B YOTEKNOLOJ ANAB L M DALI

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ YÜKSEK L SANS TEZ Serkan AKCAN KAMAN CEV ZLER NDE APOM KS S OLASILI ININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARA TIRILMASI B YOTEKNOLOJ ANAB L M DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ KAMAN CEV ZLER NDE APOM KS S OLASILI ININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARA TIRILMASI Serkan AKCAN YÜKSEK L SANS TEZ B YOTEKNOLOJ ANAB L M DALI Bu tez 15/11/2007 Tarihinde A a ıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirli i le Kabul Edilmi tir. mza mza mza.. Prof. Dr. Salih KAFKAS Prof.Dr. Nurgül TÜREM Doç.Dr. Hakan ÖZKAN DANI MAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında Hazırlanmı tır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalı ma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Ara tırma Projeleri Birimi (Proje No:ZF2006YL25) ve TÜB TAK-TOVAG (Proje No: 104O139) Tarafından Desteklenmi tir. NOT:Bu tezde kullanılan özgün ve ba ka kaynaktan yapılan bildirilerin, ekil ve foto rafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir

3 ÖZ YÜKSEK L SANS TEZ KAMAN CEV ZLER NDE APOM KS S OLASILI ININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARA TIRILMASI Serkan AKCAN ÇUKUROVA ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ B YOTEKNOLOJ ANAB L M DALI Danı man : Prof. Dr. Salih KAFKAS Yıl : 2007, Sayfa: 76 Jüri : Prof. Dr. Salih KAFKAS Prof.Dr. Nurgül TÜREM Doç.Dr. Hakan ÖZKAN Bu çalı ma Kaman cevizlerinde apomiksis olasılı ını moleküler markörleri kullanarak ortaya çıkarmayı amaçlamı tır. Çalı manın materyalini apomiktik olarak ceviz fidanı üretimi yapan iki farklı fidan üreticisinden alınan Kaman-1 ve Kaman-5 genotiplerine ait 40 adet bitki ile apomiktik oldu u belirtilen fidanlarla önceden kurulmu ve kısmen meyve vermeye ba lamı 20 a aç ve orijinal Kaman-1 ve Kaman-5 genotipleri olu turmu tur. Böylece projede toplam 62 genotip kullanılmı tır. Ara tırmada moleküler markör yöntemlerinden ISSR ve SRAP teknikleri kullanılmı tır. ISSR yönteminde 15 adet polimorfik primer kullanılmı tır. SRAP tekni i ise cevizde ilk defa bu çalı mada kullanılmı olup taranan 120 primer kombinasyonu arasından seçilen 10 primer kombinasyonu bu çalı mada kullanılmı tır. Uygulanan 10 adet SRAP primeri toplam 185 adet bant üretmi olup, bunun 100 adedinin polimorfik oldu u belirlenmi tir. ISSR analizlerinde 15 adet primer 200 adet bant vermi olup, bunların 122 adedinin polimorfik oldu u belirlenmi tir. Tüm Kaman1 ve Kaman-5 genotipleri arasındaki genetik benzerlik indeksleri 0.60 ile 0.93 arasında de i mi tir Böylece a ısız olarak ve apomiktik oldu u iddia edilerek satılan ceviz fidanlarının apomiktik olmadıkları sonucu ortaya çıkmı tır. ISSR yönteminin SRAP tekni ine göre birbirine yakın ceviz genotiplerini daha iyi ayırdı ı belirlenmi tir. Ayrıca ISSR ile SRAP genetik benzerlik katsayıları arasındaki korelasyon dü ük (0.22) bulunmu tur. Anahtar Kelimeler: Ceviz, SRAP, ISSR, Genetik çe itlilik, Juglans regia. I

4 ABSTRACT MSc THESIS DETERMINATION OF APOMIXIS POSSIBILTY IN KAMAN WALNUT GENOTYPES Serkan AKCAN DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF BASIC AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisior : Prof. Dr. Salih KAFKAS Year : 2007, page: 76 Jury : Prof. Dr. Salih KAFKAS Prof. Dr. Nurgül TÜREM Assoc. Prof. Hakan ÖZKAN It is aimed to expose possibility of apomixis in Kaman walnut genotypes by molekuler markers in this research. The plant materials in this study were 40 Kaman- 1 and Kaman-5 seedlings obtained from two nurserymen who produce them as a apomictic and 20 trees planted prevously as a apomictic that have partial nut production and orijinal Kaman-1 and Kaman-5 genotypes. Finally, 62 walnut plants were used in this project. SRAP and ISSR molekuler marker techniques were used in this study. Usage of SRAP marker was the first time in walnut and 10 primers produced totally 185 bands and 100 of them were polymorphic.while 15 ISSR primers amplified 200 bands and 122 of them were polymorphic. Genetic similarity coefficents among all Kaman-1 and Kaman-5 individuals changed between 0,60 and 0,93. As a result, this study demonstrated that non-grafted walnut seedlings sold as a apomictic in Kaman are not apomixis. In addition, ISSR markers differentiated walnut seedlings better than SRAP ones. Furthermore, the correlation between ISSR and SRAP genetic similarity matrices was foud very low (0,22). Key Words : Walnut, SRAP, ISSR, Genetic diversity, Juglans regia. II

5 TE EKKÜR Öncelikle bana bu konuyu veren, ara tırmaya yönlendiren ve bugüne kadar yapmı oldu umuz çalı malarda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, Yüksek Lisans a ba ladı ım günden itibaren çalı malarıma önder olan çok de erli danı man hocam Sayın Prof. Dr. Salih KAFKAS a yürekten te ekkürü borç bilirim. Tezin yürütülmesi a amasında bilgisini ve deste ini hiçbir zaman esirgemeyen Çukurova Üniversitesi Tarla Bitkileri Bölümü ö retim üyesi de erli hocam Doç. Dr. Hakan ÖZKAN a, tezimin laboratuvar çalı malarının yürütülmesinde maddi destek sa layan TÜB TAK-TOVAG grubuna ve Çukurova Üniversitesi Bilimsel Ara tırma Projeleri Birimine, Laboratuvar çalı maları sırasında deste ini esirgemeyen de erli arkada ım Zir. Yük. Müh. Yıldız DO AN a, çok te ekkür ederim. Bugüne kadar her zaman yanımda olan ve çalı malarım sırasında maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen çok de erli aileme (Mahmut AKCAN, Zeynep AKCAN ve Haluk AKCAN) yürekten sonsuz te ekkürlerimi sunarım. III

6 Ç NDEK LER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TE EKKÜR III Ç NDEK LER... IV Ç ZELGELER D Z N. VI EK LLER D Z N... X S MGELER ve KISALTMALAR XII 1. G R L TERATÜR ÖZET SRAP ve ISSR Markörleri le lgili Çalı malar Cevizlerde Moleküler Markör Teknikleri ile Yapılan Çalı malar Apomiksis Kavramı Ve Cevizde Apomiksis Konusunda Yapılan Çalı malar Apomiksis Cevizde Apomiksis le lgili Çalı malar Di er bitki türlerinde apomiksisin belirlenmesi ile ilgili çalı malar MATERYAL ve METOT Materyal Yöntem Yaprak örneklerinin toplanması DNA izolasyonu DNA Konsantrasyonunun Belirlenmesi ISSR analizleri SRAP analizleri Primerlerin Polimorfizm Oranlarının ve Bilgi çeriklerinin Belirlenmesi Primerlerin Ayırma Güçlerinin Belirlenmesi Ceviz Genotipleri Arasındaki Genetik li kilerin 22 IV

7 Belirlenmesi BULGULAR ve TARTI MA Cevizlerde Apomiksisin Ticari Olarak Üretimi Yapılan Fidanlarda Belirlenmesi Kaman Kaman Cevizlerde Apomiksisin Tohumdan Çıkmı ve Meyve Vermeye Ba lamı A açlarda Belirlenmesi Kaman Kaman ISSR ve SRAP Yöntemlerinin Polimorfizm ve Ayırma Gücü Bakımından Kar ıla tırılması ISSR ve SRAP Yöntemlerinden Elde Edilen Benzerlik ndeksleri Arasındaki Korelasyon Apomiksisin Belirlenmesi le lgili Moleküler Çalı maların Genel De erlendirmesi SONUÇ ve ÖNER LER. 66 KAYNAKLAR ÖZGEÇM 76 V

8 Ç ZELGELER D Z N SAYFA Çizelge 1.1 Dünya da önemli ceviz üreticisi ülkelerin üretim de erleri 1 Çizelge 3.1 Denemede kullanılan fidan üreticilerinden alınan ceviz çö ürlerinin listesi.. 14 Çizelge 3.2 Tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı a açların listesi. 15 Çizelge 3.3 Çalı mada kullanılan ISSR primerlerinin baz dizilimleri, baz sayıları ve ceviz DNA sına PCR da yapı ma sıcaklıkları 18 Çizelge 3.4 Çalı ma kapsamında kullanılan SRAP ileri primerleri 19 Çizelge 3.5 Çalı ma kapsamında kullanılan SRAP geri primerleri 20 Çizelge 4.1 ISSR primerlerinin FidancıA dan alınan Kaman-1 (FÜA-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri Çizelge 4.2 ISSR primerlerinin FidancıB den alınan Kaman-1 (FÜB-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri Çizelge 4.3 SRAP primer çiftlerinin Fidancı A dan alınan Kaman-1 (FÜA-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri 27 Çizelge 4.4 SRAP primer çiftlerinin FidancıB den alınan Kaman-1 (FÜB- K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri VI

9 Çizelge 4.5 Fidancı A dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.6 Fidancı A dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 29 Çizelge 4.7 Fidancı A dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 30 Çizelge 4.8 FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.9 FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.10 FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 33 Çizelge 4.11 ISSR primerlerinin FidancıA dan alınan Kaman-5 (FÜA-K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri 37 Çizelge 4.12 ISSR primerlerinin FidancıB den alınan Kaman-5 (FÜB-K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri Çizelge 4.13 SRAP primer çiftlerinin FidancıA dan alınan Kaman-5 (FÜA- K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), 39 VII

10 polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri... Çizelge 4.14 SRAP primer çiftlerinin FidancıB den alınan Kaman-5 (FÜB- K5) çö ürlerinin PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri Çizelge 4.15 Fidancı A dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.16 Fidancı A dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 41 Çizelge 4.17 Fidancı A dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 42 Çizelge 4.18 Fidancı B den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.19 Fidancı B den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 46 Çizelge 4.20 Fidancı B den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 47 Çizelge 4.21 ISSR primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-1 (Tohum-K1) a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri 50 Çizelge 4.22 SRAP primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-1 (Tohum-K1) 51 VIII

11 a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri Çizelge 4.23 Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri.. 52 Çizelge 4.24 Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 52 Çizelge 4.25 Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri.. 52 Çizelge 4.26 ISSR primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-5 (Tohum-K5) a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri 57 Çizelge 4.27 SRAP primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-5 (Tohum-K5) a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri 58 Çizelge 4.28 Verime ba lamı Kaman-5 a açlarında ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.29 Verime ba lamı Kaman-5 a açlarında SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri 59 Çizelge 4.30 Verime ba lamı Kaman-5 a açlarında ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan 59 IX

12 genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.31 ISSR ve SRAP primerlerinden elde edilen toplam bant sayıları (TBS), primer ba ına dü en toplam bant sayısı (PBDTBS), polimorfik bant sayıları (PBS), primer ba ına dü en polimorfik bant sayısı (PBDPBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri. 62 Çizelge 4.32 ISSR ve SRAP yöntemlerinden elde edilen genetik benzerlikler arasında yapılan Mantel kofenetik korelasyon testi sonuçları.. 63 Çizelge 4.33 Kaman-1 ve Kaman-5 genotiplerinde apomiksisin belirlenmesi ile ilgili yapılan moleküler çalı maların genel özeti Çizelge 4.34 Apomiksisin belirlenmesi ile ilgili yapılan moleküler çalı malar kapsamında ISSR ve SRAP yöntemlerinin kar ıla tırılması. 65 X

13 EK LER D Z N SAYFA ekil 3.1 Size marker olarak kullanılan, DNA nın EcoRI ve HindIII kesim enzimleri ile hazırlanmı olan DNA sı 19 ekil 3.2 Me1-Em9, Me1-Em10, Me2-Em3, Me2-Em4 SRAP primerlerinin taramada kullanılan 6 Kaman cevizi genotipindeki amplifikasyonu.. 20 ekil Kaman-1 ceviz genotipinde ISSR 12.sıra ve UBC 853 no lu ISSR primerinin amplifikasyon ürünleri.. 23 ekil 4.2 FidancıA ve FidancıB den alınan Kaman-1 ceviz çögürlerinde SRAP Me3-Em9 primer çiftinin amplifikasyon ürünleri.. 24 ekil 4.3 A fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 30 ekil 4.4 A fidan üreticisinden alınan çö ürlere SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 31 ekil 4.5 A fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR ve SRAP tekniklerinden elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 31 ekil 4.6 B fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 32 ekil 4.7 B fidan üreticisinden alınan çö ürlere SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 34 ekil 4.8 B fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR ve SRAP tekniklerden elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı ekil FidancıA ve Fidancı B den alınan Kaman-5 çö ürleri ile Kaman-5 ceviz genotipinde UBC 814 no lu ISSR primerinin amplifikasyonu. 36 ekil 4.10 FidancıA ve FidancıB den alınan Kaman-5 çö ürleri ile Kaman-5 ceviz genotipinde SRAP Me2-Em4 primer çiftinin amplifikasyonu. 36 XI

14 ekil 4.11 A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 42 ekil 4.12 A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 43 ekil 4.13 A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine uygulanan ISSR ve SRAP teknikleri sonuçlarının birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı 44 ekil 4.14 B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı ekil 4.15 B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 45 ekil 4.16 B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR ve SRAP tekniklerinin sonuçlarının birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı ekil 4.17 Tohumdan çıkmı ceviz genotiplerinde UBC 853 no lu ISSR primerinin amplifikasyon ürünleri. 48 ekil 4.18 Tohumdan çıkmı Kaman-1 ceviz genotiplerinde SRAP Me3- Em1 primer çiftinin amplifikasyonu.. 49 ekil 4.19 Tohumdan çıkmı a açlara ISSR tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 53 ekil 4.20 Tohumdan elde edilmi a açlara SRAP tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı ekil 4.21 Tohumdan elde edilmi a açlara ISSR ve SRAP tekniklerinin birlikte uygulanması ve elde edilen verilerin birlikte 54 XII

15 de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı ekil 4.22 Tohumdan çıkmı Kaman-5 ceviz genotiplerinde UBC 826 no lu ISSR primerinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi.. 55 ekil 4.23 Tohumdan çıkmı Kaman-5 ceviz genotiplerinde SRAP Me2- Em4 primer çiftinin amplifikasyonu. 56 ekil 4.24 Tohumda elde edilmi çö ür a açlarına ISSR tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 60 ekil 4.25 Tohumdan elde edilmi çö ür a açlarına SRAP tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı.. 60 ekil 4.26 Tohumdan elde edilmi çö ür a açlarına ISSR ve SRAP tekniklerinin birlikte uygulanması ve elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analiziyle elde edilen soya acı.. 61 XIII

16 S MGELER ve KISALTMALAR AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism AG : Ayırma Gücü bç : Baz Çifti CTAB : Setil Trimetil Amonyum Bromit dk : Dakika datp : Deoksi Adenozin Trifosfat dctp : Deoksi Sitidin Trifosfat dgtp : Deoksi Guanozin Trifosfat dttp : Deoksi Timidin Trifosfat DNA : Deoksiribonükleik Asit EDTA : Etilendiamin Tetraasetikasit EST : Esteraz HCl : Hidroklorik Asit ISSR : Inter Simple Sequence Repeat M : Molar MA : Moleküler A ırlık MDH : Malat Dehidrogenaz MgCl2 : Magnezyum Klorür ml : Mililitre mm : Milimolar NaCl : Sodyum Klorür Na2S2O5 : Sodyum Metabisülfit ng : Nanogram PB : Polimorfizm Bilgi çeri i PBS : Polimorfik Bant Sayısı PBDTBS : Primer Ba ına Dü en Toplam Bant Sayısı PBDPBS : Primer Ba ına Dü en Polimorfik Bant Sayısı PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PGM : Fosfoglukomutaz XIV

17 PO : Polimorfizm Oranı PRO : Peroksidaz PVP : Polivinilpirolidon QTL : Kantitatif Özellik Lokusu RAPD : Randomly Amplified Polymorphic Dna RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism rpm : Revolutions Per Minute SAMPL : Selective Amplification Of Microsatellite Polymorpic Loci SRAP : Sequence Related Amplified Polymorphism SSR : Simple Sequence Repeat Taq : Thermus Aquaticus TBE : Tris/Borat/EDTA (Tampon Çözeltisi) TBS : Toplam Bant Sayısı Tris : Tris (Hidroksil Metil) Aminometan Tris-HCl : Tris Hidroklorür UPGMA : Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Average UBC : University Of British Columbia UV : Ultraviolet µm : Mikromolar µl : Mikrolitre DNA : Lamda Deoksiribonükleik Asit XV

18 1. G R Serkan AKCAN 1. G R Dicotiledoneae sınıfı, Juglandales takımı, Juglandaceae familyası, Juglans cinsinden olan cevizin; en çok J. regia türünün ticareti ve kültürü yapılmaktadır (Manning, 1978). J. Regia türü, en (1986) e göre Karpat da larından güneyden itibaren Do u Avrupa ve Türkiye, Irak, ran ın do usundan ve Himalaya da larının ötesinde kalan ülkeleri içeren geni bir alanın tabii bitkisidir. Vavilov, cevizin orijin merkezlerinin Orta Asya ve Yakın Do u oldu unu bildirmi tir. Ceviz üretiminde Türkiye, dünyada önemli bir konumdadır. Ülkemizin hemen hemen her bölgesinde ceviz yeti tiricili i yapılmaktadır yılı istatistiklerine göre, dünyada önemli ceviz üreticisi olan ülkeler arasında sırayla Çin ( ton), ABD ( ton), ran ( ton), Türkiye ( ton) ve Ukrayna ( ton) gelmektedir (Faostat, 2005). Çizelge 1.1. Dünya da önemli ceviz üreticisi ülkelerin üretim de erleri (Faostat, 2005). SIRA ÜLKELER ÜRET M (ton) % 1 Çin ABD ran TÜRK YE Ukrayna Hindistan Di er DÜNYA Cevizin gen merkezleri arasında olan Türkiye, ceviz varlı ı ile dünyada ilk sırada olmasına ra men, üretim ve ihracatta maalesef istenilen yerde de ildir. Ancak son on yılda ülkemizde ceviz yeti tiricili inde olumlu geli meler ya anmaktadır. Son yıllarda a ılı ceviz üretiminin fidancılık içinde karlı üretim kolu haline gelmesi yüzlerce ki iyi a ılı ceviz fidanı üretimine te vik etmi tir (Akça, 2005) yılı verilerine göre ülkemiz ceviz yeti tiricili inde kg/ha verim söz konusu iken ABD de kg/ha, ran da ise kg/ha verim alındı ı belirtilmektedir (Akça, 2005). Ülkemiz ceviz yeti tiricili inde verimin dü ük olmasının nedenleri arasında, kapama plantasyonların olmaması, ekolojik ko ullara uyan çe it seçiminin 1

19 1. G R Serkan AKCAN yapılmaması, hastalık ve zararlılarla mücadelenin yapılmaması, gübreleme ve budama gibi teknik uygulamaların tamamen ihmal edilmesi sayılabilir. Cevizler monoik bitki özelli ine sahiptir, yani erkek ve di i çiçek salkımları aynı a aç üzerinde fakat farklı yerlerde bulunur. Bir önceki geli me döneminin sürgünleri üzerinde bulunan yan tomurcukların geli mesiyle arası erkek çiçek içeren püsküller (kedicik) olu urken, o yılki geli me dönemine ait ilkbahar sürgünlerinin ucunda ise sayıları 1-12 arası de i en di i çiçekler olu ur ( en, 1986). Türkiye de ço u tohumdan çıkmı, 4 milyon civarında ceviz a acı bulunmaktadır. Çok fazla genetik açılım meydana geldi i için her bir ceviz a acı ayrı bir genotip durumundadır. Islah açısından bakıldı ında bu durum çok önemli olsa da, ihracatta bir yeknesaklık sa lama bakımından dezavantajdır. Bu ekilde ülkemizin dı pazarda rekabet ansı bulunmamaktadır (Akça, 2005). Türkiye nin dünya ceviz ihracatında rekabet edecek güce gelmesinin tek yolu standart çe itlerle kapama bahçeler kurmaktır. Ülkemiz ekolojik ko ullarının bir çok tip ve çe idimizin iç ceviz olarak tüketilmeye elveri li olması iç ceviz ihracatında ülkemize kolaylıklar sa layacaktır. Gerek iç ceviz gerekse dı ceviz satımında Türkiye nin en önemli sorunu standart çe itlerle üretimin yapılmamasıdır. Bir çuval dolusu meyvelerin dahi birbirinden farklı olması, hatta 1 kg iç cevizde bile çok farklı tipte iç ceviz bulunması ülkemiz ceviz ihracatının önünü kapamaktadır (Akça, 2005). Ceviz çe itleri ans çö ürlerinden veya ıslah programlarından meydana gelmi tir. Islahçılar için bu çe itlerin tanımlanması oldukça önemlidir. Ancak genetik çe itlili i belirlemek için kullanılan morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal yöntemler çevresel faktörlerden etkilenmekte ve oldukça zaman almaktadır. DNA markör tekniklerinin geli tirilmesiyle farklı ekolojilerdeki genetik materyaller karakterize edilebilmektedir. Günümüzde RAPD, SSR, ISSR, AFLP ve SRAP gibi moleküler markör teknikleri bu amaçla yo un bir ekilde kullanılmaktadır. Birçok bitki türünde yapılan ara tırmalarda SSR ve AFLP markör teknikleri polimorfizm bakımından, RAPD ve ISSR tekniklerinin maliyet bakımından, RFLP, SSR, ISSR ve AFLP i aretleyicilerinin ise tekrarlanabilirlik bakımından avantajlı oldukları belirlenmi tir. (Pejic ve ark., 1998; Mignouna ve ark., 2003; Rana ve Bhat, 2004). 2

20 1. G R Serkan AKCAN Zietkiewicz ve ark. (1994) tarafından geli tirilen ISSR tekni i mikrosatellitler arasında kalan bölgeleri ço altmaktadır. Bu teknikte rastgele üretilmi dinükleotid, tetranükleotid ve pentanükleotid tekrarlara sahip primerler kullanılmaktadır. Maliyeti ve tekrarlanabilirli i yüksek olan ISSR tekni i antepfıstı ı (Kafkas ve ark., 2006), bu day (Nagaoka ve Ogihara, 1997) ve di er bir çok kültür bitkisinde tür içi ve türler arası genetik varyasyonun belirlenmesinde ba arı ile kullanılmı tır. Ceviz çe itlerinde genetik ili kilerinin DNA seviyesinde saptanmasında ilk kullanılan teknik RFLP olmu tur (Fjellstrom ve ark., 1994). Sonraki yıllarda Nicese ve ark. (1998) yaptıkları çalı mada RAPD ve Potter ve ark. (2002) yaptıkları çalı mada ISSR, Dangl ve ark. (2005) SSR, Kafkas ve ark. (2005) ise AFLP ve SAMPL tekniklerini kullanmı lardır. Ülkemizde yo un a ılı ceviz fidanı talebini kar ılamak için ceviz çö ürleri tırpanlanarak yeni süren sürgünlerin a ı sürgünü olarak tanıtılması ve bu gibi çö ürlerin a ılı ceviz fidanı olarak satılması yaygın olarak kar ımıza çıkan bir sorundur. Üreticiler bu durumu ancak a açların uzun süre meyveye yatmamasından ve meyveye yatan a açların meyvelerinin birbirinden çok farklı olmasından anlamaktadırlar. Uzun yıllar sonra anla ılan bu sorun, sadece üreticiye zarar vermekle kalmayıp aynı zamanda ülkemiz ceviz yeti tiricili ine de büyük zararlar vermektedir. Çiçekli bitkilerin üremesi belli ba lı üç farklı ekilde olmaktadır: (1) yabancı döllenme yoluyla üreme, (2) kendine döllenme yoluyla üreme ve (3) e eysiz üreme. Çok yıllık bitkiler bu üç yöntemi de kullanmaktadır. E eysiz üreme bakımından apomiksis, yani döllenme olmadan tohum olu umu ço u çiçekli bitkinin ya am döngüsünün önemli bir özelli idir (Richards, 2003). Apomiksis yolu ile bitki eldesi, ba ta ceviz olmak üzere, vejetatif ço altılması zor veya mümkün olmayan bitki türlerinde, önemli genotiplerin daha hızlı, kolay ve pratik bir ekilde kitlesel ço altılıp yayılması bakımından çok önemlidir. Nitekim, son yıllarda a ılı ceviz fidanına olan talebi kar ılamak üzere Kır ehir in Kaman ilçesinde apomiktik oldu u iddia edilen genotiplere ait tohumlardan yeti tirilen bitkilerle yüzlerce dönüm kapama ceviz bahçeleri kurulmu tur. Ancak bu 3

21 1. G R Serkan AKCAN genotiplerin gerçekten apomiktik özelli e sahip olup olmadıkları henüz belirlenmemi tir. Bununla birlikte, son birkaç yıl içerisinde apomiktik oldukları iddia edilen fidanlarla kurulan bahçelerin a ı ile çe it de i tirme i lemine tabi tutuldukları önemli bir gerçektir (Akça, 2005). Bu bakımdan halihazırda bu ekilde da ıtımı yapılan fidanların genetik olarak birbirlerinin aynı olup olmadıklarının belirlenmesi ülkemiz ceviz yeti tiricili inin u anda vakit geçirmeden çözülmesi gereken en önemli sorunlarından birisidir. Aksi durumda, tohumdan çıkan ceviz a acı sayısı kapama bahçeler eklinde artı gösterecektir. Da ıtımı yapılan genotiplerin apomiktik özelli e sahip olması durumunda ise cevizlerde çok ciddi bir sorun olan ço altma ve fidan üretiminde bir homojenlik sa lanacaktır. Bu nedenle, cevizlerde apomiksisin incelenerek durumun genetiksel olarak ortaya konulması, hem pratik açıdan hem de ileride yapılacak ıslah çalı malarına da genetik bilgi sa laması bakımından oldukça önemli olacaktır. Bu nedenle bu çalı manın amacı: 1- SRAP moleküler markör tekni ini cevize uyarlamak, 2- Ticari olarak apomiktik oldu u iddia edilerek satı ı yapılan çö ürlerin, apomiktik olup olmadıklarını SRAP ve ISSR moleküler markör tekniklerini kullanarak DNA düzeyinde ortaya çıkarmak, 3- Apomiktik oldu u iddia edilen çö ürlerle kurulmu olan bahçelerdeki apomiksis varsayımının SRAP ve ISSR tekniklerini kullanarak ara tırmak, 4- SRAP ve ISSR tekniklerinin cevizde çok yakın akraba olan bireylerde ayırma gücünü ara tırmak, 5- Cevizde ISSR ve SRAP tekniklerini kar ıla tırmak, 6- Böylece cevizlerde yapılacak moleküler markör çalı malarına alt yapı olu turmaktır. 4

22 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN 2. L TERATÜR ÖZET 2.1. SRAP ve ISSR Markörleri le lgili Çalı malar SRAP tekni i PCR esasına dayalı bir tekniktir. Bu yöntemde ileri ve geri olmak üzere iki primer kullanılır. Birinci primer ileri (forward) primer olup 17 nükleotid uzunlu undadır ve ilk 14 nükleotit sabittir. Bu ilk 14 bazın son 4 bazı CCGG bazlarını içerir ve bu nedenle ileri primer ço unlukla ekzon bölgelerine ba lanır. Ayrıca ileri primer 3 ucunda üç tane seçici baz içerir ve bu bazlar rastgele seçilebilirler. kinci primer ise geri (reverse) primer olarak adlandırılır ve 18 baz uzunlu undadır. Bu pirmerde ise ilk 15 nükleotit sabittir. Bu ilk 15 bazın son 4 bazı AATT bazlarını içerir ve bu nedenle ileri primer ço unlukla intron ve promotor bölgelerine ba lanır. Son üç baz yine seçici olup rastgele seçilir. Bu primer ise genotipte daha çok intron ve promotor bölgelerini ço altır (Li ve Quiros, 2001). ISSR tekni inin temeli de PCR a dayalıdır. Ço unlukla dinükleotid veya trinükleotid tekrarlarından olu an primerler kullanılır. Bu teknikte mikrosatellitler arasında kalan bölgeler ço altılmaktadır. Primerin 3 ucunda bulunan seçici bazlar polimorfizm açısından önemlidir. Primerin DNA ya yapı ma sıcaklı ı her primer için ayrı ayrı belirlenir. (Zietkiewicz ve ark., 1994). Ferriol ve ark. (2003) yaptıkları çalı mada, SRAP ve AFLP moleküler markör yöntemlerini kullanarak Avrupa ve Amerika dan toplanan Cucurbita pepo ve Cucurbita ovifera alt türlerinden toplam 69 genotip kullanmı lardır. Çalı mada 11 adet SRAP primer kombinasyonu denenmi ve toplam 88 bant elde edilmi tir. Elde edilen bantların 64 ünün (%72.7) polimorfizm gösterdi i ve baz uzunluklarının ise 154 bp ile 653 bp arasında de i ti i belirlenmi tir. AFLP yönteminde ise 6 primer kombinasyonu denenmi ve toplam 478 bant elde edilmi tir. Elde edilen bantların 253 tanesinin (%53) polimorfik olu u saptanmı tır. Sonuçta her iki markör sistemi kar ıla tırılmı tır: genetik benzerliklerin SRAP yönteminde AFLP ye göre daha dü ük oldu unu ve SRAP yönteminin yakın çe itleri ayırma konusunda verdi i bilgilerin, AFLP yöntemin verdi i bilgilere göre daha güvenilir oldu unu bildirmi lerdir. 5

23 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN Budak ve ark. (2004) yaptıkları çalı mada, çimde ISSR, SRAP, RAPD ve SSR moleküler markör yöntemleri kullanarak, filogenetik akrabalıklarını ve kökenlerini tespit etmi lerdir. Çalı mada 15 genotip kullanılmı tır. 46 adet ISSR primeri kullanılmı, 256 tane bant elde edilmi, bunların 207 tanesinin (%81) polimorfizm gösterdi i saptanmı tır. 180 tane SSR primeri kullanılmı, 194 bant elde edilirken, bunun 168 tanesinin (%87) polimorfizm gösterdi i belirlenmi tir. 30 tane RAPD primeri kullanılmı, toplam 210 bant olu mu ve bu bantların 165 tanesinin (%79) polimorfizm gösterdi i belirlenmi tir. Son olarak çalı mada 34 SRAP primeri kullanılmı, toplam 263 bant elde edilirken, bunların 249 tanesinin (%95) polimorfizm gösterdi i belirlenmi tir. Sonuçta, SRAP yönteminin çim çe itlerini ayırmada en yüksek polimorfizm gösteren yöntem oldu u saptanmı tır. Ayrıca benzerlik indeksleri arasında yapılan korelasyon analizleri sonucunda, SRAP yönteminin en çok RAPD yöntemine benzedi i (r=0.73) ve en az ise SSR (r=0.09) ve ISSR (r=0.10) yöntemlerine benzedi i belirlenmi tir. Budak ve ark. (2005) yaptıkları çalı mada Buchloe dactyloides (bo a otu) bitkisinde nükleer ve organel genomlarında ISSR, SSR, SRAP ve RAPD moleküler markör sistemlerini kullanarak, çe itli bölgelerdeki bo a otlarının akrabalıklarını ve ploidi seviyelerini tespit etmi lerdir. Ara tırıcılar 20 bo a otu içerisinde diploid, tetraploid, pentaploid ve hekzaploid fertleri ISSR, SSR, SRAP, RAPD moleküler marker sistemleri ile karakterize etmi lerdir. ISSR kullanılarak 30 ile 38, SSR kullanılarak 28 ile 35, SRAP kullanılarak 31 ile 37 arasında allel tespit edilmi olup SRAP yönteminin SSR ve ISSR yöntemleri ile benzer sonuçlar verdi i, fakat RAPD yöntemiyle yapılan çalı mada ploidi seviyeleri ile allel sayıları arasında herhangi bir ili kinin saptanamadı ı görülmü tür. Bu nedenle, poliploid genotiplerlerle yapılan çalı malarda RAPD yönteminin kullanı lı olmadı ı bildirilmi tir. Guo ve Luo (2005), Trabzon hurmasında (Diospyros kaki Thunb.) SRAP analizleri ile Japon ve Çin de bulunan hurma çe itlerinin akrabalıklarını ortaya koymu lardır. Çalı mada 10 Çin, 11 Japon çe idi, 6 adet de bunlarla ili kili çe itler olmak üzere 27 çe it materyal olarak kullanılmı tır. SRAP analizinde toplam 72 primer kombinayonu denenmi tir. Toplam 136 bant elde edilmi olup, bunlardan 110 6

24 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN tanesinin (%80) polimorfik oldu u görülmü tür. Primer ba ına ortalama 5.5 bant elde edilmi tir. Ara tırıcılar SRAP yöntemi ile hurma genotiplerini kolaylıkla ayırabildiklerini, yöntemin yeni ve çok güçlü oldu unu bildirmi lerdir. Lin ve ark. (2005) yaptıkları çalı mada SRAP, SSR RAPD moleküler markör metotlarını kullanarak pamukta elyaf kalitesi için kantitatif özellik lokuslarının belirlenmesi üzerinde çalı mı lardır. Çalı mada 238 SRAP primer kombinasyonu, 368 SSR primeri ve 600 adet RAPD primeri kullanılmı tur. Çalı mada F2 populasyonu kullanılmı tır. Kullanılan SSR primerinin %34.2 si, RAPD primerlerinin %10.3 ü ve SRAP primer kombinasyonlarının %50.8 i polimorfik bant üretmi tir. Toplam 749 polimorfik lokus belirlenmi ve bunların 437 tanesi SRAP (3.61 lokus / primer), 205 tanesi SSR ve 107 tanesi RAPD yöntemlerinden elde edilmi tir. Bulunan 749 polimorfik lokustan toplam 566 adeti (363 SRAP, 141 SSR, 62 RAPD) ba lantı haritası olu tumada kullanılmı tır. Ba lantı haritasının olu umunda SRAP %64.1, SSR %24.9 ve RAPD ise %11 oranında katkıda bulunmu tur. Elyaf kalitesini etkileyen toplam 13 QTL belirlenmi ve bunların 10 tanesinin (%76) SRAP markörü oldu u saptanmı tır. Ara tırıcılar en fazla kantitatif özellik lokuslarının SRAP yönteminde bulunmasını bu yöntemin genle ilgili DNA bölgelerini ço altmasından kaynaklanmasına ba lamı lardır Cevizlerde Moleküler Markör Teknikleri ile Yapılan Çalı malar RFLP moleküler markör tekni i ile Kaliforniya da Wolfskill ara tırma bahçesinde yer alan, 48 ceviz (J. regia) genotipi arasındaki genetik ili ki belirlenmi tir. Çalı mada 21 RFLP probu kullanılmı, bunlardan 16 tanesi polimorik bant vermi tir. Çalı ma sonucunda Ashley ile Payne çe itleri birbirinden ayırt edilememi olup iki farklı grup olu mu tur. Kaliforniya ceviz genetik kayna ının Nepal, Çin, Kore ve Japon ceviz genetik kaynaklarına daha az benzerlik gösterdi i, Fransa, ç Avrupa ve ran genetik kaynakları ile daha yakın ili kili oldu u belirlenmi tir (Fjellstrom ve ark., 1994) Fjellstrom ve Parfitt (1994), yaptıkları çalı mada cevizlerde genetik haritalama çalı masında kullanılmak üzere, PstI restriksiyon enzimi ile olu turulmu genomik kütüphanesi kullanılarak 48 lokusa sahip 32 RFLP probu geli tirilmi tir. 7

25 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN Bu problar 63 adet (J. hindsi x J. regia)x J. regia melez bitkileri ve ebeveynleri kullanılarak kalıtıma bakılmı tır. Çalı mada 42 lokus ile 12 ba lantı grubu belirlenmi tir. RAPD tekni i ile yapılan bir ara tırmada (J. hindsi x J. regia) x J. regia melez bitkileri kullanılarak genetik haritalama çalı ması yapılmı tır. 25 primer kullanılarak 66 markör belirlenmi tir. Bunların içerisinden yedi tanesi 1:1 Mendel açılımı göstermi ve genetik haritalama için kullanılmı tır (Woeste ve ark., 1996). RAPD moleküler markör tekni i ile yapılan di er bir ara tırmada, de i ik ceviz melezleri ayırt edilebilmi ve ebeveynleri belirlenebilmi tir. Ara tırmada iki farklı J. nigra. x J. regia F1 melezleri ile (J. nigra x J. regia) x J.nigra ve (J. nigra x J. regia) x J.regia geri melez bitkileri kullanılmı tır. Önce 80 adet primer taranmı, bunlardan 25 adet polimorfizm gösteren primer RAPD analizlerinde kullanılmak üzere seçilmi tir. Yapılan RAPD analizleri sonucunda toplam 91 bant görülmü tür. Sonuç olarak ara tırıcılar, RAPD tekni inin cevizlerde ebeveynlerin belirlenmesinde ve F1 melezlerinin ayırt edilmesinde kullanılabilece ini bildirmi lerdir (Malvolti ve ark., 1997). Kaliforniya Üniversitesi nde RAPD tekni i kullanılarak yapılan ara tırmada, 19 ceviz (J. regia) çe idi ebeveyn olarak kullanılmı ve ıslah sonucu ortaya çıkan çe itlerin karakterizasyonu ve genotipler arası genetik ili kileri belirlenmi tir. Çalı mada 72 primer kullanılmı tır. Tüm primerler bant vermesine kar ın, sadece 18 primer polimorfik bant üretmi tir. Çalı mada ebeveynler ve yavruları arasında ortak bantlar görülürken sadece yavru bitkilerde amplifike olan bantlara da rastlanmı tır. Ara tırıcılar, RAPD yönteminin genotipler arasındaki genetik benzerli in saptanması, yeni çe itlerin tanımlanması, ebeveyn seçimi, ceviz ıslahı programları gibi konularda kullanılabilece ini bildirmi lerdir (Nicese ve ark., 1998) Kaliforniya da Wolfskill ara tırma bahçesinde yer alan 48 ceviz (J. regia) çe idi arasındaki genetik ili ki ISSR moleküler markör tekni ini ile belirlenmi tir. Önce dört genotipte 47 primer taranmı ve en fazla polimorfizm gösteren 8 primer seçilmi tir. Bu sekiz primerin 48 ceviz çe idinde amplifikasyonu sonucu 54 bant elde edilmi ve bunların 31 tanesi (%57) polimorfizm göstermi tir. Çalı ma sonucunda ISSR tekni inin RAPD tekni i ile benzer maliyette fakat, daha fazla polimorfizme 8

26 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN sahip oldu u, ceviz çe itlerinin tanımlanmasında ve ceviz genotipleri arasındaki genetik ili kilerin belirlenmesinde kullanılabilece ini bildirilmi tir (Potter ve ark., 2002). Woeste ve ark. (2002), J. nigra türünde çalı ma yapmı, 30 adet (GA/CT) n tekrarlanan baz dizilerini içeren SSR primerlerini geli tirmi lerdir. Bu primerlerin J. nigra da genetik haritalama çalı malarında, populasyon çalı malarında, çe itlerin karakterizasyonunda kullanılabilece ini bildirmi lerdir. Ancak, ara tırıcılar bu primerlerin J. regia da çalı ıp çalı madı ını test etmemi lerdir. Foroni ve ark. (2005) ile Dangl ve ark. (2005). J. nigra da geli tirilen SSR primerlerini J. regia çe itlerinde uygulamı lar ve sırasıyla ara tırıcılar 6 adet ve 14 adet olmak üzere toplam 20 adet SSR primerinin J. regia çe itlerinde kullanılabilece ini bildirmi lerdir. Kafkas ve ark. (2005b) yaptıkları çalı mada, Kahramanmara Sütçüimam Üniversitesi genetik kaynaklarında bulunan 21 ceviz çe idinde AFLP ve SAMPL moleküler markör tekniklerini kullanarak çe itler arasındaki genetik ili kiyi incelemi lerdir. Çalı mada 6 AFLP primer kombinasyonu kullanılmı ve toplam 179 bant elde edilmi tir. Elde edilen bantların %49.9 unun polimorfik oldu u ve primer ba ına ortalama bant sayısının 29.8 oldu u belirlenmi tir. SAMPL moleküler markör analizinde ise 2 primer kullanılmı, 51 bant elde edilmi ve bu bantların %50.9 unun polimorfik oldu u saptanmı tır. Çalı ma sonucunda SAMPL moleküler markör tekni inin birbiri ile yakın ili kili çe itleri ayırmada, AFLP yöntemine göre daha etkili oldu u bildirilmi tir Apomiksis Kavramı ve Cevizde Apomiksis Konusunda Yapılan Çalı malar Apomiksis Apomiksis kavramı konusunda bugüne kadar birbirinden farklı tanımlamalar yapılmı olmasına kar ın, günümüzde esas olarak döllenme olmadan tohumlu meyve olu umu olarak adlandırılmaktadır. Sporofitik ve gametofitik apomiksis olmak üzere iki tipi mevcuttur. Adventif embriyoni olarak da adlandırılan sporofitik apomiksisde embriyolar embriyo kesesi dı ındaki nusellus veya integümentler gibi sporofitik 9

27 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN hücrelerden meydana gelmektedir. Bu apomiksis tipinde embriyo kesesi olu mamakta ve embriyo direk olarak sporofitik doku hücrelerinden olu maktadır. Gametofitik apomiksisde ise olu an diploid embriyo kesesi içerisindeki diploid yumurta hücresi geli erek embriyoyu olu turmaktadır. Döllenmemi yumurta hücresinden embriyo olu umuna partenogenesis adı da verilmektedir. Gametofitik apomiksisin apospory ve diplospory olmak üzere iki tipi vardır. Diplosporide embriyo kesesi direk olarak veya durdurulmu mayozdan sonra megaspor ana hücresinden mitozla olu urken, aposporide embriyo kesesi nüseller hücrelerden meydana gelir. Apospory yüksek yapılı bitkilerde en yaygın apomiksis tipi olup, bazen çoklu embriyo kesesi varlı ıyla karakterize edilmektedir. E er bir genotip hem apomiktik hem de döllenmi tohum üretiyorsa buna fakültatif apomiksis denilmektedir. Endospermin olu ma ekline göre ise apomiksis pseudogamous ve autonomous olarak ikiye ayrılmaktadır. Pseudogamous tipinde apomiktik tohum eldesi için mutlaka tozlanma gereklidir. Çünkü embriyo tozlanma sonucu olu an triploid endospermden beslenmektedir. Autonomous tipte ise tozlanmaya gerek yoktur ve endosperm kendili inden meydana gelmektedir ve diploid yapıdadır (Darrigues ve ark., 2003; Spielman ve ark., 2003; Agafonov ve ark., 2004). Apomiksis 35 familya yı içine alan 300 den fazla bitki türünde belirlenmi tir. En ba ta gelen familyalar Poaceae, Asteraceae ve Rosaceae dir (Richards, 2003) Cevizde Apomiksis ile lgili Çalı malar Cevizde apomiksis ile ilgili ilk bulgular Nuth (1933), Chriffen (1960) ve Shanderl (1964) tarafından rapor edilmi tir. Nuth dikogami gösteren ve izole edilen cevizlerin meyve verdiklerini gözlemlemi tir. Daha sonra Shanderl izole etti i di i çiçeklerden tozlama yapmadan meyve elde etmi ve en iyi apomiktik genotipi 10 yıl sonra seçmi tir. Ara tırıcı bu özelli in Alman ve Macar çe itlerinin genel karakteri oldu unu belirtmi tir (Valdiviesso, 1990). Sartorius ve Stösser e (1997) göre cevizlerde apomiktik meyve tutumu konusunda ilk gözlem, eski Sovyetler Birli inde 1949 yılında Zarubin tarafından yapılmı tır. Daha sonra Almanya da 1964 yılında Schanderl, izolasyon yapılan çiçeklerden apomiktik meyve elde etmi tir. Nitekim literatüre bakıldı ında, Portekiz 10

28 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN (Valdiviesso, 1990), Rusya (Loiko, 1990), Almanya (Sartorius, 1990) ve ABD de (Aly Mohammed ve ark., 1992) apomiktik ceviz genotiplerinin varlı ından söz edilmektedir. Shanderl nin çalı masına göre (Valdiviesso, 1990), apomiktik embriyo normalde oldu u gibi embriyo kesesinin bulundu u yerde olu mamı ve apomiktik embriyo mikrofile yakın ve nusellus bo lu u ile mikrofil arasında yerle mi tir. Bazen mikrofile çok yakın bazen de biraz uzak olan somatik embriyo direk olarak bir nusellus hücresinden meydana gelmi tir (adventif embriyoni). Ara tırıcı, bundan sonraki apomiktik embriyo büyümesinin normal döllenmi embriyo büyümesinden farklı olmadı ını belirlemi tir. Buna göre, önce iki parçalı ovül büyümü ve sonra dı integüment tarafından olu turulan bo lu a girmi tir. Hızlı ovül büyümesi apomiktik embriyonun nusellus bo lu una ula masına yardımcı olmu ve bu bo luktaki sıvı, embriyo tarafından kullanılarak normal döllenme sonucu olu an endospermin yerini almı tır. Ancak ara tırıcı, apomiktik meyve tutumunun yıllara göre %2.5 ile %57 arasında de i ti ini ve iklimsel ko ullara ba lı oldu unu bildirmi tir. Almanya da Sartorius (1990) tarafından yapılan bir doktora çalı masında apomiktik oldu u daha önce belli olan iki ceviz çe idinde mekanizmayı belirmek bakımınan histolojik çalı malar yapılmı tır. Apomiktik olmadı ı bilinen bir çe it daha çalı maya ilave edilerek toplam üç çe itte çiçeklerin bir kısmı açık tozlamaya bırakılmı di er bir kısmı da bez torbalarla izole edilmi tir. ki yıl süresince yapılan bu çalı mada 1986 yılında % ve 1987 yılında ise % oranında meyve tutumu elde edilmi tir. Açık tozlamada meyve tutumu ise 1986 yılında % ve 1987 yılında ise % arası olmu tur. Yapılan histolojik çalı malarda embriyo kesesi, embriyo kesesi ana hücresinden meydana gelmi ve somatik bir nusellus hücresinden apospor embriyo kesesi olu umu gözlenmemi tir. Apomiktik tohum taslaklarında apomayotik embriyo kesesi olu umu diplospory yoluyla yani indirgenmemi bir makrospordan meydana geldi i belirlenmi tir. Normal sekiz çekirdekli embriyo kesesi olu umu gözlenmi ancak izole edilen çiçeklerden embriyo her zaman için yumurta hücresinin bölünmesiyle yani partenogenesis yoluyla olu mu tur. Bir istisna dı ında adventif embriyoni olu umuna rastlanmamı tır. Döllenmemi ve bu nedenle dökülmü olan yumurtalıklar içerisinde endosperm 11

29 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN çekirde i olu umu gözlenmi tir. Endosperm embriyonun varlı ına ba lı olmaksızın kendili inden (otonom) olarak geli im göstermi tir. Yapılan kromozom çalı malarında hem apomiktik hem de apomiktik olmayan örneklerde endospermin diploid yapıda oldu u belirlenmi tir. Aly Mohammed ve ark. (1992) tarafından yapılan çalı mada ceviz ovül dokularından elde edilen somatik embriyoların apomiktik veya zigotik mi oldukları izoenzim ve RFLP yöntemleri kullanılarak belirlenmeye çalı ılmı tır. Çalı mada Cisco ve Sunland ceviz çe itlerinin di i çiçek salkımları izole edilmi ve herhangi bir yapay tozlama çalı ması yapılmamı tır. Izoenzim analizlerinde biri dı ında tüm embriyolar ana bitki ile aynı bulunmu, ancak RFLP analizleri embriyoların zigotik olduklarını göstermi tir. zole edilen çiçeklerden zigotik embriyoların olu ması, ya tozlanmanın izolasyon i leminden önce gerçekle mesi ve çiçek tozlarının çiçekler reseptif oluncaya kadar torba içerinde canlı kalmasından veya iyi bir izolasyonun yapılmamasından kaynaklanabilece i belirtilmi tir Di er Bitki Türlerinde Apomiksisin Belirlenmesi ile lgili Çalı malar Bitkilerde apomiksisi belirlemek için ara tırıcılar bugüne kadar fenotipik, sitolojik, biyolojik ve moleküler markörler kullanmı lardır (Darrigues ve ark., 2003). Bunların içerisinde moleküler markör teknikleri son yıllarda en çok kullanılan yöntemler olmu tur. Bu teknikler, de i ik türlerde apomiksisin ve düzeyinin belirlenmesinde (Nassar ve ark., 1998), apomiksis ile ili kili markörün bulunmasında, kalıtımında ve haritalanmasında (Ozias-Askins ve ark., 1993; 1998; Leblanc ve ark., 1995; Gustine ve ark., 1997; Grimanelli ve ark., 1998; Spillane ve ark., 2001) kullanılmı lardır. Manyok (Monihot esculenta) bitki türünde Nassar ve ark. (1998) tarafından yapılan moleküler çalı mada apomiktik oldu u dü ünülen iki genotipe ait açık tozlama ile elde edilmi toplam 67 yavru bitkide RAPD yöntemi kullanılarak yavru bitkiler ile ana bitkiler arasındaki benzerliklere bakılmı tır. Ara tırmada 24 adet polimorfik RAPD primeri kullanılmı tır. Elde edilen sonuçlar, yavru bitkilerin %2 oranında ana bitkinin aynısı oldu unu göstermi tir. Ara tırıcılara göre, apomiktik 12

30 2. L TERATÜR ÖZET Serkan AKCAN olan bitkilerin ana ile aynı RAPD bantları üretmesi gerekti i ve yavru bitkiler ile ana bitki arasında polimorfizm görülmesinin bu tip bitkilerin apomiktik de il, zigotik olduklarını gösterdi ini bildirmi lerdir. Pessino ve ark. (1998) yaptıkları çalı mada, Brachiaria hibritlerinde apomiksis ile ilgili be marker saptayabilmi lerdir. Normalde diploid yapıdaki Brachiaria ruziziensis kolhisin ile muamele edilerek tetraploid hale getirmi ve apomiktik olan Brachiaria brizantha çe idi ile melezleme sonucu 43 tane F1 bitkisi elde edilerek populasyon olu turulmu tur. Çalı mada 25 RFLP probu ve 46 AFLP markörü üretilmi, Bunlardan üç tane RFLP markörünün ve iki tane AFLP markörünün apomiksis ile ili kili olu u saptanmı tır. Zeng ve ark. (2003) tarafından yapılan bir çalı mada, Woonyoungia septentrionalis türünün apomiktik özelli e sahip olup olmadı ı iki genotipte çiçeklerin izole edilmesi, yapay tozlama ve do al tozlanma uygulamalarıyla belirlenmeye çalı ılmı tır. Ara tırıcılar, meyve tutma oranı, tohum olu turma oranı ve tohumların çimlenme durumlarını incelemi lerdir. Tüm uygulamalarda elde edilen bulguların birbirine benzer bulunması nedeniyle ara tırıcılar bu türde fakültatif apomiksisin varlı ını i aret etmi lerdir. 13

31 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN 3. MATERYAL ve METOT 3.1. Materyal Apomiksisi belirlemek amacıyla apomiktik olarak ceviz fidanı üretimi yapan iki farklı fidan üreticisinden Kaman-1 ve Kaman-5 olarak satı ı yapılan toplam 40 adet bitki (Çizelge 3.1) ile apomiktik oldu u belirtilen tohumlarla (Kaman-1 ve Kaman-5) önceden kurulmu ve kısmen meyve vermeye ba lamı 20 a aç denemenin materyalini olu turmu tur (Çizelge 3.2). Bu ara tırmada ayrıca Kaman-1 ve Kaman-5 genotiplerinin ana a açları da kontrol olarak kullanılmı tır. Böylece toplam 62 adet bitki bu çalı mada materyal olarak kullanılmı tır. Çizelge 3.1. Denemede kullanılan fidan üreticilerinden alınan ceviz çö ürlerinin listesi. Sayı Fidan Üreticisi Genotip Bitki No Kod Kısaltma 1 A Kaman-1 1 FÜA-K1-1 A1 2 A Kaman-1 2 FÜA-K1-2 A2 3 A Kaman-1 3 FÜA-K1-3 A3 4 A Kaman-1 4 FÜA-K1-4 A4 5 A Kaman-1 5 FÜA-K1-5 A5 6 A Kaman-1 6 FÜA-K1-6 A6 7 A Kaman-1 7 FÜA-K1-7 A7 8 A Kaman-1 8 FÜA-K1-8 A8 9 A Kaman-1 9 FÜA-K1-9 A9 10 A Kaman-1 10 FÜA-K1-10 A10 11 A Kaman-5 1 FÜA-K5-1 B1 12 A Kaman-5 2 FÜA-K5-2 B2 13 A Kaman-5 3 FÜA-K5-3 B3 14 A Kaman-5 4 FÜA-K5-4 B4 15 A Kaman-5 5 FÜA-K5-5 B5 16 A Kaman-5 6 FÜA-K5-6 B6 17 A Kaman-5 7 FÜA-K5-7 B7 18 A Kaman-5 8 FÜA-K5-8 B8 19 A Kaman-5 9 FÜA-K5-9 B9 20 A Kaman-5 10 FÜA-K5-10 B10 21 B Kaman-1 1 FÜB-K1-1 A11 22 B Kaman-1 2 FÜB-K1-2 A12 23 B Kaman-1 3 FÜB-K1-3 A13 24 B Kaman-1 4 FÜB-K1-4 A14 25 B Kaman-1 5 FÜB-K1-5 A15 26 B Kaman-1 6 FÜB-K1-6 A16 14

32 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN Çizelge 3.1 in devamı. Sayı Fidan Üreticisi Genotip Bitki No Kod Kısaltma 27 B Kaman-1 7 FÜB-K1-7 A17 28 B Kaman-1 8 FÜB-K1-8 A18 29 B Kaman-5 9 FÜB-K5-1 B11 30 B Kaman-5 1 FÜB-K5-2 B12 31 B Kaman-5 2 FÜB-K5-3 B13 32 B Kaman-5 3 FÜB-K5-4 B14 33 B Kaman-5 4 FÜB-K5-5 B15 34 B Kaman-5 5 FÜB-K5-6 B16 35 B Kaman-5 6 FÜB-K5-7 B17 36 B Kaman-5 7 FÜB-K5-8 B18 37 B Kaman-5 8 FÜB-K5-9 B19 38 B Kaman-5 9 FÜB-K5-10 B20 39 B Kaman-5 10 FÜB-K5-11 B21 40 B Kaman-5 11 FÜB-K5-12 B22 Çizelge 3.2. Tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı a açların listesi. Sayı Kaynak Genotip Bitki no Kod Kısaltma 1 Tohum Kaman-1 1 Tohum-K1-1 A19 2 Tohum Kaman-1 2 Tohum-K1-2 A20 3 Tohum Kaman-1 3 Tohum-K1-3 A21 4 Tohum Kaman-1 4 Tohum-K1-4 A22 5 Tohum Kaman-1 5 Tohum-K1-5 A23 6 Tohum Kaman-1 6 Tohum-K1-6 A24 7 Tohum Kaman-1 7 Tohum-K1-7 A25 8 Tohum Kaman-1 8 Tohum-K1-8 A26 9 Tohum Kaman-1 9 Tohum-K1-9 A27 10 Tohum Kaman-1 10 Tohum-K1-10 A28 11 Tohum Kaman-5 1 Tohum-K5-1 B23 12 Tohum Kaman-5 2 Tohum-K5-2 B24 13 Tohum Kaman-5 3 Tohum-K5-3 B25 14 Tohum Kaman-5 4 Tohum-K5-4 B26 15 Tohum Kaman-5 5 Tohum-K5-5 B27 16 Tohum Kaman-5 6 Tohum-K5-6 B28 17 Tohum Kaman-5 7 Tohum-K5-7 B29 18 Tohum Kaman-5 8 Tohum-K5-8 B30 19 Tohum Kaman-5 9 Tohum-K5-9 B31 20 Tohum Kaman-5 10 Tohum-K5-10 B32 15

33 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN 3.2. Yöntem Yaprak Örneklerinin Toplanması Çö ürlerden ve a açlardan alınan yaprak örnekleri ayrı ayrı kese ka ıtlarına konduktan sonra buz kutusu içerisinde laboratuvara ula tırılmı tır. Yaprak örnekleri %50 lik alkolle yıkanıp kurutulduktan sonra sıvı azot ( C) ile muamele edilmi ve DNA izolasyonuna kadar C de muhafaza edilmi tir DNA zolasyonu DNA ekstraksiyonu için laboratuvarda düzenli olarak cevizlerde uygulanmakta olan, Doyle ve Doyle nin (1987) geli tirdi i ve Kafkas ve ark nın (2005b) modifiye etti i yöntem uygulanmı tır. Bu yöntemde; 0.5 g genç yaprak örne i alınarak, bir miktar sıvı azot ile havanda iyice ezilmi olup, 1.5 mililitrelik üç adet eppendorf tüpe e it miktarda konulduktan sonra her bir eppendorf tüp içerisine 0.7 ml CTAB tampon çözeltisi (100 mm Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mm EDTA, %2 CTAB, %2 PVP, mercaptoethanol, %0.1 Na 2 S 2 O 5 ) ilave edilmi tir. Daha sonra ise 65 0 C de sıcak su banyosuna konulmu tur. Sıcak su banyosuna alınan eppendorf tüpler 10 dk. arayla çalkalanmı tır ve bu i lem 60 dk. boyunca devam etmi tir. Sıcak su banyosundan sonra eppendorf tüpler oda sıcaklı ında 5-10 dk. bekletiltikten sonra her bir tüpün içerisine ekstraksiyon buffer ile 0.7 ml kloroform:isoamyl alkol (24 : 1) ilave edilmi tir. Bu a amadan sonra tüpler 15 dk. boyunca her 3 dakikada bir çalkalanmı olup daha sonra 15 dk. süre ile rpm de santrifüj edilmi tir. Santrifüj sonunda tüplerin üst fazları yeni eppendorf tüplere aktarılarak DNA çökelmesi için üzerlerine so uk isopropanol ilave edilmi tir. DNA çökelmesi so uk ortamlarda daha iyi gerçekle ti i için eppendorf tüpler 70 0 C de 2 saat bekletilmi olup bu süre sonunda 10 dk süre ile rpm de santrifüj yapılmı tır. Santrifüj sayesinde DNA tüplerin dibine çökelmi ve üstte bulunan isopropanol ise bo altılmı tır. Bu i lemden sonra tüplerin içerisine 0.5 ml %76 lık etanol ilave edilerek yıkama i lemine geçilmi tir. Etanol 16

34 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN eklenen tüpler +4 0 C de 2 saat bekletildikten sonra kurumaya alınmı tır. Kurutulan DNA saf suda çözülerek izolasyon tamamlanmı tır DNA Konsantrasyonunun Belirlenmesi Moleküler markör analizlerinin uygulanmasından önce DNA konsantrasyonunun belirlenmesi PCR reaksiyonu açısından oldukça önem arz etmektedir. Çalı mada DNA konsantrasyonunu ayarlarken %0.8 lik agaroz jel konsantrasyonu kullanılmı olup, her bir Kaman Cevizi genotipinin DNA konsantrasyonu, konsantrasyonu belli olan DNA ile kar ıla tırılmak suretiyle tahmini olarak 5 ng/µl ayarlanmı tır. Öncelikle her bir Kaman cevizi genotipinden izole edilen ve saf suda çözdürülen DNA dan 2 µl, yükleme boyasından 4 µl ve saf sudan 14 µl alınmak suretiyle 20 µl lik örnekler hazırlanmı olup, bu örneklerin 10 µl si %0.8 lik konsantrasyonda hazırlanmı agaroz jel üzerinde bulunan yuvalara yüklenmi tir. Elektroforezde 45 dakika 90 voltta ko turma i lemi yapılmı olup UV ı ı ı altında jelin resmi alınmı tır. Agaroz jele yüklenen konsantrasyonu belli DNA lar (25ng- 50ng-100ng-200ng) ile cevizleri genotipleri DNA ları kar ıla tırılarak her bir genotipten elde edilen stok DNA nın konsantrasyonu tahmin edilmi tir. PCR analizlerinde 5 ng/µl DNA konsantrasyonu kullanılmı tır. Bu a amada her bir örne in konsantrasyonu stok DNA ların konsantrasyonu baz alınarak 5 ng/µl olacak ekilde ayarlanmı tır. Ayarlanan örnekler tekrar %0.8 lik konsantrasyonda agaroz jelde bulunan kuyucuklara yüklenerek 90 voltta 45 dakika ko turulmu ve UV altında resimleri çekilmi tir. Tahmini olarak 5 ng/µl den fazla olanlara saf su, az olanlara ise stok DNA dan eklenerek tüm örneklerin konsantrasyonu 5 ng/µl ye ayarlanmı tır ISSR Analizleri ISSR analizleri Zietkiewicz ve ark. (1994) nın geli tiridi i ve Do an ın (2006) cevize uyarladı ı yönteme göre yapılmı tır. Buna göre 25 l amplifikasyon reaksiyonu 75 mm Tris-HCl, ph=8.8, 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 2 mm MgCl 2, 0.1% Tween 17

35 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN 20, 100 M datp, 100 M dttp, 100 M dgtp, 100 M dctp, 0.2 M primer, 1.0 unite Taq DNA polymerase ve 10 ng DNA içermi tir. Sıcaklık ve döngü ko ulları olarak, 94 0 C de 2 dk. ön denatürasyon i leminden sonra, 35 döngü boyunca örnekler denatürasyon için 94 0 C de 1 dk, primerin DNA ya yapı ması için primere göre de i mek üzere C de 1 dk, ve uzama safhası için 72 0 C de 2 dk. tutulmu lardır. Ayrıca, örnekler son uzama safhası için 72 0 C de 10 dk. bekletilmi lerdir. Ara tırmada primer olarak ise daha önce Do an (2006) tarafından polimorfik oldu u belirlenen 15 primer kullanılmı tır (Çizelge 3.3). Bu primerlerin baz dizilimleri farklı oldu u için kalıp DNA ya yapı ma sıcaklıkları da (annealing) farklıdır. Bu sıcaklıklar Kafkas ve ark. (2006) tarafından yapılan bir çalı mada belirlenmi tir. Çizelge 3.3. Çalı mada kullanılan ISSR primerlerinin baz dizilimleri, baz sayıları ve ceviz DNA sına PCR da yapı ma sıcaklıkları. No Kod Baz dizilimi (5 3 ) Baz Sayısı DNA ya Yapı ma Sıcaklıkları( C) 1 UBC 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC UBC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC UBC 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA UBC 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG UBC 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC UBC 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC UBC 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC UBC 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT UBC 846 CAC ACA CAC ACA CAC ART UBC 853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT UBC 854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG UBC 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT UBC 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA UBC 858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT Elde edilen PCR ürünleri 0.5 x TBE tampon çözeltisinde (89 mm Tris-Cl, 89 mm borik asit, 20 mm EDTA) %1.8 lik agaroz jelde ko ularak etidiyum bromit ile boyanmı ve UV altında foto rafları çekilmi tir. 18

36 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN Bant büyüklüklerinin belirlenmesinde DNA nın EcoRI ve HindIII kesim enzimleri ile hazırlanmı olan DNA sı kullanılmı tır. Bu DNA da bant büyüklükleri sırasıyla 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3520 bç eklindedir ( ekil 3.1) ekil 3.1. Size marker olarak kullanılan, DNA nın EcoRI ve HindIII kesim enzimleri ile hazırlanmı olan DNA sı SRAP Analizleri SRAP analizleri Li ve Quiros un (2001) geli tirmi oldu u yönteme göre yapılmı tır. Proje kapsamında 10 ileri (Çizelge 3.4) ve 20 geri (Çizelge 3.5) kullanılmak üzere toplam 120 adet primer kombinasyonu 6 genotipte polimorfizm bakımından taranmı tır ( ekil 3.2). Kullanılan primer çiftlerinden 70 adedinin polimorfik bant üretti i fakat 9 adedinin polimorfik bant üretmedi i belirlenmi tir. Geriye kalan 41 adet primer çifti ise hiç bant üretmemi tir. Tarama i lemi sonucunda en polimorfik oldu u belirlenen 10 adet SRAP primer çifti 29 adet Kaman-1 ve 33 adet Kaman-5 cevizi genotipine uygulanmı tır. Çizelge 3.4. Çalı ma kapsamında kullanılan SRAP ileri primerleri. No Kod leri Primerler (5 3 ) Baz Sayısı 1 Me1 TGA GTC CAA ACC GGA TA 17 2 Me2 TGA GTC CAA ACC GGA GC 17 3 Me3 TGA GTC CAA ACC GGA AT 17 4 Me4 TGA GTC CAA ACC GGA CC 17 5 Me5 TGA GTC CAA ACC GGA AG 17 6 Me6 TGA GTC CAA ACC GGA CA 17 7 Me7 TGA GTC CAA ACC GGA CG 17 8 Me8 TGA GTC CAA ACC GGA CT 17 9 Me9 TGA GTC CAA ACC GGA GG Me10 TGA GTC CAA ACC GGA AA 17 19

37 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN Çizelge 3.5. Çalı ma kapsamında kullanılan SRAP geri primerleri. No Kod Geri Primerler (3 5 ) Baz sayısı 1 Em1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT 18 2 Em2 GAC TGC GTA CGA ATT TGC 18 3 Em3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC 18 4 Em4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA 18 5 Em5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC 18 6 Em6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA 18 7 Em7 GAC TGC GTA CGA ATT CAA 18 8 Em8 GAC TGC GTA CGA ATT CAC 18 9 Em9 GAC TGC GTA CGA ATT CAG Em10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT Em11 GAC TGC GTA CGA ATT CTA Em12 GAC TGC GTA CGA ATT CTC Em13 GAC TGC GTA CGA ATT CTG Em14 GAC TGC GTA CGA ATT CTT Em15 GAC TGC GTA CGA ATT GAT Em16 GAC TGC GTA CGA ATT GTC Em17 GAC TGC GTA CGA ATT GAG Em18 GAC TGC GTA CGA ATT AAG Em19 GAC TGC GTA CGA ATT GAA Em20 GAC TGC GTA CGA ATT GTT 18 MA ekil 3.2. Me1-Em9, Me1-Em10, Me2-Em3, Me2-Em4 SRAP primerlerinin taramada kullanılan 6 Kaman cevizi genotipindeki amplifikasyonu (1. Kaman-1, 2.FÜA-K1-6, 3. Tohum-K1-5, 4. Kaman 5, 5. FÜB-K5-5, 6. Tohum-K5-8, MA: moleküler a ırlık. 20

38 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN PCR reaksiyonu 25 l de yapılmı tır. Buna göre, amplifikasyon reaksiyonu 75 mm Tris-HCl, ph=8.8, 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 2 mm MgCl 2, 0.1% Tween 20, 100 M datp, 100 M dttp, 100 M dgtp, 100 M dctp, 0.2 M primer, 1.0 unite Taq DNA polymerase ve 10 ng DNA içermi tir. leri primerler primerlerin DNA ya yapı ma (annealing) sıcaklı ı ilk 5 döngüde 35 0 C geri kalan 30 döngüde ise 50 0 C olarak ayarlanmı tır. Toplam 35 döngü boyunca örnekler 94 0 C de 1 dk ve 72 0 C de 2 dk tutulmu tur. SRAP analizleri sonucunda elde edilen PCR ürünleri 0.5 x TBE tampon çözeltisinde (89 mm Tris-Cl, 89 mm borik asit, 20 mm EDTA) %2 lik agaroz jelde ko ularak etidiyum bromit ile boyanmı ve UV altında foto rafları çekilmi tir. Elde edilen DNA bantlarının büyüklüklerinin belirlenmesinde DNA nın EcoRI ve HindIII kesim enzimleri ile hazırlanmı olan DNA sı kullanılmı tır. Bu DNA da bant büyüklükleri sırasıyla 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3520 bç eklindedir Primerlerin Polimorfizm Oranlarının ve Bilgi çeriklerinin Belirlenmesi Çalı mada kullanılan ISSR ve SRAP primerlerinin polimorfizm oranları (PO), primerlerden elde edilen polimorfik bant sayılarının, toplam bant sayısına bölünüp 100 ile çarpılması ile bulunmu tur. Polimorfizm bilgi içeriklerinin (PB ) belirlenmesinde ise öncelikle çalı mada polimorfik bantlarda toplam var (1) ve yok (0) olan bant sayıları belirlenmi olup bu bantların frekansları ayrı ayrı hesaplanmı ve Smith ve ark. nın (1997) geli tirdikleri yöntemle primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) a a ıdaki formüle göre hesaplanmı tır. Formülde yer alan Pi, i bandının frekansını temsil etmektedir. PB = 1 - Pi Primerlerin Ayırma Güçlerinin Belirlenmesi Çalı mada kullanılan primerlerin ayırma güçleri Prevost ve Wilkinson (1999) tarafından geli tirilen yönteme göre a a ıdaki formül esas alınarak 21

39 3. MATERYAL ve METOT Serkan AKCAN hesaplanmı tır. Formülde bulunan p, I bandının toplam ceviz genotipindeki oranı temsil etmektedir. Ayırma gücü = Ib Ib = 1- (2 x p ) Ceviz Genotipleri Arasındaki Genetik li kilerin Belirlenmesi SRAP ve ISSR amplifikasyon ürünleri var (1) yada yok (0) eklinde de erlendirilmi ve elde edilen veriler NTSYSpc 2.11V (Rohlf, 2004) bilgisayar paket programında analiz edilmi tir. Sonuç olarak analiz edilen genotiplerin birbirlerinin aynısı mı yoksa birbirlerinden farklı mı oldukları belirlenmi tir. Farklı olan bireylerin de birbirlerinden ne kadar farklı oldukları aralarındaki genetik benzerli in hesaplanmasıyla bulunmu tur. Ayrıca aynı paket programları kullanılarak soya açları da elde edilmi tir. Genetik benzerlik indeksi Jaccard a göre hesaplanmı olup, soya acının elde edilmesinde UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average) yöntemi kullanılmı tır. Her iki markör yönteminden elde edilen veriler ayrı ayrı de erlendirildi i gibi birlikte de de erlendirilmi olup, Mantel kofenetik korelasyon testi (Mantel, 1967) yapılarak her iki yöntemden elde edilen benzerlik indeksleri arasındaki korelasyonlar hesaplanmı tır. 22

40 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN 4. BULGULAR ve TARTI MA 4.1. Cevizlerde Apomiksisin Ticari Olarak Üretimi Yapılan Fidanlarda Belirlenmesi Kaman-1 FidancıA ve FidancıB den alınan Kaman-1 çö ürlerinde daha önce cevizde Do an (2006) tarafından yapılmı olan çalı mada polimorfik oldu u belirlenen 15 ISSR primeri uygulanmı olup, UBC853 no lu primerinin kullanılması ile elde edilen bir jelin görüntüsü ekil 4.1 de verilmi tir MA 19 ekil 4.1. FidancıA ve FidancıB den alınan 19 adet Kaman-1 ceviz çö üründe UBC 853 no lu ISSR primerinin amplifikasyon ürünleri. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi, (1. FÜA-K1-1, 2. FÜA-K1-2, 3. FÜA-K1-3, 4. FÜA-K1-4, 5. FÜA-K1-5, 6. FÜA-K1-6, 7. FÜA-K1-7, 8. FÜA-K1-8, 9. FÜA-K1-9, 10. FÜA-K1-10, 11. FÜB-K1-1, 12. FÜB-K1-2, 13. FÜB-K1-3, 14. FÜB-K1-4, 15. FÜB-K1-5, 16. FÜB-K1-6, 17. FÜB-K1-7, 18. FÜB- K1-8, 19. Kaman-1) MA: moleküler a ırlık. ekil 4.1 e bakıldı ında, ISSR UBC 853 no lu primerinin 19 adet Kaman-1 ceviz genotipi ile yapılan PCR amplifikasyonu sonucu olu an ürünlerin elektroforezde ko turulup UV ı ı ı altında çekilen jel resminde toplam 7 adet bandın 5 inin polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i ti i belirlenmi tir. SRAP tekni inde yapılan taramalar sonucunda en polimorfik oldu u belirlenen 10 primer çifti FidancıA ve FidancıB den alınan 18 adet Kaman-1 genotipine uygulanmı ve bu genotipler arasındaki genetik ili ki tespit edilmi tir. 23

41 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Örnek olarak Me3-Em9 primer çiftinin Kaman-1 genotiplerindeki amplifikasyonu sonucu elde edilen ürünlerin gösterildi i jel görüntüsü ekil 4.2. de verilmi tir MA ekil 4.2. FidancıA ve FidancıB den alınan 19 adet Kaman-1 ceviz çö üründe SRAP Me3-Em9 primer çiftinin amplifikasyon ürünleri. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi, (1. FÜA-K1-1, 2. FÜA-K1-2, 3. FÜA-K1-3, 4. FÜA-K1-4, 5. FÜA-K1-5, 6. FÜA-K1-6, 7. FÜA-K1-7, 8. FÜA-K1-8, 9. FÜA-K1-9, 10. FÜA-K1-10, 11. FÜB-K1-1, 12. FÜB-K1-2, 13. FÜB-K1-3, 14. FÜB-K1-4, 15. FÜB-K1-5, 16. FÜB-K1-6, 17. FÜB-K1-7, 18. FÜB- K1-8, 19. Kaman-1 ) MA: moleküler a ırlık. ekil 4.2 incelendi inde, Me3-Em9 primer çiftinin 19 adet Kaman-1 ceviz genotipi ile yapılan PCR amplifikasyonu sonucu olu an ürünlerin elektroforezde ko turulup UV ı ı ı altında çekilen jel resminde toplam 8 adet bandın 4 ünün polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i im gösterdi i belirlenmi tir. ISSR analizlerinde kullanılan primerlerin FidancıA ve FidancıB den alınan çö ürlerde toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri Çizelge 4.1 ve Çizelge 4.2 de verilmi tir. A firmasından alınan Kaman-1 çö ürlerine 15 adet ISSR primerinin uygulanması sonucunda toplam 104 bant elde edilmi olup, 50 tanesinin polimorfik oldu u görülmü tür. Primerlerden ortalama 6.9 tane bant elde edilmi tir. Polimorfizm oranı ise %47.3 olarak tespit edilmi tir. En dü ük polimorfizm oranı 24

42 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN (%16.7) UBC 810 no lu primerden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%87.5) UBC 826 no lu primerden elde edilmi tir. Çizelge 4.1. ISSR primerlerinin FidancıA dan alınan Kaman-1 (FÜA-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. No Primer TBS PBS PO (%) PB AG 1 UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC Toplam Ortalama A firmasından alınan Kaman-1 genotiplerinde ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.71 olarak belirlenmi olup, en yüksek (0.97) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 810 no lu, en dü ük (0.53) polimorfizm bilgi içeri i de eri ise UBC 856 no lu primerden elde edilmi tir. Primerlerin ayırma güçleri (AG) incelendi inde; toplam ayırma gücü de eri olarak bulunmu olup, en yüksek (1.33) ayırma gücü de eri UBC 856 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.36) ayırma gücü de eri UBC 810 no lu primerden elde edilmi tir. B firmasından alınan Kaman-1 fidanlarında ise toplam 109 bant elde edilmi ve 59 tanesinin polimorfik oldu u belirlenmi tir. Primerler ortalama 7.2 tane bant vermi tir. En dü ük polimorfizm oranı (%25) UBC 858 no lu primerden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%75) UBC 834 no lu primerden elde edilmi tir. 25

43 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge 4.2. ISSR primerlerinin FidancıB den alınan Kaman-1 (FÜB-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. No Primer TBS PBS PO PB AG 1 UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC Toplam Ortalama B firmasından alınan Kaman-1 genotiplerinde ise ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.68 olarak bulunmu tur. En yüksek (0.85) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 814 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.38) polimorfizm bilgi içeri i UBC 834 no lu primerden elde edilmi tir. Primerlerin ayırma güçlerine bakıldı ında, toplam ayırma gücü de eri olarak tespit edilmi tir. En yüksek (1.52) ayırma gücü de eri UBC 834 no lu primerden elde edilmi olup, en dü ük (0.71) ayırma gücü de eri ise UBC 853 no lu primerden elde edilmi tir. SRAP analizlerinde A ve B fidan üreticisinden alınan Kaman-1 genotiplerine ait verilerin de erlendirilmesi sonucunda elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri Çizelge 4.3 ve Çizelge 4.4 de verilmi tir. A firmasından alınan Kaman-1 fidanlarına 10 adet SRAP primer çiftinin uygulanması sonucunda toplam 88 bant elde edilmi olup, 40 tanesinin polimorfik oldu u görülmü tür. Polimorfizm oranı ise %44.9 olarak tespit edilmi tir. En yüksek 26

44 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN polimorfizm oranı (%77.8) Me10-Em12 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük polimorfizm (%20) Me3-Em10 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Primer ba ına ortalama 4 polimorfik bant elde edilmi tir. B firmasından alınan Kaman-1 fidanlarında ise toplam 89 bant elde edilmi ve 43 tanesinin polimorfik oldu u görülmü tür. Polimorfizm oranı ise %47.7 olarak belirlenmi tir. En dü ük polimorfizm oranı (%20) Me3-Em10 no lu primer çiftinden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%66.7) Me1-Em10 ve Me3-Em13 no lu primer çiftlerinden elde edilmi tir. Primer ba ına ise ortalama 4.3 polimorfik bant elde edilmi tir. Çizelge 4.3. SRAP primer çiftlerinin FidancıA dan alınan Kaman-1 (FÜA-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. Primer TBS PBS PO (%) PB AG Me1-Em Me2-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me3-Em Me3-Em Me10-Em Toplam Ortalama A firmasından alınan Kaman-1 genotiplerinde toplam 40 polimorfik bant olu mu olup, en yüksek polimorfizm oranı (%77.8) Me10-Em12 primer çiftinden elde edilirken, en dü ük polimorfizm oranı (% 22.2) Me3-Em4 primer çiftinden elde edilmi tir. En fazla polimorfik bant üreten primer çifti Me10-Em12 olarak tespit edilirken, Me3-Em10 primer çifti ise yalnızca bir tane polimorfik bant vermi tir. Tüm primer çiftlerinin ortalama polimorfizm oranı ise %44.9 olarak belirlenmi tir. Ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.72 olarak belirlenmi olup, en yüksek (0.97) polimorfizm bilgi içeri i de eri Me3-Em3 no lu primer çiftinden, en dü ük (0.45) polimorfizm bilgi içeri i de eri ise Me3-Em1 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Primerlerin ayırma güçleri (AG) incelendi inde; toplam ayırma gücü 27

45 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN de eri 8.89 olarak bulunmu olup, en yüksek (1.44) ayırma gücü de eri Me3-Em10 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.30) ayırma gücü de eri Me3-Em3 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Çizelge 4.4. SRAP primer çiftlerinin FidancıB den alınan Kaman-1 (FÜB-K1) genotiplerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. Primer TBS PBS PO (%) PB AG Me1-Em Me2-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me3-Em Me3-Em Me10-Em Toplam Ortalama B firmasından alınan Kaman-1 genotiplerinden ise toplam 89 bant elde edilmi olup, bunların 43 tanesinin polimorfik oldu u görülmü dolayısıyla ortalama polimorfizm oranı % 47.7 olarak belirlenmi tir. En fazla bant üreten primer çifti (12 adet) Me2-Em1 olurken, polimorfik bant bakımından en az bant üreten primer çifti (1 adet) ve en dü ük polimorfizm (%20) oranına sahip primer çifti yine Me3-Em10 olmu tur. Ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.64 olarak belirlenmi tir. En yüksek (0.94) polimorfizm bilgi içeri i de eri Me3-Em3 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.45) polimorfizm bilgi içeri i Me3-Em4 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. SRAP primer çiftlerinin ayırma güçleri incelendi inde, toplam ayırma gücü de eri olarak bulunmu tur. En yüksek (1.44) ayırma gücü de eri Me3-Em4 no lu primer çiftinden elde edilmi olup, en dü ük (0.44) ayırma gücü de eri ise Me3-Em3 no lu primerden elde edilmi tir. A fidan üreticisinden alınan 10 adet çö üre uygulanan ISSR analizleri sonucunda çö ürler birbirlerinden ve Kaman-1 genotipinden genetik olarak farklı 28

46 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN bulunmu tur. A fidancısından alınan çö ürlere uygulanan ISSR, SRAP ve her iki yöntemden (ISSR+SRAP) elde edilen verilerin birlikte de erlendirmesi sonucu ortaya çıkan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.5, Çizelge 4.6 ve Çizelge 4.7 de verilmi tir. Çizelge 4.5. FidancıA dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A A A A A A A A A Kaman Çizelge 4.6. FidancıA dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A A A A A A A A A Kaman Genetik benzerlik indeksleri 0.72 ile 0.86 arasında de i mi tir. UPMGA analizleri sonuçlarına göre genotipler 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta Kaman- 1 genotipi ile birlikte 6 genotip bulunurken ikinci grupta 5 genotip yer almı tır. Kaman-1 e en yakın genotip FÜA-K1-1 olurken, dendrogramda birbirine en yakın iki çö ürün FÜA-K1-4 ile FÜA-K1-8 in (0.86) oldu u belirlenmi tir. En uzak iki çö ür ise FÜA-K1-2 ile FÜA-K1-5 (0.72) olmu tur ( ekil 4.3). 29

47 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge 4.7. FidancıA dan alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A A A A A A A A A Kaman FÜA-K1-1 KAMAN-1 FÜA-K1-4 10MW FÜA-K1-8 FÜA-K1-2 FÜA-K1-3 FÜA-K1-7 FÜA-K1-5 FÜA-K1-6 FÜA-K1-9 FÜA-K1-10 0,77 0,79 0,82 0,84 0,87 ekil 4.3. A fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. A fidan üreticisinden alınan 10 adet çö üre uygulanan SRAP tekni i ile elde edilen verilerden yapılan UPMGA analizleri sonuçlarına göre genel olarak 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta 5 genotip bulunurken ikinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere yine 5 genotip yer almı tır. FÜA-K1-1 no lu genotip ise bu iki grubun dı ında yer almı tır. Birbirine en yakın çö ürler FÜA-K1-5 ile FÜA- K1-6 (0.91) bulunurken, FÜA-K1-2 ile FÜA-K1-3 (0.72) no lu çö ürler birbirine en uzak olarak belirlenmi tir. Kaman-1 genotipine en yakın çö ür ise FÜA-K1-8 olmu tur ( ekil 4.4). A fidan üreticisinden alınan 10 adet fidan çö ürüne uygulanan SRAP ve ISSR tekniklerinden elde edilen verilerin birlikte de erlendirildi i UPMGA 30

48 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN analizleri sonuçlarına göre, çö ürler genel olarak 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 6 genotip bulunurken, ikinci grupta ise 5 genotip yer almı tır. Kaman-1 genotipine en yakın çö ür FÜA-K1-4 (0.84) olmu tur. Birbirine en yakın çö ürler FÜA-K1-1 ile FÜA-K1-4 (0.83) bulunurken, FÜA-K1-2 ile FÜA-K1-3 (0.72) no lu çö ürlerin birbirlerine en uzak oldukları belirlenmi tir ( ekil 4.5). 10MW ,77 0,81 0,84 0,88 0,91 FÜA-K1-1 FÜA-K1-2 FÜA-K1-5 FÜA-K1-6 FÜA-K1-4 FÜA-K1-7 FÜA-K1-3 KAMAN-1 FÜA-K1-8 FÜA-K1-10 FÜA-K1-9 ekil 4.4. A fidan üreticisinden alınan çö ürlere SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 10MW FÜA-K1-1 FÜA-K1-4 FÜA-K1-2 FÜA-K1-7 FÜA-K1-8 KAMAN-1 FÜA-K1-3 FÜA-K1- FÜA-K1-5 FÜA-K1-6 FÜA-K1-10 0,79 0,81 0,83 0,85 0,87 ekil 4.5. A fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR ve SRAP tekniklerinden elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. B fidan üreticisinden alınan 8 adet çö üre uygulanan ISSR analizleri sonucunda genetik benzerlik indeksleri 0.69 ile 0.81 arasında de i mi tir. UPMGA 31

49 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN analizleri sonuçlarına göre, genotipler 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta 4 genotip bulunurken, ikinci grupta Kaman-1 genotipi ile birlikte 5 çö ür yer almı tır. Kaman-1 genotipine en yakını (0.76) FÜB-K1-5 çö ürü olurken, FÜB-K1-1 çö ürü ise en uzak (0.70) genotip olarak belirlenmi tir. Gruplarda en yakın çö ürler FÜB- K1-5 ile FÜB-K1-7 (0.81) olurken en uzak çö ürler FÜB-K1-3 ile FÜB-K1-6 (0.69) olmu tur. UPMGA analizleri sonucunda elde edilen soya acı verilmi tir. ekil 4.6 de 11MW FÜB-K1-1 FÜB-K1-4 FÜB-K1-8 FÜB-K1-6 FÜB-K1-2 FÜB-K1-5 FÜB-K1-7 KAMAN-1 FÜB-K1-3 0,73 0,75 0,77 0,79 0,82 ekil 4.6. B fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. B fidan üreticisinden alınan 8 adet çö üre uygulanan ISSR analizleri sonucunda çö ürler birbirlerinden ve Kaman-1 genotipinden DNA seviyesinde farklı bulunmu olup, çö ürlere test edilen ISSR, SRAP ve her iki yöntemden (ISSR+SRAP) elde edilen verilerin birlikte de erlendirmesi sonucu ortaya çıkan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.8, Çizelge 4.9 ve Çizelge 4.10 da verilmi tir. Çizelge 4.8. FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A A A A A A A Kaman

50 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge 4.9. FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A A A A A A A Kaman Çizelge FidancıB den alınan Kaman-1 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A A A A A A A Kaman B fidan üreticisinden alınan 8 adet çö üre uygulanan SRAP tekni i ile elde edilen verilerden yapılan UPMGA analizleri sonuçlarına göre 2 ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 5 genotip bulunurken, ikinci grupta ise 4 genotip yer almı tır. Birbirine en yakın çö ürler FÜB-K1-1 ile FÜB-K1-5 (0.84) bulunurken, FÜB-K1-4 ile FÜB-K1-8 (0.69) no lu çö ürler birbirine en uzak olarak belirlenmi tir ( ekil 4.7). Kaman-1 genotipine en yakın çö ür ise FÜB- K1-1 (0.85) olmu tur. B fidan üreticisinden alınan 8 adet çö üre uygulanan ISSR ve SRAP tekni i ile elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi ile yapılan UPMGA analizleri sonuçlarına göre 2 grup ortaya çıkmı tır. Birinci grupta 4 genotip bulunurken ikinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 5 genotip yer almı tır. Kaman-1 genotipine en yakın çö ür (0.78) FÜB-K1-5 olurken, FÜB-K1-7 no lu çö ür ise en uzak olarak saptanmı tır. Birbirine en yakın çö ürler FÜB-K1-5 ile FÜB-K1-7 (0.79) 33

51 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN bulunurken, FÜB-K1-3 ile FÜB-K1-8 (0.71) no lu çö ürler birbirine en uzak olarak belirlenmi tir ( ekil 4.8). FÜB-K1-1 KAMAN-1 FÜB-K1-5 11MW FÜB-K1-4 FÜB-K1-3 0,75 0,78 0,80 0,83 0,85 FÜB-K1-2 FÜB-K1-6 FÜB-K1-7 FÜB-K1-8 ekil 4.7. B fidan üreticisinden alınan çö ürlere SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. FÜB-K1-1 FÜB-K1-4 11MW KAMAN-1 FÜB-K1-3 FÜB-K1-2 0,75 0,76 0,77 0,79 0,80 FÜB-K1-5 FÜB-K1-7 FÜB-K1-6 FÜB-K1-8 ekil 4.8. B fidan üreticisinden alınan çö ürlere ISSR ve SRAP tekniklerden elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. A ve B firmasından alınan Kaman-1 ve Kaman 5 genotiplerine ait ISSR analizlerinde toplam 391 bant elde edilmi olup bunların 199 tanesinin polimorfik oldu u görülmü tür. Polimorfizm oranı ortalama %48.8 olarak bulunmu tur. Polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) ortalaması 0.67 olarak tespit edilirken, ayırma gücü (AG) toplamları ortalama olarak saptanmı tır. Potter ve ark. (2002) tarafından yapılan çalı mada; 8 ISSR primerinin 48 ceviz çe idinde amplifikasyonu sonucu 54 bant elde edilmi ve bunların 31 tanesinin (%57) polimorfik oldu u belirlenmi tir. Do an (2006) tarafından yapılan çalı mada 34

52 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN ise 25 ISSR primerinin 62 ceviz çe idine amplifikasyonu sonucunda toplam 181 adet bant elde edilmi bunlardan 129 adedinin polimorfik oldu u görülmü tür. Polimorfizm oranı %71.27 bulunurken, ayırma gücü de eri (AG) toplamı ise olarak belirlenmi tir. Bu çalı mada elde edilen ISSR verileri Potter ve ark. (2002) ve Do an ın (2006) çalı ma sonuçlarına göre daha dü ük bulunmu tur. Bu durum seçilen genotiplerin birbirine daha yakın akraba olmasından kaynaklanmaktadır. Ayrıca bu çalı mada elde edilen ayırma gücü de eri Do an ve ark. (2006) elde ettikleri sonuçlardan 2 kat daha dü ük bulunmu tur. Bu durum Kaman cevizlerinin kendi aralarındaki varyasyonunun daha dü ük oldu unu göstermektedir. Ayrıca SRAP moleküler markör tekni i cevizde ilk defa uygulanması bakımından Kaman-1 çö ürlerinin DNA seviyeinde ayırt edilmesinde etkili bir yöntem olmu tur. Bu sonuç da cevizde SRAP tekni inin genetik olarak birbirlerine benzer genotiplerin ayırt edilmesinde kullanılabilece ini göstermektedir. Elde edilen bu sonuçlara göre, iki farklı fidan üreticisinden alınan Kaman- 1 in tohumundan çıkmı çö ürlerde yapılan ISSR ve SRAP analizleri sonucunda Kaman-1 tohumundan çıkmı bireylerde geni bir varyasyonun oldu u ve a ılamadan bu ekilde kurulacak bahçelerden elde edilecek meyvelerde de geni bir varyasyon olaca ı açıktır. Sonuç olarak Kaman-1 genotipi ile ceviz bahçesi kurulması istenildi inde mutlaka a ılı fidanla kurulması zorunludur. Bu durum da Kaman-1 genotipinin apomiktik meyve üretmedi ini göstermektedir Kaman-5 Do an ve ark. (2006) tarafından daha önce yapılmı olan çalı mada belirlenen polimorfik primerlerden 15 tanesi FidancıA ve FidancıB den alınan 22 Kaman-5 çö ürüne uygulanmı olup, UBC 826 no lu primerin üretmi oldu u bantlar ekil 4.9 de verilmi tir. ekil 4.9 a bakıldı ında UBC 826 no lu primerin 23 adet Kaman-5 ceviz genotipi ile yapılan PCR amplifikasyonu sonucu olu an 8 adet banttan 4 ünün polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i ti i görülmektedir. 35

53 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN MA ekil 4.9. FidancıA ve FidancıB den alınan 22 adet Kaman-5 çö üründe UBC 814 no lu ISSR primerinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi: 1. FÜA-K5-1, 2. FÜA-K5-2, 3. FÜA-K5-3, 4. FÜA-K5-4, 5. FÜA- K5-5, 6. FÜA-K5-6, 7. FÜA-K5-7, 8. FÜA-K5-8, 9. FÜA-K5-9, 10. FÜA- K5-10, 11. FÜB-K5-1, 12. FÜB-K5-2, 13. FÜB-K5-3, 14. FÜB-K5-4, 15. FÜB-K5-5, 16. FÜB-K5-6, 17. FÜB-K5-7, 18. FÜB-K5-8, 19. FÜB-K5-9, 20. FÜB-K5-10, 21. FÜB-K5-11, 22. FÜB-K5-12, 23. Kaman-5. MA: moleküler a ırlık MA 23 ekil FidancıA ve FidancıB den alınan 22 adet Kaman-5 çö üründe SRAP Me2-Em4 primer çiftinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi: 1. FÜA-K5-1, 2. FÜA-K5-2, 3. FÜA-K5-3, 4. FÜA-K5-4, 5. FÜA-K5-5, 6. FÜA-K5-6, 7. FÜA-K5-7, 8. FÜA-K5-8, 9. FÜA-K5-9, 10. FÜA-K5-10, 11. FÜB-K5-1, 12. FÜB-K5-2, 13. FÜB-K5-3, 14. FÜB-K5-4, 15. FÜB-K5-5, 16. FÜB-K5-6, 17. FÜB-K5-7, 18. FÜB-K5-8, 19. FÜB-K5-9, 20. FÜB-K5-10, 21. FÜB-K5-11, 22. FÜB-K5-12, 23. Kaman-5. MA: moleküler a ırlık. SRAP tekni inde ise yapılan taramalar sonucunda en polimorfik oldu u belirlenen 10 primer çifti FidancıA ve FidancıB den alınan 22 adet Kaman-5 36

54 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN genotipine uygulanmı ve bu genotipler arasındaki genetik ili ki ortaya çıkarılmı tır. Me2-Em4 primer çiftinin Kaman-1 genotipindeki amplifikasyonu sonucu elde edilen ürünlerin jel görüntüsü ekil 4.10 de verilmi tir. ekil 4.10 da Me2-Em4 primer çiftinin 23 adet Kaman-5 ceviz genotipi ile yapılan PCR amplifikasyonu sonucu olu an toplam 12 adet banttan 6 sının polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i im gösterdi i belirlenmi tir. ISSR ve SRAP analizlerinde kullanılan ve FidancıA ve FidancıB den alınan çö ürlere uygulanan primerlerin toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerik (PB ) de erleri Çizelge 4.11 ve Çizelge 4.12 de verilmi tir. Çizelge ISSR primerlerinin FidancıA dan alınan Kaman-5 (FÜA-K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. No Primer TBS PBS PO PB AG 1 UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC Toplam Ortalama A firmasından alınan Kaman-5 fidanlarına 15 adet ISSR primerinin uygulanması sonucunda toplam 86 bant elde edilmi olup, 41 tanesinin polimorfik oldu u görülmü tür. Polimorfizm oranı ise %44.7 olarak tespit edilmi tir. UBC

55 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN no lu primer polimorfik bant vermemi tir. En yüksek polimorfizm oranı (%75) UBC 811 no lu primerden elde edilmi tir. Primer ba ına ortalama 2.7 polimorfik bant elde edilmi tir. Primerlerin ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.61 olarak belirlenmi olup, en yüksek (0.99) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 853 no lu primerden, en dü ük (0) polimorfizm bilgi içeri i de eri ise UBC 823 no lu primerden elde edilmi tir. Ayırma güçleri (AG) bakımından; primerlerin toplam ayırma gücü de eri olarak bulunmu tur. En yüksek (1.70) ayırma gücü de eri UBC 811 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.18) ayırma gücü de eri ise UBC 853 no lu primerden elde edilmi tir. Çizelge ISSR primerlerinin FidancıB den alınan Kaman-5 (FÜB-K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. No Primer TBS PBS PO PB AG 1 UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC Toplam Ortalama B firmasından alınan Kaman-5 çö ürlerinde ise toplam 92 bant elde edilmi ve 49 tanesinin polimorfik oldu u belirlenmi olup, ortalama polimorfizm oranı ise %51 olarak hesaplanmı tır. En dü ük polimorfizm oranı (%25) UBC 823, UBC 853 ve UBC 858 no lu primerlerden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%80) 38

56 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN UBC 855 no lu primerden elde edilmi tir. Primer ba ına ise ortalama 3.2 polimorfik bant dü mü tür. Primerlerin ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.68 olarak belirlenmi tir. En yüksek (0.91) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 853 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.14) polimorfizm bilgi içeri i ise UBC 823 no lu primerden elde edilmi tir. Primerlerin toplam ayırma gücü de eri olarak hesaplanmı tır. En yüksek (1.85) ayırma gücü de eri UBC 823 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.62) ayırma gücü de eri ise, UBC 815, UBC 829 ve UBC 853 no lu primerlerden elde edilmi tir. SRAP analizlerinde kullanılan ve FidancıA ve FidancıB den alınan çö ürlere uygulanan primerlerin toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri Çizelge 4.13 ve Çizelge 4.14 de verilmi tir. Polimorfik oldu u tespit edilen 10 adet SRAP primer çiftinin A firmasından alınan Kaman-5 çö ürlerine uygulanması sonucunda toplam 87 banttan 37 tanesinin polimorfik oldu u ve ortalama polimorfizm oranının %41.9 oldu u belirlenmi tir. En yüksek polimorfizm oranı (%62.5) Me3-Em10 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük polimorfizm (%16.7) Me3-Em2 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Primer çiftleri ortalama 8.7 bant üretmi tir. Çizelge SRAP primer çiftlerinin FidancıA dan alınan Kaman-5 (FÜA-K5) çö ürlerinde PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. Primer TBS PBS PO (%) PB AG Me2-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me9-Em Me10-Em Me10-Em Toplam Ortalama

57 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge SRAP primer çiftlerinin FidancıB den alınan Kaman-5 (FÜB-K5) çö ürlerinin PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve ayırma gücü (AG) de erleri. Primer TBS PBS PO (%) PB AG Me2-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me9-Em Me10-Em Me10-Em Toplam Ortalama A firmasından alınan Kaman-5 genotiplerinde ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.56 olarak belirlenmi tir. En yüksek (0.76) polimorfizm bilgi içeri i de eri Me10-Em9 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.39) polimorfizm bilgi içeri i de eri ise Me3-Em2 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Ayırma güçleri (AG) bakımından primer çiftleri kar ıla tırıldı ında; toplam ayırma gücü de eri olarak belirlenmi olup, en yüksek (1.55) ayırma gücü de eri Me3-Em2 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.91) ayırma gücü de eri Me10-Em9 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. B firmasından alınan Kaman-5 çö ürlerinde toplam 89 bant elde edilmi ve 40 tanesinin polimorfik oldu u belirlenmi tir. Polimorfizm oranı ise %45.2 olarak hesaplanmı tır. En dü ük polimorfizm oranı (%33.3) Me2-Em1, Me3-Em2, Me10 Em12 no lu primer çiftlerinden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%62.5) Me6-Em9 ve Me3 Em10 no lu primer çiftlerinden elde edilmi tir. Primerler ise ortalama 8.9 bant üretmi tir. SRAP primer çiftlerinin ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.56 olarak bulunmu tur. En yüksek (0.67) polimorfizm bilgi içeri i de eri Me6-Em7 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.44) polimorfizm bilgi içeri i Me2-Em4 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Primer çiftlerinin toplam ayırma gücü de eri olarak bulunmu tur. En yüksek (1.46) ayırma gücü de eri Me3-Em4 no lu 40

58 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN primer çiftinden elde edilmi olup, en dü ük (0.97) ayırma gücü de eri ise Me10- Em9 no lu primerden elde edilmi tir. A fidancısından alınan çö ürlerde test edilen ISSR, SRAP ve her iki yöntemden (ISSR+SRAP) elde edilen verilerin birlikte de erlendirmesi sonucu ortaya çıkan genetik benzerlik katsayıları Çizelge 4.15, Çizelge 4.16 ve Çizelge 4.17 de verilmi tir. Çizelge FidancıA dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B B B B B B B B B Kaman Çizelge FidancıA dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B B B B B B B B B Kaman A fidan üreticisinden alınan 10 adet Kaman-5 fidan çö ürüne uygulanan ISSR analizi sonucunda çö ürler birbirlerinden ve Kaman-5 genotipinden genel olarak farklı bulunmu tur. Genetik benzerlik indeksleri 0.66 ile 0.89 arasında de i mi tir. UPMGA analizleri sonuçlarına göre genotipler 2 ana gruba ayrılmı tır. 41

59 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Birinci grupta Kaman-5 genotipi ile birlikte 8 genotip bulunurken ikinci grupta 2 genotip yer almı tır. FÜA-K5-2 genotipi bu grupların dı ında yer almı tır. Gruplarda en yakın çö ürler FÜA-K5-4 ile FÜA-K5-8 (0.89) olurken en uzak çö ürler FÜA- K5-2 ile FÜA-K5-5 (0.66) olmu tur. Kaman-5 genotipine en yakın çö ür FÜA-K5-6 (0.86) olurken, en uzak çögür FÜA-K5-2 (0.70) olmu tur. UPMGA analizleri sonucunda elde edilen soya acı ekil 4.11 de verilmi tir. Çizelge FidancıA dan alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B B B B B B B B B Kaman FÜA-K5-1 FÜA-K5-4 FÜA-K5-8 FÜA-K5-5 FÜA-K5-6 31MW 0,71 0,76 0,80 0,85 0,90 KAMAN-5 FÜA-K5-7 FÜA-K5-9 FÜA-K5-3 FÜA-K5-10 FÜA-K5-2 ekil A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. A fidan üreticisinden alınan 10 adet Kaman-5 fidan çö ürüne uygulanan SRAP analizi sonucunda yine çö ürler birbirlerinden ayrılabilmi ve Kaman-5 genotipinden DNA seviyesinde farklı bulunmu tur. Genetik benzerlik katsayıları 42

60 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN 0.74 ile 0.93 arasında de i mi tir. UPMGA analizleri sonuçlarına göre genotipler 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta Kaman-5 genotipi ile birlikte 7 genotip bulunurken, ikinci grupta 4 genotip yer almı tır. Gruplarda en yakın çö ürler FÜA- K5-6 ile FÜA-K5-8 (0.93) olurken, en uzak çö ürler FÜA-K5-1 ile FÜA-K5-7, FÜA-K5-3 ile FÜA-K5-8, FÜA-K5-4 ile FÜA-K5-6 (0.74) olmu tur. Kaman-5 genotipine en yakın çö ür FÜA-K5-5 (0.88) olurken, en uzak çö ür FÜA-K5-2 (0.74) bulunmu tur. UPMGA analizleri sonucunda elde edilen soya acı ekil 4.12 de verilmi tir. 31MW 0,79 0,83 0,86 0,90 0,93 FÜA-K5-1 FÜA-K5-3 FÜA-K5-4 FÜA-K5-5 FÜA-K5-10 KAMAN-5 FÜA-K5-9 FÜA-K5-2 FÜA-K5-7 FÜA-K5-6 FÜA-K5-8 ekil A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. A fidan üreticisinden alınan 10 adet Kaman-5 fidan çö ürüne uygulanan SRAP ve ISSR tekniklerinden elde edilen veriler birlikte de erlendirilmi olup yapılan UPMGA analizleri sonuçlarına göre genel olarak yine 2 ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-5 genotipi dahil olmak üzere 8 genotip bulunurken, ikinci grupta 2 genotip yer almı tır. FÜA-K5-2 no lu genotip bu grupların dı ında yer almı tır. Kaman-5 genotipine en yakın çö ür FÜA-K5-5 (0.86) olmu tur. Birbirine en yakın çö ürler FÜA-K5-4 ile FÜA-K5-5 (0.88) olurken, FÜA-K1-2 ile FÜA-K1-5 (0.71) birbirlerine en uzak çö ürler olarak belirlenmi tir ( ekil 4.13). B fidan üreticisinden alınan 12 adet Kaman-5 çö ürlerine uygulanan ISSR analizleri sonucunda kendi aralarında ve Kaman-5 genotipinden genel olarak farklı bulunmu tur. Genetik benzerlik indeksleri 0.66 ile 0.83 arasında de i mi tir. 43

61 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN UPMGA analizleri sonuçlarına göre genotipler 2 ana gruba ayrılmı tır. Birinci grupta 9 genotip bulunurken ikinci grupta 3 genotip yer almı tır. Kaman-5 genotipi ise bu grupların dı ında yer almı tır. Birbirlerine genetik olarak en yakın çö ürler FÜB-K5-4 ile FÜB-K5-10 (0.83) olurken, en uzak çö ürler FÜB-K5-2 ile FÜB-K5-11 (0.66) olmu tur. UPMGA analizleri sonucunda elde edilen soya acı ekil 4.14 da verilmi tir. 31MW 0,75 0,79 0,82 0,85 0,89 FÜA-K5-1 FÜA-K5-4 FÜA-K5-5 FÜA-K5-3 KAMAN-5 FÜA-K5-6 FÜA-K5-10 FÜA-K5-8 FÜA-K5-7 FÜA-K5-9 FÜA-K5-2 ekil A fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine uygulanan ISSR ve SRAP teknikleri sonuçlarının birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 41MW 0,69 0,73 0,76 0,80 0,83 FÜB-K5-1 FÜB-K5-6 FÜB-K5-9 FÜB-K5-3 FÜB-K5-4 FÜB-K5-10 FÜB-K5-5 FÜB-K5-7 FÜB-K5-2 FÜB-K5-8 FÜB-K5-11 FÜB-K5-12 KAMAN-5 ekil B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. B fidan üreticisinden alınan 12 adet Kaman-5 fidan çö ürüne uygulanan SRAP tekni i ile elde edilen veriler ile yapılan UPMGA analizleri sonuçlarına göre 44

62 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN yine 2 ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-5 genotipi dahil olmak üzere 8 genotip bulunurken, ikinci grupta 4 genotip yer almı tır. FÜB-K5-1 no lu genotip bu grupların dı ında yer almı tır. Kaman-5 genotipine en yakın çö ür FÜB-K5-6 (0.87) olmu tur. Birbirine en yakın çö ürler FÜB-K5-2 ile FÜB-K5-6 (0.88) bulunurken, FÜB-K5-1 ile FÜB-K5-3 (0.71) no lu çö ürler ise birbirine en uzak olarak belirlenmi tir ( ekil 4.15). 41MW 0,76 0,79 0,83 0,86 0,89 FÜB-K5-1 FÜB-K5-2 FÜB-K5-6 FÜB-K5-1 FÜB-K5-9 FÜB-K5-3 FÜB-K5-12 FÜB-K5-4 KAMAN-5 FÜB-K5-5 FÜB-K5-7 FÜB-K5-10 FÜB-K5-8 ekil B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine SRAP tekni inin uygulanması sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. B fidancısından alınan çö ürlere test edilen ISSR, SRAP ve her iki yöntemden (ISSR+SRAP) elde edilen verilerin birlikte de erlendirmesi sonucu ortaya çıkan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.18, Çizelge 4.19 ve Çizelge 4.20 de verilmi tir. B fidan üreticisinden alınan 12 adet Kaman-5 çö ürlerine uygulanan ISSR ve SRAP tekniklerinden ortaya çıkan sonuçların birlikte de erlendirilmesi sonucu elde edilen dendogramda 2 ana grup olu mu tur. Birinci grupta 8 genotip bulunurken ikinci grupta 4 genotip yer almı tır. Kaman-5 genotipi ise bu genotiplerin dı ında yer almı tır. Birbirine en yakın çö ürler FÜB-K5-5 ile FÜB-K5-10 (0.83) bulunurken, FÜB-K5-7 ile FÜB-K5-12 (0.71) no lu çö ürlerin birbirine en uzak oldukları belirlenmi tir ( ekil 4.16). Kaman-5 genotipine en yakın çö ür FÜB-K5-2 (0.78) no lu çö ür iken, en uzak çö ür ise (0.71) FÜB-K5-8 olmu tur. 45

63 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge FidancıB den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B B B B B B B B B B B Kaman Çizelge FidancıB den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B B B B B B B B B B B Kaman A ve B Firmalarından alınan Kaman-1 ve Kaman-5 genotiplerine yapılan SRAP analizleri sonucunda SRAP primer çiftlerinden toplam 353 bant elde edilmi olup bunların 160 tanesinin polimorfik oldu u tespit edilmi tir. Polimorfizm oranı % olarak tespit edilmi tir. SRAP tekni i cevizlerde ilk defa kullanılmı olup Kaman-5 çö ürlerinin birbirlerinden genetik olarak ayırt edilmesinde oldukça ba arılı olmu tur. 46

64 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Çizelge FidancıB den alınan Kaman-5 genotipinin çö ürlerinde ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B B B B B B B B B B B Kaman MW 0,75 0,77 0,79 0,81 0,84 ekil B fidan üreticisinden alınan Kaman-5 çö ürlerine ISSR ve SRAP tekniklerinin sonuçlarının birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. Bu çalı mada elde edilen ISSR verileri Potter ve ark. (2002) ile Do an ın (2006) çalı ma sonuçlarına göre daha dü ük bulunmu tur. Bu durum bu çalı mada kullanılan genotiplerin birbirine daha yakın akraba olmasından yani varyasyonun daha dü ük olmasından kaynaklanmaktadır. FÜB-K5-1 FÜB-K5-2 FÜB-K5-3 FÜB-K5-9 FÜB-K5-6 FÜB-K5-4 FÜB-K5-5 FÜB-K5-10 FÜB-K5-7 FÜB-K5-8 FÜB-K5-11 FÜB-K5-12 KAMAN-5 ki farklı fidancıdan alınan Kaman-5 çö ürlerinde yapılan ISSR ve SRAP analizleri sonucunda Kaman-5 tohumundan çıkmı bireylerde geni bir varyasyonun oldu u belirlenmi tir. Bu nedenle a ılamadan, tohumdan çıkmı çö ürlerle kurulacak 47

65 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN bahçelerden elde edilecek meyvelerde de geni bir varyasyon olacaktır. Sonuç olarak, Kaman-5 genotipi ile ceviz bahçesi kurulması istenildi inde mutlaka a ılı fidanların kullanılması zorunludur. Elde dilen tüm bu sonuçlar Kaman-5 genotipinin apomiktik meyve üretmedi ini açıkça göstermektedir Cevizlerde Apomiksisin Tohumdan Çıkmı ve Meyve Vermeye Ba lamı A açlarda Belirlenmesi Kaman-1 Daha önce Do an (2006) tarafından polimorfik oldu u belirlenen 15 adet ISSR primeri tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı Kaman-1 a açlarında uygulanmı olup, UBC 853 no lu primerin üretmi oldu u bantlar ekil 4.17 de verilmi tir MA ekil Tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-1 ceviz çö ür a acında UBC 853 no lu ISSR primerinin amplifikasyon ürünleri. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi: 19. Tohum-K1-1, 20. Tohum-K1-2, 21. Tohum-K1-3, 22. Tohum-K1-4, 23. Tohum-K1-5, 24. Tohum-K1-6, 25. Tohum-K1-7, 26. Tohum-K1-8, 27. Tohum-K1-9, 28. Tohum-K1-10 ve 29. Kaman-1. MA: moleküler a ırlık. ekil 4.17 incelendi inde, UBC 853 no lu primerin tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-1 ceviz genotipinde yapılan PCR amplifikasyonu sonucunda elde edilen toplam 7 adet bandın 4 ünün polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i ti i belirlenmi tir. 48

66 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN SRAP tekni inde ise yapılan taramalar sonucunda en polimorfik oldu u belirlenen 10 primer çifti tohumdan çıkmı Kaman-1 genotiplerine uygulanmı tır. Örnek olarak Me3-Em9 primer çiftinin Kaman-1 genotiplerindeki amplifikasyonu sonucu elde edilen ürünlerin gösterildi i jel görüntüsü ekil 4.18 de verilmi tir. MA ekil Tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-1 ceviz çö ür a acında SRAP Me3- Em1 primer çiftinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi: 19. Tohum-K1-1, 20. Tohum-K1-2, 21. Tohum-K1-3, 22. Tohum- K1-4, 23. Tohum-K1-5, 24. Tohum-K1-6, 25. Tohum-K1-7, 26. Tohum- K1-8, 27. Tohum-K1-9, 28. Tohum-K1-10 ve 29. Kaman-1. MA: moleküler a ırlık. ekil 4.18 incelendi inde Me3-Em1 primer çiftinin tohumdan çıkmı ve meyveye ba lamı 10 adet Kaman-1 ceviz genotipinde yapılan analizler sonucunda toplam 10 adet bant elde edilmi ve bu bantların yarısı polimorfizm göstermi olup polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i im göstermi tir. Tohumdan çıkmı ve meyveye ba lamı Kaman-1 cevizi çö ürlerine 15 adet ISSR primerinin uygulanması ile elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri Çizelge 4.21 de verilmi tir. Tohumdan çıkmı Kaman-1 a açlarına 15 adet ISSR primerinin uygulanması sonucunda toplam 109 bant elde edilmi olup, 58 tanesi (%51.8) polimorfizm göstermi tir. Primer ba ına ortalama 3.9 polimorfik bant dü mü tür. En yüksek 49

67 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN polimorfizm oranı (%87.5) UBC 826 no lu primerden elde edilirken, en dü ük polimorfizm (%25) UBC 858 no lu primerden elde edilmi tir. Çizelge ISSR primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-1 (Tohum-K1) a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri. No Primer TBS PBS PO PB AG 1 UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC Toplam Ortalama Çalı mada polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) ve ayırma güçleri de (AG) de erlendirilmi olup, tohumdan çıkmı Kaman-1 a açlarında ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.67 olarak saptanmı tır. En yüksek (0.85) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 829 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.45) ise UBC 823 no lu primerden elde edilmi tir. Primerlerin toplam ayırma gücü de eri olarak bulunmu tur, En yüksek (1.45) ayırma gücü de eri UBC 823 no lu primerden elde edilirken, en dü ük (0.64) edilmi tir. ayırma gücü de eri UBC 829 no lu primerden elde Tohumdan çıkmı Kaman-1 cevizi genotiplerine polimorfik oldu u belirlenen 10 adet SRAP primer çifti de uygulanmı tır. Elde edilen amplifikasyon ürünleri aynı ekilde en belirgin bantlar dikkate alınarak var (1) ve yok (0) eklinde de erlendirilmi tir. Verilerin de erlendirilmesi sonucunda elde edilen toplam bant 50

68 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri a a ıdaki Çizelge 4.22 de verilmi tir. Çizelge SRAP primerlerinin tohumdan çıkmı Kaman-1 (Tohum-K1) a açlarında PCR amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), polimorfizm bilgi içeri i (PB ) ve primerin ayırma gücü (AG) de erleri. Primer TBS PBS PO (%) PB AG Me1-Em Me2-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me3-Em Me3-Em Me10-Em Toplam Ortalama Polimorfik oldu u tespit edilen 10 adet SRAP primer çiftinin tohumdan yeti en Kaman-1 genotiplerine uygulanması sonucunda toplam 87 bant elde edilmi olup, 41 tanesinin (%46.5) polimorfizm gösterdi i tespit edilmi tir. En yüksek polimorfizm oranı (%8) Me3-Em13 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük polimorfizm (%14.3) Me3-Em3 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Primer çiftleri ortalama 8.7 bant üretmi tir. Ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.71 olarak belirlenmi olup, en yüksek (0.97) polimorfizm bilgi içeri i de eri Me3-Em3 no lu primer çiftinden, en dü ük (0.51) polimorfizm bilgi içeri i de eri ise Me3-Em4 no lu primer çiftinden elde edilmi tir.toplam ayırma gücü de eri 9.59 olarak belirlenmi olup, en yüksek (1.39) ayırma gücü de eri Me3-Em4 no lu primer çiftinden elde edilirken, en dü ük (0.36) ayırma gücü de eri Me3-Em3 no lu primer çiftinden elde edilmi tir. Tohumdan yeti mi ve meyve vermeye ba lamı 10 adet a açta uygulanan ISSR tekni inden elde edilen veriler ile olu turulan soya acında iki ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 6 genotip 51

69 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN bulunurken, ikinci grupta 5 genotip yer almı tır. Tohumdan çıkmı a açlara test edilen ISSR, SRAP ve her iki yöntemden (ISSR+SRAP) elde edilen verilerin birlikte de erlendirmesi sonucu ortaya çıkan genetik benzerlik indeksleri Çizelge 4.23, Çizelge 4.24 ve Çizelge 4.25 de verilmi tir. Çizelge 4.23 Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında ISSR analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A A A A A A A A A Kaman Çizelge Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A A A A A A A A A Kaman Çizelge Verime ba lamı Kaman-1 a açlarında ISSR ve SRAP analizleri sonucu elde edilen ve Jaccard a göre hesaplanan genetik benzerlik indeksleri. A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A A A A A A A A A Kaman

70 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN Kaman-1 genotipine en yakın çö ür a aç Tohum-K1-5 (0.86) iken, en uzak çö ür a aç ise Tohum-K1-6 (0.68) olarak saptanmı tır. Birbirine en yakın a açlar Tohum-K1-9 ile Tohum-K1-10 (0.92) bulunurken, Tohum-K1-5 ile Tohum-K1-6 (0.66) no lu a açlar birbirine en uzak olarak belirlenmi tir ( ekil 4.19). 19MW 0,73 0,78 0,83 0,88 0,93 TOHUM-K1-1 TOHUM-K1-3 TOHUM-K1-4 TOHUM-K1-2 TOHUM-K1-5 KAMAN-1 TOHUM-K1-6 TOHUM-K1-7 TOHUM-K1-8 TOHUM-K1-9 TOHUM-K1-10 ekil Tohumdan çıkmı a açlara ISSR tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. Tohumdan elde edilmi ve meyve vermeye ba lamı 10 adet a aca uygulanan SRAP tekni inden elde edilen veriler sonucunda olu an dendrogramda iki ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 8 genotip bulunurken, ikinci grupta 3 genotip yer almı tır. Kaman-1 genotipine en yakın çö ür a aç Tohum-K1-1 (0.86) olurken, en uzak çö ür a aç ise Tohum-K1-6 (0.71) olmu tur. Birbirine en yakın çö ür a açlar Tohum-K1-1 ile Tohum-K1-4 (0.84) bulunurken, Tohum-K1-4 ile Tohum-K1-6 (0.69) no lu çö ür a açların birbirine en uzak oldukları belirlenmi tir ( ekil 4.20). Tohumdan elde edilmi ve meyve vermeye ba lamı 10 adet a aca uygulanan ISSR ve SRAP tekniklerinden elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu elde edilen soya acında iki ana grup olu mu tur. Birinci grupta Kaman-1 genotipi dahil olmak üzere 6 genotip yer alırken ikinci grupta ise 5 genotipin bulundu u görülmü tür. Kaman-1 genotipine en yakın çö ür a aç Tohum-K1-5 (0.83) bulunmu tur. Kaman-1 genotipine en uzak çö ür a acın ise Tohum-K1-4 (0.69) oldu u tespit edilmi tir. Birbirine en yakın çö ür a açlar Tohum-K1-9 ile Tohum- 53

71 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN K1-10 (0.86) bulunurken, Tohum-K1-5 ile Tohum-K1-6 (0.69) no lu çö ür a açların ise birbirlerine en uzak oldukları belirlenmi tir ( ekil 4.21). 19MW 0,75 0,78 0,81 0,83 0,86 TOHUM-K1-1 KAMAN-1 TOHUM-K1-4 TOHUM-K1-9 TOHUM-K1-2 TOHUM-K1-3 TOHUM-K1-8 TOHUM-K1-6 TOHUM-K1-5 TOHUM-K1-7 TOHUM-K1-10 ekil Tohumdan elde edilmi a açlara SRAP tekni inin uygulanması ve elde edilen verilerin de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. 19MW 0,75 0,78 0,80 0,83 0,86 TOHUM-K1-1 TOHUM-K1-4 TOHUM-K1-2 TOHUM-K1-3 TOHUM-K1-5 KAMAN-1 TOHUM-K1-6 TOHUM-K1-9 TOHUM-K1-10 TOHUM-K1-7 TOHUM-K1-8 ekil Tohumdan elde edilmi a açlara ISSR ve SRAP tekniklerinin birlikte uygulanması ve elde edilen verilerin birlikte de erlendirilmesi sonucu UPMGA analizi ile elde edilen soya acı. Kaman-1 tohumundan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı Kaman-1 a açlarının DNA seviyesinde kar ıla tırılması sonucu bu çö ür a açların genetik olarak birbirlerinden farklı oldukları belirlenmi tir. Böylece bir önceki bölümde Kaman-1 çö ürleri üzerinde yapılan çalı malar sonucunda elde edilen sonuçlar 54

72 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN bulgular ile benzer sonuçlar elde edilmi olup, Kaman-1 genotipinin apomiktik meyve vermedi i sonucu ortaya çıkmı tır Kaman-5 Tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı 10 adet Kaman-5 a acında daha önce Do an (2006) tarafından polimorfik oldu u belirlenen 15 ISSR primeri uygulanmı olup, UBC 826 no lu primerden bir görünüm ekil 4.22 de verilmi tir. MA ekil Tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-5 ceviz çö ür a acında UBC 826 no lu ISSR primerinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi: 23. Tohum-K5-1, 24. Tohum-K5-2, 25. Tohum-K5-3, 26. Tohum- K5-4, 27. Tohum-K5-5, 28. Tohum-K5-6, 29. Tohum-K5-7, 30. Tohum- K5-8, 31. Tohum-K5-9, 32. Tohum-K5-10 ve 33. Kaman-5. MA: moleküler a ırlık. ekil 4.22 incelendi inde, UBC 826 no lu primerinin tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-5 ceviz genotipi ile yapılan PCR amplifikasyonu sonucu olu an toplam 7 adet bandın 3 ünün polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i ti i belirlenmi tir. SRAP tekni inde ise yine daha önce yapılan taramalar sonucunda en polimorfik oldu u belirlenen 10 primer çifti tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı a açlarda uygulanmı tır. Örnek olarak Me2-Em4 primer çiftinin jel görüntüsü ekil 4.23 de verilmi tir. ekil 4.23 incelendi inde, Me2-Em4 primer çiftinin tohumdan çıkmı ve meyve vermeye ba lamı 10 adet Kaman-5 ceviz genotipi ile yapılan PCR 55

73 4. BULGULAR ve TARTI MA Serkan AKCAN amplifikasyonu sonucu ortaya çıkan toplam 9 adet bandın 4 ünün polimorfik oldu u ve bu polimorfik bantların büyüklüklerinin bç arasında de i iklik gösterdi i belirlenmi tir. MA ekil Tohumdan çıkmı 10 adet Kaman-5 ceviz çö ür a acında SRAP Me2- Em4 primer çiftinin amplifikasyonu. Sırası ile çe it ve genotiplerin isim listesi(23. Tohum-K5-1, 24. Tohum-K5-2, 25. Tohum-K5-3, 26. Tohum- K5-4, 27. Tohum-K5-5, 28. Tohum-K5-6, 29. Tohum-K5-7, 30. Tohum- K5-8, 31. Tohum-K5-9, 32. Tohum-K5-10 ve 33. Kaman-5 ) MA: moleküler a ırlık. ISSR analizlerinde kullanılan primerlerden elde edilen toplam bant sayıları (TBS), polimorfik bant sayıları (PBS), polimorfizm oranı (PO), ayırma gücü (AG) ve primerlerin polimorfizm bilgi içerikleri (PB ) de erleri Çizelge 4.26 da verilmi tir. Tohumdan çıkan ve meyve vermeye ba lamı Kaman-5 genotiplerinde kullanılan ISSR primerleri toplam 87 bant vermi olup 43 tanesinin (%47.2) polimorfizm gösterdi i belirlenmi tir. En dü ük polimorfizm oranı (%25) UBC 854 no lu primerden elde edilirken, en yüksek polimorfizm oranı (%80) UBC 811 ve UBC 855 no lu primerlerden elde edilmi tir. Primer ba ına ise ortalama 2.8 polimorfik bant dü mü tür. Primerlerin ortalama polimorfizm bilgi içeri i de eri 0.64 olarak belirlenmi tir. En yüksek (0.88) polimorfizm bilgi içeri i de eri UBC 815 ve UBC 846 no lu primerlerden elde edilirken, en dü ük (0.32) polimorfizm bilgi içeri i UBC 856 no lu primerden elde edilmi tir. Primerlerin toplam ayırma gücü de eri