Karbonhidrat Deneyleri. Yrd. Doç. Dr. Serkan SAYINER Yakın Doğu Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı

Transkript

1 Karbonhidrat Deneyleri Yrd. Doç. Dr. Serkan SAYINER Yakın Doğu Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı

2 Karbonhidrat Deneyleri Bitkiler tarafından fotosentez olayı sırasında üretilen karbonhidratlar doğada bitkisel,hayvansal ve tek hücreli organizmalarda yaygın halde bulunan maddelerdir. Bir karbonhidrat olan nişasta tohumlarda, meyvelerde ve köklerde bulunur. Glikojen hayvanların vücudunda depo edilen ve onlar için enerji kaynağı olan bir karbonhidrattır. Selüloz, bitkilerde destek dokusu görevi yapar ve hücre duvarının başlıca yapı maddesini oluşturur. Bakteri hücre duvarları da peptidoglikan denen karbonhidrat kapsar.

3 Karbonhidrat Deneyleri Karbonhidratlar, Polihidroksilli alkollerin aldehit veya keton türevleri (monosakkaritler), Bunların polimerleri (di, oligo ve polisakkaritler), Oksidasyon ürünleri (şeker asitleri), Redüksiyon ürünleri (şeker alkolleri), Substitüsyon ürünleri (amino şekerler) ile sülfatlı ve fosfatlı esterleri olarak tarif edilir.

4 Monosakkaritler Monosakkaritler hidroliz olduklarında daha basit şekle dönüşmeyen karbonhidratlardır. Karbon atomları sayısına göre trioz, tetroz, pentoz, heksoz ve heptozlar olarak ayrılırlar ve kapsadıkları aldehit veya keton grubuna göre aldozlar ve ketozlar olarak bilinirler. Monosakkaritler sahip oldukları aldehit ve keton grupları ile ortamda var olan bakır, gümüş gibi iyonları redükleyebilirler.

5 Disakkaritler Disakkaritler hidroliz olduklarında iki molekül aynı veya farklı monosakkarit veren karbonhidratlardır. Sakkaroz, laktoz ve maltoz bu gruba örnek oluştururlar. Sakkaroz şeker kamışı,şeker pancarında bulunur. Sofra şekeri olarak bilinir. Bitkilerin yeşil yapraklarında sentez edildikten sonra bitkilerin diğer kısımlarına taşınır ve orada depo edilir. Glikoz ve fruktoz monosakkaritlerinin α;1 2 glikozid bağı (trehaloz tip) ile birleşmesinden oluşan disakkarittir. Serbest aldehit veya keton grubu içermediğinde sakaroz redükleyici bir şeker değildir.

6 Disakkaritler Laktoz (süt şekeri) da bir disakkarittir. Galaktoz ve glikozun β;1 4 glikozidik bağ ile birleşmesinden oluşmuştur. Serbest bir aldehit grubu içerir ve bu nedenle de redükleyici özellikte bir şekerdir. Maltoz da redükleyici bir disakkarittir. İki glikoz molekülünün α;1 4 glikozidik bağ ile birleşmesinden meydana gelmiştir ve serbest bir aldehit grubuna sahiptir.

7 Polisakkaritler Çoğu karbonhidratlar tabiatta polisakkarit denilen yüksek molekül ağırlıklı polimerler olarak bulunurlar. D-glikoz polisakkarit yapısında en sık yer alan bir monosakkarittir. D-mannoz,D-galaktoz, D-ksiloz, L-arabinoz,D-glikuronik asit, D- galakturonik ve D-mannuronik asitler, D-galaktozamin ve nöraminik asitlere de rastlanır. Polimerler tek tip monosakkaritten oluşuyorsa homopolisakkarit (homoglikan),birden fazla tipte monosakkarit kapsıyorsa buna heteropolisakkarit (heteroglikan) denir.

8 Polisakkarit Tür Monosakkarit birimleri Nişasta -Amilaz -Amilopektin Bazı Polisakkaritlerin Yapısı Ve Fonksiyonları Homo- Homo- (α1 4) Glu, linear (α1 4) Glu (α1 6) Glu, dallanma noktaları her Monosakkarit birim sayısı ya kadar Fonksiyonları Bitkilerde enerji deposu Glikojen Homo- (α1 4) Glu, dallanma noktaları her e kadar Bakteri ve hayvan hücrelerinde enerji deposu Selüloz Homo- (β1 4) Glu e kadar Bitkilerin hücre duvarlarına şekil verir ve dayanıklılık sağlar. Kitin Homo- (β1 4) N-asetilglikozamin Çok büyük Böceklerin, örümceklerin ve kabukluların dış iskeletine sertlik verir ve dayanıklılık sağlar. Dekstran Homo- (α1 6)Glu, (α1 3)Glu, dallanma noktaları Peptidoglikan Hetero- peptidler ekli N-asetilmuramik asit (β1 4) N-asetilglukozamin (β1 Değişken büyüklükte Çok büyük Bakterilerde hücre dışı adeziv Bakterilerin hücre zarfına dayanıklılık ve sertlik verir. Agaroz Hetero- D-Gal(β1 4) 3,6-anhidro- L -Gal (α Alglerde hücre duvarını oluşturur. Hyalüronan (glikozaminoglikan) Hetero-;asidik GluA(β1 3) N- asetilglukozamin (β e kadar Omurgalılarda, cilt ve bağ dokusunun hücre dışı matriksi; Glikan eklemlerde viskozite ve kayganlık sağlar.

9 Karbonhidratların Üzerine Alkalilerin Etkisi Kuvvetli alkaliler monosakkaritlerin polimerize olmalarına sebep olur. Oligosakkaritler ve polisakkaritler sulandırılmış alkalilerle hidroliz olmazlar ancak, hidroksil iyonları(oh) polisakkariti kuran basit şekerlerin yapısını bozar. Sulandırılmış alkalilerle muamele edilen monosakkaritlerde 1 ve 2 numaralı karbonlar etrafında yeniden tertiplenme olur. Bu olay bir enol ara madde üzerinden gerçekleşir (enel-diol veya di-enol) ve enolizasyon olarak isimlendirilir.

10 Karbonhidratların Üzerine Alkalilerin Etkisi Enolizasyon, aldehit ve ketonların genel bir fenomenedir. Bir C atomundan, komşu karbonil grubunun (aldehit veya keton grubu) oksijenine bir protonun göç etmesi ile doymamış alkol, yani bir enol oluşturması olayına enolizasyon denir. Bu olay sonrası meydana gelen ürünlere de enodiol denir.

11 Karbonhidratların Üzerine Alkalilerin Etkisi Kuvvetli alkali ortamlarda, enediol formların tepkime yetenekleri çok yükselir. Yoğun alkali ortamlarda, monosakkarit çözeltiler, iyice karıştırıldıktan sonra kaynatılırsa, sarı kırmızı kahverengi biçimde renk değişmesi görülür. Renk değişimi sonunda reçine özelliğinde maddeler oluşur. Bu sırada da karamel kokusu duyulur.

12 Moore Deneyi Deneyin prensibi Alkali ortamda ısı etkisiyle şekerin 1 ve 2 numaralı karbon atomları arasında yeniden tertiplenme ile redükleyici özellikle sarı renkli di-enol gruplarının teşekkülü esasına dayanır. Deneyin için gerekli kimyasal maddeler Glikoz çözeltisi ve %10 luk NaOH çözeltisi Deneyin yapılışı Bir deney tüpüne alınan 2 ml glikoz çözeltisi 1 ml kadar %10 luk NaOH çözeltisi ile karıştırılır ve ısıtılırsa, karışımın rengi sarı olur. Daha sonraki kahve rengine dönüşür. Renk değişimi sonunda reçine özelliğinde maddeler oluşur. Bu sırada da karamel kokusu duyulur. Deney sırasında kuvvetli redükleyici parçalanma ürünleri oluşur ve bunlara «Redükton» lar denir.

13 MOORE Deneyi

14 Karbonhidratların Redükleme Özelliklerine Dayanan Deneyler Bu grupta yer alan üç deneyinde (Fehling, Benedict ve Barfoed) çalışma prensipleri aynı esasa dayanır. Tek fark, ilk iki deneyde ortam alkali iken Barfoed deneyinde ortamın hafif asit oluşudur. Deneylerin ortak prensibi Serbest aldehit yada keton grubuna sahip şekerler alkali ortamda ısı ve etkisi ile ağır metal hidratlarını (Cu,Bi,Ag) redükleme özelliği gösterirler. Deney sırasında şekerler oksitlenirler ve şeker asitlerini (aldonik asitler) verirler.

15 Fehling Deneyi Deney için gerekli kimyasal maddeler %0,2 lik glikoz çözeltisi Fehling A çözeltisi. Bunun için g CuSO 4 tamamlanır.,5h 2 O tartılıp,biraz suda çözülür ve su ile litreye Fehling B çözeltisi. Bu çözeltiyi hazırlanırken 250 g NaOH suda çözülür ve üzerine 346 g potasyum tartarat eklenerek su ile litreye tamamlanır. Maltoz, laktoz ve sakkaroz çözeltisi.

16 Fehling Deneyi Deneyin yapılışı Bir deney tüpüne önce 1 ml Fehling A, 1 ml Fehling B çözeltisi konup, karşılaştırılarak Fehling ayıracı hazırlanır. Fehling A ve B çözeltileri birbirleriyle karıştıktan sonra uzun süre dayanmaz. Bu nedenle ayrı ayrı şişelerde muhafaza edilirler ve test öncesi eşit miktarları karıştırılarak kullanılır. Diğer bir deney tüpüne 2 ml % 0.2 lik glikoz çözeltisi ve üzerine yukarıda hazırlanan 2 ml Fehling ayıracı ilave edilir. İçerik homojen oluncaya kadar karıştırılır. Tüp daha sonra kaynar su banyosuna bırakılır. Önce sarı sonra yeşilimsi ve en sonunda tuğla kırmızısı bir tortu reaksiyonun pozitif olduğunu gösterir. Kırmızı tortu iki değerli bakır iyonlarının (Cu +2 ) bir değerli bakıra (Cu + ) indirgendiğini gösterir.

17

18 Fehling Deneyi Cu ++ + Glikoz Cu + + Glikonik asit Deneyin başında oluşan sarı renk CuOH den ileri gelir. Daha sonra bunun da su kaybetmesi ile kırmızı renkli Cu 2 O meydana gelir. 2Cu OH OH 2CuOH + H 2 O + O sarı 2CuOH Cu O + H 2 O Cu kırmızı

19 Fehling Deneyi Fehling çözeltisinde bulunan NaOH, glikozun reaksiyon yeteneğini artırır, potasyum sodyum tartarat (senyet tuzu) ise reaksiyon sırasında oluşan Cu(OH) 2 nin çökmesini önler ve eriyik halde kalmasını sağlar. Diyabetlilerin idrarlarında şeker (glikoz) varlığını göstermede Fehling deneyinden yararlanılabilir. Üratlar ve kreatinin Fehling ayıracını redüklerler. Muhafaza etmek amacıyla idrara kloroform ilavesi de benzer etki gösterir.

20 Benedict Deneyi Deney için gerekli kimyasal maddeler Benedict Ayıracı 73 g sodyum sitrat ve 100 g anhidr sodyum karbonat bir miktar suda eritilir ve hızla karıştırılmak suretiyle sitrat karbonat çözeltisine eklenir. Daha sonra ayıraç su ile litreye tamamlanır. Bu ayıraç uzun süre bozulmadan bekletilebilir. Fehling ayıracındaki NaOH in yerini %10 luk Na 2 CO 3 (sodyum karbonat) ve senyet tuzununkini %20 sodyum sitrat almıştır. Benedict ayıracı Fehling ayıracı kadar alkali değildir ve ne üratlarla,ne kreatininle, ne de kloroformla redüklenir. Bu nedenle patolojik idrarlarla,glikozun varlığını göstermede Fehling deneyine tercih edilir. Ayrıca,bu deney Fehling deneyinden daha duyarlıdır. Glikoz Çözeltisi

21 Benedict Deneyi Deneyin yapılışı Deney tüpüne alınan 3 ml Benedict ayıracına 10 damla glikoz çözeltisi ilave edilir. Karıştırılarak tüpün içeriği homojen hale getirilir ve kaynamakta olan su banyosunda bir kaç dakika tutulur. Soğumaya bırakılır. Sarımsı bir tortulaşmanın görülmesi şekerin redükleyici bir şeker olduğunu gösterir. Şeker çözeltisinin hacmini artırarak yoğun ve kırmızı bir tortu elde edilebilir. Örneğin; 3 ml glikoz çözeltisi ile kırmızı bir tortu elde edilir. Şeker miktarına göre yeşil-sarı, turuncu, kırmızı renk elde edilebilir.

22 Farklı monosakkarit konsantrasyonlarına ait Benedict Test sonucu

23 Barfoed Deneyi Bu deney indirgeyici özelliğe sahip ve konsantrasyonları aynı olan disakkaritleri monosakkaritlerden ayırt etmeye yarar. Monasakkaritler zayıf asit ortamlarda da redükleyici özellik gösterirken disakkaritlerde bu özellik yok denecek kadar azdır. Bu nedenle Barfoed deneyinde disakkaritler bu özellik belli bir süre sonra hidroliz olmaları sonucunda gecikmeli olarak ve çok az miktarda redükleme özelliği gösterirler. Karbonhidratlar arasında bu farkı özellik barfoed deneyinin prensibini teşkil eder.

24 Barfoed Deneyi Deney için gerekli kimyasal maddeler Barfoed Ayıracı 66 g bakır asetat bir miktar suda çözülür ve üzerine 10 ml glasiyel asetik asit eklenir. Daha sonrasu ile litreye tamamlanır. Glikoz çözeltisi Laktoz çözeltisi Sakkaroz çözeltisi

25 Barfoed Deneyi Deneyin Yapılışı Yaklaşık 5 ml barfoed ayıracına 0.5 ml kadar şeker çözeltisi (glikoz,laktoz ve sakkaroz olarak ayrı ayrı tüplerde) eklenir. Tüpler kaynamakta olan su banyosuna aynı anda bırakılarak redüklenme için geçen süreye ve tortulaşma oranına dikkat edilir. Kırmızı bir tortu veya kırmızı bir bulutlanma reaksiyonu (+) olduğunu gösterir. Deney sonucu üç şeker içinde karşılaştırılır. Ksiloz Glikoz Fruktoz Laktoz Sakkaroz

26 Şekelerin Asit Oramdaki Davranışları (Furfural Teşkili) Deneylerin ortak prensibi Yoğun asit ortamlarda, kaynatılmak suretiyle monosakkarit molekülü 3 mol H 2 O kaybaderek dehidratasyona uğrar. Bunun sonucunda pentozlardan furfural, heksozlardan 5-hidroksi-metil furfural meydana gelir. Bu bileşiklerin en önemli özelliği orsin, floroglusin, rezorsin, alfa-naftol gibi bazı aromatik bileşiklerle (polifenoller) kondanse olarak renk reaksiyonları vermesidir. Molisch deneyi (alfa-naftol, menekşe, genel KH tanıma deneyi), Seliwanoff (Rezorsin, pembe, ketoheksoz). Pentozlar orsin ile yeşil, floroglusin ile kırmızı renk verirler ve pentozların tanınmasında yardımcı olur.

27 Molisch Deneyi İster serbest isterse proteine bağlı olsun tüm şekerler bu reaksiyonu verirler. Bu nedenle, Molisch deneyi birkaç istisna dışında şekerleri genel tanınma reaksiyonudur. Bu istisnalar amino şekerler, şeker alkolleri ve karboksilik asitler, bazı keturonik asitler ve dihidrokiasetondır. Deney için gerekli kimyasal maddeler Molisch Ayıracı α-naftolün alkoldeki % 1 lik çözeltisidir. %0.2 lik glikoz çözeltisi (Ayrıca sakkaroz, maltoz ve laktoz çözeltisi)

28 D-Glikoz 5-Hidroksimetil furfural 5-Hidroksimetil furfural α-naftol Mor renkli boya

29 Molisch Deneyi Deneyi Yapılışı Bir deney tüpüne 2 ml % 0.2 lik glikoz çözeltisi konur. Üzerine Molisch ayıracı yaklaşık 6 damla eklenir. Sonra tüp 45 derece eğik tutularak kenarından dibe akıtılmak suretiyle yaklaşık 2 ml yoğun H 2 SO 4 ile tabaka teşkil edilir. Sıvıların temas yüzeyinde mor-menekşe bir renk oluşması reaksiyonun pozitif olduğunu gösterir. Deney sakkaroz, maltoz ve laktoz çözeltisi ile tekrarlanabilir.

30 Seliwanoff Deneyi Ketoheksozlar sıcakta HCl etkisine aldoheksozlara oranla çok az dayanıklıdırlar. Bunlar, rezorsinol (1-3 dihidrokisbenzen) ile reaksiyona girerek karakteristik kırmızı renkli bir kompleks oluşturan hidrosimetil furfuralı verirler. Aynı şartlarda, glikoz renk oluşturmaz bunun için glikozu daha uzun süre kaynamak gerekir. Sakkaroz HCl ile ısıtma işlemi sırasında hidroliz olur ve böylece serbest kalan fruktoz pozitif reaksiyon verir.

31 D-Fruktoz 5-Hidroksimetil furfural Rezorsin Kiraz kırmızısı renkli madde

32 Seliwanoff Deneyi Deney için gerekli kimyasal maddeler Seliwanoff Ayrıca 0.5 g Rezorsin 330 ml yoğun HCl de eritilir ve distile su ile litreye tamamlanır. %1 lik fruktoz çözeltisi. (Ayrıca %1 lik sakkaroz çözeltisi, glikoz çözeltisi) Deneyin yapılış Bir deney tüpünde 5 ml seliwanoff ayıracı üzerine % 1 lik fruktoz çözeltisinden 5-6 damla eklenir ve kaynamakta olan su banyosunda, kırmızı renk oluşuncaya kadar bekletilir. Deney %1 lik sakkaroz ve glikoz çözeltileri ile birlikte tekrarlanır ve sonuçlar karşılaştırılır.

33 Bial Deneyi Pentozları tanıma deneyidir. Deney için gerekli kimyasal maddeler Bial Ayıracı 3 g orsin 1 litre yoğun HCl de eritilir ve üzerine %1 lik FeCl 3 çözeltisinden 3 ml eklenir. Ksiloz çözeltisi Glikoz çözeltisi Sakkaroz çözeltisi

34 Pentoz furfural orsin Mavi-yeşil kompleks Heksoz 5-hidroksimetil furfural orsin Kahverengi kompleks

35 Bial Deneyi Deneyin yapılışı Bir deney tüpünde 3 ml bial ayıracına 5 ml ksiloz çözeltisi eklenir ve bir dakika kaynatılır. Mavi-yeşil renk teşekkülü pentozlar için reaksiyonun pozitif olduğunu gösterir. Pentozlar, triozlar ve üronik asitler (örneğin glikuronik asit) pozitif reaksiyon verirler. Deney glikoz ve sakkaroz kullanarak tekrarlanır ve sonuçlar rapor edilir. Heksozlar deney sonunda kahverengi veya gri tonlu bir renkli bileşik oluştururlar.

36 Anilin Deneyi (Anilin asetat testi) Deneyin prensibi Bial testinde olduğu gibi bu test de furfural türevlerinin oluşması ve tayin edilmesine dayanan bir testtir. Glikuronik asit Bial testi ile pozitif reaksiyon verdiği halde anilin testini negatif verir. Deney için gerekli kimyasal maddeler Anilin, Glasiyel asetik asit, Ksiloz çözeltisi Deneyin yapılışı 1 ml ksiloz çözeltisi üzerine 1 ml glasiyel asetik asit ile 3 damla anilin ilave edilir. Birkaç dakika kaynatılır ve soğuması için 2 dakika bekletilir. Açık kırmızı bir rengin oluşması pentozlar için pozitif sonucu gösterir. Heksozlar furfural bileşik ve dolayısı ile renk oluşturmaz.

37 Sakkarozun Hidrolizi Deneyin prensibi Hidroliz, bir molekülün su alarak kendini kuran alt moleküllere parçalanması olayıdır. Hidroliz kimyasal olarak (asitle kaynatarak) yada enzimatik olarak (ekmek mayası, şarap mayası veya bira mayası) gerçekleştirir. Deney için gerekli kimyasal maddeler Sakkaroz çözeltisi Konsantre HCl NaOH çözeltisi Ekmek mayası çözeltisi

38 Sakkarozun Hidrolizi Sakkarozun asitle hidrolizi Yaklaşık 5 ml sakkaroz çözeltisi, 2.5 ml distile su ve 0.5 ml konsantre HCl ile karıştırılıp su banyosunda 10 dakika ısıtıldıktan sonra soğutulur. Daha sonra NaOH ile nötralize edilir sonra soğutulur. NaOH ile nötralize edildikten sonra Fehling deneyi çalışır ve sonuç raporlanır. Sakkaroz hidroliz öncesi Fehling deneyini pozitif vermez. Bunun sebebi redükleyici olmamasıdır. Asitle ısıtma sırasında sakkaroz glikoz ve fruktoz moleküllerine parçalandığından redükleyici özellik kazanır. Sakkaroz + H 2 O Glikoz + Früktoz

39 Sakkarozun Hidrolizi Sakkarozun maya ile hidrolizi Sakkaroz asitle hidroliz edildiği gibi maya ile de hidroliz edilebilir. Birkaç ml sakkaroz çözeltisi üzerine 1 ml ekmek mayası çözeltisi ilave edilerek bir müddet 37ºC lik su banyosunda ısıtılır. Bu esnada enzimin etkisiyle sakkaroz glikoz ve fruktoza parçalanır. Daha sonra Fehling deneyi yapılır ve sonucun pozitif olduğu görülür. Diğer indirgenme deneyleride yapılabilir.

40 Ozazon Reaksiyonu Bu reaksiyon, deney sonunda elde edilen kristallerin karakteristik şekilleri yardımıyla redükleyici şekerlerin birbirlerinden ayırtedilmesini sağlar. Deneyin prensibi Çeşitli şekerlerin fenilhidrazin ile teşkil ettikleri sarı ozazon kristalleri mikroskop altında incelenirse birçoğunun farklı şekilde oldukları görülür. Bütün α -hidroksi karbonil bileşikleri ozazon teşkil etmek üzere fenilhidrazin ile reaksiyona girerler. Redükleyici şekerlerin hepsi fenilhidrazin ile ozazon teşkil ederler. O halde, sakkaroz ozazon vermez.

41 Ozazon Reaksiyonu Ozazon teşekkülü 1. ve 2. karbon atomlarındaki konfigürasyonu bozar. Bu nedenle yalnız 1. ve 2. karbon atomlarındaki konfigürasyonların farklı olmasıyla birbirinden ayrılan şekerler (glikoz, fruktoz ve mannoz) aynı ozazonu verirler.

42 Ozazon Reaksiyonu Deney için gerekli kimyasal maddeler % 0.2 lik glikoz, fruktoz, maltoz ve laktoz çözeltileri Taze hazırlanmış fenilhidrazin-klorhidrat + sodyum asetat + asetik asit karışımı. Deneyin yapılışı Deney tüplerine sırası ile 3 er ml şeker çözeltileri ve yine her birine 3 er ml hazırlanan taze ayıraçdan eklenir. Tüpler karıştırılır ve kaynamakta olan su banyosuna bırakılır. Çok sayıda sarı kristaller görülünceye kadar bu şekilde bekletilir. Kristalleşme görülen tüp su banyosundan alınır ve bir tüp taşıyıcısında soğumaya bırakılır.

43 Ozazon Reaksiyonu Her şeker için kristalleşme süresi de kaydedilir. Soğudukça kristaller yoğunlaşır (ozazon). Bir pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine bu kristallerden bir miktar alınır ve mikrospkopta incelenir. Kristallerin şekilleri çizilir. Glikoz ve fruktoz çabuk kristal verirler ve oluşan kristtallerin şekli aynı olup ekin demetleri şeklindedir. Laktoz ve maltoz çok daha uzun sürede (yaklaşık 30 dakika içinde) ozazon kristalleri verirler. Laktozazon 100 ºC de oluşan düzensiz ince iğnecikler kristalleşir (at kestanesi). Maltozazon ise 206 ºC oluşan geniş tabetler şeklinde kristalleşir(ay çiçeği).

44 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Deneyin prensibi Polisakkaritler iyotu, moleküllerin büyüklüğüne göre, farklı şekilde absorbe ederler ve renkli bir kompleks verirler. Kompleks ısıda yıkılır ve soğutma sırasında tekrar şekillenir. Nişastanın iyot ile mavi renk vermesi onun tanınmasında kullanılır. Yine mineral bir asitle (HCl) nişasta hidroliz edilir ve hidroliz safhaları iyot ile verdiği değişik renklerden izlenir. Sırasıyla amilodekstrin (menekşe), eritrodekstrin (kırmızı) ve akrodekstrin (renksiz,sadece iyotu kendi rengi hakim) safhalarından (kısmi hidroliz) sonra Fehling deneyinin pozitif vermesi ile hidrolizin tamamlandığı (tam hidroliz) anlaşılır.

45 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Deney için gerekli kimyasal maddeler 2 g Nişasta İyot veya dilüe lügol eriyiği Nişastanın asitle hidrolizi Yaklaşık 2 g nişasta bir deney tüpüne konur, üzerine ml soğuk distile su ilave edilir ve iyice karıştırılarak bir süspansiyon teşkil edilir. Bu süspansiyon bir beherde kaynamakta olan 100 ml suya devamlı karıştırmak suretiyle ilave edilir. Elde edilen süspansiyon farklı uygulamalar yapılır.

46 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Nişasta süspansiyonundan bir deney tüpüne yaklaşık 1 ml alınır ve tüp musluk altında tutularak su ile soğutulur, üzerine 1 damla iyot veya dilüe lügol eriği ilave edilir. Oluşan mavi renkli çözelti kaynayıncaya kadar ısıtılır ve tekrar soğutulur. Sonuç kaydedilir. Süspansiyona Fehling deneyi yapılır ve sonuç kaydedilir. Nişasta süspansiyonundan bir deney tüpüne 5 ml konur, üzerine 2 ml %5 lik NaOH ilave edilir. Kaynayıncaya kadar ısıtılır ve bundan sonra ısıtmaya da 2 dakika devam edilir. Sonra soğutulur ve üzerine 1 damla yoğun HCl ilave ederek nötralize edilir ve bu karışımla Fehling deneyi yapılır. Sonuç kaydedilir.

47 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Beherde kalan nişasta süspansiyonu üzerine 5 ml yoğun HCl ilave edildikten sonra bunun 15 ml kısmını bir deney tüpüne alıp bir beherde kaynamakta olan suya daldırılır ve burada dakika bırakılır. Bu suretle nişasta su alarak hidroliz olur. Hidrolizin başlangıç safhasında küçük bir örnek alınıp iyot eriyiği veya lügol eriyiği ilave edilirse mavimsi kırmızı renk verir. Bu, amilodeksitrinin teşekkül ettiğini gösterir. Daha bir müddet geçtikten sonra tekrar küçük bir örnek alınıp iyot eriyiği veya lügol eriyiği ile kontrol edilirse kırmızı renk verir. Bu da eritrodekstrin teşekkülünü gösterir. Tekrar bir müddet geçtikten sonra yine küçük bir örnek alınıp iyot eriyiği veya lügol eriyiği ile muamele edilirse renk teşekkül etmez. Bu da aksodekstin teşekkülünü gösterir. Daha sonra Fehling deneyi uygulanır ve sonuç kaydedilir.

48 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Nişastanın tükrükle hidrolizi Nişasta tükürükle ve bağırsak salgısında bulunan amilazlar tarafından da hidroliz edilebilir Deneyin yapılışı Bir deney tüpüne 5 ml kadar nişasta süspansiyonu alınır. Üzerine 1 damla iyot çözeltisi (veya dilüe lügol) eklenerek mavi rengin oluşması sağlanır. Daha sonra bu karışım ikinci bir tüpte toplanmış olan tükürük üzerine eklenip karıştırılır ve 37ºC lik bir su banyosunda kendi haline bıraklılır. Rengin hızla açıldığı gözlenir. Tükürükteki amilaz etkisiyle nişasta molekülünün parçalanmaya başlaması iyot ile olan bağının çözülmesine ve rengin açılmasına neden olur.daha ileri derecede bir hidroliz mavi renk tamamen kaybolur.

49 Nişastanın Hidrolizi ve İyot Testi Yaklaşık 2 ml tükürük 8 ml kadar su ile karıştırılır. Bu karışım numaralanmış 4 tüpe eşit olarak paylaştırılır. Tüplerden her birine 2 ml kadar %0.5 lik nişasta süspansiyonundan eklenir ve çalkalandıktan sonra hemen sonra birinci tüp kaynatılır. Daha sonra tüpler 37 derecedeki bir su banyosuna bırakılır ve yaklaşık 2 dakika sonra 2. tüpten 5 dakika sonra 3. tüpten ve 10 dakika sonra 4. tüpten örnekler alıp iyot testi uygulanarak kısmi hidroliz ürünleri olan dekstrinlerin oluşumu izlenir. Bu sürenin sonunda tüplerin her birine Fehling deneyi uygulanarak hidrolizin tamalanıp tamamlanmadığı kontrol edilir.

50 Fermentasyon Bazı şekeler maya ile karıştırılırsa CO 2 ve etil alkol meydana gelir. Bu reaksiyona fermentasyon denir ve oksijen kullanılamaz. Olay anaerobik bir parçalanmadır. Fermentasyon hassas bir yöntem olup bununla %0.05 g şekeri kesin olarak göstermek mümkündür. Deneyin prensibi Şekerlerin oksijensiz ortamda maya etkisiyle etil alkol ve CO 2 e parçalanması ve açığa çıkan belirli testlerle kontrol edilmesi esasına dayanır.

51 Fermentasyon Deney Einorn fermentasyon tüpleri ile yapılır. Bir deney tüpüne şeker çözeltisi ve bir mercimek büyüklüğü maya (bira mayası,şarap mayası yada ekmek mayası) konu ve iyice karştırılır. Fermentasyon tüpü bu karşımla doldurulur. Tüpün kapalı kolunda hava kalmaması için gerekli hareketler yapılır. Açık ağzı pamuk tıpa ile kapatılır. Maya etkisiyle şeker etil alkol ve CO 2 e parçalanır. Oluşan CO 2 kapalı kolda toplanır. Bunun hacmi ölçlmek suretiyle şeker miktarı hesaplanabilir.

52 Fermentasyon CO 2 oluşumunun gösterilmesi Ermentasyon tüpüne % 50 lik NaOH den birkaç damla eklenip tüpün ağzı baş parmakla sıkıca kapatılarak kuvvetlice çalkalanırsa CO 2 ile NaOH birleşir ve Na 2 CO 3 teşekkül eder ve CO 2 gazının yerinde teşekkül eden vakum etkisiyle baş parmağın tüpün içine doğru çekildiği hissedilir. C 2 H 5 OH olumunun gösterilmesi Fermentasyonda etil alkol teşekkül ettiği tüpe lügol çözeltisinden birkaç damka eklenmekle sarı renkte özel kokulu (hastane kokusu) iyodorm (CHI 3 ) oluşumundan anlaşılır.

53 Bilinmeyen bir maddenin karbonhidrat yönünden analizi Bilinmeyen örnek karbonhidrat mı? Hayır İndirgeyici mi? Hayır. Ne olabilir? Evet Disakkarit mi? Ne olabilir? Aldopentoz? Aldoşeker mi? Monosakkarit mi? Aldoheksoz? Ketopentoz? Ketoşeker mi? Ketoheksoz? Evet

54 Kaynaklar Barfoed C (1873). Über die Nachweisung des Traubenzuckers neben Dextrin und verwandten Körpern. Fresenius' Zeitschrift für Analytische Chemie 12(1):27. DOI: /BF Benedict SR (1909). A reagent for the Detection of Reducing Sugars. J Biol Chem 5: Fehling H (1849). Die quantitative Bestimmung von Zucker und Stärkmehl mittelst Kupfervitriol. Annalen Der Chemie Und Pharmacie 72(1): DOI: /jlac Foulger JH (1931). The User of the Molisch (α-naphthol) Reactions in the Study of Sugars in Biological Fluids. J Biol Chem 92: Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T (1999). Temel Biyokimya Uygulamaları. 1. Baskı, Median Yayınevi, Ankara. Reeves RE, Munro J (1940). Quantitative Determination of Pentoses. Ind Eng Chem Anal Ed 12(9): DOI: /ac50149a028. Sánchez-Viesca F, Gómez R (2018). Reactivities Involved in the Seliwanoff Reaction. Modern Chemistry 6(1):1-5. DOI: /j.mc Seliwanoff T (1887). Notiz über eine Fruchtzuckerreaction. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 20:181. DOI: /cber