Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi. Muş Alparslan University Journal of Science ULUSAL HAKEMLİ DERGİ ISSN:

Transkript

1 Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi Muş Alparslan University Journal of Science ULUSAL HAKEMLİ DERGİ ISSN: CİLT/VOL: 1 SAYI/NO:2 YIL/YEAR: ARALIK/DECEMBER 2013

2 Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi Muş Alparslan University Journal of Science Sahibi Muş Alparslan Üniversitesi Adına Prof. Dr. Nihat İNANÇ (Rektör) Editör/Editor Doç. Dr. Ercan BURSAL Editör Yardımcıları/Associate Editors Yrd. Doç. Dr. Bayram GÜNDÜZ Yrd. Doç. Dr. Nevin TURAN

3 Yayın Kurulu/Editorial Board Prof. Dr. Cevad SELAM Prof. Dr. Ekrem ATALAN Prof. Dr. Osman ÖZCAN Prof. Dr. Erdal Necip YARDIM Doç. Dr. Ercan BURSAL Doç. Dr. Esin KAYA Doç. Dr. Harun POLAT Doç. Dr. İbrahim ERDOĞAN Doç. Dr. Murat KAYRİ Yrd. Doç. Dr. Bayram GÜNDÜZ Yrd. Doç. Dr. Ekrem ALMAZ Yrd. Doç. Dr. Hasan Ali AYGÖR Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ALLAHVERDİ Yrd. Doç. Dr. Muhsin İNCESU Yrd. Doç. Dr. Nevin TURAN Yrd. Doç. Dr. Ömer ARSLAN Yrd. Doç. Dr. Zeydin PALA Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi yılda en az iki sayı olarak yayınlanan ulusal hakemli bir dergidir. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi nde yayınlanan yazıların bilimsel ve hukukî sorumluluğu yazarlarına aittir. Yayınlanan yazıların bütün yayın hakları Muş Alparslan Üniversitesi ne ait olup, yayıncının izni olmadan kısmen veya tamamen basılamaz, çoğaltılamaz veya elektronik ortama taşınamaz. İletişim: Tel: Fax: Web: / editorfbd@alparslan.edu.tr Adres: Muş Alparslan Üniversitesi / Rektörlük Grafik Tasarım Erdal YILDIZ

4 İÇİNDEKİLER / CONTENTS BAZI PESTİSİTLERİN GÖKKUŞAĞI ALABALIĞI KARACİĞERİNDEN SAFLAŞTIRILAN MİTOKONDRİAL TİYOREDOKSİN REDÜKTAZ ENZİMİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE İN VİTRO ETKİLERİNİN İNCELENMESİ INVESTIGATION IN VITRO EFFECTS OF SOME PESTICIDES ON THE ACTIVITY OF MITOCHONDRIAL THIOREDOXIN REDUCTASE ENZYME THAT PURIFIED FROM RAINBOW TROUT LIVER İlknur ÖZGENÇLİ, Yusuf TEMEL, Ö. İrfan KÜFREVİOĞLU, Mehmet ÇİFTCİ KATI FAZ FERMENTASYONU (KSF) TEKNİĞİ ile Bacillus subtilis ATCC 6051 den α-amilaz ÜRETİMİ α-amylase PRODUCTION FROM Bacillus subtilis ATCC 6051 WITH SOLID STATE FERMENTATION (SSF) Sedat KAYA, Yusuf ÖNEN, Fikret UYAR, Nurullah AKCAN STAFİLOKOKSİK HAŞLANMIŞ DERİ SENDROMU STAPHYLOCOCCAL SCALDED SKIN SYNDROME Emine GÖKÇEOĞLU, Hanifi KÖRKOCA YATAN HASTA KATLARINDAKİ KAT SEKRETERLERİNİN İŞ YÜKÜ ANALİZİ WORKLOAD ANALYSIS OF FLOOR SECRETARIES IN INPATIENT FLOORS Şerife BALAT, Hanife OK IŞIK ÜNİTESİNİN ÖĞRETİMİNDE BİLGİSAYAR ANİMASYONLARININ ETKİSİ THE EFFECT OF COMPUTER ANIMATIONS ON THE TEACHING OF THE LIGHT UNIT Yasemin KOÇ, Ümit ŞİMŞEK, Cemil HAS THE COLLECTIVE EXCITATIONS AND RESONANCES IN ATOMIC NUCLEI Ali KULIEV

5 176,178,180 Hf İZOTOPLARINDA FOTON SAÇILMA TESİR KESİTLERİNİN HESAPLANMASI Hüseynqulu QULİYEV, Ekber GULIYEV HAFİF 103,105,107 Te İZOTOPLARININ KABUK MODELİ HESAPLAMALARI SHELL MODEL CALCULATIONS OF LIGHT 103,105,107 Te ISOTOPES Öznur DEMİRÖRS, Erdal DİKMEN SİVRİCE (ELAZIĞ) FAY ZONUNDA RADON GAZI YAYILIMININ MEVSİMSEL DEĞİŞİMİ SEASONAL CHANGES OF RADON GAS EMISSIONS ON SİVRİCE (ELAZIĞ) FAULT ZONE Sultan ŞAHİN BAL, Mahmut DOĞRU

6

7 Muş Alparslan Üni versi tesi Fen Bilimleri Dergisi Muş Alparslan University Journal of Science ISSN: Cilt/Volume:1 Sayı/ Issue:2 Aralık/December: 2013 BAZI PESTİSİTLERİN GÖKKUŞAĞI ALABALIĞI KARACİĞERİNDEN SAFLAŞTIRILAN MİTOKONDRİAL TİYOREDOKSİN REDÜKTAZ ENZİMİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE İN VİTRO ETKİLERİNİN İNCELENMESİ INVESTIGATION IN VITRO EFFECTS OF SOME PESTICIDES ON THE ACTIVITY OF MITOCHONDRIAL THIOREDOXIN REDUCTASE ENZYME THAT PURIFIED FROM RAINBOW TROUT LIVER İlknur ÖZGENÇLİ 1, Yusuf TEMEL 1, Ö. İrfan KÜFREVİOĞLU 1, Mehmet ÇİFTÇİ 2* 1 Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü, ERZURUM 2 Bingöl Üniversitesi, Rektörlük, BİNGÖL ÖZET Bu çalışmada, gökkuşağı alabalığı karaciğerinden saflaştırılan mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi aktivitesi üzerine bazı herbisit ve insektisitlerin in vitro etkileri incelendi. Enzimin saflaştırılmasında 2, 5 - ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi yöntemi kullanıldı. Enzim 11,8 EÜ/mg protein spesifik aktiviteyle, % 2,38 verimle ve 648,4 kat saflaştırıldı. Enzimin saflık kontrolü Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile yapıldı ve tüm kinetik çalışmalarda saf enzim kullanıldı. Yapılan kinetik çalışmalarda 4 ü herbisit 4 ü insektisit olmak üzere kullanılan tüm pestisitlerin enzim üzerinde inhibisyon etkisi tespit edildi. Anahtar Kelimeler: Gökkuşağı Alabalığı, Tiyoredoksin Redüktaz, Herbisit, İnsektisit, İnhibisyon ABSTRACT In this study, we determined the in vitro effects of some herbicides and insecticides on the activity of mitochondrial Thioredoxin Reductase that purified from liver of rainbow trout. For purification of enzyme, 2, 5 -ADP Sepharose 4B affinity chromatography technique was used. The enzyme was purified 648,4-fold from rainbow trout liver mitochondria in a yield of 2.38 % with 11,8 U/mg. SDS-PAGE was done to control the purify of enzyme and also showed a single band for the enzyme. According to the kinetic studies, inhibition effects of all pesticides including four of herbicides and four of insecticides were identified. Key Words: Rainbow Trout, Thioredoxin Reductase, Herbicide, Insecticide, Inhibition * Sorumlu Yazar/Corresponding Author: Mehmet ÇİFTCİ, Bingöl Üniversitesi, Bingöl Üniversitesi Rektör Yardımcısı, 12000, Bingöl, ciftcim@atauni.edu.tr 109

8 Özgençli ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , GİRİŞ Tiyoredoksin redüktazlar (EC ) lipoamid dehidrogenaz, glutatyon redüktaz gibi piridin nükleotit disülfit oksidoredüktazlar arasında flavoprotein ailesine bağlı enzimlerdir. Bu ailenin üyelerinin her biri disülfit içeren aktif bir bölge, bir NADPH bağlanma yeri ve bir FAD prostetik grubun oluşturduğu homodimerik proteinlerdir [1]. Tiyoredoksin redüktazlar (TrxR), Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys amino asitlerinden oluşan katalitik bölümü ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) bağlanma bölümü ile aktivite gösterirler. Ayrıca, katalitik bölüm ile etkileşime giren ve redoks aktivitesi için gerekli olan C-terminal bölgesinde selenosistein içerirler [2,3]. Selenyum TrxR aktivitesi için gereklidir. Yapılan çalışmalarda kültür ortamına 1 µm Se eklenmesi halinde hücresel TrxR aktivitesinin 40 kat arttığı görülmüştür [4]. TrxR aktivitesi, oksidatif hekzos monofosfat (HMPS) siklusunun kontrol noktası enzimi olan glukoz-6-fosfat dehidrogenez (G6PD) ile üretilen NADPH tarafından düzenlenir [5]. Enzimin sitozolik ve mitokondrial olmak üzere iki formu vardır [2]. Ancak memelilerde TrxR ler sitozolik, mitokondrial ve testis-spesifik tiyol regülatörü olmak üzere 3 değişik izoformda bulunur [6]. Enzimin en önemli fonksiyonu tiyoredoksin proteininin NADPH a bağımlı olarak indirgenmesini katalizlemektir. Bu reaksiyonda elektronlar NADPH dan enzimin prostetik grubu olan FAD aracılığıyla enzimin substratı olan tiyoredoksine akar ve substratı indirger [1]. TrxR ler okside tiyoredoksinleri indirgeme kabiliyetleri sebebiyle bu isimle adlandırılmışlardır [3]. Tiyoredoksinler (Trx) ise Trp-Cys-Gly-Pro-Cys- Lys amino asitlerinden oluşan bir katalitik bölüm içeren kda luk bir protein ailesidir. Bu proteinlerin iki sistein grubu geri dönüşümlü oksidasyon / redüksiyona uğrar. Trx in redükte olmuş ditiyol formu [Trx-(SH) 2 ] disülfit grubu içeren okside protein substratlarını redükte eder. Okside disülfid formu [Trx-(S-S)] ise TrxR tarafından düzenlenen NADPH-bağımlı bir yolla siklusa geri katılır [7]. Tiyoredoksin dışında lipoik asit [8], lipid hidroperoksit [9], selenit, vitamin C [10], Vitamin K 3 [11], 5,5 dithiobis-(2 nitrobenzoik asit), alloksan [12], dehidroaskorbat [13] ve tümör supresor protein P53 [14] enzimin bilinen diğer substratlarındandır. Ancak bu substratların çoğunun indirgenmesinde TrxR nin fizyolojik rolü tam olarak bilinmemektedir. TrxR/Trx sistemi, DNA sentezi ve hücre çoğalması için gerekli olan deoksiribonükleotidlerin yapımında kritik bir rol oynar. Trx, nükleotid difosfatların deoksiribonükleotidlere dönüşümünü katalizleyen bir enzim olan ribonükleotid redüktazın, ribozu indirgemesi için gerekli olan elektronları sağlar [15]. Ribonükleotitlerin D-Riboz kısmının 2 Deoksiriboza indirgenmesi bir ara hidrojen taşıyıcı proteini olan tiyoredoksin aracılığıyla NADPH tarafından verilen bir çift hidrojen atomuna gereksinim duyar. Tiyoredoksin NADPH dan ribonükleotit difosfata H atomları taşıyan SH grubu çiftlerine sahiptir. Oksitlenmiş ya da disülfit formu tiyoredoksin redüktazla katalizlenen bir tepkimeyle NADPH tarafından indirgenir. İndirgenmiş tiyoredoksin, ribonükleotit redüktaz tarafından nükleozit difosfatları (NDP) deoksinükleozitdifosfatlara (dndp) indirgemede kullanılır [16]. Bu çalışmada öncelikle tiyoredoksin redüktaz enziminin gökkuşağı alabalığı karaciğer mitokondrisinden ilk kez saflaştırılması ve bazı pestisitlerin bu enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlandı. 2. MATERYAL VE METOD 2.1.Materyal Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerden EDTA, DTNB, Potasyum Fosfat, NADPH, Etanol, Poliakrilamid, Coomassie brillant blue, Sodyum dodesil sülfat, DTT, Tris, HCl, 2,5 ADP Sepharose 4B ve diğer tüm kimyasal maddeler Sigma Chem Com. dan temin edilmiştir. 110

9 Özgençli et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , Metod Homojenatın Hazırlanması Homojenat hazırlamak için gökkuşağı alabalığı karaciğeri (40 g) bıçak yardımıyla küçük parçalara ayrıldı. Karaciğer parçaları 120 ml 0,05 M Tris HCl (ph 7,5) tamponu içersine alınarak ultraturraks vasıtasıyla homojenize edildi. Hazırlanan homojenattan mitokondri organeli elde edebilmek için gradientli santrifüj yapıldı. Öncelikle 6000xg de 30 dk santrifüj yapılıp elde edilen süpernatant 22000xg de 30 dk tekrar santrifüj edildi. Çökelek homojenat tamponuna alınarak 22000xg de 30 dk santrifüj yapıldı. Daha sonra çökelek 3 defa 20 şer saniyelik periyotlarla sonikatöre konuldu. Sonikatörle parçalanan çökelek 24000xg de 30 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrası elde edilen süpernatant 2,5 ADP Sepharose 4B afinite kolonuna yüklenmek üzere +4 C de muhafaza edildi , 5 -Adp Sepharose 4B Afinite Kromatografisiyle Enziminin Saflaştırılması 10 ml lik yatak hacmi için 2 g kuru 2,5 - ADP sepharose 4B jeli tartılarak, 400 ml destile su ile katı maddelerin uzaklaştırılması için birkaç defa yıkandı. Yıkama esnasında jel şişirilmiş oldu. Şişirilmiş jelin havası su trompu kullanılarak vakum ile alındıktan sonra dengeleme tamponu (10 mm Tris/HCl, 1 mm EDTA, ph 7,4) ilave edilerek jel süspanse edildi. Süspanse edilmiş jel, 1x10 cm lik kapalı sistemden oluşan soğutmalı kolona paketlendi. Jel çöktükten sonra peristaltik pompa yardımıyla dengeleme tamponu ile dengelendi. Kolonun dengelenmiş olduğu elüat ile tamponun 280 nm de absorbanslarının ve ph larının eşitlenmesinden anlaşıldı. Böylece afinite kolonu hazırlanmış oldu. Mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz enzimini saflaştırmak amacıyla hazırladığımız süpernatant kolona yavaş yavaş tatbik edildi. Kolon örnek numune geçişi tamamlandıktan sonra dengeleme tamponu ile 280 nm de absorbans görmeyinceye kadar yıkandı. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra 2-10 mm NADP + çözeltisiyle gradientli elüsyon işlemi gerçekleştirildi. Elüatlar 0,5 ml olarak toplandı. Toplanan elüatlarda enzim aktivitesi bakıldı Bradford Yöntemiyle Protein Tayini 2, 5 ADP-Sepharose 4B afinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırılan enzim için kantitatif protein miktarı Bradford metoduna göre belirlendi [17] Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile Enzim Saflığının Kontrolü Enzim saflaştırıldıktan sonra %3-10 kesikli sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Laemmli metoduna göre yapılarak enzimin saflık derecesi kontrol edildi [18] In Vitro İnhibisyon Çalışmaları Etken maddesi glifosat izopropilamin, fenoksaprop-p-etil, 2,4-diklorofenoksiasetik asit dimetil amin tuzu ve haloksifop-p-metil ester olan 4 çeşit herbisit ve etken maddesi diklorvos, lambda siyalotrin, sipermetrin, klorpirifos olan 4 çeşit insektisitin enzim aktivitesi üzerine in vitro etkisi incelendi. Çalışılan her madde ilk olarak saf suyla 1000 kat veya daha fazla seyreltildi. Her pestisitin 5 farklı konsantrasyonunda enzimin aktivitesi ölçüldü. İnhibitörsüz enzimin aktivitesi olan kontrol aktivitesi %100 olarak kabul edilip diğer inhibitör konsantrasyonlarında % Aktiviteler hesaplandı. İnhibitör konsantrasyonlarına karşı % Aktivite grafiği çizildi. Çizilen bu grafiklerden inhibibtörler için IC 50 değerleri hesaplandı. 3.BULGULAR 3.1 Kantitatif Protein Tayini İçin Kullanılan Standart Grafik Elde ettiğimiz enzim çözeltilerindeki kantitatif protein tayini Bradford yöntemiyle belirlendi. Homojenat, gradientli santrifüj ve afinite kromatografisi sonucu elde edilen enzim çözeltilerindeki kantitatif protein tayini bu standart grafikten faydalanılarak bulundu. Standart çö- 111

10 Özgençli ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , zeltilerin μg proteine karşılık gelen absorbans değerleri Şekil 1 de gösterildi. Absorbans (595 nm) 0,9 0,6 0,3 y = 0,0091x R² = 0, µg protein Şekil 1. Bradford yöntemiyle proteinlerin kantitatif tayininde kullanılan standart grafik 3.2 Mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz Enziminin 2, 5 -ADP Sepharose 4B Afinite Kromatografisiyle Saflaştırması İle İlgili Sonuçlar Hazırlanan homojenat 2, 5 -ADP Sepharose 4B afinite kolonuna yüklendi. Daha sonra gradientli elüsyon gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar çizelge 1 de gösterildi. Çizelge 1. Gökkuşağı alabalığı karaciğer mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz enziminin 2, 5 - ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi ile saflaştırma sonuçları Numune Türü Toplam Hacim (ml) Toplam Protein (mg) Toplam Aktivite (EÜ) Spesifik Aktivite (EÜ/mg) % Verim Saflaştırma Katsayısı 3.3 Gökkuşağı Alabalığı Karaciğeri Mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz Enziminin SDS-PAGE ile Saflık Kontrolü 2, 5 -ADP Sepharose 4B afinite kromatografisinden elde edilen elüatlardaki enzimlerin saflığını kontrol etmek için kesikli SDS-PAGE yöntemi kullanıldı. Bu amaçla elektroforez sistemi kurularak enzim numuneleri sırayla kuyulara uygulandı ve yürütüldü. Elde edilen bantları gösteren fotoğraf Şekil 2 de gösterildi k Da 85 k Da 50 k Da 35 k Da 25 k Da Şekil 2. 2, 5 -ADP Sepharose 4B afinite kolonundan elüe edilen Gökkuşağı alabalığı karaciğer mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz enziminin SDS-PAGE ile saflık kontrolü. *1., 2. ve 4. kuyu: Afinite kolonundan alınan Tiyoredoksin redüktaz enzimi, 3. kuyu: standart proteinler (β-galaktosidoz: 120 kda, BSA: 85 kda, ovalbumin: 50 kda, CA: 35 kda, β-laktoglobulin: 25 kda, lizozim: 20 kda) Homojenat ,8 13,2 0, ,5 -ADP Sepharose 4B afinite kromotografisi 8 0,0264 0,314 11,8 2,38 648,4 3.4 Gökkuşağı Alabalığı Karaciğeri Mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz Enzimi Üzerine Bazı İlaçların Etkilerinin Belirlenmesine Ait Çalışma Sonuçları Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial Tiyoredoksin redüktaz enzimi aktivitesi üzerine bazı pestisitlerin etkilerini belirleyebilmek için bu pestisitlerin stok çözeltileri hazırlandı. Bu çözeltilerden değişik konsantrasyonlarda alınarak gökkuşağı alabalığı karaciğer tiyoredoksin redüktaz enzimi aktivitesi üzerine etkileri araştırıldı. Çalışmalar sonucu kullanılan pestisit kon- 112

11 Özgençli et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , santrasyonuna karşı % Aktivite grafikleri Şekil 3-11 de verildi. % Aktivite y = 100e -0,01x R² = 0, [Glikofosat İzopropilamin] µm Şekil 3. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi glifosat izopropilamin olan herbisitin etkisi % Aktivite y = 100e -25,03x R² = 0, ,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 [Haloksifop-p-metil ester] µm Şekil 6. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi haloksifop-p-metil ester olan herbisitin etkisi y = 100e -0,801x R² = 0, y = 100e -0,013x R² = 0,9864 % Aktivite ,5 1 1,5 2 [Fenoksaprop-p-etil] µm Şekil 4. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi fenoksaprop-p-etil olan herbisitin etkisi % Aktivite [Diklorvos] µm Şekil 7. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi diklorvos olan insektisitin etkisi y = 100e -0,193x R² = 0, y = 100e -0,381x R² = 0, % Aktivite % Aktivite [2,4- Diklorofenoksiasetik asit dimetil amin tuzu] µm Şekil 5. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi 2,4-diklorofenoksiasetik asit dimetil amin tuzu olan herbisitin etkisi 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 [Lambda siyalotrin] µm Şekil 8. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi lambda siyalotrin olan insektisitin etkisi 113

12 Özgençli ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , % Aktivite y = 100e -0,5x R² = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 [Sipermetrin]µM Şekil 9. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi sipermetrin olan insektisitin etkisi % Aktivite y = 100e -1,813x R² = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 [Klorpirifos] µm Şekil 10. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri mitokondrial tiyoredoksin redüktaz enzimi üzerine etken maddesi klorpirifos olan insektisitin etkisi 4. TARTIŞMA VE SONUÇ Tiyoredoksin Redüktazın en önemli biyolojik fonksiyonu tiyoredoksini indirgemesine bağlı olarak hücre büyümesine katkı sağlamak ve oksidatif strese karşı korumaktır [3].TrxR lerin fizyolojik substratları olan tiyoredoksinler, hücre büyümesi ve inhibe apoptoz düzenlemesinde önemli rol oynarlar [19,20]. Vücutta fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Bu dengenin bozulması oksidatif strese yol açar. Antioksidan sistem hasar öncesi radikal oluşumunu önler, oksidatif hasarı onarır, hasara uğramış molekülleri temizler ve mutasyonu önler [21]. Tiyoredoksin redüktaz enziminin fizyolojik substratı olan Tiyoredoksin proteini de hidrofilik fazda okside substratı redükte etmesi açısından antioksidan etki gösterir ve bu yönüyle oksidatif stresi engeller. İnsan, hücrelerin oksidatif stresten korunması için önemli bir antioksidan olan askorbik asit sentezleme kabiliyetine gereksinim duyar. Bu nedenle diyetle alımı ve oksidize formlarından (dehidroaskorbik asit, askorbil serbest radikali) askorbata dönüşümü hücre içi askorbat seviyesinin muhafazası için önemlidir. TrxR ler oksidatif stres altındaki hücrelerde askorbil serbest radikalleri askorbata indirgeme bakımından önemlidir [3]. İnsan tümörlerinin çoğunda p53 mutasyonunun görülmesi bu proteinin kanser önlemede önemli bir rol oynadığını gösterir [22]. Tümör baskılayıcı protein olan p53, insan genomunun bütünlüğünü sağlamak, apoptoz kontrolünü sağlamak, hücre döngüsünü durdurmak ve DNA tamirini aktive etmek gibi hayati rolleri olan multifonksiyonel bir proteindir [23]. P53 aktivitesini kontrol eden birçok mekanizmanın yanı sıra redoks kontrol mekanizması da oldukça önem arz etmektedir. Yapılan çalışmalar neticesinde TrxR I geninin bozulması halinde p53 proteinin gen ekspresyonunu uyarma kabiliyetinin engellendiği görülmüştür [24,25]. Bazı hastalıklarla ilgili yapılan çalışmalarda, TrxR enziminin dolaylı olarak rol aldığı saptanmıştır. Özellikle kanser, AIDS ve immun sistem hastalıklarında TrxR nin fonksiyonunun anlaşılması bu enzimin insan hastalıklarında da rol alan bir enzim olduğunun en iyi kanıtı olmuştur. Kanser hücreleri ve birçok kanser çeşidi üzerinde yapılan çalışmaların çoğu TrxR sistemle ilişkilendirilmiştir [3]. Trx/TrxR sisteminin biyolojik aktiviteleri ve saldırgan tümör büyümesi ile olan bağlantısı, bu sistemin kanser tedavisi için önemli bir hedef olduğunu düşündürür [26]. Bu çalışmada yukarıda bahsettiğimiz sebeplerden ötürü ilk olarak; fazlaca önem taşıyan tiyoredoksin redüktaz enziminin saflaştırılması hedeflendi. Daha sonra bu enzimle ilişkilendirilen hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçların 114

13 Özgençli et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , hazırlanmasında fikir verebilecek maddelerin tayini için bazı pestisitlerin enzim aktivitesi üzerine etkisi araştırıldı. Yapılan literatür taramasında TrxR enziminin sıçan karaciğeri [27], sığır karaciğeri ve timusu [28], E.coli [29], maya [30] gibi kaynaklardan çalışıldığı görülmüştür. Saflaştırma basamakları genel olarak incelendiğinde amonyum sülfat çöktürmesi, sephadex G-50, DEAE selüloz, CM selüloz ve 2, 5 -ADP Sepharose 4B afinite kromatografisinin birbirini izlediği çok aşamalı bir prosedür izlendiği belirlenmiştir. Bunun yanı sıra saflaştırılan enzimlerin sitozolik mi mitokondrial mi olduğu konusunda tereddütlerimiz oluşmuştu. Yaptığımız bu çalışmada ilk olarak bu çok basamaklı ve zaman kaybına sebep olan saflaştırma prosedürlerinin yerine tek basamakta 2, 5 -ADP Sepharose 4B afinite kromatografisiyle ve yüksek saflıkta enzim elde edilmiştir. Böylece diğer çalışmalara nazaran hem yüksek aktivitede ve stabil enzim elde edilmiş hem de zamandan tasarruf sağlanmıştır. Ayrıca enzim mitokondrial peletten elde edildiğinden tereddüt etmeden mitokondrial olduğunu söyleyebileceğimiz TrxR saflaştırılmıştır. Çalışmamızın sonraki aşamasını Trx/TrxR sistemiyle ilişkilendirilen hastalıkların tedavisinde fikir belirtebilecek bileşiklerin tayin edilmesi oluşturmaktaydı. Çalışmaya başlamadan önce literatür taraması yapılarak hangi madde ve bileşiklerin enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi oluşturduğu konusunda fikir edinilmiştir. Buna göre; şuanda mevcut kanser tedavisinde kullanılan ajanlardan sisplatin, PX-12 ve plörotin geri dönüşümsüz birer TrxR inhibitörleridir. Yine Gd +3 içeren bir porfirin olan moteksafin gadolinyum kanser hücresindeki metabolizmayı bozarak DNA tamirini engeller ve hücre ölümünü kolaylaştırır [24]. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene,13-cis-retinoic acid [12], nitrojen mustardlar (Chlorambucil,melphalan), alkil sülfanatlar (busulfan), daunorubicin, doxorubicin, karmustin ve platin içeren antikanser bileşiklerin enzim üzerinde inhibisyon etkisi saptanmıştır [31]. Aurothioglucose, arsenik trioksit, flavonoidler,platin ve altın bileşiklerinin yanı sıra Cu +2, Ni +2, Zn +2, Cd +2, Mn +2,Co +2 [32], Hg +2 [33] gibi ağır metallerde enzim üzerinde inhibisyon etkisi saptanan metallerdir. Yaptığımız çalışmada etken maddesi glifosat izopropilamin, fenoksaprop-p-etil, 2,4-diklorofenoksiasetik asit dimetil amin tuzu ve haloksifop-p-metil ester olan 4 çeşit herbisit ve etken maddesi diklorvos, lambda siyalotrin, sipermetrin, klorpirifos olan 4 çeşit insektisitin enzim aktivitesi üzerine in vitro etkisi incelenmiştir. Tüm pesitisitlerin enzim aktivitesi üzerinde µm düzeyinde inhibisyon etkisi tespit edilmiştir. Gökkuşağı alabalığı karaciğerinden saflaştırılan mitikondrial TrxR enzimi üzerinde her bir pestisitin IC 50 değerleri aşağıdaki çizelgede belirtilmiştir. Çizelge 2. Gökkuşağı alabalığı karaciğeri Mitokondrial Tiyoredoksin Redüktaz enzimi için bulunan IC 50 değerleri İLAÇLAR IC 50 DEĞERLERİ(µM) Glifosat izopropilamin 69 Fenoksaprop-p-etil 0,86 2,4-diklorofenoksiasetik 3,57 asit dimetil amin tuzu Haloksifop-p-metil ester 0,027 Diklorvos 53,07 Lambda siyalotrin 1,82 Sipermetrin 1,38 Klorpirifos 0,38 IC 50 değerleri glifosat izopropilamin için 69, fenoksaprop-p-etil için 0,86, 2,4-diklorofenoksiasetik asit dimetil amin tuzu için 3,57 ve haloksifop-p-metil ester bileşiği için 0,027, diklorvos için 53,07, lambda siyalotrin için 1,82, sipermetrin için 1,38 ve klorpirifos için 0,38 µm olarak belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan pestisitlerin tamamının çok eser miktarda dahi enzimi tamamen inhibe etmesinden dolayı bu bileşikler, Trx/TrxR sistemiyle ilişkilendirilen tümör, kanser, AİDS ve değişik immün sistem rahatsızlıklarında Trx/TrxR salınımını azaltma 115

14 Özgençli ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , maksatlı ilaçların hazırlanmasında fikir verici olabilir. Aynı zamanda bu pestisitlerin, sulama kanallarıyla nehirlere ulaşması ve buradan balıklara nüfus etmesi durumunda, yine sulama kanalları ya da elle temas yoluyla insan sindirim sistemine erişmesi durumunda Trx/TrxR sistemini geri dönüşümsüz inhibe edeceğinden onarılmaz zararlara yol açabilir. KAYNAKÇA [1] Williams, C.H. Jr, Lipoamide dehydrogenase, glutathione reductase, thioredoxin reductase, and mercuric ion reductase, a family of flavoenzyme transhydrogenases, In Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes (Müller, F., ed.), 3; CRC Press, Boca Raton, FL., [2] Powis, G., Montfort, W.R., Properties and biological activities of thioredoxin, Pharmacol Toxicol, 41, , [3] Mustacich, D., Powis, G. Thioredoxin reductase, Biochem J, 346, 1-8, [4] Gallegos, A., Berggren, M.I., Gasdaska, J.R. and Powis, G., Mechanisms of the regulation of thioredoxin reductase activity in cancer cells by the chemopreventive agent selenium, Cancer Res., 57, , [5] Ayene, IS., Stamato, T.D., Mauldin SK, Biaglow JE, Tuttle SW, Jenkins SF et al., Mutation in the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene leads to ınactivation of ku dna binding during oxidative stress, J Biol Chem 277, , [6] Turanov, A., Hatfield, D.L.,Gladyshev, V.N., Characterization of Protein Targets of Mammalian Thioredoxin Reductase, Methods enzymol, 474, , [7] Nishinaka, Y., Nakamura, H., Masutani, H., Redox control of cellular function by thioredoxin: a new therapeutic direction in host defence, Arch Immunol Ther Exp 49, , [8] Arner, E.S.J., Nordberg, J. and Holmgren, A., A. Efficient reduction of lipoamide and lipoic acid by mammalian thioredoxin reductase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 225, , [9] Björnstedt, M., Hamberg, M., Kumar, S., Xue, J. and Holmgren, A., Human thioredoxin reduces lipid hydroperoxides by NADPH and selenocysteine strongly stimulates the reaction via catalytically generated selenols, J. Biol. Chem., 270, , [10] Arner, E.S.J.and Holmgren, A., Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase, Eur. J. Biochem., 267, , [11] Holmgren, A., Reduction of dislufides by thioredoxin. Exceptional reactivity of insulin and suggested functions of thioredoxin in mechanism of hormone action, Eur. J. Biochem., 254, , [12] Rigobello, M.P., Callegaro, M.T., Barzon, E., Benetti, M.and Bindoli, A., Purification of mitochondrial thioredoxin reductase and ıts ınvolvement ın the regulation of membran permeability, Free Radical Biology-Medicine, 24, , [13] May, J.M., Mendiratta, S., Hill, K.E.and Burk, R.F., Reduction of dehydroascorbate to ascorbate by the selenoenzyme thioredoxin reductase, J Biol Chem, 272, , [14] May, J.M., Cobb, C.E., Mendiratta, S., Hill, K.E.and Burk, R.F., Reduction of the ascorbyl free radical to ascorbate by thioredoxin reductase, J. Biol. Chem., 273, , [15] Jordan, A., Reichard, P., Ribonucleotide reductases, Annu Rev Biochem, 67, 71-98, [16] Lehninger, A.L., Principles of biochemistry. Newyork: Worth, Publishers Inc,

15 Özgençli et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , [17] Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation(quantifi cation**) of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, , [18] Laemmli, UK., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, , [19] Baker, A., Payne, C.M., Briehi, M.M. and Powis, G.,Thioredoxin, a gene found overexpressed in human cancer, inhibits apoptosis in vitro and in vivo, Cancer Res., 57, , [20] Gasdaska, J.R., Berggren, M.I., and Powis, G., Cell growth stimulation by the redox protein thioredoxin occurs by a novel helper mechanism, Cell Growth Differ, 6, , [21] Dündar, Y., Aslan, R., Antioksidan denge ve korunmasında vitaminlerin rolü, Hayvancılık Araştırma Dergisi, 306, 1-17, [22] Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., Harris, C.C., P53 mutations in human cancers, Science (Washington DC), 253, 49-53, [23] Jeorger, A.C., Fersht, A.R., Structure-function-rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants, Oncogene, 26, , [24] Hainaut, P., Miller, J., Redox modulation of p53 conformation and sequence-specific DNA binding, Cancer Res., 53, , [25] Polyak, K., Xia, Y., Zweler, J.L., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B., A model for p53-induced apoptosis, Nature (London), 389, , 1997 [26] Kemerdere, R.,Glial tümörlerde tiyoredoksin redüktaz dengeleri (Uzmanlık Tezi),İstanbul Üniversitesi Cerrah Paşa Tıp Fakültesi Nöroşirürji ABD, İstanbul,2008 [27] Luthman, M., Holmgren, A., Rat liver thioredoxin and thioredoxin reductase: purification and characterization, Biochemistry, 21, , [28] Holmgren, A., Bovine thioredoxin system. Purification of thioredoxin reductase from calf liver and thymus and studies of its function in disulfide reduction, J Biol., Chem. 252, , [29] Gonzales, P.P., Baldesten, A., Reichard, P., Purification of a thioredoxin system from yeast, Journal of Biochem., 245, , [30] Bar-Noy, S., Gorlatov, N., Stadtman, T. C.,Overexpression of wild type and secys/ cys mutant of human trxr in E.coli: the role of selenocysteine in the catalytic activity, Free Radical Biology&Medicine, 30, 51-61, [31] Wittle, A.B., Anestal, K., Jerremalm, E., Ehrsson, H., Arner, E.S.J., Inhibition of trxr but not of gr by the major classes of alkylating and platinium-containing anticancer compounds, Free Radical Biology&Medicine, 39, , [32] Tandogan, B. and Ulusu,N.N., Thioredoxin reductase, Hacettepe J. Biol, Chem., 39, 87-92, [33] Carvalho, C. Et. Al, Biomarkers of adverse response to mercury : histopathology versus thioredoxin reductase activity, Journal of Biomedicine and Biotechnology, ,

16

17 Muş Alparslan Üni versi tesi Fen Bilimleri Dergisi Muş Alparslan University Journal of Science ISSN: Cilt/Volume:1 Sayı/ Issue:2 Aralık/December: 2013 KATI FAZ FERMENTASYONU (KSF) TEKNİĞİ ile Bacillus subtilis ATCC 6051 den α-amilaz ÜRETİMİ α-amylase PRODUCTION FROM Bacillus subtilis ATCC 6051 WITH SOLID STATE FERMENTATION (SSF) *Sedat KAYA 1, Yusuf ÖNEN 2, Fikret UYAR 2, Nurullah AKCAN 3 1 Muş Alparslan Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarları Koordinatörlüğü, Muş 2 Dicle Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Diyarbakır, 3 Siirt Üniversitesi, Eruh Meslek Yüksekokulu, Hemşirelik Bölümü, Siirt ÖZET Enzimler genelde biyoteknolojide, endüstride, yiyecek, tekstil, kağıt, tıp ve eczacılık gibi alanlarda kullanılmaktadır. Enzimler; bitkisel, hayvansal kaynaklardan ve mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, kültür ortamında kolay çoğalmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Bu çalışmadaki amacımız Katı Faz Fermentasyon yöntemi ile Bacillus subtilis ATCC 6051 den α-amilaz üretimi ile ilgili parametrelerin optimizasyonu ile ilgili çalışmalar yapmaktır. Enzim üretimi için en iyi inkübasyon sıcaklığı, inkübasyon süresi ve ph sı belirlendi. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık ve ph sırasıyla 50 o C ve 6.5 olarak tespit edilmiştir. Enzim için uygun inokülüm (ekim) miktarı % 30, başlangıç nem miktarı % 20 olarak tespit edilmiştir. Enzim için en iyi ekstraksiyon medyumu çeşme suyu olarak tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Katı faz fermentasyonu (SSF), Bacillus subtilis, α-amilaz, Pirinç kabuğu ABSTRACT The usages of enzymes are used in biotechnology, industry, food, textil, paper, medicine and pharmaceutical. Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals, they have considerably higher catalytic activity, they don t from undesirable by-products, they are more stable and relatively cheap, and they can be obtained much quantity. The main goal of the present study is to realize the optimization parameters of the α-amylase obtained from Bacillus subtilis ATCC 6051 by solid phase fermentation method. The best incubation temperature, inkübation time and ph were determined for optimum enzyme activitiy. Enzyme showed optimum activity at 50 C and ph 6.5. Amount of innoculum and initial moisture content suitable for enzyme production were found to be 30 % and 20 % respectively. The tap water was the best exraction medium. Key Words: Solid State Fermentation (SSF), Bacillus subtilis, α-amylase, Rice husk * Sorumlu Yazar/Corresponding author: Sedat KAYA, Muş Alparslan Üniversitesi, Merkezi Labaratuarları Koordinatörlüğü, 49100, Muş, Tel: , s.kaya@alparslan.edu.tr 119

18 Kaya ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , giriş Enzimler, biyolojik sistemlerin reaksiyon katalizörleridirler. Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere günlük ve ekonomik hayata girmiştir (Kıran ve ark. 2006). Nişastanın hidrolizinde merkezi bir rol üstlenen amilazlar; nişastanın glikoz, maltoz, maltotrioz, oligosakkarit (alfa-limit dekstrin) ve alfa 1-6 glikozidik bağları gibi ürünlere parçalanmasını sağlayan büyük öneme sahip hidrolitik enzimlerdir (Gubta ve ark. 2003, Taniguchi ve Honnda 2009). α-amilazlar düz amiloz molekülü ve dallanmış amilopektin molekülündeki α-1,4 glikozidik bağlarını parçalayan ekstraselüler enzimlerdir (Kandra 2003, Vıshnu ve ark. 2006). Katı faz fermantasyonu (SSF) genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda katı (nemli) metaryal üzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır (Pandey ve ark. 2000, Singhania ve ark. 2009, Hashemi ve ark. 2010). Enzim üretimi geleneksel olarak SmF (Submerged Fermentation) ile yapılmaktadır. Ancak daha sonra Solid State Fermentation (SSF) in bulunması ile birçok araştırmacı enzim üretimi için SSF i kullanmaya başlamıştır. Pandey ve ark. (2001) enzim üretim işlemlerinde, SSF in SmF ye göre oluşan ürünün daha fazla olması ve daha ekonomik olması yönünden SSF i kullanmışlardır. Ayrıca SSF in SmF e göre daha fazla kullanılması sadece bu avantajlara bağlı olmayıp aynı zamanda SmF ye uygun olmayan endüstriyel atıkların SSF te kullanılması ve SmF de ciddi problem oluşturan katabolik represyon ve proteazlar tarafından proteinlerin yıkımı çoğunlukla SSF te az oranda veya hiç meydana gelmediğinden kullanım alanı SmF ye göre gittikçe artmaktadır (Kar ve ark. 2010). Bugün çevremiz büyük bir değişim içerisindedir ve teknolojik gelişmelerdeki süreklilik bu yarışta katalizör rol oynamaktadır. SSF te substrat kaynağı olarak ekonomik değeri olmayan tarımsal sanayi artıkları kullanılır. Bu çalışmadaki amacımız Katı Faz Fermentasyon yöntemi ile Bacillus subtilis ATCC 6051 den α-amilaz üretimi ile ilgili parametrelerin optimizasyon çalışmalarını yapmaktır. 2. MATERYAL VE YÖNTEM 2.1. Biyolojik Materyal Yaptığımız çalışmada ticari olarak Microbiologist inc. ten temin edilen Bacillus subtilis ATCC 6051 biyolojik materyal olarak kullanıldı Katı Besiyeri 8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck), 1000 ml saf suya tamamlanarak çözündükten sonra otoklava bırakıldı Nutrient Broth (NB) Besiyeri 8 g NB, 1000ml saf suya tamamlanıp çözünme işlemi tamamlandıktan sonra otoklava bırakıldı Luria Broth (LB) Besiyeri 10 g maya özütü, 5 g NaCl (Merck), 5 g tripton, 1000 ml saf suya tamamlanıp çözünmesi sağlandıktan sonra otoklava bırakıldı SSF Besiyeri Pamuk küspesi, mısır küspesi, mercimek kabuğu, pirinç kabuğu, buğday kepeği ve arpa sapı kurutularak blendırden geçirildi. Farklı gözenek büyüklüğündeki eleklerden geçirilerek 500, 1000 ve 1500 μm, olmak üzere üç farklı parça büyüklüğünde substratlar elde edildi μm büyüklüğünde olanlar alındı. 100 ml lik erlenmayer içerisinde hacim % 30 olacak şekilde 3 g tartılıp üzerine 10 ml çeşme suyu eklendi. 121 C de 15 dk otoklavda bekletilerek steril edildi. Soğuduktan sonra 600 nm de 0.6 OD ye gelen bakterilerden % 30 inokulum besi yerine katılarak 37 C de inkübasyona bırakıldı Tampon Çözeltiler 30 ml 0.1 M Na 2 HPO 4 ve 19 ml 0.1M NaH 2 PO 4 hazırlanır. Hazırlanan bu çözeltiler bir beher içerisinde karıştırıldıktan sonra hacimleri 120

19 Kaya et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , saf su ile 100 ml ye tamamlanır Nişastanın Hazırlanması % 0.5 lik nişasta 0.1M ph 7.0 sodyum fosfat tamponu içinde çözünmesi sağlanarak hazırlandı Alkalin Çözeltisi % 4 Na 2 CO 3, % 4 Na-K tartarat, % 2 Cu- SO 4.5H 2 O Bir beherde 100 ml için %4 oranında Na 2 CO 3 hazırlandı. Ayrı tüplerde hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO 4 ten 1 er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları sağlandı. Alkalin çözeltisi protein miktar tayininde kullanıldı Bernfeld Reaktifinin Hazırlanması Bir beherde 20 g 3,5 dinitrosalisilik asit (DNS veya DCA), 400 ml saf suya tamamlanarak çözünmesi sağlandı. Başka bir beherde 32 g NaOH çözeltisi 300 ml saf suya tamamlanarak çözünmesi sağlandı. DNS karıştırıcıda karışmaya devam ederken üzerine yavaş yavaş NaOH çözeltisi ilave edildi. Karışım bir süre sıcak su banyosunda bekletildi. Üzerine 600 g Na-K tartarat azar azar eklendi. Son olarak çözeltinin hacmi saf su ile 2000 ml ye tamamlandı. Bernfeld reaktifi α-amilaz enzim aktivite tayininde reaksiyon durdurucu olarak kullanıldı Bakteri Üretimi NB ve LB sıvı besiyerlerine katı besi yerinden platin öze yardımıyla ekim yapıldı. Çalkalayıcıda 37ºC sıcaklıkta 150 rpm çalkalama hızında 24 saat inkübasyona bırakıldı. 600 nm de 0.6 OD ye gelen bakteri kolonilerinden SSF besiyerine ekim yapıldı SSF Besiyerinden Enzim Üretimi SSF besiyeri 120. saate kadar inkübasyona bırakıldı. 24 saatte bir SSF besi yeri üzerine 10 ml çeşme suyu eklenip 30 dk çalkalandıktan sonra karışım steril gazlı bezle süzüldü. Süzüntü santrifüj tüpüne aktarılarak soğutmalı santrifüjde rpm de 5dk santrifüj edildi. Üst sıvı enzim aktivite tayinlerinde kullanıldı α-amilaz Enzim Aktivite Tayini α-amilaz enzim aktivite tayini Bernfeld yöntemine göre yapıldı (Bernfeld 1955). Bu yönteme göre 150 μl enzim çözeltisi ve 200 μl % 0.5 lik nişasta çözeltisi (0.1 M, ph 7.0 sodyum fosfat tamponunda çözünmüş) 37ºC de 30 dk inkübe edildi. Bu süre sonunda reaksiyonu durdurmak için 400 μl DNS (3,5-dinitrosalisilik asit) çözeltisi ilave edilerek 5 dk kaynar su banyosunda bekletildi. DNS, sıcakta indirgen şeker uçlarıyla tepkimeye girerek reaksiyonun durmasını ve renk oluşumunu sağlar. Örnekler soğuduktan sonra üzerine 8 ml saf su ilave edilerek seyreltme yapıldı. Daha sonra vorteksten geçirildi ve 489 nm de spektrofotometrik ölçüm yapıldı. Bir enzim ünitesi deney şartları altında 1 μmol nişastayı 30 dk da maltoza parçalayan enzim miktarı olarak tanımlandı Protein Miktar Tayini Protein miktar tayini Lowry yöntemine göre yapıldı (Lowry 1951). Tüplere 2.5 ml alkalin çözeltisi konulduktan sonra üzerine 25 μl enzim ve 225 μl saf su ilave edildi. Örnekler 15 dk 40 ºC de su banyosunda bekletildikten sonra üzerine 1:1 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek 30 dk karanlıkta bekletildi. Bu sürenin sonunda 660 nm de spektrofotometrik ölçüm yapıldı. Standart eğriyi çizmek için derişimi bilinen Bovin Serum Albumin den (BSA) bir seri standart çözelti hazırlandı. Örneklerin protein içerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı. 3. BULGULAR 3.1. Enzim Üretimi Üzerine Substratın Etkisi Çalışmada SSF te Bacillus subtilis ATCC 6051 in üremesi için pamuk küspesi, mısır küspesi, pirinç kabuğu, buğday kepeği, mercimek kabuğu ve arpa sapı gibi çeşitli endüstriyel atıklar kullanılarak bakteri için uygun substrat kaynağı belirlenmeye çalışıldı. Bakterimiz için en iyi substrat kaynağı olarak 48. saatte pirinç 121

20 Kaya ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , kabuğunda elde edildiğinden çalışmalara pirinç kabuğu kullanılarak devam edildi. Şekil 3.1. de görüldüğü gibi en iyi aktivite U/mg değerinde pirinç kabuğunda elde edilmiştir. Kullandığımız katı substratlardan en iyi aktiviteyi pirinç kabuğu vermesinin nedeni besin içeriğinin daha fazla olması ya da kullandığımız Bacillus subtilis ATCC 6051 in bu substrata karşı özel bir spesifitesinin olabileceği düşünüldü. SSF katı substrat kaynağı olarak pirinç kabuğu seçildikten sonra uygun inkübasyon süresinin belirlenmesi için 120. saate kadar her 24 saatte bir enzim aktivite tayinine bakıldı. α-amilaz için en uygun inkübasyon süresi 48. saatte U/mg değerinde maksimum aktivite tespit edildi. Şekil 3.2. de görüldüğü gibi en yüksek enzim aktivitesi 48. saat olarak tespit edilmiş bu saatten sonra ise enzim aktivitesinde düşüş meydana gelmiştir. Gangadharan ve ark. (2006) mikrobiyal büyümenin düşmesinin nedeni ortamda substratın bitmesinden dolayı mikroorganizmanın durgunluk evresine girmesi ve dolayısıyla ortamda oluşan sekonder metabolitlerin oluşturduğu kontaminasyonun aktiviteyi düşürdüğünü ve enzim üretiminin azalttığını bildirmişlerdir. Şekil 3.2. İnkübasyon Saatinin Belirlenmesi Şekil 3.1. Uygun Substratın Tespiti Mikrobiyal büyüme ve ürün oluşumu için fermantasyon sistemine uygun katı substratın belirlenmesi oldukça önemlidir. SSF te yaygın olarak kullanılan ve birçok araştırmacı tarafından uygun olarak belirlenen substratların başında pirinç ve buğday kabuğu darı, mısır, muz kabuğu, manyok, kahve samanı ve patates artıkları gibi tarımsal ürünler başta gelmektedir (Krishna ve ark. 1996) Enzim Üretimi Üzerine İnkübasyon Süresinin Etkisi Baysal ve ark. (2008) fermantasyon ortamında meydana gelen diğer bileşiklerin etkileşim sonucu oluşan denatürasyonun, aktiviteyi ve dolayısıyla enzim üretimini düşürdüğünü ifade etmişlerdir. SSF te inkübasyon süresinin kısalığı hem zamandan tasarruf açısından hem de bakterinin daha az kontamine olması açısında önemlidir Enzim Üretimi Üzerine İnkübasyon Sıcaklığının Etkisi Enzim üretiminde optimum sıcaklığı belirlemek için SSF besiyerleri hazırlandı. Besiyerlerin her birisi 25, 30, 37, 40, 45, 50 ve 55 ºC olmak üzere farklı inkübasyon sıcaklıklarına bırakıldı. 48. saatte örneklerin üst sıvısından gerçekleştirilen enzim aktivite tayininde en iyi enzim aktivitesi için optimum inkübasyon sıcaklığının 37ºC de U/mg değerinde maksimum aktivite tespit edildi (Şekil 3.3). Ancak sıcaklığın yükselmesiyle enzim üretiminde düşüş gözlemlendi. 55ºC de herhangi bir aktiviteye rastlanamadı. Spesifik Aktivite (U/mg) 1600, , , ,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0, Optimum sıcaklık( C) Şekil 3.3. Optimum Sıcaklık Tespiti 122

21 Kaya et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , Yapılan çalışmalarda kullanılan Bacillus tiplerinin optimum büyüme sıcaklıkları C arasında değişmektedir. Kunamneni ve ark. (2005) SSF tekniğiyle termofilik fungus Termomyces lanuginosus ten 50 ºC de, Baysal ve ark. (2008) SSF tekniğiyle Bacillus sp. den α-amilazı 37ºC de maksimum elde ettiklerini bildirmişlerdir Enzimin Optimum Başlangıç ph sının Belirlenmesi Enzimin optimum ph sını belirlemek için pirinç kabuğu içeren SSF besi yerine çeşme suyunun ph sı 0.1 M HCl ve 0.1 M NaOH ile 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 olmak üzere çeşitli ph larda ayarlanarak 10 ml ilave edildi. Çalkalayıcıda 48 saat sonra enzim aktivite tayinine bakıldı. Şekil 3.4. te görüldüğü gibi enzim için maksimum aktivite ph 7 de U/mg olarak elde edildi. Bu yüzden çalışmalarda ph sı 7.0 çeşme suyu kullanıldı. Şekil 3.4. Optimum ph ın Belirlenmesi 3.5. Enzim Üretimi Üzerine Substrat (Nem) Miktarının Belirlenmesi SSF besiyerine, besi yeri hacminin %10, 20, 30, 40, 50 ve 60 ı olacak şekilde sırasıyla 1, 2, 3, 4, 5 ve 6 g pirinç kabuğu ilave edildi. Üzerine 10 ml çeşme suyu eklendikten sonra yapılan aktivite tayini sonucunda enzim için en iyi aktivite U/mg değerinde % 20 nem miktarındaki pirinç kabuğunda elde edildi (Şekil 3.5). Spesifik Aktivite (U/mg) 1800, , , , ,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0, Nem oranı (%) Şekil 3.5. Uygun Substrat Miktarının Belirlenmesi Baysal ve ark. (2008) SSF te nem miktarının artması katı substratların porositlerini azalttığından dolayı oksijen transfer işlemini engeller. Nem miktarının az olması ise substratın çözünürlüğünü düşürmesinde ve dolayısıyla substratın istenilen düzeyde kabarmamasında etkili olduğunu bildirmişlerdir. Baysal ve ark. (2008) SSF tekniğiyle Bacillus sp. den alkalin α-amilaz üretiminde % 30 ve Kar ve ark. (2010) SSF tekniğiyle Streptomyces erumpens MTCC 7317 den termostabil α-amilaz üretiminde % 60 nem miktarını kullanmışlardır. Genellikle mantarlar hafif asidik ph larda iyi ürerken bakteriler ise daha çok nötr ph larda iyi üreme göstermektedirler (Gupta ve ark. 2003). Rıaz ve ark. (2003) Bacillus subtilis GCBUCM-25 ten elde ettikleri α-amilaz ın optimum başlangıç ph sını 7.5, Asgher ve ark. (2005) Bacillus subtilis ten elde ettikleri α-amilaz ın optimum başlangıç ph sını 8 ve Michelin ve ark. (2010) Paecilomyces variotii den elde ettikleri α-amilazın optimum başlangıç ph sını 4.0 olarak bulmuşlardır Enzim Üretimi Üzerine İnokülüm (Ekim) Miktarının Belirlenmesi SSF besi yerlerine besi yeri hacminin %10, 20, 30, 40, 50, 60 ve 80 olacak şekilde 600 nm de 0.6 OD ye gelen baktarilerden 1000 μl den 8000 μl ye kadar değişen miktarlarda ekim yapıldıktan sonra örnekler inkübasyona bırakıldı. Enzim aktivitesi sonucunda maksimum aktivite miktarında % 30 tespit edildi (Şekil 3.6). 123

22 Kaya ve ark. Muş Alparslan Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 1 (2), , Spesifik Aktivite (U/mg) 1600, , , ,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0, İnokulum (%) Şekil 3.6. İnokülüm (Ekim) Miktarının Belirlenmesi Rıaz ve ark. (2003) Bacillus subtilis ten elde ettikleri α-amilaz enzimi için inokülüm miktarı % 4 olarak belirtmişlerdir. İnokülüm hacmi katı ortamdaki biyomas üretim miktarını belirler. Bakteri büyümesi ve α-amilaz aktivitesi açısından inokülüm miktarı oldukça önemli olduğunu belirtmişlerdir. Rıaz ve ark. (2003) Pandey ve ark. (2004) inokülüm miktarının fazla olması bakteriyel büyümeyi artırabilir, ancak ortamdaki substrat miktarının çok çabuk tükenmesinden ötürü bakterinin ölüm fazına girebileceğini ve ortamda oluşan kontaminasyondan dolayı enzim aktivite değerinin de düşmesine neden olacağını belirtmişlerdir. Gangadharan ve ark. (2006) Bacillus amyloliquefaciens ATCC den α- amilaz üretiminde 1 ml ekim ile U/gr değerinde maksimum enzim üretmişlerdir. Ekim miktarının artması, fermentasyon ortamındaki sınırlayıcı besinlerden dolayı enzim üretimini negatif yönde etkilediğini bildirmişlerdir. 4. TARTIŞMA VE SONUÇ Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem kazanmaktadır. Modern biyoteknolojinin ışığında şu anda α-amilazlar biyofarmakolojik uygulamalardaki önemi artmaktadır. Bu çalışmada α- amilazların gıda, tekstil, kağıt, deterjan, şeker şuruplarının üretiminde, siklodekstrin üretiminde, farmakoloji gibi uygulama alanlarındaki üretimleri açısından önemli olan birçok parametrenin SSF kullanılarak optimizasyonları sağlanması amaçlanmıştır. Bu alanlarda kullanılan α- amilazlar dünya enzim piyasasının %30 unu oluşturur. Amilazlarla ilgili son çalışmalara bakıldığında, enzimin daha düşük sıcaklık değerlerinde aktif olma ve yüksek sıcaklıkta ve stabil ph larda Ca 2+ iyonlarından bağımsız aktif olabilen enzimlere yönelik çalışmalar hız kazanmaktadır. Enzimin düşük sıcaklıklarda aktif olması özellikle deterjan sanayisinde etkili olup lekelerin uzaklaştırılmasında yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyulmadan daha düşük sıcaklıklarda işlevin gerçekleşmesine olanak sağlar. Burada önemli olan daha az elektrik kullanımı ile yüksek oranda tasarrufa gidilmesidir. Bacillus subtilis ATCC 6051 den elde edilen α-amilazın C sıcaklıklarında aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Endüstriyel alanlarda kullanılan α-amilazlar daha çok mikroorganizmalardan sağlanmaktadır. Çalışmada kullanılan Bacillus subtilis ATCC 6051 in bu özelliğe sahiptir. Endüstriyel üretimde mikrobiyal kaynaklı enzimlerin ekonomik oluşları, mevsimsel ve potansiyel kısıtlamalara bağlı kalmayışları açısından avantajları uzun zamandır savunulmaktadır. SSF te katı substrat kaynağı olarak kullanılan endüstriyel atıkların hem maliyet açısından hem de bunların geri dönüşümü yoluyla çevresel zirai kirliliğin önlenmesi açısından oldukça önemli yararlar sağlamaktadır. Bu yüzden SSF çevresel ve gıda mikrobiyolojisi alanında oldukça önem kazanmıştır. Ayrıca bu substratların doğada çok fazla olması ve her zaman kolay bir şekilde karşılanabilmesi çalışmalara engel oluşturabilecek zaman ve para gibi önemli sorunlara çözüm oluşturabilmektedir. Sonuç olarak yapılan bu çalışmada özellikle çevrede çok fazla kirliliğe neden olan tarımsal atıklarının kullanılması biyolojik açıdan çevre kirliliğine önemli oranlarda katkı sağlanabilmekte ayrıca biyoteknolojide bilimsel çalışma- 124

23 Kaya et al. Muş Alparslan University Journal of Science, 1 (2), , larda önemli bir sorun olan maliyete de çözüm sunabilmektedir. Bu çalışmada SSF tekniği ile ticari olarak Bacillus subtilis ATCC 6051 den amilaz üretmek için özellikle Karacadağ yöresine ait pirinç kabuğu substrat kaynağı olarak kullanılması, bu atıkların yüksek oranda geri dönüşümü açısından ekolojik olarak çevre kirliliğinin önüne geçilebilecektir. Elde edilen enzimin sıcaklık ve ph özelliklerinden dolayı kağıt, deterjan, gıda ve tekstil gibi alanlarda kullanılabileceği düşünülmektedir. Dünya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve ekonomik olarak oldukça önemlidir. Birçok tarımsal atığın hayvan yemi vb. alanlarda kullanılabildiği bilinen bir gerçektir. Fakat SSF tekniği kullanılarak bu atıklardan, ticari önemi olan enzimler üretmede kullanılması daha ekonomik ve daha ekolojik yarar sağlanabileceği düşünülmektedir. KAYNAKÇA [1] Baysal, Z., Uyar, F., Doğru M., Alkan, H.. Production of Extracellular Alkaline a-amylase by Solid State Fermentation with a Newly Isolated Bacillus sp. Biochemistry&Biotechnology, 38, , [2] Bernfeld, P.. Enzymes carbohydrate metabolism, In Metods In Enzymology Academic Press, 17, , [3] Gangadharan, D. K., Sivaramakrishnan, S., Nampoothiri, K. M., Soccol,C. R. Pandey A: α- Amylases from microbial sources an Overview on recent developments. Food Technol Biotechnol, 44, , [4] Gupta, R., Gigras. P., Mohapatra, H., Goswami V.K., Chauhan, B Microbial α-amylases: a biotechnological perspective. Process Biochem. 38, , [5] Hashemi, M., Razavi, S.H., Shojaosadati, S.A., Mousavi, S.M., Khajeh, K., Safari.M. Development of a solid-state fermentation process for production of an alphaamylase with potentially interesting properties Journal of Bioscience and Bioengineering. 3, , [6] Hashemi, M., Mousavi, S.M., Razavi, S.H., Shojaosadati, S.A. Mathematical modeling of biomass and amylase production kinetics by Bacillus sp. İn solid-state fermentation based on solid dry weight variation Biochemical Engineering Journal, 53, , [7] Kandra, L. α-amylases of medical and industrial importance; Journal of Moleculer Structure (Teochem) p , [8] Kar, S., Data,T.K., Ray, R.C. Optimization of Thermostable α- Amylase Production by Streptomyces erumpens MTCC 7317 in Solid-state Fermentation Using Cassava Fibrous Residue, Brazılıan Archıeves of Bıolıgy and Technology an İnternational journal 53, , [9] Kıran, Ö.E., Çömlekçioğlu,U., Dostbil, N., Bazı mikrobiyal enzimler ve endüstrideki kullanım alanları, KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 9, 1, [10] Krisha, C., Chandrasekaran M., Banana Waste As Substrate For α-amylase Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation ; Microbial Biotechnology, 46: , [11] Kunamneni, A., Permaul, K., Singh, S. Amylase production in solid state fermentation by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus, Journal of Bioscience and Bioengineering, 100, , [12] Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Protein measurement with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193, , [13] Michelin, M., Silva, T. M., Benassi, V. M., Peixoto-Nogueira, S. M., Moraes, L.A., Leão, J. M., Jorge, J. A., Terenzi, H. F., Polizeli, M. L. Purification and characterization of a thermostable a-amylase produced by the fungus Paecilomyces variotii, Carbohydrate Research,345, , [14] Pandey, A., Selvakumar, P., Soccol, C.R., Nigam, P. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes, Current Science,77, The application of enzymes in industry, , [15] Pandey, A., Soccol, C.R., Mitchell, D. New developments in solid state fermentation:i Bioprocesses and products. Process Biochem 35, ,