Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016"

Kelebek Dilaver
5 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Prof. Dr. Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD, 2016

Antifungaller Direnç gelişimi Geniş spektrumlu antifungaller Tedavi için antifungal seçiminde karmaşa Tür düzeyinde tanımlama Antifungal Duyarlılık Testi (AFDT) uygun doğru tedavi Comparative

2 Antifungaller Direnç gelişimi Geniş spektrumlu antifungaller Tedavi için antifungal seçiminde karmaşa Tür düzeyinde tanımlama Antifungal Duyarlılık Testi (AFDT) uygun doğru tedavi Comparative Evaluation of a New Commercial Colorimetric Microdilution Assay (SensiQuattro Candida EU) with MIC Test Strip and EUCAST Broth Microdilution Methods for Susceptibility Testing of Invasive Candida Isolates JCM, 53, , 2015

3 STANDART REFERANS YÖNTEMLERİ Buyyon Mikrodilüsyon (BMD) [CLSI - EUCAST] Zaman alıcı İş yoğunluğu Rutin laboratuvarlar için uygun değil

4 SEÇENEK - YÖNTEMLER Uygulaması Kolay Ticari olarak elde edilebilir Maliyet etkin Manuel Kısa süreli Yarı otomatize Seçenek Yöntemler Otomatize

5 Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İ) 1. CLSI ya da EUCAST BMD ile kıyaslanabilir sonuçlar : 2. Esas uyum (EU): ±2 kat sulandırımı aşmayan MİK sonuçları 3. Kategorik Uyum (KU): Yorumlanabilir MİK sonuçları arası uyum [Hassas (H), Intermediate (I) (Orta), Dirençli (D)] %90)

6 Seçenek Yöntemlerden Beklenenler (İİ) 4. Çok Büyük Hata (ÇBH): Yalancı duyarlılık (<%1.5) 5. Büyük Hata (BH): Yalancı dirençlilik 6. Küçük Hata (KH): Dirençli/duyarlı Orta (I) 7. Reproducibility: Tekrarlanabilirlik 8. Değişikliklere uygunluk (İlaç ekleme / çıkarma, son noktada değişiklik..)

7 FDA ONAYLI TESTLER SYO ( Sensitre Yeast One) (TREK Diagnostic systems, Inc., Cleveland, ABD) Vitek 2 (biomérieux, Fransa) E test (AB Biodisk İsveç--bioMérieux, Fransa) Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, ; AAC, 58, , 2014

8 SYO Kolorimetrik Buyyon Mikrodilusyon CLSI uyumlu 1998 (5 antifungal) 2012 (9 antifungal) Dehidrate iki kat seri sulandırımlar( SYO-YO10) Alamar mavisi Kolorimetrik okuma Kırmızı: üreme + Mavi:üreme MİK:Üremenin olmadığı en düşük ilaç [C]

10 Candida türleri Cryptococcus türleri Hızlı çoğalan mayalar Aspergillus türleri Üretici firmanın önerileri doğrultusunda test hazırlanır.

12 Posakonazol Vorikonazol Flukonazol Itrakonazol C.albicans C.glabrata C.tropicalis Trailing (Hafif mor renk)

15 VİTEK 2 Tam otomatize 9-24 saat içerisinde (ortalama 15 saat) Spektrofotometrik okuma

16 VİTEK 2 AF03 IUO Güncelleştirilmiş Form FCZ son konsantrasyon Yeni CLSI CBP leri ile uyumlu Dirençli kökenleri saptayabiliyor.

17 E test Kullanıma hazır MİK Antifungalin gradient konsantrasyonlarını içeren şerit

18 Amfoterisin B Anidulafungin Kaspofungin Mikafungin Flukonazol Itrakonazol Posakonazol Vorikonazol Flusitozin RPMI 1640 AM3 besiyerleri

19 Flukonazol Üremenin %80 inhibisyonu Küçük kolonilerin dışlanması Büyük kolonilerin kestiği nokta

20 VOR Üremenin %80 inhibisyonu Büyük kolonilerin kestiği nokta

21 C. lusitaniae Amfoterisin B RPMI-1640 AM3

22 ÇALIŞMALARDAN ÖRNEKLER VİTEK 2 (AST-YS01 kart) SYO (Y08 formatı) UYUMU / Candida türleri (CLSI M27 A3 S3 Temelli KIYASLAMA!) FCZ için EU düşük bulunan türler C.albicans %70±10 C.parapsilosis %71.4±12 C.kefyr %50 Toplamda %81.4±4.6 EU Interlaboratory evaluation of VITEK2 system and Sensititre YeastOne for antifungal susceptibility testing of yeasts isolated from blood cultures against four antifungal agents NEWMICROBIOLOGICA, 34, , 2011

23 Amfoterisin B için EU düşük bulunan türler C.krusei %60 C.kefyr %50 Toplamda %84.3±4.3 EU Flusitozin için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii, C.tropicalis %66 C.lusitaniae %50 Toplamda %81.4±4.6 EU Vorikonazol için EU düşük bulunan türler C.guilliermondii %16.6 C.tropicalis, C.lipolytica %50 Toplamda %88,6±3.4 EU SONUÇ: VİTEK 2 daha güvenilir / 13 saatte sonuç!!

24 SYO-CLSI M27 A3-S4 SYO MİK yorumu Türe özgül revize CBP lere göre ya da ECV lere göre 474 Kan izolatı Candida türü Problemli hastalar(ybü, Cerrahi servisi, Hematoloji Servisi) Antifungal Susceptibilities of Candida Isolates Causing Bloodstream Infections at a Medical Center in Taiwan, ; AAC, 58, , 2014

25 SYO-CLSI EU ORANLARI C.albicans >%95 FCZ (H) C.parapsilosis C.krusei %100 VOR (H) C.glabrata C.tropicalis %90.9 FCZ (DBD) %78.6 VOR (H)

26 Tüm izolatlar >%97 MİKA,ANİDİLA Tüm izolatlar %100 Amfo B (WT) (MİK<1)

27 SYO-CLSI UYUMU 24 saatte sonuç C.tropicalis C.tropicalis VOR «duyarlı değil» POS «WT dışı» izolatlarda

28 SYO-CLSI UYUMU 24 saat Uyum %95-99 ECV SYO da 1 dilüsyon değişiyor. CLSI CBP SYO için uygun mu? SYO ya özgül CBP ler belirlenmeli?

29 E test-syo-clsi M38 A2 Aspergillus/Aspergillus dışı küfler AMFOTERİSİN B VORİKONAZOL YÖNTEMLER ARASI UYUM ± 2 DİLÜSYONDA GÖRECE İTRAKONAZOL In Vitro Susceptibility Testing of Aspergillus and Non-Aspergillus Filamentous Moulds to Antifungal Agents: Evaluation of Three Different Methods Macedonian Journal of Medical Sciences. 15; 5(3): , 2012

30 E test CLSI ile uyumlu Zon içi mikrokoloniler DEĞERLENDİRME DIŞI Kaspofunginde rezidüel üreme (okuma zorluğu) Amfoterisin B ve ITR direncini saptamada SYO dan üstün!!!! Besiyeri hazırlığında üretici firma önerilerine %100 uyulmalı!!!

31 SYO Aspergillus / Aspergillus dışı kökenlerde / Amfoterisin B dirençli kökenleri saptayamıyor!!!!! Kaspofungin yalancı yüksek MİK değeri ITR, VOR, POS Tüm küf cinsleri için için uygun

32 CLSI SYO

33 Farklı antifungal ajanlar için E test sonuçları

34 SYO-CLSI EKİNOKANDİN / CANDIDA KÖKENLERİ AND %98.3 CAS %93.6 Toplamda KU MİKA %99.6 CAS - C.glabrata %89.7 C.krusei %69.1 Sonuç Ekinokandin, CLSI YENİ CBP ve ECV SYO için uygun Comparison of the Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel with CLSI microdilution for antifungal susceptibility testing of the echinocandins against Candidaspp., using new clinical breakpoints and epidemiological cutoff values Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 73, , 2012

35 MALDI TOF MS / CLSI CAS Candida albicans Rapid Antifungal Susceptibility Testing by Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry Analysis; Journal of Clinical Microbiology, 51, 9, , 2013

36 YÖNTEM C.albicans klinik izolat n=65 Fks1 mutant(+) kontrol kökenleri MALDİ TOF MS-CLSI (revize CBP) CAS RPMI da 9 farklı ilaç konsantrasyonu + C.albicans kökenleri 37 C, 15 saat-3 saat inkübasyon

37 Toplanan Maya Hücreleri Steril su ile yıkama Formik asit ile süspansiyon (1 er µl) Etanol + Sinnamik asit Bruker Daltonik Biotyper(3,0 yazılım)

38 Spektraların Toplanması-Veri Tabanı Eldesi 65 C.albicans spektraları / veritabanı ile kıyaslama CCI (Composite Correlation Index) MPCC (Minimal Profile Change Concentration) saptanması

39 MALDİ TOF MS Spektra ve rölatif jel MALDI a. WT C. albicans izolatı b. Fks1 mutant C.albicans izolatı WT ve fks1 0, 0.03 ve 32 µg/ml CAS ile muamele sonucu her iki izolat için minimal değişiklikler görülmektedir.

40 MALDI TOF MS CCI lerin ısı haritasına çevrilmesi

41 MALDI TOF MS - CLSI UYUMU 65 kökenin 61 i uyumlu sonuç 51 köken HASSAS 11 köken DİRENÇLİ(fks1 mutasyon+) 1 ÇBH (%1.6) Toplam uyum %98.4

42 MİKROKALORİMETRİ CLSI Amfo B, VOR, POS, CAS Aspergillus türleri Prensip: Sabit sıcaklıkta (izotermal / 37 C) Mikrobiyal üreme Artan metabolizmayla birlikte ISI üretimi Mikrokalorimetri ile ısı üretiminin ölçülmesi Isothermal microcalorimetry: a novel method for real-time determination of antifungal susceptibility of Aspergillus species,; Clinical Microbiology and Infection, 18, 7, E241 E245, 2012

A.fumigatus ATCC 204305 için MHIC saptanması. Sol panelde «ISI AKIŞI», Sağ panelde ANTİFUNGALLERİN varlığında TOPLAM ISI (SDB de inokülüm: 2.5 X10 ⁴ konidia/ ml.

44 A.fumigatus ATCC için MHIC saptanması. Sol panelde «ISI AKIŞI», Sağ panelde ANTİFUNGALLERİN varlığında TOPLAM ISI (SDB de inokülüm: 2.5 X10 ⁴ konidia/ ml.) GC: Growth Control (Üreme Kontrol) Sayılar: Antifungal konsantrasyonu (mg/l). NOKTALI YATAY ÇİZGİ: Amfo B ve TRİAZOLLER için: üretilen TOTAL ISININ %50 inhibisyonu Ekinokandinler için: ISI AKIŞ PİK inde %50 azalma. MHIC = DAİRE içindeki KONSANTRASYONLAR

47 GC (Growth Control) (Üreme kontrolü) Daire içindekiler MHIC Noktalı yatay çizgi Amfoterisin B ve triazoller: GC ye göre toplam ısının %50 inhibisyonu Ekinokandinler: GC ye göre toplam ısı akış pikinde %50

48 o o Antifungalsiz ortam Kontrol Değişik konsantrasyonlarda ilaç varlığında ISI DEĞİŞİKLİKLERİ MHIC (Minimal Heat Inhibitory Concentration) ölçümü CİNS ve TÜRE göre: 5. (Candida türleri) saatte sonuç

49 Mikrokalorimetri /CLSI M38 A2 Uyumu (± 2 dilüsyon) Amfo B %90 VOR %100 POS %90 CAS %70

50 Mikrokalorimetri - Dezavantajları Dolaşımda gaz habbecikleri / mikroorganizma kümeleri Kanallarda tıkanıklık Kanaldan kalorimetriye transferde mikroorganizma miktarında değişiklikler RUTİN KULLANIMA UYGUN DEĞİL Yeni üretilen ilaçlar için kullanılabilir.

51 AKIM SİTOMETRİ

52 AKIM SİTOMETRİSİ / CLSI C.albicans Amfoterisin B + Maya..30 dk. FCZ + Maya 6 saat Vital DNA boyası (FUN-1..) MİK= (en düşük İlaç [C] Hücreiçi Floresein yoğunluğunda %50 CLSI M27 A2 ile uyum: %96 (amfo B için)-%99 FCZ için Dezavantaj: Özel ekipman gerekliliği Int J Pharmaceutical & Biological Archives. 5, 1-6, 2014.

53 DİĞER YÖNTEMLER ERGOSTEROL ÖLÇÜMÜ FCZ Farklı [C]+ Maya Toplam Ergosterol miktarında Değişiklik o CLSI ile ~ %100 uyumlu «Trailing» sorunu YOK Küfler için uygun Dezavantaj: Geliştirilmesi gerekli Quantitation of Candida albicans Ergosterol Content Improves the Correlation between In Vitro Antifungal Susceptibility Test Results and In Vivo Outcome after Fluconazole Treatment in a Murine Model of Invasive Candidiasis. AAC. 44, , 2000.

54 XTT (Kolorimetrik Yöntem) (XTT) + Mantar (Candida, Cryptococcus, küfler) + Antifungal ( Farklı [C] Biyofilm içinde / planktonik Canlı mantar hücrelerinin varlığında.xtt indirgenmesi RENK DEĞİŞİMİ Spektrofotometrik ölçüm Amfoterisin B, FCZ, ITR, FLC MİK : Metabolik aktiviteyi %50--%80 azaltan antifungal [C] CLSI ile UYUM % Kısa sürede sonuç Dezavantajı: Geliştirilmesi gerekli Biofilm production and evaluation of antifungal susceptibility amongst clinical Candida spp. isolates, including strains of the Candida parapsilosis complex Med Mycol. 49, , 2011.

Benzer belgeler

ANTİFUNGAL DİRENÇ MEKANİZMALARI ve DUYARLILIK TESTLERİ. Nilgün ÇERİKÇİOĞLU 2014 MARMARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ AD

ANTİFUNGAL DİRENÇ MEKANİZMALARI ve DUYARLILIK TESTLERİ Nilgün ÇERİKÇİOĞLU 2014 MARMARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ AD İn Vitro Duyarlılık Test Sonuçları Duyarlı (MİK) Doza bağımlı duyarlı