Ast ml Hastalarda Serbest Oksijen Radikalleri ve Antioksidanlar n Aktiviteleri

Transkript

1 ARAfiTIRMA Ast ml Hastalarda Serbest Oksijen Radikalleri ve Antioksidanlar n Aktiviteleri Aydanur Mihmanl, Döndü Güneylio lu, Ferhan Özfleker, Sulhattin Arslan, Mithat Özgel, Esen Akkaya SSK Süreyyapafla Gö üs, Kalp ve Damar Hastal klar E itim Hastanesi, stanbul Serbest oksijen radikalleri ve antioksidanlar n, ast m patogenezindeki rolü henüz belirlenememifltir. Çal flmam zda, ast ml hastalarda ve kontrol grubunda serbest oksijen radikallerinin ve antioksidanlar n aktivitelerini araflt rd k. Hiç ast m tedavisi görmemifl, semptomatik, hafif ast ml 18 hasta (Grup I, yafl ortalamas, 34.6), halen tedavide olan asemptomatik hafif ast ml 20 hasta (Grup II, yafl ortalamas, 35.1) ve 20 sa l kl birey kontrol grubu olarak (Grup III, yafl ortalamas, 33.2) çal flmaya al nd. Olgular n hiçbiri sigara içmiyordu. Olgular n, malondialdehid (MDA), katalaz (CAT), eritrosit glutatyon peroksidaz (GPx), plazma seruloplazmin (SP), ve C vitamini (Vit C) düzeyleri ölçüldü. MDA ve CAT ve düzeyleri, Grup I (s ras yla, 5.47±2.73 mol/l,110.45±75.15 U/L) ve Grup II (s ras yla, 4.73±2.85 mol/l, 177.4±124.8 U/L) olgularda, kontrol grubuna (s ras yla, 2.14± 0.66 mol/l, 42.54±21.97 U/L) göre anlaml olarak yüksekti, Grup I ve Grup II aras nda ise istatistiksel olarak anlaml fark yoktu (p> 0.05). GPx düzeyleri bak m ndan her üç grup aras ndaki fark, istatistiksel olarak anlaml de ildi (p>0.05). SP düzeyi Grup I de (133.48±82.68U/L) kontrol grubuna (61.84±25.94U/L) göre anlaml olarak yüksekti (p<0.01), Grup II (104.42±56.36U/L) ile kontrol grubu aras nda ise fark bulunmad (p>0.05). VitC düzeylerinin her üç grup aras ndaki fark, istatistiksel olarak anlaml de ildi (p>0.05). Sonuç olarak, oksidan ve antioksidan maddelerin ast ml olgularda kontrol grubuna göre yüksek bulunmas, serbest oksijen radikalleri ve antioksidanlar n ast m patogenezinde rol oynayabilece ini göstermektedir. Anahtar sözcükler: ast m, serbest oksijen radikalleri, antioksidanlar Toraks Dergisi, 2003;4(3): ABSTRACT Role of Free Oxygen Radicals and Antioxidants in the Pathogenesis of Asthma The role of free oxygen radicals and antioxidants in the pathogenesis of asthma, have not been well defined. In our study, we investigated plasma levels of free oxygen radicals and antioxidants in asthmatic patients. Symptomatic, mild asthmatic 18 patients who never used any antiasthma treatment (Group I, mean age, 34.6), asymptomatic, 20 mild asthmatic patients have been taking antiastma treatment (Group II, mean age, 35.1) and 20 healthy adults for control group (Group III, mean age, 33.2) were selected for this study. All cases were nonsmokers. In all selected cases, malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), erytrhrocyte glutathione peroxidase (GPx), plasma seruloplasmine (SP) and vitamine C (Vit C) were measured. MDA and CAT levels of asthmatic patients in the Group I (respectively, 5.47±2.73 mol/l and ±75.15 U/L) and in the Group II (respectively, 4.73±2.85 mol/l and 177.4±124.8 U/L) were significantly higher than control group (respectively, 2.14±0.66 mol/l and 42.54±21.97 U/L) (p<0.01), there was no significant difference between Group I and Group II (p>0.05). There was no statistically significant difference in GPx levels between three groups (p>0.05). SP levels of Group I (133.48±82.68U/L) were significantly higher than Group III (61.84±25.94U/L) (p<0.01), there was no difference between Group II (104.42±56.36U/L) and Group III (p>0.05). There was no statistically significant difference in Vit C levels between three groups (p>0.05). According to our study, oxidant and antioxidant substances were found higher in asthmatic patients than control group and it is concluded that, free oxygen radicals and antioxidants may play a role in pathogenesis of asthma. Key words: asthma, free oxygen radicals, antioxidants Yaz flma adresi: Dr. Aydanur Mihmanl At f Bey Sokak Nuri Bey Apt. No: 30/7 Ac badem, stanbul Tel: (0216) E-posta: acmihmanli@hotmail.com G R fi VE AMAÇ Serbest oksijen radikallerinin (SOR), doku hasar ve de iflik hastal klar n etyopatogenezindeki rolü, son y llarda t pta giderek artan ilgi alan oluflturmaktad r. Oksidatif stres, artm fl oksidana maruz kalma ya da azalm fl antioksidan kapasi- 264

2 Ast ml Hastalarda Serbest Oksijen Radikalleri ve Antioksidanlar n Aktiviteleri Tablo I. Gruplar n serum MDA düzeyleri (mol/ L) MDA n Ort±SS p Kontrol ±0.66 p<0.001 Grup I ±2.73 p<0.001 Grup II ±2.85 p>0.05 Tablo II. Gruplar n serum CAT düzeyleri (U/ L) Katalaz n Ort±SS p Kontrol ±21.9 p<0.01 Grup I ±75.1 p<0.01 Grup II ±124.8 p>0.05 te olarak tan mlanabilir [1]. Akci erler, oksidana maruz kalmay minimum düzeye indirmek için antioksidanlara sahiptir, ancak serbest oksijen radikallerinin afl r üretiminde ya da varl nda, bu koruyucu sistem yetersiz kalmakta ve oksidan hasar meydana gelmektedir [2]. Eozinofiller, alveoler makrofajlar ve nötrofiller, ast ml hastalarda, sa l kl bireylere göre, daha çok SOR üretmektedirler [3]. SOR, do rudan solunum yolu düz kas konraksiyonuna, doku harabiyetine, damar geçirgenli inde art fla, bronfl afl r duyarl l na ve medyatör sal m na neden olmaktad r [4]. Ayr ca SOR, mast hücrelerinden histamin sal m na ve hava yolu epitel hücrelerinden mukus salg lanmas na neden olmaktad r. [5]. Ast m, kronik hava yolu inflamasyonu ile tan mlanan bir hastal kt r. SOR un aktif inflamatuar hücreler taraf ndan üretilmesi, ast m patogenezinde rolleri olabilece ini düflündürmektedir [6]. Çal flmam zda, ast ml hastalarda oksidan ve antioksidanlar n aktivitelerini belirlemeyi amaçlad k. GEREÇ VE YÖNTEM Merkezimiz ast m poliklini ine baflvuran hiç tedavi görmemifl, ilk defa tan konulan, semptomatik, hafif ast ml 18 hasta (Grup I), halen düzenli tedavi alan, asemptomatik hafif ast ml 20 hasta (Grup II) ve 20 sa l kl birey kontrol grubu olarak (Grup III) çal flmaya al nd. Ast m tan s öykü, fizik muayene bulgular, PA akci er grafisi ve solunum fonksiyon testlerine göre konuldu. Grup II deki hastalar n tümü, en az 30 gündür inhaler steroid kullanmaktayd. Olgular n hiçbiri sigara içmiyordu. Her hastadan, malondialdehid (MDA), katalaz (CAT), eritrosit glutatyon peroksidaz (GPx), plazma serüloplazmin (SP) ve vitamin C (Vit C) düzeyleri ölçülmek üzere, hastaneye baflvurduklar gün venöz kan örne i al nd. MDA düzeyi, kan al nd ktan en geç iki saat içinde Yoshioka ve arkadafllar n n [7] önerdi i gibi, tiyobarbütirik asit (TBA) ile MDA n n oluflturdu u pembe renkli MDA-TBA bilefli inin spektrofotometrik ölçümü ile belirlendi. CAT serum düzeyleri, Goth un enzimatik kalorimetrik yöntemi ile ölçüldü [8]. Eritrosit GPx ölçümü için heparinli tüplere al - nan 10 ml kan, -20 C ta sakland. Bir ay içinde Kone Delta otoanalizörde Ransel ticari kitleri kullan larak Paglia ve Valentine nin [9] enzimatik spektrofotometrik yöntemi ile GPx düzeyi saptand. SP plazma düzeyleri, substrat olarak o-dianisidin dihidroklorür kullan larak, Lehmann ve arkadafllar n n [10] enzimatik kalorimetrik yöntemi ile ölçüldü. Vit C plazma düzeyleri dinitrofenilhidrazin (DNPH) yöntemiyle [11] plazman n elde edilmesi sonras hemen analiz edildi. Bulgular n de erlendirilmesinde tan mlay c istatistiksel yöntemlerin yan s ra (ortalama, standart sapma), normal da- l m gösteren parametreler için Anova ve Tukey HDS testi kullan ld. Normal da l m göstermeyen parametreler ise Kruskal Wallis testi ve Whitney U testi ile de erlendirildi. statistiksel anlaml l k p<0.05 düzeyinde kabul edildi. BULGULAR Tedavi uygulanmayan olgulardan oluflan Grup I de yafl ortalamas 34.6 (21-54), kad n/erkek oran 13/5, tedavi alt ndaki asemptomatik olgulardan oluflan Grup II de yafl ortalamas 35.1 (19-57), kad n/erkek oran 16/6, kontrol grubunu oluflturan Grup II de ise yafl ortalamas 33.2 (22-57), kad n/erkek oran 13/5 idi. Grup I deki hastalar n solunum fonksiyon testlerinde de iflik derecelerde bozukluk görülürken, Grup II ve Grup III teki olgularda solunum fonksiyon testleri normal s n rlarda bulundu. MDA ve CAT düzeyleri, Grup I ve Grup II olgularda, kontrol grubuna göre anlaml düzeyde yüksek bulundu. Grup I ve Grup II aras nda anlaml fark yoktu (p>0.05). Ayr nt lar Tablo I ve Tablo II de belirtilmifltir. GPx düzeyi aç s ndan ast ml olgular ile kontrol grubu aras nda fark saptanmad. Bulgular Tablo III te görülmektedir. SP düzeyi, hiç tedavi uygulanmam fl semptomatik hastalar m zda (Grup I), kontrol grubuna göre anlaml düzeyde yük- Tablo III. Gruplar n eritrosit GPx düzeylerine göre da l mlar (U/gr/Hb) Eritrosit n Ort±SS p GPx Kontrol ±14.39 p>0.05 Grup I ±22.21 p>0.05 Grup II ±31.19 p>

3 Mihmanl A. ve ark. Tablo IV. Serum SP düzeylerine göre gruplar n da l m (U/L) SP n Ort±SS p Kontrol ±25.94 p<0.01 Grup I ±82.68 p>0.05 Grup II ±56.36 p>0.05 Tablo V. Serum Vit C düzeylerine göre gruplar n da l m (mg/dl) V T C n Ort±SS p Kontrol ±0.9 p>0.05 Grup I ±7.7 p>0.05 Grup II ±0.3 p>0.05 sek bulundu (p<0.01). Düzenli tedavi görmekte olan, asemptomatik hastalar m z (Grup II) ile kontrol grubu aras nda ise fark yoktu. Gruplara göre SP sonuçlar Tablo IV te özetlenmifltir. Vit C düzeyleri bak m ndan, her üç grup aras ndaki fark, istatistiksel olarak anlaml de ildi (p>0.05). Bulgular Tablo V te yer almaktad r. TARTIfiMA Oksidatif stres, ateroskleroz, karsinogenezis, ast m, KO- AH, romatoid artrit ve psöriyazis gibi kronik inflamatuar hastal klar n patogenezinde yer almaktad r [12]. Normalde, solunum yolu epiteli, endojen ve eksojen SOR yüküne karfl antioksidan enzim ve moleküllerle korunur. Hücre içi enzimler aras nda süperoksit dismutaz (SOD), CAT, GPx, glutatyon (GSH) redoks halkas bulunur. Enzimatik olmayan bafll ca antioksidanlar aras nda SP, E vitamini ve Vit C mevcuttur. Alt solunum yollar yüzey epitel s v s nda antioksidan olarak SOD, CAT ve albümin, SP, transferrin gibi plazma proteinleriyle GSH ve vitaminler bulunur [13]. Serbest radikallere ba l doku hasar oluflumunda en önemli mekanizma, hücre zar ndaki lipidlerin peroksidasyona u ramas d r [14]. Oksidanlar, çoklu doymam fl ya asitleriyle reaksiyona girerek lipid peroksidasyonunu bafllat rlar. Bunun sonucunda, hidroperoksidaz ve uzun etkili aldehitler ortaya ç kar. Lipid peroksidasyonunun son ürünü, MDA, eten ve pantendir [15]. Bu reaksiyonlar, hücre memran ndaki lipidlerin yap s n bozar, iyonlara karfl geçirkenlik artar ve hücre ölümü olur [16]. Wood ve arkadafllar [17], ast ml hastalarda lipid peroksidasyon ürünlerini yüksek olarak saptam fllard r. Rahman ve arkadafllar [18], lipid peroksidasyon ürünlerinin plazma düzeyini, ast ml hastalarda kontrol grubuna göre yüksek bulmufllar, Vural ve arkadafllar [2] çal flmalar nda, ast ml hastalarda MDA n n yüksek oldu unu saptam fllard r. Bizim çal flmam zda da MDA düzeyleri hiç tedavi görmemifl Grup I ve düzenli tedavi görmekte olan Grup II hastalar nda kontrol grubuna göre yüksek bulundu. Ast ml hastalarda MDA n n kontrol grubuna göre yüksek bulunmas, ast mda oksidan sistem aktivitesinin artt n düflündürmektedir. Steroidler, ast mdaki hava yolu inflamasyonunu kontrol alt na almaktad r [12]. Oksidan aktivitenin yüksek bulundu- u ast ml hastalarda, steroid tedavisinden sonra oksidan düzeylerinin düfltü ünü gösteren çal flmalar vard r [19,20]. Ancak bizim tedavi uygulanmayan ve düzenli tedavi uygulanan iki grubumuzda da MDA düzeyi kontrol grubuna göre yüksek bulunmufl, ast ml hastalardan oluflan iki grup aras nda ise fark bulunamam flt r. Bu da bize steroid tedavisine ra men, oksidan aktivitenin devam edebilece ini düflündürmektedir. Ast ml hastalarda SOR aktivitesi yüksek saptan rken, çeflitli çal flmalarda antioksidan aktivite artm fl ya da azalm fl bulunmaktad r. Joseph ve arkadafllar [21] ast ml hastalarda SOD aktivitesini düflük bulduklar n bildirmifllerdir. Tekin ve arkadafllar [6], ast ml hastalarda antioksidan maddelerin düzeyini araflt rm fllar, SOD aktivitesini kontrol grubuna göre düflük bulurken, CAT ve GPx düzeylerinde anlaml bir fark saptayamam fllard r. Bu sonuçlar, ast ml hastalarda, azalm fl antioksidan düzeylerinin ast m patogenezinde katk s olabilir fleklinde yorumlam fllard r. Bir baflka çal flmada, eritrosit SOD aktivitesi normal saptan rken GPx aktivitesi kontrol grubuna göre yüksek bulunmufltur [22]. Kurosawa ve arkadafllar [23], ast ml hastalarda SOD düzeyinin sa l kl bireylere göre yüksek oldu unu saptam fllard r. Stone ve arkadafllar [24] ise plazma GPx aktivitesinde ast ml hastalar ile kontrol grubu aras nda fark bulamam fllard r. Bizim çal flmam zda CAT, Grup I ve Grup II olgular nda kontrol grubuna göre yüksek bulunurken, GPx düzeyleri bak m ndan her üç grup aras nda anlaml b r fark saptanamad. Plazma SP, önemli bir ekstraselüler antioksidand r [25]. Vural ve arkadafllar n n [2] yapt çal flmada, ast ml hastalarda, SP düzeyi yüksek bulunmufltur. Biz, SP düzeyini Grup I de kontrol grubuna göre anlaml olarak yüksek bulurken, Grup II hastalar ile kontrol grubu aras nda anlaml bir fark bulamad k. Vit C düzeyi düflük beslenmenin ast m için bir risk faktörü oldu u düflünülmektedir. Vit C, hava yollar n n yüzey epiteli s v s nda bulunan en önemli antioksidand r ve endojen ve eksojen oksidanlara karfl önemli bir koruyucu oldu- u belirtilmektedir. [5]. Elli bir ast ml hasta ile yap lan kar- 266

4 Ast ml Hastalarda Serbest Oksijen Radikalleri ve Antioksidanlar n Aktiviteleri fl laflt rmal bir çal flmada, plazma Vit C düzeyleri kontrol grubuna göre anlaml olarak düflük bulunmufltur [26]. Kalayc ve arkadafllar [27], ast ml çocuklarda antioksidan vitamin düzeylerine bakm fllar, antioksidanlar n, remisyondaki çocuklarda kontrol grubuna göre anlaml olarak düflük oldu unu bulmufllard r. Lipid peroksidasyon ürünleri ise, atak s ras nda remisyona göre anlaml derecede yüksek bulunmufl, lipid peroksidasyon ürünleri ile antioksidan vitaminler aras nda bir korelasyon görülememifltir. Ast ml hastalarda Vit C verilerek yap lan çeflitli çal flmalarda bronfl afl r duyarl l ve çeflitli ast m semptomlar nda azalma oldu u gözlenmifltir [28,29]. Bizim çal flmam zda ise Vit C plazma düzeylerinde her üç grup aras nda anlaml bir fark saptanmam flt r. Sigara içen kiflilerde yap lan çal flmalarda, oksidan madde art fl yla birlikte GSH, GPx, CAT düzeyleri de yüksek bulunmufltur [30,31]. Endojen antioksidan mekanizma, sigara içen kiflilerde, antioksidan düzeyini art rabilmektedir. Sigara duman na maruz b rak lan fare ve hamsterlerde koruyucu yan t olarak antioksidan aktivitede art fl, oksidatif tolerans modelini oluflturmaktad r. Oksidatif tolerans, tam aç klanamam fl bir fenomendir. Ancak düflük düzeyde oksidatif strese karfl adaptasyon ve antioksidan savunmada art fl olarak tan mlanmaktad r. Böylece, sigaran n oksidan etkisi KOAH geliflimine katk da bulunurken, antioksidanlar n art fl koruyucu olabilmektedir. Sigara içenlerin bir k sm nda belki de oksidatif tolerans nedeniyle KOAH geliflmemektedir [32]. Çal flmam zda, oksidan aktivitenin bir göstergesi olan MDA düzeyi, Grup I ve Grup II deki hastalarda kontrol grubuna göre yüksek bulunurken, antioksidanlardan CAT, tüm ast ml hastalar m zda, SP ise Grup I deki hastalar m zda kontrol grubuna göre anlaml olarak yüksek bulundu. Bu sonuçlar, ast ml hastalarda da (oksidatif tolerans modelinde oldu u gibi) oksidan hasarla birlikte, koruyucu olarak antioksidan aktivitenin de artabilece ini düflündürmektedir. Olgular m z n hafif ast ml olmas da bu olgular n oksidatif tolerans nedeniyle hafif ast ml grupta kald klar olas l n akla getirmektedir. Sonuç olarak, ast ml hastalarda oksidan ve antioksidan aktivitenin artm fl bulunmas, bu sistemin ast m patogenezinde rol oynayabilece ini düflündürmekle birlikte, kesin rolünün gelecekte daha iyi ayd nlanaca kan s nday z. KAYNAKLAR 1. Horvath I, Donelly LE, K ss A et al. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1998;158; Vural H, Uzun K, Erel Ü. Antioxidant status and lipid peroxidation in asthma. Solunum Hastal klar 1999;10: Kelly CA, Ward C, Stenton SC et al. Numbers and activity of cells obtained at brochoalveolar lavage in asthma, and their relationship to airway responsiveness.thorax 1998;43: Jarjour NN, Calhoun WJ. Enhanced production of oxygen radicals in asthma. J Lab Clin Med. 1994;123: Hatch GE. Asthma, inhaled oxidants, and dietary antioxidants. Am J Clin Nutr. 1995; 61 (suppl):625s-30s. 6. Tekin D, Sin BA, Mungan D et al. The antioxidative defanse in asthma. J Asthma 2000 Feb; 37(1): Yoshioka T, Kawada K, Sh mada T, Mori M. Lipid peroxidation in maternal and cord blood and protective mechanism against activated-oxygen toxicity in the blood. Am J Obs Gynecol L. 1979; Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range. Clin Chem Acta. 1991;196: Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitave and the qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med. 1967;70: Lehmann P, Schosinsky KH, Beeler MF. Standardization of serum seruloplasmin concentrations in International Enzyme Units With o-dianisidine dihydrochloride as Substrate.Clin Chem.1974;20 (12): Mc Cormick DB, Greene HL.Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Philadelphia.WB Saunders Co 1999; Horvath I, Donelly LE, Kiss A et al. Raised levels of exhaled carbon monoxide are associated with an increased expression of heme oxygenase-1 in airway macrophages in asthma: a new marker of oxidative stress. Thorax 1998; 53: Ünlü M, Akkaya A.Reaktif oksijen metabolitleri ve akci er hastal klar. Solunum Hastal klar 1999;10: fiahin Ü, Tahan V, Akkaya A ve arkadafllar. Primer akci er kanserinde lipid peroksidosyonu ve eritrosit antioksidan enzim aktivitesi. Tüberküloz ve Toraks Dergisi 1999;47 (1): Petruzzelli S, Hietanen E, Barstch H et al. Lipid peroxidation in cigarette smokers and lung cancer patiens. Chest 1990; 98: Merto lu A. Oksidan ve antioksidan etkileflimleri. zmir Gö üs Hastenesi Dergisi Ocak 1993; Cilt VII. Say : Wood LG, Fitzgerald DA, Gibson PG et al. Lipid peroxidation as determined by plasma isoprostanes is related to disease severity in mild asthma. Lipids 2000 Sep; 35(9): Rahman I, Marrison D, Donaldson K, Macnee W. Systemic oxidative stres in asthma, COPD, and smokers. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154: Antczak A, Kurmanowska Z, Kasielski M, Nowak D. Inhaled glucocorticosteroids decrease hydrogen peroxide level in expired air condensate in asthmatic patients. Respir Med May; 94 (5): Saleh D, Ernest P, Lim S et al. Increased formation of the potent oxidant peroxynitrite in the airways of asthmatic patients is associated with induction of nitric oxide synthase: effect of inhaled glucocorticoid. FASEB J 1998 Aug; 12 (11): Joseph BZ, Routes JM, Borish L. Activites of superoxide dismutases and NADPH oxidase in neutrophils obtained from asthmatic and normal donors. Inflammation 1993;17: Tho LL, Candlish JK. Superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities in erythrocytes as indices of oxygen loading in disease: a survey of one hundred cases. Biochem Med Metabol Biol.1987; 38: Kurosawa M, Kobayashi H, Nakano M. Cu-Zn superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities in platelets from stable bronchial asthmatic patients. Int Arch Allergy Immunol. 1993; 101: Stone J, Hinks LJ, Beasley R et al. Reduced selenium status of patients with asthma. Clinical Science 1989; 77: Heffner JA, Repine JE. State of art: pulmonary strategies of antioxidant defense. Am Rev Respir Dis. 1989; 140: Aderele WR, Ette SI, Oduwoule O, Ikpeme SJ. Plasma, vitamin C (ascorbic acid) levels in asthmatic children.(abstract) Afr J Med Med Sci. 1985;14: Kalayci O, Beslar T, Kilinc K, et al. Serum levels of antioxidant vitamins (alpha tocopherol, beta carotene, and ascorbic acid) in children with broncial asthma. Turk J Pediatr Jan-Mar; 42 (1):

5 Mihmanl A. ve ark. 28. Schünemann HJ, Grant BJ, Freudenhe m JL et al.the Relation of Serum Levels of Antioksidant Vitamins C and E, Retinol and Carotinoids with Pulmonary Function in the General Population. Am J Respir Crit Care Med. 2001;Vol 163. pp Forastiere F, Pistelli R, Sestini P et al. Consumption of fresh fruit rich in vitamin C and wheezing symptoms in children. Thorax 2000 Apr; 55 (4): Mangione S, Kueppers F, Puglia C, Greenspon L W. Erythrocytes prevent inactivation of alpha-1-antitrypsin by cigarette smoke. Eur Respir J. 1991;4: Cantin AM, North SL, Hubbard RC, Crystal G. Normal alveolar epithelial lining fluid contains high levels of glutathione. J Appl Physiol. 1989; 63: Repine JE, Bast A, Lankhorst I and The Oxidative Stress Study Group. Oxidative Stress in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Am J Respir Crit Care Med. 1997;