İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla in vitro Etkileşimi *

Transkript

1 Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla in vitro Etkileşimi * Human Placental Glutathione-S-Transferase : Isolation, Kinetic Properties and in vitro Interactions with Several Drugs V.Kenan ÇELİK **, Ferah ARMUTCU ***, Ahmet AKER **** ÖZET Plasental glutatyon-s-transferaz (GST-π) enzimi myiadında doğum yapmış olgunun plasentasından glutatyon agaroz affinite kolonu kullanılarak izole edildi. GST-π 2628 µmol/mg dk spesifik aktivite ve % 0,5 verimle saflaştırıldı. Enzimin substratı olan glutatyon ( GSH ) için Km değeri 2 mm, Vmax değeri 11.1 U/mg dk ; kloro-2,4-dinitrobenzen ( CDNB ) için Km değeri 0,55mM, Vmax değeri 35.0 U/mg dk olarak bulundu. İlaç etkileşimi çalışmalarında, prematüre doğumların önlenmesinde kullanılan Pre-Par (Ritodrin HCL) ve antibakteriyel etkili Ampisid (Ampisilin), enzim aktivitesini in vitro olarak % oranında inhibe ettiği gözlendi. Antiemetik olarak kullanılan Metpamid (Metoclopramid) enzim aktivitesini %80-85 oranında inhibe ederken, klinik kullanımı oldukca yaygın olan, ağrı kesici ve ateş düşürücü etkili Novaljin (Metamizol), enzim aktivitesini % oranında inhibe etti.yine anti-bakteriyel etkileri olan Iesef (Ceftriaxon) ve Sultasid (Sultamisilin) in ise enzim aktivitesini %10-15 oranında inhibe ettiği gözlendi. Bu bulgular bu tür ilaçların hamilelerde çok titiz ve dikkatli bir seçimle kullanılması gereğini ortaya koymaktadır. SUMMARY Placental GST-π was isolated from full-term placenta by glutathione affinity column. GST was obtained with 0,5 % yield and had a specific activity of 2628 units per milligram protein. Km and Vmax values for glutathione (GSH) and chloro- 2,4-dinitrobenzen (CDNB) as substrates were 2mM, 11,1 U/mg min and 0,55 mm, 35,0 U/mg min respectively. It was observed that GST activity was decreased 50-55% by Pre-Par (Ritodrine HCL) used to prevent the premature birth. Metpamid (Metoclopramid), an antiemetic, inhibited the enzyme activity 80-85%. Novalgine (Metamizole), known as an analgesic and antipyretic, is also inhibited enzyme activity 70-80%. In addition to these drugs Sultacide (Sultamisilin) and Iesef (Ceftriaxon) which have an antibacterial effect inhibited the enzyme activity 10-20%. These results suggested that these drugs must be used carefully in pregnant women. Key words: Placental GST, drug actions Anahtar kelimeler: Plasental GST, ilaç etkileşimleri C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 25(4): , 2003 GİRİŞ Glutatyon-s-transferazlar (GST,EC: ), karsinojen ve mutajenleri içeren çeşitli hidrofobik ve elektrofilik substratların glutatyonun (GSH), tiol (SH) grubu ile konjugasyonunu sağlayan çok işlevli bir enzim * XIV. Ulusal Biyokimya Kongresi nde poster olarak sunulmuştur ** Yrd.Doç.Dr., Cumhurıyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Sivas *** Uz. Dr., Kara Elmas ÜniversitesiTıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Zonguldak **** Prof.Dr., Cumhurıyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Sivas 187

2 İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla İn Vitro Etkileşimi grubudur(1). GST detoksifikasyon (zehirsizleştirme) görevini, GSH ın SH grubu ile ilgili bileşiklerin elektrofilik bölgelerini nötralize ederek yapar. Oluşan suda çözünür ürün merkaptürik asittir ve vücuttan idrarla atılır(2,4). Farklı GST formları çeşitli kaynaklardan saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Homo ve heterodimerik iki alt birimden oluşan GST ler, yapısal immünolojik özellikleri ve substrat özgüllükleri temel alınarak insan dokularında α (asidik), µ (nötral), π (bazik) ve mikrozomal olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır (5,6). Rat plasental formunun (GST-P), kimyasal hepatokarsinogenezde preneoplastik ve neoplastik lezyonlar için bir marker olabileceği gösterilmiştir (7,8). GST nin insan plasental formu (GST-π) İmmünolojik olarak GST-P ye çok benzer olduğu gözlenmiş, aynı zamanda kolon, uterus, serviks ve böbrek gibi dokularda preneoplastik lezyonlar için bir marker olabileceği de öne sürülmüştür(9,11). Son 20 yıl süresince plasenta içerisinde ksenobiyotiklerin biyotransformas-yonunun nasıl gerçekleştiği üzerine bir takım kabul edilebilir teoriler geliştirilmiştir: Bir metabolik bariyerin yabancı yapıları fetusa ulaşmadan engellediği ya da toksik metabolitler için basit bir enzim sistemi bulunduğu düşünülmektedir. Bu sistem içerisinde P-450 enzim grubu ve diğer monooksijenazlar yanında GST yer almaktadır(12). Dolayısıyla GST lerin çeşitli özellikleri ve özgüllüğünün saptanması büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada klinik kullanımı yaygın olan ilaçlar (Analjezik, antipretik, antimikrobiyal vb.) ile GST nin in vitro etkileşiminin incelenmesi amaçlanmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM GSH, Glutatyon agaroz, Kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) Sigma firmasından sağlandı. Pre-Par ( Ampül, 50 mg/ml RitodrinHCl ), Metpamid (Ampül,10mg Metoclopramide HCl), Novalgin (Ampül, 1g Dpyrone,Metamizole), Ampisid( Flakon, 1g Na Ampisilin), Sultasid (Flakon, 1g Sultamisilin) ve IESEF(Flakon, 1g Ceftriaxone disodium) değişik ticari firmalardan sağlandı. Diğer kimyasallar (tampon vs.) analitik saflıkta olup Sigma kalitesindedir. Miadında doğum yapmış olgudan alınan plasenta buzlu serum fizyolojik (4 C) ile yıkandı. Amniyotik zar ve bağ dokusundan arındırılan plasenta küçük (1-2cm 3 ) parçalara bölündü. Serum fizyolojik ile yıkanan parçalar, gr yaş doku(622 gr) başına 3 ml (toplam 1866 ml) 1mM EDTA, 2mM β-merkaptoetanol içeren 10 mm potasyum fosfat ph=7.0 tamponunda (tampon A) bıçaklı homojenizatör (Huzur) kullanılarak (en yüksek devirde 1 dk.) homojenize edildi. homojenatta aktivite ve protein tayini (Hitachi 911 otoanalizörde) yapıldı. Homojenat 14000Χ g de 4 c de 1 saat santrifüj edildi. Süpernatant pamuklu bezden geçirilerek lipidli kısımlar uzaklaştırıldı. Süpernatanda aktiviteve protein tayinleri (Coomassie brillant blue) yöntemi ile yapıldı. 200 ml süpernatant, tampon A ile dengelenmiş Glutatyon agaroz kolonuna 15 ml/saat lik akış hızı ile uygulandı. 50 mm KCl içeren tampon A ile kolona bağlanmayan proteinler uzaklaştıldı. Kolon 5 mm GSH içeren 50mM Tris/HCl ph=9.6 (tampon B) tamponu ile yıkandı, aktivite gösteren kısımlar toplandı(13). Seçilen ilaçlar ile enzimin doza bağımlı olarak etkileri ve kinetik özellikleri incelendi. Aktivite tayini: 50 µl 0,2 M sodyum fosfat ph=6,5 tamponu, 50 µl 20mM GSH 50 µl 20mM CDNB, 50 µl enzim ekstresi ve hacim 1 ml ye distile su ile tamamlandı. 340 nm de 30 C de köre karşı absorbanslardaki artış alınarak aktiviteleri hesaplandı. Bir ünite enzim aktivitesi, 30 C de 1 dakikada 1µmol ürün oluşumunu katalizleyen enzim miktarıdır. Protein tayini Coomassie brillant blue yöntemine göre yapıldı(14,15). BULGULAR Kinetik çalışmada enzimin substratlarından biri olan GSH için CDNB derişimi (1mM) sabit tutularak Km ve Vmax değerleri saptandı. CDNB için de GSH derişimi (1mM) sabit tutularak Km ve Vmax değerleri saptandı. ilaç etkileşim çalışmalarında, Ampisid, Pre-Par, Novalgin ve Metpamid, doza bağımlı olarak sırasıyla enzimi %45-50, %50-55,%70-80 ve %80-85 oranında inhibe etti(şekil 1-4). IESEF ve Sultasid ise enzim aktivitesini %10-20 oranında inhibe ettiği gözlenmiştir. 188

3 Çelik ve ark Ampisid deriþimi (mg/ml) Novalgin deriþimi (mg/ml) Şekil 1:GST-Ampisid inhibisyon grafiği. Şekil 3:GST-Novaljin inhibisyon grafiği Metpamid deriþimi (mg/ml) Pre-Par deriþimi (mg/ml) Şekil 4:GST-Metpamid inhibisyon grafiği. Şekil 2:GST-Pre-Par inhibisyon grafiği. TARTIŞMA VE SONUÇ Bu çalışmada insan plasental glutatyon-stransferaz enzimi (GST-π), glutatyon agaroz kolonu kullanılarak izole edildi, kinetik özellikleri ve saflaştırma verileri tablo 1 ve 2 de gösterildi. CDNB nin sabit derişiminde (1mM) Km 2 mm, Vmax 11.1(U/mg dk) iken 189

4 İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla İn Vitro Etkileşimi GSH ın sabit derişiminde (1mM) Km 0.55 mm, Vmax 35.0 U/mg dk olarak bulundu. Bu değer, diğer araştırmacılar tarafından bulunan değerlere oldukça yakındır(5). İlaç etkileşim çalışmalarında ilaçların enzim aktivitesini azalttığı saptandı. Ampisid ve Pre-Par %45-55 oranında, Novalgin ve Metpamid %70-85 oranında enzim aktivitesini azaltmıştır. Bu bulgular plasenta içerisinde ksenobiyotiklerin metabolize edilmeden de biyotransformasyona uğratılabileceği ve plasentada biyotransformasyon basamağında GST lerin de yer aldığı görüşünü desteklemektedir (12). Tablo 1: İnsan plasental GST sinin saflaştırma basamakları. Saflaştırma basamağı Hacim Toplam toplam aktivite Özgül aktivite Saflık Verim (ml) Protein (g) Ünite x10 3 (U/mg ) derecesi % Homojenat Süpernatant ,58 57 Affinite kromotografi , Glutatyon agaroz Tablo 2: İnsan GST-π sinin GSH ve CDNB için Km ve Vmax değerleri: Substrat GSH(CDNB=1mM) CDNB(GSH=1mM) Km(mM) Vmax(U/mg) GST ler, ksenobiyotikler ve elektrofilik bileşiklerin toksik etkilerini ortadan kaldıran, hücrelerdeki makromoleküllerin (DNA, RNA, Protein) alkillenmelerini engelleyen önemli bir enzim grubudur(16,17). Ancak ksenobiyotiklere ve bunların olumsuz etkilerine karşı eşsiz bir savunma mekanizması sağlayan GST ler, kanserle mücadelede büyük bir engel oluşturmaktadır(18). Gerçekten, günümüzde antikanser ilaçlarla kanserin sağaltımında çalışmalar yapan araştırmacıların karşılaştıkları en büyük sorunlardan biri, kanserli doku ya da hücrelerle bu kimyasallara karşı oluşturulan dirençtir ve bunda en önemli rolü GST ler üstlenmiş gözükmektedir(19-21). Özellikle son 10 yılda yapılan çalışmalarda birçok kanser ( mesane, akciğer, göğüs, beyin ) türünde GST lerin önemli bir savunma bariyeri oluşturduğu ortaya konmuştur (22-24). Yaptığımız çalışma, in vitro koşullarda gerçekleştirilmiştir. İlaçların inhibisyon etkisi in vivo koşullarda çok daha farklı ya da güçlü olabilir. Çünkü ilaçların yalnız kendilerinin değil, metabolitlerinin etkileri de olaya katılacaktır. Dolayısıyle, özellikle cenin için çok daha ciddi boyutlarda sorunlarla karşılaşılabilinir. GST lerin aktivitelerindeki azalma detoksifikasyon mekanizmasını da zayıflatacağı için cenin de savunmasız bırakılacaktır. Bunun boyutlarının ne olacağı kestirilemez. Sonuç olarak, klinik kullanımı yaygın olan analjezik ve antipiretik (Novalgin) ile antimikrobiyal ajanların (Ampisid, IESEF, Sultasid) yanında prematüre doğumların önlenmesinde (Pre-Par vb.) kullanılacak ilaçlar için seçici ve dikkatli olmak ceninin sağlıklı gelişimine olumlu yönde katkıda bulunacaktır. KAYNAKLAR 1. Ketterer, B.: Detoxication reactions of glutathione and glutathione transferases. Xenobiotica. 1986;16 (10-11): , 2. Vermeulen, N.P.E.: Analysis of mercapturic acids as a tool in biotransformation, biomonitoring and toxicological 190

5 Çelik ve ark. studies. Glutathione-S-transferases and Drug Resistance Taylor and Francis London 1990 : 1, ,. 3. Snel, C.A.W. Zhao, Y. Mulder, G.J. Pang, K.S.: Methods for the quantitation of bromosulfophthalein and its glutathione conjugate in biological fluids. Anal. Biochem 1993 ; 212: Zhao, Y. Snel. C.A.W. Mulder, G.J. and Pang, K.S.: Localization of glutathione conjugation activities toword bromosulfophthalein in perfused rat Liver: Studies with the multiple indicator dilution technique. Drug Metab. Dispos ; 21: Mannervik,B.Guthenberg,C.:Glutathionetransferase (Human placenta).methods in Enzymology ; 77 (28): Mannervik,B. Awasthi Y.C. Board, P.G et al.: Nomenculature for human glutathione transferases. Biochem J 1992 ; 282: , 7. Sato, K. Kitahara, A. Satoh, K. Ishikawa, T. Tatematsu, M. Ito, N.: The placental form of glutathione S - transferase as a new marker protein for preneoplasia in rat chemical hepatocarcinogenesis. Jpn J. Cancer Res 1984 ;75: Tatematsu, M.Mera,Y. Ito, N. Satoh, K. Sato, K.: Relative merits of immunohistochemical demonstration of placsntal A,B and C forms of glutathione S-transferase and histochemical demonstration of γ-glutamyl transferase as markers of altared foci during liver carcinogenesis in rats. Carcinogenesis ; 6: Kodate,C. Fukushı,A. Narıta,T. Kuda,H. Soma,Y.and Sato, K.: Human placental form of glutathione-s-transferase (GST-p) as a new ımmunohıs tochemical marker for human colonic carcinoma. Jpn. J. Cancer Res ; 77: , 10. Shiratori, Y. Soma, Y. Maruyama, H. Sato, S. Takano, A and Sato, K.: Immunohistochemical detection of the planceltal form of glutathione-s-transferase in dysplastic and neoplastic human uterine cervix lesions. Cancer research. 1987; 47: Harrison,DJ.Khatbanda,R. Bishop,D. McLelland,LI. Hayes, JD.:GlutathioneS-transferases in human renal carcinoma demonstrated by immunohistochemistry. Carcinogenesis ;10: Pasanen,M.Pelkonen,O.:Xenobiotic and steroid metabolizing monooksigenases catalysed by cytochrome P450 and glutathione S-transferase conjugations in human placenta and their relationships to maternal cigarette smoking. Placenta 1990 ;11: Ahmed,H. Douglas,EW. Richars, RF. Shivendra,VS. Rheem,DM. Gregg,TN. Yogesh,CA.and Alexander,K.: Primary and secondary structural analyses of glutathione S-transferase π from human placenta. Archives of Biochemistry and Biophysics ; 278: Warholm, M. Guthenberg, C. Bohr. C.V. and Mannervik, B.:Glutathione transferases from human Liver. Methods In Enzymology 1985 ;113: Scopes, R.K.: Methods for measuring protein concentration. Protein Purification Principles and Pratice. Caph ;8.(5) Jakoby, W.B.: Reactions of glutathione transferases: A pattern for the enzymes of detoxication. Glutathione-Stransferases and Drug resistance Taylor and Francis London 1990 ;1: Ketlerer, B. Tan, K.H. Meyer, D.J. and Coles, B.: Glutathione transferases: A possible role in the detaxication of DNA and lipid hydroperoxides. Glutathione-S-transferases and Drug resistance Taylor and Francis. London 1990 ;3: Bladeren, P.S.V. Scheffer, A.G. Vos, R.M.E. Bruggemen, I.M. and Temmink, J.H.M.: The interaction of allyl and benzyl ısothiocyanate and rat liver glutathione-s-tarnsferasese. Glutathione-s-transferases and Drug resistance. Taylor and Francis, London 1990 ;3: Wolf, C.R. Lewis, A.D. Carmichael, J. Ansell, J. Adams, D.J. Hickson, I.J. Harris, A. Balkwill, F.R. Griffin, D.B. and Hayes J.D. : Glutathione-S-transfrase expression in normal and tumour cells resistant to cytotoxis drugs. Glutathione-S-transferases and Drug resistance Taylor and Francis London 1990 ;3: Clapper, M.L. Buller, A.L. Smith, T.M. and Tew, K.D.: Glutathione s-transferases in alkylating agent resistant cells. Glutathione S-transferases and Drug resistance. Taylor and Francis, London 1990 ;3: Harris, A.L.: Mechanısms of anticancer drug resistance. Glutathione-S-transferases and Drug resistance Taylor and Francis, London 1990 ;2:

6 İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla İn Vitro Etkileşimi 22. Gsur, A. Haidinger, G. Hollaus, P. At all. ; Genetic Polymorphisms of CYP1A1 and GSTM1 and Lung Cancer Risk. Anticancer Research 2001.;21: Aktaş, D. Ozen, H. Atsu, N. Tekin, A. Sozen, S. Tunçbilek, E. : Glutathione S-transferase M1 gene polymorphism in bladder cancer patients: a marker for invasive bladder cancer?. Cancer Genetics and Cytogenetics : 125: J. De Roos, A. Rotman, N. And at all. : Genetic Polymorphisms in GSTM1, -P1, -T1 and CYP2E1 and the risk of Adult Brain Tumors. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention : 12: Yazışma Adresi : Dr. V. Kenan ÇELİK C. Ü. Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Sivas. 192