ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Enterococcus faecium KLİNİK İZOLATLARINDA ÇOKLU İLAÇ DİRENÇLİLİK MEKANİZMALARININ GENETİK DOĞASI Kübra KASAROĞLU BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2013 Her Hakkı Saklıdır

2 ÖZET Doktora Tezi Enterococcus faecium KLİNİK İZOLATLARINDA ÇOKLU İLAÇ DİREÇLİLİK MEKANİZMALARININ GENETİK DOĞASI Kübra KASAROĞLU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK İnsanlarda gastrointestinal sistem florasının elemanı olan enterokoklar, önemli hastane infeksiyonu etkenleri arasındadır. Çalışmamızda Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi hastanesinde çeşitli klinik servislerde yatmakta olan hastalardan alınan idrar, bos, kan, katater, pü ve rektal swab örneklerinden elde edilen kültür koleksiyonundan seçilen 64 Enterococcus faecium suşunda çoklu ilaç dirençliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Suşların identifikasyonunda Phonex antibiyogram cihazı ve rapid ID 32 Strep APİ kiti kullanılmıştır. Antibiyogram duyarlılıkları ise Phonex antibiyogram cihazı ve disk difüzyon yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Suşlardaki direnç yüzdeleri; ampsiline % 100, streptomisine % 87.5, kanamisine % 100, gentamisine % 67.18, kloramfenikole % 32.81, tetrasikline % 21.87, rifampisine % 100, vankomisine % 96.87, eritromisine % 100 ve teikoplanine % olarak belirlenmiştir. Antibiyotik direncinden sorumlu genlerin belirlenmesi amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi kullanılmıştır. PZR ürünleri dizi analizi ile doğrulanmıştır. Çalışmamızda Van B tipi direnç içeren suş saptanmış ve Türkiye den bildirilen ikinci olgu olduğu görülmüştür. Ayrıca antibiyotik direnç genlerinin konjugasyon yolu ile aktarımı araştırılmış vana direnç geni duyarlı suşlara aktarılabilmiştir. Şubat 2013, sayfa 116 Anahtar Kelimeler: E. faecium, Antibiyotik Direnç, Konjugasyon i

3 ABSTRACT Ph.D. Thesis GENETİC NATURE OF MULTİ DRUG RESİSTANCE MECHANİSMS İN THE CLİNİCAL ISOLATES OF Enterococcus faecium Kübra KASAROĞLU Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK The enterococci which are the elements of gastrointestinal system flora, are some of the important factors of nosocomial infections. In our study, our intention was to determine mutidrug resistancy of 64 Enterococcus faecium strains which are chosen from bacterial cultures obtained from the urine, CSF, blood, catheter, pus and rectal swab specimens taken from hospitalized patients at various clinical departments of Akdeniz University Faculty of Medicine. Phonex antibiogram device and rapid ID 32 Strep API kit were used for the identifications of strains. Antibiogram susceptibilities were carried out by using Phonex antibiogram device and disc diffusion methods. The percentages of resistance in strains are determined as; ampsiline % 100, streptomycin % 87.5, kanamycin % 100, gentamycin % 67.18, chloramphenicol % 32.81, tetracycline % 21.87, rifampycin % 100, vancomycin % 96.87, erythromycin % 100 and teicoplanin % Polymerase chain reaction (PCR) method was used in order the determine the genes responsible for antibiotic resistance. PCR products was confirmed by sequence analysis. In our study, strains with Van B type resistance are detected and found to be the second case reported from Turkey. Also transfer of the antibiotic resistance genes by conjugation was researched, vana resistance gene were able to transfered to sensitive strains. February 2013, 116 pages Key Words: E. faecium, Antibiotic Resistance, Conjugation ii

4 TEŞEKKÜR Lisans eğitimimim başından itibaren tüm çalışmalarımda beni yönlendiren, bilgi, sabır ve tecrübelerini benden esirgemeyen, yanında çalışmaktan onur duyduğum danışman hocam Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), çalışmam süresince yardımını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Nefise AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü); Çalışmalarım sırasında tezime önemli katkılarda bulunan Akdeniz Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Sayın Prof. Dr. Dilara Öğünç e Çalışmalarımın deneysel aşamalarında bana yardımcı olan başta Fatma Neslihan YÜKSEL e ve Prokaryot Genetiği Laboratuvarındaki arkadaşlarım Arş. Gör. Başar KARACA (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), Arş. Gör. Neslihan KARATUĞ (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), Özlem GÜNAY, Maryam DİANİ, Muhammad Nima BADALİ, Barış YAVAŞ a ve diğer çalışma arkadaşlarıma, Benden hiçbir zaman destek ve yardımlarını esirgemeyen Akdeniz Üniversitesi Kültür Laboratuvarındaki arkadaşlarım, Serpil TOSUN, Özlem KARAGÖZ, Bengü ÇAĞLAR, Sedat KUZU ve diğer çalışma arkadaşlarıma, Bu günlere gelmemi benden daha çok arzulayan babam İsmail YILDIRIM, annem Neyran YILDIRIM, kardeşlerim Aslıhan YILDIRIM, Nihal YILDIRIM a ve beni her zaman izlediklerini bildiğim sevgili amcam Ali YILDIRIM ve Mehmet YILDIRIM a Manevi desteklerini hep yanımda hissettiğim ikinci ailem A. Nurhan KASAROĞLU, Serap KASAROĞLU ve Z. Müge KASAROĞLU na Her anını beraber yürüdüğüm hayatta, elimi hiç bırakmayan ve başarmamı sağlayan ruh eşim S. Volkan KASAROĞLU na Sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Kübra KASAROĞLU Ankara, Şubat 2013 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vii ŞEKİLLER DİZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Enterococcus Cinsinin Genel Özellikleri Enterokok Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi Enterokok Enfeksiyonları Üriner sistem enfeksiyonları Endokardit Bakteriyemi İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar Yara ve yumuşak doku enfeksiyonları Neonatal enfeksiyonlar Menenjit Solunum yolu enfeksiyonları Enterokoklarda Bulunan Virülans Faktörler ve Patojenite Enterokoklarda Antibiyotik Direnci ve Direnç Mekanizmaları Doğal (kromozomal) direnç Kazanılmış direnç Beta laktam direnci Glikopeptit direnci Van A tipi direnç Van B tipi direnç Van C tipi direnç Van D tipi direnç Aminoglikozitlere direnç iv

6 Permeabiliteye bağlı direnç Aminoglikozit modifiye edici enzimlere bağlı direnç Ribozomal direnç Kloramfenikole direnç Tetrasiklinlere direnç Kinolonlara direnç Makrolitlere direnç MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bakteriler Besiyerleri Bakterilerin tür teşhisi Antibiyotikler Primerler Yöntem İzolatlarının saflık kontrolü ve tür teşhisinin doğrulanması Antimikrobiyal dirençliliğin belirlenmesi İzolatların plazmid profillerinin belirlenmesi Plazmid izolasyonu Elektroforez Plazmid büyüklüklerinin saptanması Genomik DNA izolasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Antibiyotik dirençliliği kodlayan gen bölgelerinin PZR ile araştırılması DNA dizi analizi Konjugasyon denemeleri BULGULAR VE TARTIŞMA Enterococcus faecium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılık Düzeylerinin Tanımlanması Enterococcus faecium Suşlarının Plazmid Profillerinin Tanımlanması Antibiyotik Direnç Genlerinin PZR ile Araştırılması vana ve vanb gen bölgeleri v

7 4.3.2 tetm ve tetl gen bölgeleri ermb gen bölgesi rpob1 ve rpob2 gen bölgeleri cat gen bölgesi Yüksek düzey aminoglikozit direncinden sorumlu gen bölgeleri blaz gen bölgesi Konjugasyon SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ µg Mikrogram AME Bç BLAST CLSI dntp EARSS EDTA HLR Kb M MHB ml mm PAI PBP PZR UV VRE Aminoglikozit Modifiye Edici Enzim Baz Çifti Basic Local Alignment Search Tool Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü Deoksinükleotidtrifosfat Avrupa Antibiyotik Direnci Sürveyans Sistemi Etilen Diamin Tetraasetik Asit Yüksek Seviyede Direnç Kilobaz Molar Müller Hinton Broth Minimal İnhibisyon Konsantrasyonu Mililitre Milimolar Patojenite Adası Penisilin Bağlayan Protein Polimeraz Zincir Reaksiyonu Ultra Viyole Vankomisin Dirençli Enterokok vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Enterokokların diğer Gram pozitif ve katalaz negatif koklardan ayrımı... 4 Şekil 2.2 Enterokok türlerinin fenotipik özellikleri... 6 Şekil 2.3 Avrupa da VRE prevalansı (2010)... 8 Şekil 2.4 Avrupa da VRE prevalansı (2011)... 8 Şekil 2.5 Vankomisin antibiyotiğinin ve vankomisine direncli enterokoklarda VanA direncinin hücre duvar öncülerine etki mekanizması Şekil 2.6 Vankomisin direncinden sorumlu Tn1546 transpozonundaki van A gen kümesinin genetik haritası Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının tanısında kullanılan testler Şekil 3.2 rapid ID 32 Strep Api testi ile Enterococcus faecium suşlarının doğrulanması...35 Şekil 4.1 Enterococcus faecium suşlarının disk difüzyon testi Şekil 4.2 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik dirençlilik yüzdeleri Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri Şekil 4.4 vana gen bölgesi Şekil 4.5 vanb gen bölgesi Şekil 4.6 tetm gen bölgesi Şekil 4.7 tetl gen bölgesi Şekil 4.8 ermb gen bölgesi Şekil 4.9 rpob1 gen bölgesi Şekil 4.10 rpob2 gen bölgesi Şekil 4.11 cat gen bölgesi Şekil 4.12 aac6-aph2 gen bölgesi Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi Şekil 4.14 apha3 gen bölgesi Şekil 4.15 vana geninin konjugal aktarımı Şekil 4.16 Transkonjugantta vankomisin direncinin disk difüzyon yöntemi ile doğrulanması viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Enterococcus cinsinde tanımlanan virülans faktörler Çizelge 2.2 Enterokoklarda glikopeptid direnç tipleri Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan bakteriler ve izolasyon materyalleri Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotikler ve disk konsantrasyonları Çizelge 3.3 Antibiyotik direnç genlerinin tespiti için kullanılan primerler Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları Çizelge 4.2 Standart E. faecalis ATCC29212 suşunun disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılığı Çizelge 4.3 E. faecium suşlarının antibiyotik gruplarına karşı direnç oranları ix

11 1. GİRİŞ Enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde karşılaşılan en önemli sorun, antibiyotik kullanımına bağlı olarak bakterilerde yaygınlaşan antibiyotik dirençlilik olarak tanımlanmaktadır. Önceleri önemsiz olarak görülen pek çok bakteri şu anda ciddi hastane enfeksiyonlarına neden olmaktadır. Normal florada bulunan ve ilk tanımlandıkları yıllarda sadece endokardit etkeni olarak bildirilen enterokoklar, bakterisidal antimikrobiyal terapiyi gerektiren nozokomiyal patojenler olarak son 20 yılda önem kazanmışlardır (Huycke vd. 1998). Bu artışın en önemli nedeni; enterokokların hastanelerde sıklıkla kullanılan 3. kuşak sefalosporinler gibi birçok antibiyotiğe doğal olarak dirençlilik içermeleri ve kullanılabilen tüm antibiyotiklere karşı direnç geliştirebilme özelliğine sahip olmalarıdır. β-laktamlara ve düşük konsantrasyonlardaki aminoglikozitlere karşı doğal direnç içermeleri nedeniyle, her iki sınıfa karşı yüksek düzeyde direnç oluşumu gerçekleştiğinde ilaçların sinerjetik etkisi ortadan kalkmakta ve tedavi güçleşmektedir. Enterokoklar klasik virülans faktörlerine sahip olmasa da, çoklu antibiyotik dirençlilikleri onlara antibiyotik tedavisi altında yaşama ve çoğalma olanağı sağlamaktadır. Direnç determinantlarının enterokoklar arasında ve özellikle diğer Grampozitif bakterilere plazmid ve transpozonlar aracılığıyla aktarımı, direncin hızla yayılmasına neden olmaktadır. Enterokoklarda doğru tür teşhisi, antibiyotik duyarlılık testlerinin optimize edilmesi ve direnç kaynaklarının genetik temelinin araştırılması; direncin önlenmesi ve yeni antibiyotik kullanım politikaları geliştirilmesi açısından önemlidir. Enterokok enfeksiyonları içinde E. faecalis ile oluşan enfeksiyonların oranı diğer türlere göre 10 kat fazladır. Ancak son yıllarda vankomisin dirençli enterokoklar (VRE) lerin ortaya çıkması ile bu oran gittikçe düşmüş ve E. faecium izolatları ön plana çıkmaya başlamıştır. Bu sebeple çalışmamızda hastane ortamında yaygın olarak bulunan ve enfeksiyona neden olan E. faecium suşlarının çoklu antibiyotik direnç özellikleri araştırılmış, bu özelliklerin yatay gen transferi yolu ile aktarımı analiz edilmiştir. 1

12 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Enterococcus Cinsinin Genel Özellikleri İlk defa 1899 da Fransa da yayınlanan bir yazıda intestinal orjinli Gram- pozitif koklar enterocoque olarak tanımlanmıştır (Thiercelin 1899). Streptococcus faecalis ismi 1906 da endokarditli bir hastanın kanından izole edilen organizmaya verilmiştir (Andrews ve Horder 1906). S. faecium un ilk olarak tanımlanması ise 1919 yılında Orlo-Jensen tarafından yapılmıştır (Kandler vd. 1968) lerde DNA-DNA ve DNA-ribozomal RNA hibridizasyon çalışmaları bu bakterilerin Streptococcus genusunun üyesi olmadığını göstermiş ve Enterococcus genusu içinde yeniden sınıflandırılmışlardır (Schleifer ve Kilpper-Balz 1984). Enterococcus cinsi, DNA-DNA hibridizasyon çalışmaları, 16S rrna dizi analizi ve toplam hücre protein profillerinin (WCP) belirlenmesi çalışmaları sonucunda 32 farklı türe ayrılmıştır (Facklam 2002). E. faecalis insan enterokokal enfeksiyonlarının % ına yol açmaktadır. E. faecium ise geriye kalan enfeksiyonlardan sorumludur. E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinorum, E. hirae, E. raffinosus, E. malodoratus, E. dispar ve E. mundtii diğer sık rastlanan türlerdir (Murray 1990, Ruoff vd. 1990, Jett vd. 1994). Ayrıca son on yıl içinde E. haemoperoxidus, E. villorum, E. phoeniculicola, E. canis, E. moraviensis, E. columbae ve E. cecorum gibi yeni türler de enterokok cinsi içinde tanımlanmıştır (Koneman vd. 2005). Enterokoklar tekli, ikili, ya da kısa zincirler halinde görülebilen, fakültatif anaerob, Gram- pozitif koklardır. Mikroskopik olarak streptokok türlerinden ayrılamazlar. Agarda üreyen kolonilerden yapılan Gram boyamada bazen Gram- pozitif kokobasil şeklinde görülebilirler. İdeal üreme ısıları 35 ο C olmakla birlikte ο C arasında değişen bir üreme aralığına sahiplerdir. 60 ο C ye 30 dakika dayanıklıdırlar. Optimal üreme ph ları 7.2 ±0.2 dir. Kanlı agarda 0,5-1,5 mm boyutunda, kabarık, gri - beyaz renkte koloniler oluştururlar. Bazen zayıf bir alfa hemoliz meydana getirebilirlerse de 2

13 genellikle hemolitik özellik içermezler (Murray 1990, Koneman vd. 1992, Gültekin 2004). Enterokokların tür düzeyinde identifikasyonu; tedavi yanında, epidemiyolojik ve enfeksiyonel kontrol amacı ile de yapılmaktadır. Gram- negatif bakterileri de içeren karışık örneklerden soyutlanmaları için, selektif besiyeri olarak, azid içeren safraeskulin-azid veya Enterococcosel agar, Columbia-Kolistin-Nalidiksik asit agar (CNA) veya feniletil alkol agar (PEA) kullanılabilir. CNA, PEA ya göre bakterinin hemoliz özelliğini değerlendirmede daha değerlidir. Kontamine alanlardan özellikle E. faecium izolasyonu için de sefaleksin-aztreonam-arabinoz agar kullanılabilir. Vankomisin dirençli enterokokların büyük bir kısmı E. faecium suşlarıdır. Vankomisin dirençli enterokok saptanması için 6 µg/ml vankomisin ilave edilmiş brain-heart infüzyon (BHI) agar veya Enterococcosel sıvı besiyeri kullanılabilir (Facklam ve Sahm 1995). Enterokoklar bakteriyosin üretirler. Bunların bazıları diğer Gram- pozitif mikroorganizmalar üzerinde etkilidir (Moreno vd. 2006). Enterokoklar; sitokrom enzimleri olmadığından katalaz negatiftirler. Fakat E. faecalis suşları ilk izolasyon sırasında görülüp seri pasajlarda kaybolan pseudo-katalaz üretir ve katalaz testinde zayıf bir pozitiflik gösterebilir. Ayrıca E. haemoperoxidus türlerinde de katalaz pozitifliği tanımlanmıştır (Ruoff vd. 1990). Tüm suşlar % 6,5 luk NaCl içeren buyyonda ve % 40 safra varlığında ürerler. L- pironil-beta-naftilamit (PYR) ve eskulini hidrolize ederler. Enterokoklar, E. cecorum, E. columbae ve E. saccharolyticus dışında PYR (+) dir (Facklam and Sahm 1995). Glukozu gaz yapmadan fermente ederler ve laktik asit oluştururlar. DNA larının G+C oranı % oranındadır. E. flavescens, E. casseliflavus, ve E. gallinarum gibi bazı suşlar hareketli olup 1-5 flagella içerirler. Endospor ve kapsül gibi yapıları sentezleyemezler. Bütün enterokok suşları lösin aminopeptidaz (LAP) üretirler (Murray 1990, Ruoff vd. 1990, Koneman vd. 1992). Enterokokların hücre duvar yapısı diğer Gram- pozitif koklara benzer peptidoglikan, teikoik asit, lipoproteinler ve yüzey protein antijenlerinden oluşur. E. faecium Lys-Ala 2-3 tipinde bir peptidoglikana sahiptir (Murray 1990, Korten 2002). Lancefield ın grup D antijeni, hücre duvarı ile bağlantılı 3

14 bir gliserol olan teikoik asitten oluşur. Enterokoklar D grubu antiserumlarla % 80 oranında aglütinasyon verirler. Bu sonucu, ekstraksiyon işlemi ve antiserum kalitesi etkileyebilir. Grup D antijeni tespiti, enterokoklar dışında, S. bovis, S. equinus, S. suis, Pediococcus spp. ve Leuconostoc spp. gibi diğer Gram- pozitif bakterilerde de bulunabildiğinden, özellikle doğal olarak glikopeptit direnci bulunan Leuconostoc spp. ve Pediococcus spp. den ayırımı için PYR hidrolizinden yararlanılır (Şekil 2.1). Şekil 2.1 Enterokokların diğer Gram- pozitif ve katalaz negatif koklardan ayrımı (Klein 2003, İşleroğlu vd. 2008) 4

15 Enterokokların karbon metabolizması, solunum, iyon transportu, pirimidin ve folat yolakları, stres cevapları ve reaktif oksijen türleri metabolizmaları dikkat çekicidir. Enterokokların bazal metabolik faaliyetleri için, B1, B6 ve B12 vitaminlerine, nükleik asit bazlarına ve bir karbon kaynağına ihtiyaçları vardır. E. faecalis in çoğalması için histidin, izolösin, metionin ve triptofan gerekli iken, diğer bazı türler arjinin, glutamat, glisin, lösin ve valin e ihtiyaç duyarlar (Murray vd. 1993, Facklam ve Teixeria 1998). Ancak bazı türler de bu aminoasitlere ihtiyaç duyulmaz. Vankomisin bağımlı suşlarda olduğu gibi yoğun antimikrobiyal baskı, metabolik ihtiyaçları etkileyebilir. Bu da farklı enterokok türlerinin metabolik ihtiyaçlarının suştan suşa bile farklılık gösterdiği anlamına gelmektedir (Facklam ve Teixeria 1998). Enterokokların hızlı tanı sistemleri ile teşhis edilmesini sağlayan otomatize (Phonex, Vitek, MicroScan, API 20 Strep) sistemler mevcuttur. Bu sistemler içerdikleri Grampozitif teşhis kartları ile tür düzeyinde teşhis yapabilirler. Ayrıca tiplendirmede; bakteriyosin tiplendirmesi, faj tiplendirmesi, biyokimyasal reaksiyon profilleri, antimikrobiyal direnç paternleri ve serolojik yöntemler de kullanılabilir (Facklam ve Sahm 1995). Enterokok türlerini teşhis etmede en kolay yol anahtar fenotipik karakterlere göre tür seviyesinde gruplar oluşturmaktır. Bu şekilde çeşitli test ortamlarındaki reaksiyonlarına göre 5 grupta toplanmış, ilave testler ve karakteristik özelliklerine göre de tür ayırımları yapılmıştır (Şekil 2.2). Biyokimyasal, fizyolojik, serolojik ve antibiyotik direnç paternine dayanarak ayrım yapılamadığı durumlarda moleküler tekniklere yönelinmektedir. Moleküler olarak enterokokların tiplendirilmesi çalışmalarında çok sayıda teknikten yararlanılmaktadır. Bu tekniklere; dalgalı alan jel elektroforezi (PFGE), multilokus sekans tiplendirme (MLST), rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) analizi, gen sekans analizi, çoğaltılmış fragment uzunluk polimorfizmi (AFLP) ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) örnek olarak verilebilir (Nourse vd. 1998, Mascini vd. 2006, Çelik ve Alhan 2008). 5

16 Şekil 2.2 Enterokok türlerinin fenotipik özellikleri (Facklam ve Teixeria 1998) 6

17 2.2 Enterokok Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi Enterokoklar doğada yaygın olarak (toprakta, suda, bitkilerde, hayvanlarda, kuşlarda ve böceklerde) bulunurlar. Esas konakları insan ve hayvanların gastrointestinal sistem florasıdır. Enterokoklar son yıllarda tüm dünyada giderek artan sıklıkta yol açtıkları hastane enfeksiyonu salgınları ile dikkatleri üzerlerine çekmişlerdir. İlk yapılan epidemiyolojik çalışmalar, enterokokların hastadan hastaya ve hatta hastaneler arasında yayılabilmesinin temelinde, bu bakterilerin normal bağırsak florasında bulunmalarının yattığı tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda E. faecalis in hastane enfeksiyonlarının % inde, E. faecium un ise % 5-10 unda başlıca etken olduğu saptanmıştır (Çetinkaya vd. 2000, Zırakzadeh ve Patel 2006). Ancak vankomisin dirençli enterokokların sebep oldukları enfeksiyonların kliniğine ait ilk bilgilerin açıklanması ve direnç özelliklerinin tespit edilmesinden sonra enterokoklara bağlı hastane enfeksiyonları epidemiyolojisinde iki önemli değişiklik yaşanmıştır (Uttley vd. 1988, Leclercq vd. 1988). Bunlar insidansdaki hızlı artış ve tür dağılımındaki değişimdir. Özellikle vankomisinin hastanelerde yaygın olarak kullanılmaya başlandığı 1989 yılından itibaren, Avrupa ülkeleri ve ABD den başta glikopeptit grubu antibiyotikler olmak üzere beta-laktam ve aminoglikozit grubu antibiyotiklere karşı dirençli çok sayıda klinik izolat ve vaka bildirimi yapılmış, VRE lerin özellikle E. faecium un klonal seleksiyona uğrayarak hastane ortamına hakim olduğu, ya tek başlarına ya da stafilokoklarla birlikte hastane enfeksiyonlarındaki insidanslarını hızla artırdıkları tespit edilmiştir (Çetinkaya vd. 2000). Avrupa Antibiyotik Direnci Sürveyans Sistemi (EARSS) nin verilerine göre E. faecium izolatları arasında en yüksek vankomisin direnç oranı; İrlanda % ( ), ikinci sırada ise Yunanistan olarak bildirilmiştir (% ve % ) (Şekil ). 7

18 Şekil 2.3 Avrupa da VRE prevalansı ( 2010) Şekil 2.4 Avrupa da VRE prevalansı ( 2011) 8

19 2000 li yıllarda Uluslararası Hastane Enfeksiyonu Sürveyans Sistemi (NNIS) sonuçlarına göre Amerika Birleşik Devletleri (ABD) nde enfeksiyon etkeni olarak izole edilen enterokoklar içerisinde VRE insidansının % 25 in üzerine çıktığı, hastanede yatan hastalarda VRE kolonizasyon oranının da % 5-18 arasında değiştiği, ancak hastane dışındaki popülasyonda intestinal kolonizasyon olmadığı bildirilmiştir. Ülkemizde ise ilk vankomisin direçli enterokok (VRE) suşu Akdeniz Üniversitesi nden bildirilmiştir. Bu suş malign histiyositozis tanısı almış, bronkopulmoner enfeksiyonu olan bir bebekte plevra sıvısından izole edilmiştir (Vural vd. 1998). Bunu 1999 yılında İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi ve Ankara Gülhane Askeri Tıp Akademisi nden bildirilen suşlar izlemiştir (Başustaoğlu ve Özyurt 2000) yılı itibariyle VRE sorunu ile karşılaşan merkez sayısı onu aşmıştır (Yetkin ve Ateş 2004). 2.3 Enterokok Enfeksiyonları Hastanede yatan hastalarda, endojen kökenli veya ekzojen kökenli hastane enfeksiyonları ortaya çıkar. İnfekte hastaların varlığıyla geniş bir alanı enfekte eden enterokokların, duyarlı hastalarda idrar yolları, kan, bos gibi steril vücut bölgelerine yerleşerek, üriner sistem enfeksiyonları, endokardit, sepsis veya bakteriyemi, intraabdominal enfeksiyonlar, pelvik enfeksiyonlar, menenjit ve cerrahi yara enfeksiyonlarına yol açabildikleri gösterilmiştir (Yıldırım 2007). Klinik örneklerden izole edilen suşların % ını E. faecalis, % 5-10 kadarını ise E. faecium oluşturur. Son yıllarda çoklu ilaç direnci gösteren E. faecium suşlarının hastane enfeksiyonlarında artış gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca nadir olarak E. durans, E. casseliflavus, E. raffinosus, E. gallinorum, E. mundtii, E. flavescens, E. avium ve E. hirae gibi diğer enterokok türleri hastane enfeksiyonlarda klinik materyalden izole edilirken E. malodoratus, E. pseudoavium ve E. sulfureus türleri ile PYR testi negatif olan ve atipik enterokoklar olarak adlandırılan E. columbae, E. cecorum ve E. saccharolyticus türleri henüz insanlardan izole edilmemiştir (Sood vd. 2008) 9

20 2.3.1 Üriner sistem enfeksiyonları Enterokokların sebep olduğu enfeksiyonların en sık görülen tipi üriner sistem enfeksiyonlarıdır ve çoğu nozokomiyal kaynaklıdır. ABD de enterokoklar nozokomiyal üriner sistem enfeksiyonları arasında ikinci en sık etkendir. Üriner sistemde hastane kökenli VRE enfeksiyonları; sistit, piyelonefrit, prostatit ve perinefritik apse gibi klinik tablolarla seyredebilir. Üriner kateterizasyon en sık görülen risk faktörü olmakla beraber, üriner sistem anomalileri, uzun süreli sonda kullanımı, cerrahi girişim ve antibiyotik kullanımıda enterokokal risk faktörleri arasında yer alır (Kaye 1982, Krieger vd. 1983). Toplum kaynaklı üriner sistem enfeksiyonlarında, sağlıklı kadınlarda % 5 inden azında enterokok izole edilmektedir (Yıldırım 2007). Enterokokal üriner enfeksiyonlarda bakteriyemi gelişmediği sürece mortalite düşüktür (Linden vd. 1996) Endokardit Enterokoklar infektif endokarditlerin S. viridans ve S. aureus dan sonra en sık rastlanılan üçüncü önemli etkenidir. En sık görülen tür E. faecalis dir. Hastalık cerrahi yolla veya çeşitli maniplasyonlarla bakterinin gastrointestinal sistemden veya çoğunlukla genitoüriner sistemden translokasyonu ile endojen kaynaklı subakut endokardit şeklinde başlar (Anderson vd. 2004). Ayrıca intravenöz ilaç bağımlılarında da % 5-53 oranında enterokokal endokardit görülebilir. Vakaların çoğunda altta yatan bir kapak hastalığı veya prostetik kapak bulunmakla beraber, enterokoklar normal kapaklarda da enfeksiyon oluşturabilir (Yıldırım 2007). Çoğunlukla sol taraf endokarditine neden olur ve mitral kapak, aort kapağına göre daha sık tutulmaktadır Bakteriyemi Enterokokkal bakteriyemi, endokarditlerden daha sık görülen bir klinik formdur. Hastane enfeksiyonları içerisinde giderek artan öneme sahip olan VRE bakteriyemileri, hastane kökenli tüm bakteriyemiler içerisinde Avrupa da 4. ABD de ise 3. sıklıkta görülmektedir. VRE bakteriyemisi için risk faktörleri, hemodiyaliz, organ 10

21 transplantasyonu, kortikosteroit kullanımı, kemoterapi veya parenteral beslenme, cerrahi girişimler, ciddi hastalıklar, uzun süreli antibiyotik kullanımı, üriner kateterler, nötropeni ve mukozittir (Devriese vd. 2006, Yıldırım 2007) İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar genellikle polimikrobiyaldir. Enterokoklar bağırsakta normalde bulunan diğer fakültatif ve anaerob bakterilerle birlikte etken olarak saptanmaktadır ve bu enfeksiyonlarda enterokokların esas rolünün ne olduğu açıklık kazanmamıştır. Enterokoklar, nefrotik sendrom veya sirozlu hastalarda gelişen spontan peritonit ve periton diyalizi uygulanan vakalarda gelişen abdominal enfeksiyon veya intraabdominal abselerde tek mikroorganizma olarak izole edilebilmektir. Ayrıca salpenjit, endometrit gibi peripartum maternal enfeksiyonlar ve sezeryan sonrası apselerde de etken olabildikleri gösterilmiştir (Yıldırım 2007) Yara ve yumuşak doku enfeksiyonları Enterokoklar nadiren selülit veya derin doku enfeksiyonlarına yol açarlar. Cerrahi yara enfeksiyonları, dekübitis ülserleri ve diyabetik ayak enfeksiyonlarında çoğunlukla Gram- negatifler ve anaeroblarla birlikte izole edilirler. Enterokoklar nadiren diyabetik olan veya olmayan kişilerde kronik osteomiyelite neden olmaktadırlar (Murray 1998) Neonatal enfeksiyonlar Enterokoklar yenidoğan için de önemli bir patojendir. Yenidoğanlarda erken ve geç sepsise neden olur. Yenidoğan sepsisi tablosu menenjit ve/veya bakteriyemi ile birlikte solunum güçlüğü ve ateşle karakterize bir tablodur. Prematüre veya düşük doğum ağırlıklı bebeklerde, özellikle de nazogastrik tüple beslenme, intravasküler kateter bulunması gibi durumlarda E. faecalis veya E. faecium un etken olduğu sepsis salgınları bildirilmiştir. Enterokokkal suşların % 82 si E. faecalis, % 14 ü E. faecium olarak 11

22 tespit edilmiştir. Uygun antibiyotik tedavisine iyi cevap vermektedir (Taşova ve İnal 2004) Menenjit Enterokokal menenjit nadir olmakla beraber, genellikle santral sinir sisteminde anatomik bir defekt, geçirilmiş beyin cerrahi girişimi veya kafa travması gibi predispozan faktörlerin varlığında görülmektedir (Murray 1990, Başustaoğlu 2004). Menenjit, enterokok endokarditli hastalarda gelişen bakteriyeminin nadir bir komplikasyonu olarak da oluşabilir. AIDS ve akut lösemi gibi ciddi immün yetmezlikli hastalarda da VRE menenjiti görülebilir. Etken diğer enterokok enfeksiyonlarında olduğu gibi sıklıkla E. faecalis olup daha seyrek olmak üzere E. faecium dur (Zeana vd. 2001, Yıldırım 2007) Solunum yolu enfeksiyonları Geniş spektrumlu antimikrobiyal tedavi (özellikle sefalosporinler) ve enteral beslenme uygulanan hastalarda da nadiren enterokok pnömonisi gelişebilmektedir. Enterokokların neden olduğu solunum yolu enfeksiyonu sıklığının giderek arttığı bildirilmektedir (Robert ve Moellering 2005). 2.4 Enterokoklarda Bulunan Virülans Faktörler ve Patojenite Enterokoklar, düşük virülanslı bakterilerdir. Buna rağmen toplum kaynaklı ve özellikle hastane kaynaklı enfeksiyonlarda önemli etkenlerdir. Pek çok antibiyotiğe karşı doğal olarak dirençli olmaları, diğer antibiyotiklere de kolaylıkla direnç geliştirebilmeleri ve çevreye adaptasyonlarının iyi olması nedeni ile diğer patojenlerden daha avantajlı hale gelmektedirler. Enterokoklara özgü virülans faktörlerin büyük bir çoğunluğu plazmidler üzerinde kodlanır. Gastrointestinal sistem gibi doğal çevredeki suşlar arasında horizontal (yatay) 12

23 yayılım gösteren bu özellikler, daha az virülanslıktaki endojenik floraya hızla yayılmayı sağlar (Jett vd. 1994). Virülans faktörler çoğunlukla multifaktöriyeldir ve Patojenite Adaları (PAI) olarak adlandırılan ve genom üzerinde farklı bölgelerde kümelenmiş olan virülans genler ile düzenlenmektedir. PAI ları virülans genlerin yatay transferinden sorumlu olmaları nedeniyle patojen bakterilerin evriminde plazmidler, bakteriyofajlar ve transpozonlar kadar öneme sahiptir (Hacker ve Kaper 2000, Tendolkar vd. 2003). Enterokokların patojenite adaları ilk kez 1980 yılında nozokomiyal salgına yol açan E. faecalis te tanımlanmıştır (Huycke vd. 1991, Shankar vd. 2002). Bu PAI ın bulunmasından iki yıl sonra E. faecium suşlarında E. faecalis dekinden farklı olan bir PAI varlığı bulunmuştur. E. faecium klinik izolatlarında epidemik yayılma özelliği kazandıran esp geninin görülmesi bu türdeki patojenite adası için bir indikatör olarak kabul edilmiştir (Leavis vd. 2004). Bunun aynı zamanda nozokomiyal salgınlar ile ilişkili izolatların ortak özelliği olduğu öngörülmektedir. Farklı VRE suşlarındaki PAI dizilerinin karşılaştırılması sonucu; yüksek derecede dizi benzerlikleri olduğu ve spesifik gen bölgelerinin değişen sıklıkta delesyona uğradıkları görülerek, bu mikroorganizmaların virülans düzenleme yeteneği kazandıkları öne sürülmüştür. Diğer taraftan bu çalışmalarda PAI larının en az üçte birinin konjugatif bir plazmidin kromozoma integrasyonu ile oluştuğu ispatlanmıştır. Ayrıca PAI larda fonksiyonu izah edilemeyen 18 ORF bölgesi kodlanmaktadır. Kommensal enterokokların PAI larında bu ORF bölgeleri gösterilememiş, bu sebeple de, bunların enterokokların hastane ortamında yaşamasına veya hastalık geçişine veya patogeneze katkıda bulundukları düşünülmüştür (Upadhyaya vd. 2009). Enterokoklarda tanımlanan virülans faktörler çizelge 2.1 de verilmiştir. 13

24 Çizelge 2.1 Enterococcus cinsinde tanımlanan virülans faktörler (Mundy vd. 2000, Clewell vd. 2000, Eaton ve Gasson 2001, Shankar vd. 2001, Toledo-Arana vd. 2001) Faktör/Gen efaa fm, efaa fs agg gele cyll L, cyll S cylm cylb cyla esp cpd, cob, ccf, cad Ürünlerin Virülanslıktaki Rolü E. faecalis ve E. faecium serumlarıyla ifade olan hücre duvarı ilişkili adhezinler Ökaryotik hücrelere tutunmada gerekli olan agregasyon proteini; hücresel agregasyon ve konjugasyon Toksin; ekstraselüler metaloendopeptidaz, jelatin, kollojen ve hemoglobini hidrolize eder Sitolizin (hemolizin, bakteriyosin) öncüleri; ökaryotik ve Gram- pozitif hücrelerin büyük çoğunluğunu lize eden aktif sitolizin üretiminde gerekli olan cyll L, -L S, -M, -B, ve -A genlerinin ifadesi ürünleri Sitolizinin posttranslayonel modifikasyonu Sitolizinin transportu Sitolizinin aktivasyonu İmmün cevaptan kaçmada rol oynayan hücre duvarı ilişkili protein; ptojenite adası üzerinde bulunan cyl genleri ile ilişkili olabilir Seks feremonları; insan lökositleri için kemotaktiktirler ve konjugasyonu kolaylaştırırlar Lipotaykon asidi Üretilmiş insan monositleri yoluyla sitokin üretimin uyarılması Süperoksit Hiyaluronidaz Bakteremi virülanslığı ile ilişkilidir; kültürdeki insan intestinal epitelyum hücrelerinde hücre-dna hasarının indüklenmesi Bağlayıcı dokularda hücre yüzeyi ile ilişkili enzimlerin yayılmasını sağlar 14

25 2.5 Enterokoklarda Antibiyotik Direnci ve Direnç Mekanizmaları Enterokoklardaki antibiyotik direnci doğal ve kazanılmış olmak üzere iki gruba ayrılabilir. Doğal direnç türe/cinse özgüdür. Enterokok türlerinin tamamında görülen kromozomal direnci ifade eder. Doğal direnç kromozomlar üzerindeki genler aracılığı ile oluşurken, kazanılmış direnç plazmidler veya transpozonlar üzerinde bulunan genlerle gerçekleştirilmektedir (Sarantinopoulos vd. 2001, İşleroğlu vd. 2008). Enterokoklarda antibiyotik direnci detaylı olarak araştırılmıştır (Fisher ve Philips 2009) Doğal (kromozomal) direnç Enterokok türleri penisilinlere, sefalosporinlere, linkozamidlere, trimetoprimsulfametaksazole (TMP-SMX), aminoglikozitlere (düşük düzeyde), polimiksinlere, vankomisine (E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. flavescens gibi bazı türler düşük seviyede), monobaktamlara ve kinopristin/dalfopristin e (E. faecalis) karşı kalıtsal olarak dirençlidir (Poeta vd. 2005). Enterokoklar β-laktam antibiyotiklere karşı karakteristik olarak tolerans gösterirler yani tedavi dozunda minimum bakterisidal konsantrasyon/minimum inhibitör konsantrasyon (MBK/) oranı 1/32 nin üzerindedir. Bu nedenle β-laktam antibiyotikler enterokoklara karşı bakterisidal değil, bakteriyostatik etkilidir. Enterokoklarda doğal penisilin direnci, β-laktam antibiyotiklere düşük bağlanma afinitesi gösteren penisilin bağlayan protein 5 (PBP-5) enziminin varlığına bağlıdır. E. faecalis suşlarında penisilin değeri streptokoklardan kat daha yüksektir. Enterokoklarda yarı sentetik ve penisilinaza dirençli β-laktam antibiyotiklere karşı da doğal direnç oldukça yüksek oranda bulunmuştur. Ampisilin direnci E. faecium suşlarının % ında, E. faecalis suşlarının ise % 2-3 ünde görülmektedir (Murray 1998, Çetinkaya vd. 2000, Marothi vd. 2004). Enterokoklar düşük düzeyde aminoglikozit direnci de gösterirler. Bu tip dirençte iki mekanizma söz konusudur. Birinci mekanizma tüm enterokok türlerinde bulunur ve 15

26 bakteri duvarının bu grupta bulunan antibakteriyel ilaçlara karşı geçirgenliğinin az olmasından kaynaklanır. İkinci mekanizma sadece E. faecium da bulunur. E. faecium aac6 -li geni tarafından kodlanan, 6 asetiltransferaz (AAC-6 ) enzimine sahiptir. Bu enzim aminoglikozit yapısındaki bir amino grubunun asetil CoA ya bağımlı olarak asetilasyonuna yol açar. Böylece sitoplazmaya geçen ilaç inaktive edilir. Enzim kanamisin, netilmisin, sisomisin, isepamisin ve tobramisini modifiye eder. Ancak gentamisine etkisi yoktur (Şardan 2004). Aminoglikozit grubu antibakteriyel ilaçlar, beta-laktam antibiyotik ya da vankomisin gibi hücre duvarı sentezini engelleyen antibiyotikler ile kombine edilecek olursa, zedelenen hücre duvarından bu gruptaki antibakteriyeller daha kolay geçeceğinden değerleri önemli ölçüde düşecektir. Enterokoklara karşı, beta-laktam veya glikopeptit grubu antibakteriyel ilaçlar ile aminoglikozit grub ilaçların kombinasyonunun sinerjistik mekanizması bu şekilde açıklanmaktadır (Başustaoğlu 2004). Enterokoklar linkozomit grubu antibiyotiklere de düşük düzeyde doğal olarak dirençlidir (Lefort vd. 2000, Şardan 2004). Enterokokların ekzojen folat kullanma yetenekleri bulunmaktadır. Bu nedenle trimetoprim-sulfametaksazole (TPM-SMX) de doğal olarak dirençlidirler. Bu antibiyotik in vitro olarak etkin görünmesine rağmen in vivo etkin değildir. Bu nedenle antibiyotik duyarlılık deneylerinde TPM-SMX kullanılmamalıdır (Lefort vd. 2000, Korten 2005) Kazanılmış direnç Enterokoklar plazmid ve transpozonlar yoluyla son yıllarda belirgin bir şekilde kazanılmış direnç geliştirmiştir. Bunlar arasında en önemli olanları yüksek düzey aminoglikozit direnci, beta laktamaz yapımı veya diğer mekanizmalarla gelişen yüksek düzey penisilin direncidir. Enterokokların çok önemli bir kısmı bu yol ile eritromisin, klindamisin ve tetrasiklinlere direnç kazanmış durumdadır (Korten 2002). 16

27 Beta laktam direnci Enterokokların iki ayrı direnç mekanizması ile beta-laktam antibiyotiklere direnç kazandığı saptanmıştır. Bunlardan biri E. faecium suşlarında görülen, kromozomal olan ve penisilin afinitesinin azalması sonucu PBP 5 in miktarının artması ile ortaya çıkan dirençtir. Bu mekanizmada esas, üremelerini inhibe edecek konsantrasyondaki β-laktam antibiyotiklerinin varlığında, onlara düşük bağlanma afinitesi gösteren düşük molekül ağırlıklı PBP5 sentezleyebilmeleridir. Bu sentez PBP değişikliklerini kodlayan DNA bölgesinde meydana gelen mutasyon sonucu veya plazmid kazanımı ile gerçekleşmektedir (Derbentli 1998). İkinci direnç mekanizması ise beta-laktamaz üretimidir. Bu enzimler antibiyotiğin hedef bölgeye ulaşamadan modifiye edilmesine veya parçalanmasına yol açarlar. Beta laktamaz oluşturan suş ilk olarak 1981 yılında ABD de tanımlanmıştır (Derbentli 1998, Lefort vd. 2000). Ülkemizde yapılan çeşitli çalışmalarda beta-laktamaz üreten enterokok saptanmamıştır (Moaddab ve Töreci 2000). Enterokoklarda β-laktamaz enzimini kodlayan gen, transfer edilebilen bir plazmid üzerindedir. Bazı E. faecalis suşlarında, bu genin kromozomlarda yerleştiği gösterilmiştir (Moellering 1992, Çınar vd. 1999). Beta laktamaz üreten enterokok suşlarının büyük çoğunluğunda, yüksek düzeyde gentamisin direnci de tespit edilmiştir (Markowitz vd. 1991). E. faecium un klinik izolatları penisilinlere E. faecalis den daha dirençlidir (Wax vd. 2008). PBP5 ilişkili düşük seviyeli ampisilin direnci enterokoklarda kromozomal kökenlidir. Yüksek seviyede ( > 100 µg/ml) ampisilin direnci E. faecium da düşük afiniteli PBP üretimi, E. faecalis te ise β-laktamaz üretimi ile oluşmaktadır (Handwerger vd. 1992, Lavery vd. 1997). Vankomisine dirençli E. faecium penisilin ve ampisiline daha dirençlidir. β-laktam antibiyotikler üriner sistem infeksiyonları gibi bazı infeksiyonlarda tek başına kullanılabilseler de menenjit, endokardit gibi bakterisidal aktivite gerektiren vakalarda standart kombinasyon tedavisi kullanmak gereklidir. Vankomisin ve teikoplanin gibi hücre duvarına etkili antibiyotiklerde beta-laktamaz üreten suşların etken olduğu 17

28 infeksiyonların tedavisinde yer alabilir (Kutlu ve Dokuzoğuz 2004). β-laktam antibiyotiklerin aminoglikozitlerle kombinasyonu, sinerjistik bakterisidal etki göstermektedir (penisline duyarlı ve yüksek düzey aminoglikozit direnci yok ise) (Robert ve Moellering 2000) Glikopeptit direnci Enterokoklarda glikopeptit direnci, Van A dan Van G ye kadar çeşitlilik gösterebilen farklı direnç fenotipleri ile ifade edilir. Fenotipik sınıflandırmada; bakterinin sadece vankomisin ya da hem vankomisin hem de teikoplanine dirençli olması, direncin indüklenebilir veya yapısal olması ve diğer bakterilere geçirilebilir olup olmamasına göre yapılır. Bu glikopeptit direnç tipleri içerisinde en iyi tanımlanmış olanları Van A, Van B, Van C ve Van D dirençleridir (Çizelge 2.2). 18

29 Çizelge 2.2 Enterokoklarda glikopeptit direnç tipleri (Murray 2000, Guardabassi ve Dalsgaard 2004) Özellik VanA VanB VanC VanD VanE ( µg/ml) Vankomisin Teikoplanin Transfer edilebilme 64 - > > > > ? Direnç genlerinin lokasyonu İndüklenme ile ekspresyon Plazmidler Kromozom (plazmidler) Kromozom Kromozom Kromozom Vankomisin Teikoplanin Hareketli element Tn 1546 Tn ?? Ligaz geni van A van B van C-1 ve van C-2/van C-3 Direnç tipi Kazanılmış Direnç Kazanılmış Direnç Doğal Direnç van D Kazanılmış Direnç van E Kazanılmış Direnç Direnç proteinin M.A lığı(kda) ?? Modifiye edilmiş hedef D-ala-D-lac D-ala-D-lac D-ala-D-ser D-ala-Dlac D-ala-D-ser Türler E. faecalis E. mundtii E. faecium E. raffinossus E. avium E. gallinarum E. durans E.casseliflavus E. faecalis E. faecium E. gallinarum E.casseliflavus E. flavescens E. faecium E. faecalis 19

30 Ortamda vankomisin gibi bir indükleyici bulunduğunda, sensör kinaz enziminin bir regülatör yanıt proteini ile ilişkiye girmesi sonucu, vankomisin direncinden sorumlu genlerin transkripsiyonu uyarılır. Transkripsiyona uğrayan genler, translasyona uğradığında; vankomisinin çok düşük bir ilgi ile bağlanabildiği ve D-ala-D-laktat veya D-ala-D-serin ile sonlanan hücre duvarı öncülerinin oluşumunu sağlayan ligaz enzimlerine dönüşürler. Diğer gen ürünleri ise D-ala-D-ala dipeptitlerini keserek hücre duvarının esas yapısında bulunan glikopeptitlere duyarlı hedefleri ortadan kaldırırlar (Şekil 2.5). VRE lerde peptidoglikan öncülüğündeki bu değişiklikler, glikopeptit ajanların hedefine 1000 kat daha düşük bir ilgi ile bağlanmasına neden olur ve hücre duvarı sentezinin inhibisyonu, bu temel mekanizma ile engellenir (Murray 2000, Guardabassi ve Dalsgaard 2004). Şekil 2.5 Vankomisin antibiyotiğinin ve vankomisine dirençli enterokoklarda Van A direncinin hücre duvar öncülerine etki mekanizması (V= vankomisin) (Patel 1999) 20

31 Van A tipi direnç Van A tipi direnç en sık karşılaşılan dirençtir. Dirençten kda ağırlığında, Van A adlı bir membran proteini sorumludur. Van A izolatları hem vankomisine (MIC 64 µg/ml) hem de teikoplanine (MIC 16 µg/ml) yüksek düzeyde dirençlidir. Dirence neden olan membran proteini ancak vankomisin varlığında sentezlenebilir. vana geni ve direnç ekspresyonu ile regülasyondan sorumlu vans, vanr, vanh, vanx ve vanz gibi diğer genler, E. faecium da sıklıkla bir plazmid üzerinde bulunan bp lik bir transpozon (Tn 1546) da yerleşmektedir (Şekil 2.6). Bu genlerin ekspresyonu sonucu, peptidoglikan terminalinde D-Ala-D-Ala yerine D-Ala-D-Laktat sentezlenmekte ve vankomisin bu bileşiğe daha düşük ilgi ile bağlanmaktadır (French 1998, Çetinkaya vd. 2000, Reynolds ve Courvalin 2005). Şekil 2.6 Vankomisin direncinden sorumlu Tn1546 transpozonundaki van A gen kümesinin genetik haritası (Arthur ve Courvalin 1993) (Açık oklar sekansların kodlanma yönünü; transpozonun başındaki ve sonundaki IR L ve IR R sırasıyla sol ve sağ inverted tekrarlarını; B, BamHI; Bg, BglII; EI, EcoRI; EV, EcoRV; H, HindIII; P, PstI; X, XbaI restriksiyon enzimi kesim bölgelerini göstermektedir.) Van R ve Van S proteinleri, vanhax gen kümesinin transkripsiyonunu düzenleyen iki elemanlı bir regülatör sistem oluşturur. vans, sensör gendir ve vankomisin varlığını algılamada veya tanımada rol alan Van S proteinini kodlar. vanr, regulatör gendir ve diğer direnç genlerinin transkripsiyonel aktivasyonunda görev alan Van R proteini kodlar. Van S, Van R ye sinyal verir ve dirençte yer alan Van H, Van A ve Van X gibi 21

32 diğer bazı proteinlerin sentezi veya aktivasyonu ile sonuçlanan regülatör cevabı oluşturur. Van A tipi suşlarda hem vankomisin hem de teikoplanin transkripsiyonu indükleyebilir, ancak kesin sinyaller hala bilinmemektedir. Van A, Van H ve Van X proteinleri kor proteinleridir vana, D-Ala-D-Laktat oluşumunu sağlayan bir ligaz proteini kodlar. vana tek başına vankomisin direncini sağlayamaz, çünkü D-Laktat gibi D-hidroksi asitler, enterokoklarda genellikle sentezlenmez ve enterokokların çevresinde doğal olarak bulunmazlar. Bu yüzden D-Laktat sentezlemek için enterokoklar, Van A için substrat üretiminde gerekli olan vana operonu içindeki genleri kazanmalıdır. vanh, piruvattan D-Laktat sentezini sağlayan bir dehidrogenaz enzimini kodlar ve D-Laktat havuzunun oluşumunu sağlar. vanx, bir DD-dipeptidaz enzimi olan Van X proteinini kodlar. D- Ala- D-Ala havuzunu doğal bir enterokokal ligaz ile azaltarak, yarışma sureti ile normal pentapeptit sentezini azaltır. D-Ala-D-Laktata karşı aktivitesi yoktur. vany, DD karboksipeptidaz olan Van Y proteinin kodlar ve peptidin sonundaki D-Ala yı ayırır. Bu yolla orta düzeyde direnci sağlar. vanz, ılımlı olarak teikoplanin değerini arttırır, ancak vankomisinin değeri üzerinde etkili değildir. Bunun mekanizması henüz aydınlatılmamıştır. vany ve vanz genleri dirence katkıda bulunabilir, ancak direnç fenotipi için zorunlu değildir (Malathum ve Murray 1999, Çetinkaya vd. 2000). vana geni ilk olarak E. faecium da, sonraları ise E. faecalis, E. durans, E. gallinorum, E. avium, E. mundtii, E. casseliflavus, E. raffinosus gibi diğer enterokok türlerinde de belirlenmiştir. Van A tipi direnç Avrupa da en çok görülen direnç tipidir. ABD de Van B suşları oldukça yaygın olmasına rağmen, Van A hala daha baskın direnç tipidir (Clark vd. 1993) Van B tipi direnç Van B tipi direnç; Tn1547 transpozonunu üzerinde kodlu olan vanb geninin sentezlediği 39.5 kda moleküler ağırlıklı Van B membran proteini ile oluşturulur. Vankomisin direnci orta düzeyde (: µg/ml) olup, teikoplanine duyarlıdır (: µg/ml). Modifiye edilmiş hedefi D-ala-D-laktat dır. E. faecium ve E. 22

33 faecalis türlerinde görülür. Sadece Van B direncine özgü bir gen dışında diğer altı genin, vana kümesindeki genlerle % 77 homoloji gösterdiği saptanmıştır (Arthur ve Courvalin 1993). Direnç genleri genellikle kromozom üzerinde yerleşmiştir ve konjugasyon ile aktarılabilir ancak bazı VRE vakalarında plazmidler üzerinde bulunabileceği de saptanmıştır (Handwerger vd. 1992, Lavery vd. 1997, Leclercq ve Courvalin 1997, Hanrahan vd. 2000). Van B tipi dirençte vankomisin duyarlılığında azalma, gentamisin sinerjisinde kaybolma, streptomisin sinerjisinde azalma olmuştur. Teikoplanin tek başına Van B direnci taşıyan suşlara karşı etkili bulunmuş ama bu tedavi teikoplanine dirençli suşların seleksiyonuna neden olmuştur. Teikoplanin gentamisin kombinasyonunun ise dirençli mutant gelişimini engellediği belirlenmiştir. Buna göre Van B tipi dirençli enterokokkal enfeksiyonlarda teikoplanin aminoglikozit kombine kullanımı tercih edilmelidir (Çetinkaya vd. 2000, Rice 2001) Van C tipi direnç Van C tipi direnç, E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. flavescens türlerinde görülen doğal bir direnç türüdür. Van C gen kümesi D-ala-D-serin ile sonlanan pentapeptidin oluşumunu sağlar. Bu direnç türünün üç alt tipi bulunmaktadır: Van C-1, Van C-2, Van C-3. Bu genlerin türe spesifik olduğu düşünülmektedir (E. gallinorum vanc-1, E. casseliflavus vanc-2 ve E. flavescens vanc-3). Van A veya Van B ile % oranında benzerlik gösterir. Van C tipi dirence sahip olan suşlar teikoplanine duyarlıdır. Yapısal olarak indüklenemez ve transfer edilemezler (Çetinkaya vd. 2000) Van D tipi direnç Sadece E. faecium da bildirilmiştir. VanD geni izolatları yapısal olarak hem vankomisine (MIK µg/ml) hem de teikoplanine (MIK 4-64 µg/ml) dirençlidir. vand geni kromozomaldir ve konjugasyon yolu ile transfer edilemez (Başustaoğlu 2004, Koneman vd. 2005). Modifiye edilmiş hedef D-ala-D-Laktat dır. Glikopeptit direnci gen grubu olan vand; vana ve vanb operonları ile benzer organizasyon gösterir (Perichon vd. 2000). 23

34 Aminoglikozitlere direnç Enterokoklarda aminoglikozit direnci üç farklı mekanizma ile meydana gelir Permeabiliteye bağlı direnç Aminoglikozitlere karşı kromozomal mutasyon sonucunda membrandaki permeabilitenin azalması ile oluşan direnç yüksek düzeyde olmamakla birlikte tüm aminoglikozitlere karşı çapraz direnç şeklindedir. Bu tip direnç β-laktam antibiyotikler ile birlikte kullanılarak ortadan kaldırılabilir (Başustaoğlu ve Aydoğan 2002) Aminoglikozit modifiye edici enzimlere bağlı direnç Aminoglikozitlerdeki en sık gözlenen yüksek düzeydeki (MIK 2000 µg/ml) (HLR) edinsel direnç, plazmid veya transpozon kaynaklı asetiltransferaz (AAC), adeniltransferaz (ANT), fosfatransferaz (APH) gibi modifiye edici enzimlerle antibiyotiğin inaktive edilmesidir (Murray 1998). Yüksek düzey gentamisin direncine neden olan enzim 6 - asetiltransferaz- 2 fosfo- transferaz enzim kompleksi olup streptomisin hariç klinik kullanımda olan tüm aminoglikozitlere (gentamisin, tobramisin, amikasin ve netilmisin) yüksek düzeyli direncin ortaya çıkmasında etkilidir. Streptomisine, enzimatik yoldan kazanılan yüksek düzey direnç ise adeniltranferaz (ANT-6 ) enzimi ile olmaktadır. Bu enzim varlığında sadece streptomisine karşı yüksek düzeyde direnç gelişmektedir (Leclercq vd. 1992). E. faecium kökenlerinde yüksek düzey aminoglikozit direnci bulunmasa da penisilin ile sadece gentamisin ve streptomisin sinerjik etkili olabilir. Çünkü E. faecium kökenleri doğal olarak tobramisin, netilmisin, kanamisin ve sisomisini modifiye eden 6 asetiltransferaz (AAC- 6 ) enzimini oluştururlar. AAC 6 enzimi aac(6 )- li geni tarafından kodlanır. Bu durumda yüksek düzey aminoglikozit direnci olmamakla beraber (MIK< 2000 µg/ml) hücre duvarına etkili antibiyotikler ile sayılan bu 4 aminoglikozit arasındaki sinerji bozulmaktadır (Simjee ve Gill 1997). 24

35 Ribozomal direnç Bir ribozomal proteinde oluşan tek bir aminoasit değişikliği, o ribozomun antibiyotiğe karşı düşük ilgi göstermesine neden olur. Yalnız streptomisine karşı gelişen ve transfer edilemeyen bu tür direnç nadir görülmekte ve diğer aminoglikozitlere karşı çapraz direnç oluşmamaktadır (Başustaoğlu ve Aydoğan 2002) Kloramfenikole direnç Yapılan çesitli çalısmalarda enterokokların % sinin kloramfenikole dirençli olduğu ve dirençten en sık sorumlu mekanizmanın kloramfenikol asetil transferaz üretimi olduğu bildirilmektedir (Murray 1990). Kloramfenikolün aktivitesi, kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) enzimi tarafından inhibe edilir ve direnç gelişir. Asetillenme sonucu kloramfenikol ribozomlara bağlanamaz ve protein sentezi engellenemez. Enzimi kodlayan cat geni enterokoklarda konjugatif ve konjugatif olmayan plazmidler ya da kromozom üzerinde bulunabilir. Streptokokal plazmid pip501 üzerinde bulunan kloramfenikol asetiltransferaz direnç geni ile akraba olan gen dizisi, E. faecalis ve E. faecium izolatlarında bulunmuştur bu da genin yatay gen transferi ile aktarılabildiğini göstermiştir (Aarestrup vd. 2000). Kloramfenikol enterokoklara karşı bakteriyostatik etkilidir. Klinikte kloramfenikolün in vitro kullanımı yaygın değildir çünkü çoklu ilaç direnci gösteren E. faecium a karşı in vitro aktivitesini korumaktadır. Ancak bazı VRE suşlarında kloramfenikole karşı da direnç gösterilmiştir (Robert ve Moellering 2005) Tetrasiklinlere direnç Tetrasiklin direnci enterokoklarda konjugasyon yolu ile kazanılan direncin en tipik örneğidir (Murray 1998). Enterokoklarda tetrasiklin grubu antibiyotiklere dirençten sorumlu olan çok sayıda gen tanımlanmıştır. Bunlardan tetm geni Tn916 transpozonu üzerinde taşınır ve en yaygın olarak bulunan direnç genidir (Aarestrup vd. 2000, Huys vd. 2004). tetm, teto ve tets genleri tetrasiklinlerin ribozomlar üzerindeki etkisini 25

36 inhibe eder. tetl geni ise enterokokal bir plazmid üzerinde taşınır. Bu direnç geni mikroorganizma tetrasiklinle karşılaştığında amplifiye olur. tetl ve tetk geni tetrasiklinlerin hücre dışına pompalanmasını sağlayan aktif transport sistemini de kodlar (Murray 1990) Kinolonlara direnç Direnç gyra (DNA giraz alt ünitesi) ve parc (topoizomeraz) genlerindeki mutasyonlara bağlı gelişir. Enterokokal suşların çoğunluğu kinolonlara orta seviyede duyarlılık veya direnç gösterir (Klare vd. 2003). Kinolonlar üriner sistem infeksiyonlarında tek başına kullanılabilir. Ancak üriner sistem infeksiyonu dışında başka bir infeksiyon varsa kullanılmamalıdır. Yeni kinolonlar, özellikle klinafloksasin ve sitafloksasin VRE lere karşı, eski kinolonlara göre daha etkilidir. VRE ile oluşturulan deneysel endokarditlerde klinafloksasin tek başına veya penisilinle birlikte etkili bulunmuştur (Kutlu ve Dokuzoğuz 2004) Makrolitlere direnç Makrolidlere direnç genellikle ermb geni ile ilişkilidir. Eritromisin dirençli izolatların çoğunda belirlenen ermb geni 23 rrna yı modifiye eden ve makrolidlere karşı dirençliliği sağlayan erm metilazı kodlamaktadır (Del Campo vd. 2003). Makrolidler yanında, linkozamidlere ve streptogramin B ye karşı da direçlilik sağlayan bu gen söz konusu antibiyotiklere dirençli enterokok izolatlarında çok yaygın bir şekilde görülmektedir (Aarestrup vd. 2000, Shepard ve Gilmore 2002). E. faecalis te yürütülen analizler sonucu, bu bakteride tanımlanan ermb geninin S. aureus transpozonu 554 üzerinde taşınan ermb geni ile tamamen aynı olduğu saptanmıştır (Stovcik vd. 2008). Ayrıca enterokoklarda lakton halkasının hidrolizi veya efluks mekanizması sonucu antibiyotiğin uzaklaştırılmasıyla da direnç oluşabilir (Klare vd. 2003). 26

37 Rifampisin antibiyotikleri DNA-bağımlı RNA polimerazın β-altünitesine bağlanmaktadır. Pek çok bakteride, rifampisin direnci RNA polimerazın β-altünitesini kodlayan rpob genindeki mutasyonlar ile gerçekleşmektedir (Enne vd. 2004). Özellikle rpob genleri bakterilerde yüksek düzeyde korunmuş merkezi metabolizmaya ait genlerdir. Tek başına kullanımında direnç gelişeceğinden klinikte kullanımı önerilmez. 27

38 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Bakteriler Çalışmada Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi nde çeşitli klinik servislerde yatmakta olan hastalardan alınan idrar, bos, kan, katater, pü ve rektal swab örneklerinden elde edilen bakteri kültür koleksiyonundan sağlanan suşlar kullanılmıştır. Yapılan araştırmada, daha önce Enterococcus faecium olduğu saptanmış 95 izolat arasından çoklu ilaç dirençliliği içeren 64 tanesi incelenmiştir (Çizelge 3.1). Stok kültürler -80 C de % 15 gliserol ilave edilen Trypton Soy Broth (TSB) sıvı besi ortamında saklanmıştır. Çalışma süresince denenecek kültürler, TSB besi ortamında 37 C de 1 gece geliştirildikten sonra denemeye alınmıştır Besiyerleri Trypton Soy Broth (Oxoid, UK) Kazein hidrolizat Soya hidrolizat Glukoz NaCl K2 HPO4 Destile su ph 7.3 ± 0.2 (sterilizasyondan önce) 17 g 3 g 5 g 5 g 2.5 g 1 lt 30 Gram toz besiyeri 1 litre saf su ile eritilerek karıştırıldı ve 121 C otoklavda 15 dakika sterilize edildi. 28

39 Müller-Hinton Broth (Oxoid, UK) Et ekstraktı 30 g Kazein hidrolizat 17.5 g Nişasta 1.5 g ph 7.3 ± 0.1 (sterilizasyondan önce) 38 Gram toz besiyeri 1 litre saf su ile karıştırıldı ve 121 C otoklavda 15 dakika sterilize edildi. Trypticase Soy Agar (Oxoid, UK) Kazein hidrolizat 15 g Soya hidrolizat 5 g NaCl 5 g Agar 15.0 g ph 7.3 ± 0.1 (sterilizasyondan önce) 40 Gram toz besiyeri 1 litre distile su ile karıştırıldı ve 121 C otoklavda 15 dakika sterilize edildi. 50 C ye kadar soğutuldu ve % 5 steril defibriniz koyun kanı ilave edildi Bakterilerin tür teşhisi Klinik izolatlardan enterokokların teşhisi ve testleri için BD (Becton Drive, USA) firmasına ait Phonex sistemi, Enterococcus faecium olarak tür teşhisini doğrulamak amacıyla da Rapid ID 32 Strep Api (Biomerıeux, France) testi kullanılmıştır. 29

40 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan bakteriler ve izolasyon materyalleri Kod Bakteri Türü İzolasyon materyali 1 E. faecium Rektal 2 E. faecium Kan 3 E. faecium İdrar 4 E. faecium Kan 5 E. faecium İdrar 6 E. faecium Kan 8 E. faecium İdrar 11 E. faecium Kan 12 E. faecium Kan 13 E. faecium Rektal 15 E. faecium Rektal 17 E. faecium Rektal 19 E. faecium Rektal 21 E. faecium Kan 24 E. faecium İdrar 25 E. faecium İdrar 26 E. faecium İdrar 27 E. faecium Pü 28 E. faecium Kan 29 E. faecium İdrar 30 E. faecium İdrar 31 E. faecium Katater 32 E. faecium İdrar 33 E. faecium İdrar 34 E. faecium Bos 35 E. faecium İdrar 36 E. faecium Rektal 37 E. faecium İdrar 38 E. faecium Rektal 39 E. faecium Rektal 41 E. faecium Rektal 42 E. faecium Rektal Bakteri Türü Kod İzolasyon materyali E. faecium 43 İdrar E. faecium 46 Kan E. faecium 48 Pü E. faecium 49 İdrar E. faecium 50 İdrar E. faecium 52 İdrar E. faecium 55 Rektal E. faecium 56 İdrar E. faecium 57 İdrar E. faecium 59 Rektal E. faecium 60 İdrar E. faeciums 63 Rektal E. faecium 64 Pü E. faecium 65 Rektal E. faecium 67 İdrar E. faecium 68 Rektal E. faecium 69 Kan E. faecium 70 Rektal E. faecium 71 Kan E. faecium 74 İdrar E. faecium 75 rektal E. faecium 76 İdrar E. faecium 77 Kan E. faecium 79 İdrar E. faecium 80 İdrar E. faecium 81 Kan E. faecium 84 Rektal E. faecium 87 Rektal E. faecium 89 Rektal E. faecium 90 Rektal E. faecium 94 İdrar E. faecium 95 Rektal 30

41 3.1.4 Antibiyotikler Antibiyotik duyarlılık deneylerinde kullanılan antibiyotikler SİGMA (Oxoid, UK) firmasından satın alınmıştır. Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin disk konsantrasyonları çizelge 3.2 de verilmiştir. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde standart suş Enterococcus faecalis ATCC kullanılmıştır. Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotikler ve disk konsantrasyonları (Oxoid, UK) Antimikrobiyal Madde Sembol Grubu Disk konsantrasyonu (µg) Ampisilin AMP β -laktam 10 Streptomisin STR Aminoglikozit 300 Kanamisin KAN Aminoglikozit 30 Gentamisin GEN Aminoglikozit 120 Kloramfenikol CHL Fenikol 30 Tetrasiklin TET Tetrasiklin 30 Rifampin RIF Ansamisin 5 Vankomisin VA Glikopeptit 30 Eritromisin Teicoplanin ERT TEC Makrolid Glikopeptit

42 3.1.5 Primerler Çizelge 3.3 Antibiyotik direnç genlerinin tespiti için kullanılan primerler Gen van A Vankomisin ant(6) - la Streptomisin aac(6 )-aph(2 ) Gentamisin apha-3 Kanamisin rpob1 Rifampisin rpob2 Rifampisin bla(z) Ampisilin ermb Eritromisin catpip Kloramfenikol tet M Tetrasiklin tet L Tetrasiklin vanb vankomisin Primer dizisi 5 GGGAAAACGACAATTGC 3 3 GTACAATGCGGCCGTTA 5 5 ACTGGCTTAATCAATTTGGG 3 3 GCCTTTCCGCCACCTCACCG 5 5 CCAAGAGCAATAAGGGCATACC 3 3 ACCCTCAAAAACTGTTGTTGC 5 5 GCCGATGTGGATTGCGAAAA 3 3 GCTTGATCCCCAGTAAGTCA 5 5 GTCCGTTTCGGCTTTAATATA 3 3 AAGAAACGAGCATTCAGCAA 5 5 CGCAAGCGACTCAAGAACAG 3 3 GAGCAAATGTTCCATCTTCA 5 5 TACAACTGTAATATCGGAGGG 3 3 CAATAGGTTCAGATTGGCCC 5 5 CATTTAACGACGAAACTGGC 3 3 GGAACATCTGTGGTATGGCG 5 5 GGATATGAAATTTATCCCTC 3 3 CAATCATCTACCCTATGAAT 5 5 GTTAAATAGTGTTCTTGGAG 3 3 CTAAGATATGGCTCTAACAA 5 5 CATTTGGTCTTATTGGATCG 3 3 ATTACACTTCCGATTTCGG 5 5 ATGGGAAGCCGATAGTC 3 3 GATTTCGTTCCTCGACC 5 Bant büyüklüğü Referans (bç) Dutka-Malen 732 vd Kobayashi vd Kobayashi vd Braak vd Enne vd Enne vd Stovcik vd Aarestrup vd Aarestrup vd Aarestrup vd Aarestrup vd Mcgregor ve 635 Young

43 3.2 Yöntem İzolatlarının saflık kontrolü ve tür teşhisinin doğrulanması Daha önce E. faecium olarak tanımlanmış ve antibiyotik duyarlılıkları incelenmiş olan 95 izolat arasından çoklu ilaç dirençli oldukları bilinen 64 izolat seçilmiş ve tekrar saflık kontrolü yapmak için % 5 koyun kanlı TSA besiyerine ekilmiştir. E. faecium izolatları α hemolitik olabilir yada hemolitik özellik göstermeyebilir. Bu nedenle suşlar öncelikle besiyeri üzerinde α-hemolitik, β-hemolitik veya hemolitik olmama özelliklerine göre incelenmiştir. Daha sonrasında spesifik koloniler seçilerek Gram boyamaları yapılmıştır. Tekli, ikili veya kısa zincirler halinde görünen Gram- pozitif koklar değerlendirmeye alınmıştır. Katalaz testi; öze ile temiz bir lam üzerine alınan bakteri kolonisine % 3 lük H 2 O 2 damlatılarak yapılmıştır. Hava kabarcığı oluşturmayan lamlar katalaz negatif olarak değerlendirilmiştir. % 6.5 NaCl de üremelerine ve lateks yöntemine göre serolojik olarak D grubu yüzey antijeni içerip içermediklerine bakılmıştır (Şekil 3.1). Bu özelliklerine göre yeniden Enterokok cinsine ait oldukları saptanan 64 bakterinin tür teşhisi yapılmıştır (Facklam vd. 1997). Teşhis işlemi ve (Minimal İnhibisyon Konsantrasyonu) için Gram- negatif ve Gram- pozitif bakterilerin otomatik tanı ve antibiyogram duyarlılık testlerinde kullanılan, Akdeniz Üniversitesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına ait Phonex cihazı (Becton Drive, USA) kullanılmıştır. Phonex panelinin ID kısmı, kurutulmuş kimyasal substratlı 45 kuyu ve 2 floresans kontrol kuyusu içerir. Bakteri tiplendirmesini saptamak için bir seri konvansiyonel, kromatojenik ve florejenik biyokimyasal maddeler kullanır. Üreme tabanlı ve enzimatik maddelerin her ikiside taksonomi sınırları içinde çeşitli reaktif tiplerine döner. Testler bakteri tarafından kullanım ve indirgeme olaylarının çeşitli indikatörlerle gösterilmesi presibine dayanır. Phonex ID paneli ile çalışmada kullanılan tüm suşların E. faecium olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca tür teşhisini doğrulamak amacıyla rapid ID 32 Strep Api testinden de yararlanılmıştır (Şekil 3.2). Tür teşhisi doğrulanan bakterilerden % 15 gliserol içeren TSB besiyerine stok kültürler hazırlanmıştır. 33

44 %5 koyun kanlı Tripticase soya agar Gram Boyama Gram- pozitif koklar (katalaz(-) %40 safralı ortamda üreme ve escülini hidrolize D grubu Streptekok %6.5 NaCl de üreme PYR (+) Enterococcus spp. Rapid ID 32 Strep Api ile tür teşhisi Enterococcus faecium Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının tanısında kullanılan testler (Faclam vd. 1997) 34

45 Şekil 3.2 rapid ID 32 Strep Api testi ile Enterococcus faecium suşlarının doğrulanması 35

46 3.2.2 Antimikrobiyal dirençliliğin belirlenmesi Antibiyotik duyarlılık testinde kullanılan Phonex cihazı AST paneli buyyon tabanlı bir mikrodilüsyon testidir ve kuru antimikrobiyal ajanları içeren 84 kuyu ile üreme kontrol kuyusu içerir. Bakteriyel bulanıklık, bakteriyel üremenin belirlenmesinde kullanılır. Phonex sistemi, organizmanın üremesinin belirlenmesi için redox göstergesini kullanır. Phonex VRE, yüksek düzey aminoglikozit direnci testleri NCCLS standart broth mikro seyreltme ve NCCLS taramalı agar testi ile geliştirilerek optimize edilmiştir (Anonymous 2000). % 5 koyun kanlı TSA plaklarında saf olarak elde edilen enterokok kolonilerinden ID broth içerisine steril eküvyonla BBL CrystalSpec nefelometre (Becton Drive, USA) ile Mac Farland ölçülecek şekilde bakteri süspansiyonu hazırlanmıştır. Hazırlanan süspansiyondan 25 µl indikatör çözeltisi eklenen AST broth içerisine alınmıştır. Bu şekilde hazırlanan panel cihaza yerleştirilmiştir. Panel üzerindeki kuyucuklarda oluşan biyokimyasal reaksiyonlara göre her bir izolatın türü teşhis edilmiş ve belirli antibiyotiklere karşı değerleri saptanmıştır. Ayrıca suşların antibiyotik dirençlilik/duyarlılık profillerinin araştırılmasında disk difüzyon yöntemi de kullanılmıştır. Kültürler 5mL MHB ortamına inoküle edilerek 37 C de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra kültür süspansiyonunun bulanıklılığı McFarland 0.5 standardının absorbansı 625 nm de değerinde olacak şekilde ayarlanmıştır. Absorbansı ayarlanan kültürler % 0.7 oranında agar içeren 5 ml yumuşak agar (MHB) ortamına 100 µl inoküle edilerek, Müller Hinton (Oxoid, UK) agar plakları üzerine homojen bir şekilde yayılmıştır. Antimikrobiyel ajanlar emdirilmiş 6 mm lik kağıt diskler, agar yüzeyine yerleştirilmiş ve 37 ºC de 18 saat inkübe edilmiştir. Vankomisin antibiyotiği için ise 24 saat inkübasyon uygulanmıştır. Disk difüzyonu için, 10 farklı antimikrobiyel madde kullanılmıştır. Kullanılan antimikrobiyel diskler ve içerikleri çizelge 3.2 de verilmiştir. İnkübasyon sonrası, disklerin etrafındaki zon çapları ölçülmüş ve Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü (CLSI) nün belirlediği kırılma noktaları ile karşılaştırılmıştır. Buna göre sonuçlar duyarlı (S), orta dirençli (I) ve dirençli (R) olarak belirlenmiştir (Anonymous 2011). 36

47 3.2.3 İzolatların plazmid profillerinin belirlenmesi Plazmid izolasyonu TSB broth besiyerinde 37 C de 18 saat geliştirilen E. faecium kültürlerinden, 10 ml lik TSB ortamlarına 1 ml lik inokülasyonlar yapılarak, kültürler 37 C de saat inkübasyona tabi tutulmuştur. Bu süre bitiminde santrifüj tüplerine aktarılan bakteri kültürleri, 6000 devirde 15 dakika santrifüj edilmiştir. Hücre çökeltisi kurutulduktan sonra, 380 µl sakkaroz tamponunda çözülmüş ve steril mikrosantrifüj tüplerine aktarılmıştır. 37 C ye kadar ısıtılan bu ortama 96.5 µl lizozim çözeltisi ilave edilerek 37 C su banyosunda 5 dakika bekletilmiştir µl Tris-EDTA 1 uygulamasından sonra, mikrosantrifüj tüplerine % 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinden 28 µl aktarılarak karıştırılmıştır. Bu aşamada ortamda viskozitenin artışı, lizizin başladığını göstermektedir. Lizizin tamamlanması için, mikrosantrifüj tüpleri 37 ºC su banyosunda 10 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda tüpler mekanik karıştırıcıda ve yüksek devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA nın kırılması sağlanmıştır. Ortama, yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 28 µl ilave edilmiş ve tüpler düz bir zemin üzerinde 10 dakika süre ile yavaş bir şekilde çevrilerek kromozomal DNA nın alkali denatürasyon koşulları oluşturulmuştur. Ortam ph sının uygulama sırasında arasında olup olmadığı kontrol edilmiştir. Denatürasyon aşamasının sonunda mikrosantrifüj tüplerine 50 µl 2 M Tris-HCl çözeltisi aktarılarak, 3 dakika süre ile yine düz bir zeminde karıştırılmıştır. Ortam ph sının arasına düşüşü ile nötralizasyonun sağlandığı belirlenmiştir. Mikrosantrifüj tüplerine, +4 C de tutulan 5 M NaCl çözeltisinden 72 µl ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 700 µl ilave edilerek +4 C de devirde 20 dakika santrifüj işlemi uygulanmıştır. Tüplerde oluşan üst faz, mikropipet ile yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarılmış ve deproteinasyonun sağlanması için kloroform/izoamilalkol (24:1) çözeltisinden 700 µl ilave edilmiştir. Tüpler +4 ºC de devirde 20 dakika santrifüj edilerek üst faz alınmış ve 500 µl etanol ilave edilmiştir. Ekstraktlar - 20 ºC de 1 gece bekletilmiş ve plazmid DNA, devirde 20 dakika santrifüj edilmek suretiyle çöktürülmüştür. Son aşamada sıvı faz akıtılarak DNA çökeltisi kurutulmuştur. Çökeltiler, 20 µl Tris-EDTA- 37

48 2 içerisinde çözülmüş ve elektroforez uygulamasından önce RNaz A stok çözeltisinden 2 µl ilave edilerek 37 ºC de 45 dakika inkübe edilmiştir (Anderson ve McKay 1983). Sakkaroz Çözeltisi Tris g EDTA g Sakkaroz 6.7 g Distile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Kaba filtreden geçirildi ve 121 C de sterilize edildi. Lizozim Çözeltisi Tris 0.3 g Lizozim 0.1 g Distile su 10 ml ph 8.0 ± 0.02 Membran filtre ile sterilize edildi. Tris-EDTA-1 Tris 0.6 g EDTA 9.31 g Distile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Kaba filtreden geçirildi ve 121 C de sterilize edildi. Tris-HCl Tris-HCl g Distile su 100 ml ph 7.0 ± 0.02 Kaba filtreden geçirildi ve 121 C de sterilize edildi. 38

49 SDS Çözeltisi Tris 0.6 g EDTA 0.74 g SDS 20 g Distile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Kaba filtreden geçirildi ve 121 C de sterilize edildi. Tris_EDTA-2 Tris g EDTA g Distile su 100 ml ph 7.5 ± 0.02 Kaba filtreden geçirildi ve 121 C de sterilize edildi. %3 NaCI ile Doyurulmuş Fenol Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g fenol üzerine 20 ml destile su ve 3 g NaCl aktarılarak 45 ºC deki su banyosunda çözülmüştür. Ortama 0.1 g hidroksiguinolin ilave edilmiş ve karıştırılarak oda sıcaklığında tutulmuştur. RNaz A Çözeltisinin Hazırlanışı: 5 ml steril destile su içinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat çözeltisinin ph sı, asetik asit ile 5 e ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A ilave edilmiştir. Kaynar su içerisinde 5 dakika tutulduktan sonra, ortam 20 ºC de saklanmıştır Elektroforez DNA örneklerinin elektroforezi, % 0.7 agaroz içeren jellerde yapılmıştır (Meyers vd. 1976). Yatay jel sistemleri için agaroz, 100 ml tris-asetat elektroforez tamponu içerisinde ve kaynar su banyosunda çözülmüştür. 45 ºC ye kadar soğutulan ortam elektroforez plakalarına ml olacak şekilde aktarılmış ve jel tarakları yerleştirilerek 30 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda tampon çözelti, jeli kapatacak 39

50 şekilde elektroforez tanklarına dökülmüş ve taraklar dikkatlice çıkartılmıştır. 37 ºC de 45 dakika inkübe edilen DNA örnekleri su banyosundan alınarak, 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet aracılığı ile jel kuyucuklarına aktarılmıştır. Elektroforez, 80 voltta saat süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemleri terk etmesinden sonra, elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jeller, kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış 0.2 µg/ml etidyum bromit içeren çözeltisinde 30 dakika boya işlemine tabi tutulmuştur. Boyama işlemi bitiminde jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışıkta incelenmiş ve Kodak Gel Logic 200 Imaging System kullanılarak fotoğrafları alınmıştır (Macrina vd. 1982). TRİS-Asetat Tampon Tris 4.84 g Sodyum asetat 4.08 ml EDTA 0.37 ml Distile su 1000 ml ph 8.0 ± 0.02 Marker Boya Bromfenol blue 0.25 g Sakkaroz 40 g Distile su 100 ml Plazmid büyüklüklerinin saptanması E. faecium suşlarından izole edilen plazmidlerin büyüklüklerinin belirlenmesinde; moleküler büyüklükleri bilinen (Sigma Chem. Co. D5292) ve baz çifti arasında değişen 11 süpersarmal parça içerikli ccc DNA marker larının elektroforetik hareketlilikleri ile büyüklüklerinin logaritmaları arasında tanımlanan doğrusal ilişkiden yararlanılmıştır (Macrina vd. 1978, Southern 1979, Schaffer ve Sederof 1981). Marker ccc DNA moleküllerinin agaroz jel fotoğrafları üzerinde ölçülen göç aralıkları ile 40

51 bilinen büyüklüklerinin logaritmik değerlerine bağlı olarak eğrileri çıkarılmıştır. İstatistik analizlerle her farklı jel için korelasyon katsayısı ve eğrinin eğimi belirlenerek, bakterilerden izole edilen plazmidlerin büyüklükleri saptanmıştır (Campbell 1974, Elder ve Southern 1983, Elder vd. 1983). Moleküler Büyüklük (W) = Antilog 10 [ I. (α-g) + H ] X = marker DNA moleküllerinin agaroz jel üzerindeki göç aralığı (mm) Y = Marker DNA moleküllerinin büyüklüğü (kb) A = X 1 + X 2 + X X n B = X X X X n C = log 10 Y 1 + log 10 Y 2 + log 10 Y log 10 Y n D = (log 10 Y 1 ) 2 + (log 10 Y 2 ) 2 + (log 10 Y 3 ) ( log 10 Y n ) 2 E = X 1 (log 10 Y 1 )+X 2 ( log 10 Y 2 ) + X 3 ( log 10 Y 3 )+...+X n ( log 10 Y n ) G = Ortalama X = A/N H = Ortalama Y = C/N α = Moleküler büyüklüğü bilinmeyen plazmidin jel üzerindeki göçü (mm) Eğrinin Eğimi (I) = E ( G. C) B ( G. A) Korelasyon Katsayısı (J) = E ( G. C) [ D _( H. C)].[ B _( G. A)] Genomik DNA izolasyonu TSB besiyeri ortamında 37 C de 18 saat geliştirilen E. faecium kültürleri, 10 ml lik steril santrifüj tüplerine aktarılmış ve 6000 rpm de 15 dakika santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Hücre çökeltisi 500 µl TE tampon içerisinde çözülerek g de 1 dakika oda sıcaklığında tekrar çöktürülmüştür. Oluşan hücre çökeltisi SET (Sakkaroz- EDTA-TrisHCl) tampon içerisinde çözüldükten sonra 50 µl lizozim eklenmiş ve 30 dk 37 C de inkübe edilmiştir. Bu içerik üzerine 200 µl TE tampon ve 30 µl % 20 lik SDS 41

52 eklenip, birkaç kez elde çevrilerek karıştırılmıştır. Karışım üzerine 100 µl 5 M NaCl ilave edilip tekrar karıştırılmıştır. Daha sonra ortama eşit hacimde (~500 µl) fenol aktarılmış ve emülsiyon oluşana kadar karıştırılmıştır. Ortam g de 15 dk +4 C de santrifüj edilerek fazların ayrılması sağlanmıştır. Üst faz mikropipet aracılığı ile yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış ve üzerine eşit hacim (~500 µl) kloroform/izoamil alkol eklenerek karıştırılmıştır. Karışım, g de 15 dk oda sıcaklığında santrifüj işlemine tabi tutulmuş ve oluşan üst faz yeni mikrosanrifüj tüplerine aktarılmıştır. Daha sonra bu tüpte bulunan üst sıvının iki katı hacminde % 100 lük etanol tüpe ilave edilmiştir. Bu karışım, rpm de +4 C de 15 dk santrifüj edilmiştir. Oluşan çökelti havada kurutulduktan sonra 100 µl TE tampon ile çözülerek 2 µl RNaz A eklenmiş ve 37 C de 45 dk inkübe edilmiştir. DNA saflığı spektrofotometrede A 260 /A 280 oranına bakılmak suretiyle ölçülmüştür. Tris (Tris Hidroksimetil Amino Metan) / EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetik Asit) Tris 1,21g EDTA 0.37g Distile su 1000mL ph 2N HCl kullanılarak 7.4 e ayarlandı. 121 C de sterilize edildi. SET (Sakkaroz-EDTA-Tris HCl) Tampon Tris HCl 0,788g EDTA 1,86g Sakkaroz 20g Distile su 100mL ph 8 e ayarlanıp 121 C de sterilize edildi. % 20 SDS Çözeltisi SDS Steril distile su 20g 100mL 42

53 Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi Kloroform İzoamil Alkol 24mL 1mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) PZR amplifikasyonları için Techne TC-512 Thermal Cycler (England) cihazı kullanılmıştır. T a (bağlanma sıcaklığı, C) her bir primer için ayrı ayrı T a = 2 x (A+T) + 4 x (G+C) formülü kullanılarak hesaplanmıştır. PZR sonrasında, elde edilen ürünlerden 5µl alınarak 2µl 6x yükleme boyası ile karıştırılmış ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 volt elektrik akımı altında koşturulmuştur. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile 1 kb DNA Marker dan (Fermentas, Finland) yararlanılmıştır. Elektroforez sonrası jeller, 0.2 µg/ml etidyum bromit (BioShop, Canada) çözeltisinde 20 dk süre ile boyama işlemine tabi tutularak ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör kullanılarak görüntülenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). 43

54 Antibiyotik dirençliliği kodlayan gen bölgelerinin PZR ile araştırılması rpob1 ve rpob2 gen bölgelerinin çoğaltılması (Enne vd. 2004) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 29,75 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (2mM)** 1 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 95 0 C 5 dakika 95 0 C 1 dakika 57 0 C... 1 dakika 35 döngü 72 0 C... 1 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 44

55 bla Z gen bölgesinin çoğaltılması (Stovcik vd. 2008) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 31,55 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10mM)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 2 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika 58 0 C saniye 35 döngü 72 0 C... 2 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 45

56 tetm ve tetl gen bölgelerinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 29,75 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (2mM)** 1 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika C saniye 35 döngü 72 0 C... 2 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 46

57 apha3 gen bölgesinin çoğaltılması (Braak vd. 1999) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 28,55 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10mM)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 6 µl 3 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 30 saniye C saniye 32 döngü 72 0 C... 2 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 47

58 aac6 -aph2 gen bölgesinin çoğaltılması (Kobayashi vd. 2001) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 30,55 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10mM)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika 58 0 C dakika 30 döngü 72 0 C... 2 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 48

59 vana gen bölgelerinin çoğaltılması (Dutka-Malen vd. 2005) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 31,05 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10 mm)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 3 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 2.5 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika 54 0 C dakika 30 döngü 72 0 C... 1 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 49

60 vanb gen bölgelerinin çoğaltılması (Mcgregor ve Young 2000) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 30,55 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10 mm)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 3 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika 53 0 C dakika 30 döngü 72 0 C... 2 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 50

61 ant6 gen bölgesinin çoğaltılması (Kobayashi vd. 2001) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 30,55 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (10 mm)** 0.2 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 95 0 C 10 dakika 94 0 C 30 saniye 54 0 C saniye 30 döngü 72 0 C saniye 72 0 C 10 dakika C.. 51

62 cat gen bölgesinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 29,75 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (2 mm)** 1 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 4 µl 2 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 3 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 94 0 C 5 dakika 94 0 C 1 dakika 50 0 C dakika 30 döngü 72 0 C dakika 72 0 C 7 dakika C.. 52

63 ermb gen bölgesinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000) PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim Steril distile su 32,75 µl 5X PZR tamponu* 10 µl 1 X dntp (2 mm)** 1 µl 0,04 mm İleri primer 1 µl 0,2 µm Geri primer 1µl 0.2 µm MgCl 2 (25mM)* 2 µl 1 mm Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL DNA 2 µl Toplam 50µl * Promega, USA ** Fermentas, Finland PZR koşulları 93 0 C 5 dakika 93 0 C 1 dakika 56 0 C dakika 35 döngü 72 0 C... 1 dakika 72 0 C 10 dakika C.. 53

64 3.2.6 DNA dizi analizi Antibiyotik dirençliliğini kodlayan gen bölgelerine özel olarak tasarlanan primerler kullanılarak PZR gerçekleştirilmiştir. Elde edilen PZR ürünleri saflaştırılmış ve dizi analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapılmıştır. Sonuçlar PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirilmiştir Konjugasyon denemeleri Konjugal verici ve alıcı suşlar antibiyotik ilaveli TSB ortamlarında 37 ºC de 18 saat geliştirilmiş ve aynı ortamlarda 10 1 düzeyinde dilüsyonları hazırlanmıştır. Bu dilüsyonlardan alınan 2 ml verici ve 3 ml alıcı suş kültürleri karıştırıldıktan sonra, filtrasyon işlemi ile steril membran filtreler (0.45 µm, Sartorius, Germany) üzerinde toplanmıştır. Alıcı ve verici suş kültür karışımlarını içeren filtreler TSA plaklarına yerleştirilerek, 37 ºC de 18 saat inkübe edilmiştir. Bu süre bitiminde TSA plaklarından alınan filtreler, 1 ml steril fizyolojik su içerisinde çözülmüş ve 10 8 düzeyine kadar seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Her bir dilüsyondan alıcı ya da verici suşun duyarlı olduğu her iki antibiyotiği içeren agar plaklarına sürme ekim yapılarak 37 ºC de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır (Lampkowska vd. 2008). 54

65 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1 Enterococcus faecium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılık Düzeylerinin Tanımlanması Araştırmada kullanılan Akdeniz Üniversitesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonundan sağlanan 64 E. faecium izolatının 25 ini idrar, 22 sini rektal, 12 sini kan, 3 ünü pü ve geri kalan 2 tanesini bos ve katater kültürlerinden elde edilen suşlar oluşturmaktadır. Enterokokların her tür nozokomiyal enfeksiyonlardan, özellikle üriner sistem enfeksiyonlarından izolasyon sıklığı gittikçe artmaktadır. Ülkemizde yapılan araştırmaların çoğunda enterokoklar en sık idrardan izole edilmişlerdir (Gür 1997, Esen vd. 2001). Çalışmamızda da diğer çalışmalarla uyumlu olarak E. faecium izolatlarına en sık idrarda rastlanmıştır. E. faecium suşlarının antibiyotik duyarlılık profillerinin belirlenmesinde bölüm de anlatıldığı gibi Phonex sistemi ve disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır. Phonex antibiyogram sisteminde çalışılan antibiyotik disklerinin konsantrasyonları sonuçlarına göre direnç özellikleri incelenecek 10 farklı antibiyotik disk difüzyon yöntemi ile de doğrulanmıştır (Şekil 4.1). Çalışmada kullanın suşların antibiyotik duyarlılık sonuçları çizelge 4.1 de verilmiştir. Şekil 4.1 Enterococcus faecium suşlarının disk difüzyon testi 55

66 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları Bakteri Adı= E. faecium (1) Bakteri Adı= E. faecium (2) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 20mm Kloramfenikol X 24mm Gentamicin SYN X 24mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X 4mm R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Tetrasiklin X 24mm S<=0.5 Teikoplanin X 5mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (3) Bakteri Adı= E. faecium (4) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X 10mm R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 13mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 15mm Kloramfenikol X 19mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X - R>8 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X R>16 *Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 56

67 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (5) Bakteri Adı= E. faecium (6) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X 17mm I 4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 12mm Kloramfenikol X 17mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 23mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 23mm S<1000 Tetrasiklin X 10mm R>8 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (8) Bakteri Adı= E. faecium (11) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 14mm R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 18mm Kloramfenikol X 24mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 26mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Teikoplanin X 9mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 57

68 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (12) Bakteri Adı= E. faecium (13) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 12mm Rifampin X 16mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 17mm Kloramfenikol X 15mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (15) Bakteri Adı= E. faecium (17) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X 16mm I 4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X 10mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 30mm Kloramfenikol X 26mm Gentamicin SYN X 28mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X 26mm S<=1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 58

69 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (19) Bakteri Adı= E. faecium (21) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 13mm R>16 Vankomisin X 14mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 17mm Rifampin X - Kanamicin X 13mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 26mm Gentamicin SYN X 22mm S<=500 Gentamicin SYN X 24mm S<=500 Streptomicin SYN X 20mm S<=1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 24mm S<=0.5 Tetrasiklin X 32mm S<=0.5 Teikoplanin X 9mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (24) Bakteri Adı= E. faecium (25) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 10mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X 10mm R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 14mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 17mm Kloramfenikol X 19mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 18mm R>8 Tetrasiklin X 27mm S 2 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 59

70 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (26) Bakteri Adı= E. faecium (27) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 23mm S<=1 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 9mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 17mm Kloramfenikol X 22mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 25mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 20mm S<=1 Bakteri Adı= E. faecium (28) Bakteri Adı= E. faecium (29) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 15mm I 8 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X 13mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 19mm Kloramfenikol X 19mm Gentamicin SYN X 25mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 6mm R>1000 Tetrasiklin X 10mm R>8 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 18mm S<=1 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 60

71 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (30) Bakteri Adı= E. faecium (31) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 10mm R>16 Vankomisin X 12mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 25mm Kloramfenikol X 24mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 29mm S<=500 Streptomicin SYN X 6mm R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 29mm S<=0.5 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (32) Bakteri Adı= E. faecium (33) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 22mm S<=1 Vankomisin X 22mm S<=1 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 23mm Kloramfenikol X 20mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Teikoplanin X 23mm S<=1 Teikoplanin X 20mm S<=1 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 61

72 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (34) Bakteri Adı= E. faecium (35) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 24mm S<=1 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 11mm Rifampin X 12mm Kanamicin X - Kanamicin X 12mm Kloramfenikol X 23mm Kloramfenikol X 19mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X 22mm S<=1 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (36) Bakteri Adı= E. faecium (37) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 11mm R>16 Vankomisin X 23mm S 2 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 13mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 27mm Gentamicin SYN X 25mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 20mm S<=1 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 62

73 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (38) Bakteri Adı= E. faecium (39) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 11mm R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 25mm Kloramfenikol X 29mm Gentamicin SYN X 26mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (41) Bakteri Adı= E. faecium (42) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 14mm Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 18mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 29mm S<=0.5 Tetrasiklin X 9mm R>4 Teikoplanin X 13mm I 16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 63

74 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (43) Bakteri Adı= E. faecium (46) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 28mm S<=1 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin I 20mm I 4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X 14mm Kloramfenikol X 18mm Kloramfenikol X 25mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 23mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 9mm R>4 Tetrasiklin X 24mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 25mm S<=1 Bakteri Adı= E. faecium (48) Bakteri Adı= E. faecium (49) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 24mm S<=1 Vankomisin X 14mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 13mm Kanamicin X - Kanamicin X 12mm Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 28mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 22mm S<=1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X 21mm S<=1 Teikoplanin X 8mm R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 64

75 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (50) Bakteri Adı= E. faecium (52) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 21mm S 2 Vankomisin X 21mm S 2 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 19mm Kloramfenikol X 18mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Teikoplanin X 22mm S<=1 Teikoplanin X 20mm S<=1 Bakteri Adı= E. faecium (55) Bakteri Adı= E. faecium (56) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 24mm S<=1 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 12mm Rifampin X 10mm Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 26mm Kloramfenikol X 24mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 32mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 25mm S<=1 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 65

76 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (57) Bakteri Adı= E. faecium (59) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 9mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X 13mm Kloramfenikol X 15mm Kloramfenikol X 17mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 25mm S<=1000 Tetrasiklin X 10mm R>8 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X 16mm R>16 Bakteri Adı= E. faecium (60) Bakteri Adı= E. faecium (63) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 16mm Kloramfenikol X 22mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 28mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 66

77 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (64) Bakteri Adı= E. faecium (65) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 16mm Kloramfenikol X 20mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 9mm R>8 Tetrasiklin X 21mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (67) Bakteri Adı= E. faecium (68) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X 15mm I 2 Rifampin X 12mm Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X 12mm Kloramfenikol X 22mm Kloramfenikol X 25mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 26mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 21mm S<=1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 24mm S<=0.5 Teikoplanin X 8mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 67

78 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (69) Bakteri Adı= E. faecium (70) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 22mm S<=1 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X 12mm Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 24mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 24mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 21mm S<=1000 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X 20mm S<=1 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (71) Bakteri Adı= E. faecium (74) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 22mm S<=1 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X 9mm R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X 11mm Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 19mm Kloramfenikol X 16mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X - R>4 Tetrasiklin X 10mm R>8 Teikoplanin X 20mm S<=1 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 68

79 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (75) Bakteri Adı= E. faecium (76) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X 16mm R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X 11mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 16 mm Kloramfenikol X 15mm Gentamicin SYN X 26 mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X - R>8 Tetrasiklin X 36mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (77) Bakteri Adı= E. faecium (79) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 16 mm Kloramfenikol X 15mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 9mm R>4 Tetrasiklin X 9mm R>8 Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 69

80 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (80) Bakteri Adı= E. faecium (81) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X 16mm Kanamicin X 12mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 16mm Kloramfenikol X 17mm Gentamicin SYN X 26 mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 11mm I 16 Bakteri Adı= E. faecium (84) Bakteri Adı= E. faecium (87) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 13mm R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X 13mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 22mm Kloramfenikol X 16mm Gentamicin SYN X 24mm S<=500 Gentamicin SYN X 28mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X 8mm R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 70

81 Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam) Bakteri Adı= E. faecium (89) Bakteri Adı= E. faecium (90) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X - Kloramfenikol X 24mm Kloramfenikol X 16mm Gentamicin SYN X 15mm S<=500 Gentamicin SYN X 13mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 26mm S<=0.5 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Bakteri Adı= E. faecium (94) Bakteri Adı= E. faecium (95) DİSKLERİ R S I DİSKLERİ R S I Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16 Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8 Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4 Rifampin X - Rifampin X - Kanamicin X - Kanamicin X 11mm Kloramfenikol X 22mm Kloramfenikol X 17mm Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 26mm S<=500 Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000 Tetrasiklin X 9mm R>4 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5 Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 71

82 Çizelge 4.2 Standart E. faecalis ATCC29212 suşunun disk difüzyon ve testlerine göre antibiyotik duyarlılığı Bakteri Adı= E. faecalis ATCC (Kontrol) DİSKLERİ R S I Vankomisin X 18mm S 2 Ampicilin X 26mm S<=2 Eritromisin X 17mm I 2 Rifampin X 12mm Kanamicin X - Kloramfenikol X 18mm Gentamicin SYN X 17mm S<=500 Streptomicin SYN X 15mm S<=1000 Tetrasiklin X 17mm I 8 Teikoplanin X 17mm S<=1 Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. =Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli 64 adet E. faecium suşunun tamamı ampsiline, kanamisine, eritromisine ve rifampisine; 52 tanesi vankomisine, 56 tanesi yüksek düzey streptomisine, 43 tanesi yüksek düzey gentamisine, 22 tanesi kloramfenikole, 14 tanesi tetrasikline ve 51 tanesi teikoplanine dirençli bulunmuştur (Çizelge 4.3). 72

83 Çizelge 4.3 E. faecium suşlarının antibiyotik gruplarına karşı direnç oranları GRUBU ADI DİSK İÇERİĞİ DUYARLILIK (%) GLİKOPEPTİDLER S I R Vankomisin 30 µg MAKROLİDLER Teicoplanin 30 µg Grup Ortalaması Eritromisin 15 µg Kloramfenikol(Fenikoler) 30 µg Rifampin (Ansamisinler) 5 µg Grup Ortalaması TETRASİKLİNLER Tetrasiklin 30 µg Grup Ortalaması AMİNOGLİKOZİDLER Gentamisin 120 µg Kanamisin 30 µg Streptomisin 300 µg Grup ortalaması β - LAKTAMLAR Ampicilin 10 µg Grup ortalaması Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli Suşlarının toplam antibiyotik dirençlilik yüzdeleri; ampsiline % 100, streptomisine % 87.5, kanamisine % 100, gentamisine % 67.18, kloramfenikole % 32.81, tetrasikline % 21.87, rifampisine % 100, vankomisine % 96.87, eritromisine % 100 ve teikoplanine % olarak belirlenmiştir (Şekil 4.2). 73

84 Şekil 4.2 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik dirençlilik yüzdeleri Çalışmada kullanılan 3, 5, 24, 57, 64, 74, 77 ve 79 numaralı suşların tamamı test edilen tüm antibiyotiklere dirençli bulunmuştur. Bu suşlar yüksek düzeyde aminoglikozit, β- laktam, glikopeptit, makrolit ve tetrasiklin direnci içermektedir. Çalışmada elde edilen sonuçlara göre glikopeptit antibiyotiklere karşı oluşan direnç yüzdesi % dir. Sadece 29 numaralı suş vankomisine orta düzeyde direnç göstermiştir. Klinik izolatlarda düşük düzey vankomisin direnci önemlidir. Ancak bu direncin saptanması disk difüzyon gibi klasik metodlarla gözden kaçırılabilir. Bu nedenle direnç fenotiplerinin araştırılmasında PZR etkili bir yöntemdir (Dutka-Malen vd. 1995). Son yıllarda yapılan çalışmalar vankomisin dirençli E. faecium suşlarının, E. faecalis e göre çok daha yüksek oranlarda olduğunu göstermiştir (Rudy vd. 2005). Türkiye de 2001 yılına kadar yapılan çalışmalarda sadece 3 VRE vakasına rastlanmıştır (Altay 1996, Şekercioğlu vd. 1998, Vural vd. 1998). Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar direncin 74

85 ne derece tehlikeli boyutlara ulaştığının göstergesidir. Aygün vd. (2008) yapmış oldukları çalışmalarda 467 hastanın % 1.9 unda VRE kolonizasyonu belirlenmiş ve bunların tamamının vankomisin ve teikoplanine dirençli E. faecium olduğu tanımlanmıştır. Ergani- Özcan vd. (2008) pediatri bölümünde yatan hastalarla yaptığı bir yıllık sürveyans taraması sonucunda, 586 hastadan sadece 10 tanesinde VRE suşu saptamıştır. Aynı yılda Sayıner (2008) 250 hastada aldığı rektal sürüntü örneğinde VRE oranını % 15 olarak bildirmiştir. Yiş vd. (2010) 123 perirektal sürüntü örneği ile yaptığı çalışmada VRE kolonizasyon oranını % 14.6 olarak belirlemiştir. Brezilya da D azevedo ve Furtado (2008) tarafından yapılan bir çalışmada 81 hastanın fekal sürveyans kültürlerinde, tamamı vankomisin ve teikoplanine dirençli, 37 VRE suşu izole edilmiş ve bunların 20 tanesi (% 54,05) E. faecium olarak tanımlanmıştır. Bu oranlarla kıyaslandığında çalışmamızda elde edilen veriler oldukça yüksek olup, elde ettiğimiz bulgular vankomisin dirençli enterokok sayısının ülkemizde artığını göstermektedir. Çalışmada kullandığınız 32 numaralı suş, hem vankomisine ve hem de yüksek düzey gentamisin direncine sahiptir. Vankomisine dirençli suşlar genellikle diğer antibiyotiklere de dirençlilik içermektedir (French 1998, Gordon vd. 1998). Yüksek düzey aminoglikozit direncinin giderek yaygınlaşması, enterokokların neden olduğu, aminoglikozitlerin sinerjik etkisi ile tedavi edilen enfeksiyonlar için önemli bir sorundur. Çünkü böyle bir direncin varlığında penisilin ve aminoglikozit kombinasyonunun etkisi ortadan kalkar. Bu nedenle enterokoklar ile oluşan ağır enfeksiyonlarda yüksek düzey aminoglikozit direncinin belirlenmesi gerekmektedir (Robert ve Moellering 2000). Çalışmamızda aminoglikozit antibiyotiklerden yüksek seviyede gentamisin direnci (HLGR) içeren suşlar % 67.18, yüksek seviyede streptomisin direnci (HLSR) içeren suşlar ise % 87.5 olarak bulunmuştur. Hem HLGR hem de HLSR gösteren suşların yüzdesi % 62.5 oranındadır. Çalışmamızda kanamisine yüksek düzey direnç oranı % 98.4 olarak bulunmuştur. Sadece 46 numaralı suş orta düzeyde kanamisin direnci göstermiştir. Karadenizli vd. (2002) enterokok türlerine göre yüksek düzey aminoglikozit düzeyleri üzerine yaptığı çalışmada, E. faecium suşları için direnci; HLGR % 25.6 ve HLSR % 11.6 olarak belirlenmiştir. Mert-Dinç vd. (2009) nın yaptığı çalışmada aynı antibiyotiklere direnç oranlarını E. faecium suşunda sırasıyla % 52 ve % 61.5 bulunmuştur. Aral vd. (2011) klinik kökenli enterokoklarla yaptıkları 75

86 çalışmada, izole ettikleri 96 E. faecium suşunun % 60 ında HLGR, % 65 inde HLSR direnci saptamıştır. Kobayashi vd. (2001) yaptıkları çalışmada E. faecium için HLGR yi % 43 olarak saptamıştır. Mounir vd. (2011) ise HLGR oranını % 29.5, HLSR oranını ise % 25 olarak belirlemiştir. Çalışmamızda elde edilen yüksek düzey aminoglikozit direnç oranları, bu konuda yapılan çalışma bulgularıyla uyumlu bulunmuştur. Makrolit grubu antibiyotiklere karşı E. faecium için belirlenen direnç oranları oldukça yüksektir. Aarestrup vd. (2000) yaptıkları çalışmada E. faecium klinik örneklerde eritromisin direnç oranını % 20, kloramfenikol direnç oranını % 12, tetrasiklin direnç oranını ise % 12 olarak bulmuşlardır. Trieu-Cuot vd. (1993) klinik E. faecium suşlarının yaklaşık % 50 sini kloramfenikole dirençli bulmuştur. Çalışmamızda direnç yüzdeleri eritromisin ve rifampisin için % 100, kloramfenikol için % 32.8 dir. Çalışmadaki 5 numaralı suş dışında tüm suşların kloramfenikole orta düzeyde direnç göstermeleri dikkat çekicidir. Araştırmamızda, test edilen E. faecium suşlarında tetrasiklin antibiyotiklerine direnç oranı % bulunmuştur. Klinik enfeksiyonlardan, gıda maddelerinden ve hayvansal gıdalardan izole edilen E. faecium suşları arasında söz konusu dirençlilikler yaygın bir şekilde bulunmaktadır (Aarestrup vd. 2000). Beta laktamaz üreten enterokoklar ilk olarak 1983 yılında tespit edilmiştir. Bazı araştırıcılar, penisiline dirençli izolatların hiçbirinin β-laktamaz üreticisi olmadığını saptamıştır (Murray ve Mederski Samaroj 1983, Aarestrup vd. 2000). Bu durum enterokoklarda penisilin dirençliliğin farklı bir mekanizma ile sağlandığını kanıtlamaktadır. Ülkemizde yapılan çalışmalarda beta- laktam antibiyotiklere dirençli enterokokların giderek arttığına dikkat çekilerek, bu artışta penisilinlere dirençli, betalaktamaz üretmeyen suşların rol aldığı ileri sürülmüştür (Gür 1997). Çalışmamızda grup temsilcisi olan ampisilin incelenmiş ve tüm suşlar ampisiline dirençli bulunmuştur. 76

87 4.2 Enterococcus faecium Suşlarının Plazmid Profillerinin Tanımlanması 64 adet E. faecium suşunun ve kontrol olarak kullanılan E. faecalis ATCC suşunun plazmid içerikleri alkali denatürasyon yöntemi kullanılarak araştırılmıştır (Anderson ve McKay 1983). Plazmid izolasyonu ve agaroz jel elektroforezi çalışmaları sonucu incelenen suşlarda; sayıları 1 ile 10 arasında değişen farklı moleküler büyüklüklere sahip plazmid içerikleri belirlenmiştir. Saptanan plazmidlerin en küçüğü 2.2 kb en büyüğü ise 35.8 kb moleküler büyüklükte bulunmuştur (Şekil 4.3 ). Enterokok suşları ile yürütülen diğer çalışmalarda; 2-8 adet arasında değişen sayıda plazmid içerdikleri saptanmıştır. Bu plazmidlerin büyüklükleri ise kb arasında bulunmuştur. Son vd. (1999) vankomisin dirençli 19 E. faecium suşuna ait plazmid profillerini ve antibiyotik dirençliliklerini incelemiş ve bu suşların 15 inde büyüklükleri kb arasında değişen 5 ile 8 adet arasında plazmid tanımlamıştır. Rosvoll vd. (2010), 93 E. faecium izolatının 88 inde 1-7 adet plazmidin olduğunu belirlemiştir. Çöleri vd. (2004), klinik enterokok izolatlarında büyüklükleri 2.08 ile kb arasında olan ve sayıları 1 ile 11 adet arasında değişen plazmid içeriği saptamıştır. Ayrıca bu araştırmada enterokoklarda plazmid üzerinde kodlanan bir antibiyotik direnci tespit edilmiştir. Bu çalışmada 36 ve 38, 50 ve 52, 77 ve 79, 80, 84 ve 90 numaralı suşlarının aynı plazmid içeriğine sahip oldukları belirlenmiştir. Diğer tüm suşlarda plazmid içerikleri, sayı ve büyüklük bakımından değişim göstermiştir. Aynı plazmid içeriğine sahip suşların farklı hastalardan izole edilerek tanımlanması, söz konusu izolatların klonal yayılımına işaret etmektedir. Özellikle çoklu antibiyotik direncine sahip suşların klinik yayılımının araştırılması açısından bu veriler önem taşımaktadır. 77

88 M Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri. M; Süper Sarmal ccc DNA Marker, 1 E. faecium (kb) 35.3, 27.2, 16.5, 14.8, 12.3, 10.8, 7.9, 5.5, 3.5, E. faecium (kb) 31.5, 23.6, 16.8, E. faecium (kb) 32.9, 23.2, 17.0, 12.5, E. faecium (kb) 35.8, 25.9, 17.1, 12.4, 7.7, 6.4, E. faecium (kb) 29.5, 16.8, 11.5, 6.9, 5.4, 3.6, E. faecium (kb) 35.0, 21.9, 17.2, 12.9, 7.3, 6.1, 4.4, 3.4, E. faecium (kb) 29.6, 20.1, 15.8, 13.1, 9.7, 3.7, E. faecium (kb) 31.5, 28.6, 17.7, 13.1, 10.2, 5.9, 3.6, E. faecium (kb) 33.8, 27.7, 17.9, 13.5, 10.4, 5.2, 4.3, E. faecium (kb) 29.7, 20.1, 16.5, 12.7, 7.8, 4.4, 3.8, E. faecium (kb) 21.1, 18.4, 12.7, 8.8, 6.1, 4.8, 4.1, E. faecium (kb) 26.8, 19.3, 18.0, 13.5, 3.4, E. faecium (kb) E. faecium (kb) 25.7, 22.4, 18.0, 16.2, 13.7, 7.1, 6.2, E. faecium (kb) 23.9, 17.2, 13.5, E. faecium (kb) 24.6, 17.5, 13.3, 8.3, 5.7, 4.8, E. faecium (kb) 24.4, 17.7, 13.1, 7.9, 4.7, E. faecium (kb) 21.2, E. faecium (kb) 21.2, 19.6, 14.1, 4.2, E. faecium (kb) 24.6, 17.5, 15.2, E. faecium (kb) 24.8, 18.9, 14.5, 7.8, 5.6, 4.8, 3.2, 2.5 M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067 Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292) 78

89 M Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker 31 E. faecium (kb) 20.2, 18.9, 17.1, 10.5, 7.6, 4.8, 3.7, E. faecium (kb) 34.5, 23.2, 21.2, 15.8, 5.3, E. faecium (kb) 21.7,19.6, 16.7, 14.5, 9.6, 6.8, E. faecium (kb) 20.8, 19.1, 16.4, 8.7, 6.4, E. faecium (kb) 22.7, 20.6, 18.7, 16.3, 11.5, 6.9, 5.4, 3.2, E. faecium (kb) 22.5, 19.4, 17.9, 16.2, 13.4, 7.0, 6.3, E. faecium (kb) 21.9, 18.6, 15.8, 5.8, E. faecium (kb) 22.5, 19.4, 17.9, 16.2, 13.4, 7.0, 6.3, E. faecium (kb) 18.8, 15.3, E. faecium (kb) 21.3, 18.9, 14.9, 11.7, 6.1, 4.5, 3.7, E. faecium (kb) 18.7, 14.8, 7.9, 5.9, E. faecium (kb) 18.6, 14.7, 10.4, 6.1, E. faecium (kb) 20.5, 17.4, 14.3, 5.8, 3.6, E. faecium (kb) 20.6, 18.7, 17.5, E. faecium (kb) 21.2, 17.9, 8.9, 5.0, E. faecium (kb) 20.0, 16.8, 14.4, E. faecium (kb) 20.0, 16.8, 14.4, E. faecium (kb) 18.6, 17.1, 13.4, 7.7, 5.6, 3.5, E. faecium (kb) 16.3, 14.4, 9.1, 6.2, E. faecium (kb) 13.7, 8.7, 5.3, 3.0, E. faecium (kb) 13.8, 8.2, 5.5, 3.4 M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067 Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292) 79

90 M Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, E. faecium (kb) 21.4, 17.5, 15.7, 14.2, 11.3, 9.7, 6.5, E. faecium (kb) 20.7, 18.3, 15.6, 11.4, 6.5, E. faecium (kb) 21.1, 15.4, 10.0, 6.9, E. faecium (kb) 21.2, 19.0, 14.8, 10.4, 9.6, E. faecium (kb) 23.2, 17.6, 15.0, 11.4, 7.2, 6.3, E. faecium (kb) 17.6, 14.9, E. faecium (kb) 24.5, 21.2, 17.6, 14.9,12.3, E. faecium (kb) 21.2, 16.8, 14.8, 10.4, 4.9, E. faecium (kb) 28.0, 21.2, 16.8, 14.8, 11.4, 8.2, 4.9, E. faecium (kb) 35.8, 28.0, 21.2, 18.5, 14.7, 11.4, 4.2, 3.3, E. faecium (kb) 33.1, 27.1, 21.2, 4.2, 3.3, E. faecium (kb) 28.0, 26.5, 21.2, 16.8, 9.6, 5.5, E. faecium (kb) 28.0, 26.1, 22.5, 16.6, 9.6, 5.5, E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, E. faecium (kb) 28.0, 26.1, 19.0, 17.3, 13.7, 9.7, 6.4, E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, E. faecium (kb) 24.5, 15.5, 13.4, 9.7, 7.2, E. faecium (kb) 24.3,15.9, 13.5, 9.6, 7.8, E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, E. faecium (kb) 24.2, 15.8, 13.1, 5.7, E. faecium (kb) 15.6, 13.1, 5.8 Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292) 80

91 M K 60 Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker K; Standart suş E. faecalis ATCC M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067 K E. faecalis ATCC29212(kb) 35.8, 30.4, E. faecium (kb) 33.1, 30.4, 26.1, 12.6, 10.4, 9.6, 6.3 Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292) 81

92 4.3 Antibiyotik Direnç Genlerinin PZR ile Araştırılması 64 adet E. faecium suşunda, çoklu antibiyotik dirençlilik genlerinin varlığı, antibiyotik dirençlilik genine özgü tasarlanan primerlerle gerçekleştirilen PZR çalışmaları ile araştırılmıştır (Çizelge 3.3). Elde edilen PZR ürünleri ile dizi analizi gerçekleştirilmiş, nükleotit dizileri NCBI Blast programı kullanılanarak karşılaştırılmıştır ( 2012) vana ve vanb gen bölgeleri Vankomisin direnç primerleri ile gerçekleştirilen PZR sonucunda vana gen bölgesine spesifik primerlerle 732 bç lik gen bölgesi çoğaltılmıştır. Yüksek düzeyde vankomisine direnci gösteren suşların hepsinin van A tipi direnç içerdiği belirlenmiştir. Fenotiple uyumlu olarak tüm suşlar teikoplanine duyarlı bulunmuştur. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC kullanılmıştır. PZR ürünlerinin dizi analizleri sonucunda çoğaltılan bölgelerin vankomisin direnç gen bölgesi olduğu doğrulanmıştır (Şekil 4.4). Van A direnç fenotipine neden olan vana geni kromozom veya plazmidler üzerinde bulunabilir (Fisher ve Phillips 2009). Kazanılmış antibiyotik direnci genellikle plazmidler üzerinde lokalize olur ve transpozonlar aracılığı ile aktarılır (Hanrahan vd. 2000) Çalışmamızda elde edilen bulgulara göre; 29 numaralı suş dışında tüm suşlarda vana genine kromozom üzerinde; 31, 67, 76 numaralı suşlar dışında geriye kalan 48 suşta hem kromozom hem de plazmid üzerinde rastlanmıştır. 29 numaralı suşun vankomisine orta düzey dirençli olması Van B direncine işaret etmiştir. Yapılan çalışmalarda glikopeptit dirençli E. faecium izolatlarının süratle arttığı belirlenmiştir. Özellikle hastane enfeksiyonu olarak oranının artması ve stafilokoklar gibi diğer türlere konjugasyon yoluyla aktarılabiliyor olması, vankomisin direncinin gelecekte de önemli bir risk faktörü olduğunun göstergesidir. Vankomisin direncinin öneminin artmasındaki nedenlerden biri de E. faecium da yüksek derecede indüklenebilir glikopeptit direnci gösteren Van A fenotipi içerikli Tn1546 transpozonunun tanımlanmasıdır (Leclercq vd. 1988). 82

93 M K N M 732 bç Şekil 4.4 vana gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 732 bç Şekil 4.4 vana gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 732 bç Şekil 4.4 vana gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 83

94 Fenotipik olarak vankomisine orta düzeyde direnç gösterip, teikoplanine duyarlı olan 29 numaralı suş Van B tipi direnç açısından incelenmiştir. Vankomisin direnç primerleri ile gerçekleştirilen PZR sonucunda vanb gen bölgesine spesifik primerlerle 635 bç lik bölge çoğaltılmış ve sonuçlar DNA dizi analizi verileri ile doğrulanmıştır (Şekil 4.5). Vankomisin dirençlilik determinantları kromozom üzerinde bulunmakla birlikte konjugasyon yolu ile aktarılabilir özelliktedir (Hanrahan vd. 2000). Tn1547, Tn1549 ve Tn5382 transpozonları vanb operonunu içerir. Türkiye den bildirilen ilk Van B tipi direnç 2012 yılında Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi den bildirilmiştir (Coşkun vd. 2012). Çalışmamızda tanımlanan idrar izolatı 29 numaralı suş, vanb direnç geni içeren ikinci suş olması açısından önemlidir. Ayrıca Van B tipi direncin saptanması, ülkemizde de glikopeptit direncinin geliştiğini göstermektedir. Ülkemizde yaygın olmamakla birlikte Amerika ve diğer gelişmiş ülkelerde Van B tipi direnç önemli hastane enfeksiyonu nedenleri arasındadır (Mcgregor ve Young 2000). M 29 K N M 635 bç Şekil 4.5 vanb gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 84

95 4.3.2 tetm ve tetl gen bölgeleri Tetrasiklin direnci enterokoklarda konjugasyon yolu ile kazanılan direncin en tipik örneğidir (Murray 1998). Enterokoklarda tetrasiklin grubu antibiyotiklere dirençten sorumlu olan çok sayıda gen tanımlanmıştır. Bunlardan tetm geni Tn916 transpozonu üzerinde taşınır ve en yaygın olarak bulunan direnç genidir (Aarestrup vd. 2000, Huys vd. 2004). tetm, teto, tetk ve tets genleri tetrasiklinlerin ribozomlar üzerindeki etkisini inhibe eder. tetl geni ise enterokokal bir plazmid üzerinde taşınır. Tetrasiklin direnci enterokoklar arasında oldukça yaygındır. En sık bulunan gen tetm genidir. Aarestrup vd. (2000) tarafından klinik, gıda ve hayvan kökenli örneklerden elde edilen suşlarla yapılan çalışmada, 81 E. faecium izolatının 77 sinde (% 95) tetm geni, % 16 sında tetl geni saptanmıştır. teto ve tetk direnç genlerine ise rastlanmamıştır. tetm geninin plazmid aracılı yatay gen transferi yolu ile aktarımının tanımlanması, bu genin klinik önemini arttırmıştır (Poeta vd. 2005). tetm ve tetl gen bölgelerine özgü primerler kullanılarak yürütülen PZR sonucunda, tetrasikline dirençli 14 E. faecium suşunun kromozomu üzerinde tetm direnç geni belirlenmiş ve sonuçlar DNA dizi analizi verileri ile doğrulanmıştır (Şekil 4.6). 74 numaralı suşta ise hem tetm hem de tetl direnç geni belirlenmiştir (Şekil 4.7). Her iki direnç geninin aynı suş üzerinde bulunması litaratür verileri ile uyum göstermektedir (Aarestrup vd. 2000). 85

96 M K N M 657 bç Şekil 4.6 tetm gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M 74 K N M 475 bç Şekil 4.7 tetl gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 86

97 4.3.3 ermb gen bölgesi Makrolidlere direnç genellikle 23S rrna nın metilasyonundan sorumlu ermb geni ile ilişkilidir ve metilasyon sonucu eritromisin ribozomlara bağlanamaz. ermb geni Tn917 transpozonu ile çeşitli plazmidler üzerinde taşınabilmektedir. Ancak kromozomal lokasyonlu olanları da belirlenmiştir (Jensen vd. 1999, Wax vd. 2008). Çalışmadaki ermb geni tüm suşlarda kromozomal DNA üzerinde pozitif olarak bulunmuştur. Çoğaltılan 422 bç lik gen bölgesi dizi analiz sonuçları, PZR ürününün ermb gen bölgesine ait olduğunu doğrulamıştır (Şekil 4.8). M K N M 422 bç Şekil 4.8 ermb gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 87

98 M K N M 422 bç Şekil 4.8 ermb gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 422 bç Şekil 4.8 ermb gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 88

99 M K N M 422 bç Şekil 4.8 ermb gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) rpob1 ve rpob2 gen bölgeleri rpob1 ve rpob2 gen bölgelerine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda sırasıyla 1000 bç ve 1094 bç lik gen bölgeleri çoğaltılmıştır (Şekil ). E. faecalis ATCC suşu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Dizi analizleri sonuçlarıyla PZR ürünlerinin rpob1 ve rpob2 gen bölgelerinden çoğaltıldığı doğrulanmıştır. Çalışmada kullanılan suşların tamamı rpob2 tipi direnç genini bulundururken, 43, 49, 50, 55, 56 numaralı suşlar dışındaki diğer suşlarda rpob1 genine rastlanmıştır. Rifampisinin E. faecium klinik örneklerin tedavisinde kullanımı, dirençli suşlara neden olacağından tercih edilmez. Antibiyotik baskısının yarattığı mutasyonlar ile gerçekleşen rifampisin dirençliliği tüm bakteri gruplarında görülmüştür. Klinik kökeni örneklerde yüksek oranda rifampisin direnç genotipinin bulunması, kontrolsüz antibiyotik kullanımına işaret etmektedir. Söz konusu mutasyonların bakterilerde oluşum ve yayılma sıklığı yalnız klinik açıdan değil, bakteri evrimi açısından da önem taşımaktadır. Bu nedenle bu mutasyonların enterokoklarda taranması, patojen ilişkili suşların tespiti açısından zorunludur (Enne vd. 2004). 89

100 M K N M 1000 bç Şekil 4.9 rpob1 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 1000 bç Şekil 4.9 rpob1 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 1000 bç Şekil 4.9 rpob1 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 90

101 M K N M 1000 bç Şekil 4.9 rpob1 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 1094 bç Şekil 4.10 rpob2 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 1094 bç Şekil 4.10 rpob2 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 91

102 M K N M 1094 bç Şekil 4.10 rpob2 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 1094 bç Şekil 4.10 rpob2 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) cat gen bölgesi cat gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 506 bç lik gen bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC kullanılmıştır (Şekil 4.11). DNA dizi analizi sonuçları PZR ürünlerinin cat gen bölgesine ait olduğunu doğrulamıştır. Çalışmada kullanılan 5 numaralı suş dışında tüm suşlar kloramfenikole orta düzeyde dirençli bulunmuştur. Klinik enterokok suşlarında kloramfenikol dirençlilik oldukça yaygın bir özellik olarak belirlenmiştir. Enzimi kodlayan genler enterokoklarda 92

103 konjugatif ve konjugatif olmayan plazmidler ya da kromozom üzerinde bulunabilir. Streptokokal plazmid pip501 üzerinde bulunan kloramfenikol asetiltransferaz direnç geni ile akraba olan gen dizisi, E. faecalis ve E. faecium izolatlarında bulunmuştur bu da genin yatay gen transferi ile aktarılabildiğini göstermiştir (Aarestrup vd. 2000). M K N M 506 bç Şekil 4.11 cat gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 506 bç Şekil 4.11 cat gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 93

104 4.3.6 Yüksek düzey aminoglikozit direncinden sorumlu gen bölgeleri Yüksek düzeyde aminoglikozit direnci (AME); gentamisin, streptomisin ve kanamisin antibiyotiklerine yüksek düzeydeki direnci ifade eder. Enterokokların düşük düzeyde doğal olarak aminoglikozitlere dirençli olması tedavide sinerjistik etki oluşturmak amacıyla hücre duvarı sentezini inhibe eden bir antibiyotikle aminoglikozit grubu antibiyotiğin kombine kullanımını gerektirir. Ancak plazmid ve transpozonlar aracılığı ile kazanılmış direnç gelişimi nedeniyle yüksek düzey aminoglikozit direncinin ortaya çıkışı tedavide aminoglikozitler ile kombine olarak hücre duvarı sentezini inhibe eden ajanların kullanılması ile elde edilen sinerjistik etkiyi de ortadan kaldırmaktadır (Shepard ve Gilmore 2002). Bu nedenle AME direncinin belirlenmesi önemlidir. Çalışmamızda AME grubuna ait genlerin spesifik primerleriyle PZR yapılmıştır. PZR ürünlerinin dizi analizleri sonucunda çoğaltılan bölgelerin aminoglikozit direnç gen bölgeleri olduğu saptanmıştır. Yüksek düzey gentamisin direncinden sorumlu aac(6 )- aph(2 ) gen bölgesinin spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 675 bç lik gen bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC suşu kullanılmıştır (Şekil 4.12). M K N M 675 bç Şekil 4.12 aac(6 )-aph(2 ) gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 94

105 M K N M 675 bç Şekil 4.12 aac(6 )-aph(2 ) gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 675 bç Şekil 4.12 aac(6 )-aph(2 ) gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) ant6 gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 596 bç lik gen bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC kullanılmıştır (Şekil 4.13). Bu PZR ürünleri ile yürütülen dizi analizi sonucunda çoğaltılan bölgenin ant6 gen bölgesi olduğu saptanmıştır. Enterokoklarda streptomisin direnci diğer aminoglikozit grubu antibiyotiklerden farklı olarak ribozomal mutasyonlar veya Adenil transferaz sentezlenmesi sonucu oluşmaktadır. 95

106 M K N M 596 bç Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 596 bç Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) M K N M 596 bç Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 96

107 M K N M 596 bç Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) apha3 gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 292 bç lik gen bölgesi tüm suşlarda çoğaltılmıştır. Çalışmada pozitif kontrol olarak E. faecalis ATCC kullanılmıştır (Şekil 4.14). Dizi analizi sonuçları PZR verilerini doğrulamıştır. M K N M 292 bç Şekil 4.14 apha3 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su) 97

108 292 bç M K N M 292 bç Şekil 4.14 apha3 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol 29212, N; Negatif kontrol (su) suş E. faecalis ATCC M K N M 292 bç Şekil 4.14 apha3 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol 29212, N; Negatif kontrol (su) suş E. faecalis ATCC M K N M Şekil 4.14 apha3 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol 29212, N; Negatif kontrol (su) suş E. faecalis ATCC 98

109 4.3.7 blaz gen bölgesi blaz gen bölgesinin araştırılması için S. aureus NCTC 8325 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Pozitif kontrol ile belirlenen 831 bç lik bölge, PZR analizi sonucunda tüm suşlar fenotipik olarak dirençli olmasına karşın direnç geni E. faecium suşlarında saptanmamıştır. Enterokok türlerini de içeren Gram- pozitif koklarda plazmid kodlu blaz geninin genellikle β-laktamaz üretiminden sorumlu olmasına karşın, çalışmamızla benzer olarak ulusal ve yurt dışı çalışmalarda blaz geni tespit edilememiştir. Stovcik vd. (2008), ampisilin dirençli izolatlarda PZR analizleri sonucunda β-laktamaz genlerinin saptanamadığını ileri sürmüştür. Aynı zamanda Türkiye de yapılan çalışmalarda beta-laktam antibiyotiklere dirençli enterokokların giderek arttığına dikkat çekilerek, bu artışta penisilinlere dirençli, beta-laktamaz üretmeyen suşların rol aldığı gösterilmiştir (Gür 1997). Bu sebeple β-laktam direnç mekanizmalarının daha detaylı olarak incelenmesi gerekmektedir. 4.4 Konjugasyon Yatay gen transferi, mikrobiyal evrimin en önemli unsurlarından biri olarak kabul edilmektedir. Yatay gen transferinin doğal mekanizmaları; konjugasyon, transformasyon ve transdüksiyondur. Konjugasyon; bakteriyel genlerin, verici ve alıcı hücrelerin fiziksel yüzey teması yolu ile oluşan konjugasyon köprülerinden tek yönlü aktarımı olarak tanımlanmaktadır. Enterococcus türleri arasındaki genetik değişim transdüksiyonla olsa da, en yaygın mekanizma konjugasyondur. Bunun yanında enterokoklarda; kromozomlar veya plazmidler üzerinde bulunan, hareketli genetik determinantlar olan transpozonlar ile yapılan gen atarımı da gösterilmiştir (Simjee ve Gill 1997). VRE lerde yüksek seviyede glikopeptit direnç fenotipi gösteren genler çoğunlukla yüksek kopya sayısına ve yüksek stabiliteye sahip plazmidler ve plazmidlere ilave olmuş transpozonlar üzerinde bulunurlar. Plazmid veya kromozomlara ilave olmuş konjugatif transpozonlar aracılığıyla kazanılmış glikopeptit direnci de yine insersiyon dizileri içeren transpozonun başka bir konukçu DNA ya ilave olabilmesi ile kolaylıkla aktarılabilir. Direnç genini içeren plazmidin stabilitesinin ve kopya sayısının yüksek 99

110 olması da direncin sürdürülebilme ve transfer edilebilme olasılığını sağlamlaştırır (Clewell 1993, Dunny vd. 1995). Handwerger vd. (1990) nozokomiyal bir E. faecium suşu ile yaptıkları çalışmada hem vankomisin direnci hem de beta hemoliz ile feromon cevaptan sorumlu 55 kb lık bir phkk100 konjugatif plazmidi izole etmişlerdir. Bozdoğan ve Leclercq (1999) E. faecium ile yaptıkları araştırmada, 60 kb dan büyük bir plazmid aracılı vankomisin ve streptogramin direnci saptanmışlardır. Çalışmamızda E. faecium suşların konjugatif özelliklerinin belirlenmesi için antibiyotik duyarlı suşlar alıcı, dirençli suşlar ise verici suş olarak kullanılarak filtre eşleşme yöntemi ile konjugasyon denemeleri yürütülmüştür. Konjugasyon denemelerinde tetrasiklin, vankomisin ve kloramfenikol antibiyotik direnç genlerinin aktarım özelliklerine bakılmıştır. Çalışmamızda direncin aktarımının belirlenmesinde alıcı suşlar gentamisin duyarlı olarak seçilmiştir. Eritromisin ve kanamisin antibiyotik direnç genlerinin aktarılabilirliği literatürde bulunmuş ancak çalışma yaptığımız tüm suşların bu antibiyotiklere dirençli olmasından dolayı konjugasyon denemelerine alınmamıştır (Clewell 1993, Dunny vd. 1995). Sadece vankomisin direnç geninin aktarımına bakılan, 6 (vana R /Gen S ) ve 32 (vana S /Gen R ) numaralı suşlarla yapılan konjugasyon denemesinde transkonjugant elde edilmiştir (Şekil 4.15). vana genini içeren plazmidinin konjugasyon sıklığı, verici hücre başına 18.9 x 10-3 olarak belirlenmiştir. 4.6 kb plazmid alıcı suşta bulunmazken konjugant üzerinde bulunmuştur. Bu plazmidin vankomisin direncini kodladığını doğrulamak için disk difüzyon testi yapılmış ve 37 o C de 24 saat inkübasyon sonunda konjugantlar hem vankomisine hem de gentamisine dirençli olarak bulunmuştur (Şekil 4.16). 100

111 M /6 M 4.6 kb Şekil 4.15 vana geninin konjugal aktarımı M; Marker, 32; Alıcı suş, 6; Verici suş, 32/6; Konjugant M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, Alıcı suş 25.6, 21.9, 15.8, 5.6, Verici suş 22.6, 16.2, 12.5, 9.9, 5.7, 4.6,3.3 32/6 Konjugant 25.6, 22.0, 15.8, 5.6, 4.6 Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292) Vankomisin Gentamisin Şekil 4.16 Transkonjugantta vankomisin direncinin disk difüzyon yöntemi ile doğrulanması 101