.bileşik, c. 5.bileşik ve d. 6.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre) a) b) c) Şekil 4.7 In vitroda 3. besin ortamı (0.2 mg/l NAA mg/l TDZ) denemesinde 3. örnek alımında belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik) (Çizelge 4.3 e göre) 22

33 Çizelge 4.4 Kontrol örneğinde belirlenen azotlu bileşikler ve bulunma yüzdeleri Bileşiğin adı Yüzde alan (%) Piperidine, 3-methyl- 1,73 4(1H)-Pyrimidinone, 2-(methylthio)- 1,33 2-Methyl-8-nitroisoxazolizidine 1,40 (S)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-2-(hydroxymethyl)pyrrolidine 1,43 6-Amino-5-cyano-4-(5-cyano-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl)-2-methyl- 4H-pyran-3-carboxylic acid ethyl 1,81 4-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazoline[3-N]-1-oxyl 1,35 Propanoic acid, 2,2-dimethyl-, [3-(acetyloxy)-2,3,3a,9a-tetrahydro-6- oxo-6h-furo[2',3':4,5]oxazolo[ 1,23 2,2'-(1,4-Piperazinediyl)bis[N-(4-methoxyphenyl)succinimide] 1,63 Propanamide, 3-(2-ethylpiperid-1yl)-N-(3-chlorophenyl) Bu çalışmada kontrol örneğinde in vitrodan farklı 8 ve benzer 1 azotlu bileşiğe rastlanmıştır ve bu bileşikler örneğin genel profilinin %13.11 ini oluşturmaktadır. Piperidine, 3-methyl- (C8H14N2O3) bileşiği 0.2 mg/l NAA mg/l TDZ ortamının 3. örnek alımından elde edilen azotlu bileşik ile benzer bulunmuş ve örneğinin yüzde alanının in vitro denemesine (%1.05) (Çizelge 4.2) göre daha yüksek oranda (%1.73) olduğu görülmüştür (Çizelge 4.4). Kontrol örneğinde en yüksek yüzde alana sahip azotlu bileşik ise 6-Amino-5-cyano-4-(5-cyano-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl)-2-methyl- 4H-pyran-3-carboxylic acid ethyl (C 17 H 18 N 4 O 3 ) bileşiğidir. 23

34 a) b) c) d) e) f) g) h) Şekil 4.8 Kontrol örneğinde belirlenen azotlu bileşiklerin açık formülleri (halka yapıları) (a. 1.bileşik, b. 2.bileşik, c. 3.bileşik, d. 4.bileşik ve e. 5.bileşik, f. 6.bileşik, g. 7.bileşik ve h. 8.bileşik) (Çizelge 4.4 e göre) 24