KULLANIM TALİMATLARI KISMEN TAMAMLANMIŞ ve ŞİŞELENMİŞ BESİYERLERİ BA CE.doc Rev.: Ağustos 2003

Transkript

1 BA KULLANIM TALİMATLARI KISMEN TAMAMLANMIŞ ve ŞİŞELENMİŞ BESİYERLERİ BA CE.doc Rev.: Ağustos 2003 BD Sabouraud Glucose Agar KULLANIM AMACI Şişelerde tedarik edilen BD Sabouraud Glucose Agar, klinik ve klinik olmayan malzemelerden mantarların (mayalar, küfler ve dermatofitler) izolasyonu ve kültivasyonunda kullanılan kısmen tamamlanmış bir besiyeridir. PROSEDÜR İLKELERİ VE AÇIKLAMASI Mikrobiyolojik yöntem. Sabouraud Glucose Agar, dermatofitlerin kültivasyonu için Sabouraud tarafından geliştirilmiştir. 1,2 Günümüzde, klinik örneklerden elde edilenler de dahil olmak üzere bütün mantarların izolasyonu ve kültivasyonu için kullanılmaktadır. 3,4 Besiyeri, düşük ph ı ve yüksek glikoz konsantrasyonu sebebiyle kontaminasyona neden olan bakteriler için kısmen inhibe edicidir. USP de mikrobiyal sınır testlerinde bundan bahsedilmiştir. 5 Besiyerinin litresi başına 100 mg tetrasiklin veya 100 mg benzilpenisilin sodyum ilave edildiğinde, besiyeri EP spesifikasyonunu karşılar. 6 BD Sabouraud Glucose Agar da Neopepton, azotlu bir gelişme faktörü kaynağıdır. Glikoz (=dekstroz), mikroorganizmaların gelişmesi için bir karbon ve enerji kaynağı sağlar. Yüksek glikoz konsantrasyonu ve görece düşük ph sağlanması, birçok bakteri yüksek şeker konsantrasyonunu tolere edemediği ve düşük ph ile kısmen inhibe edildiği için mantarların gelişmesi açısından avantajlıdır. Bununla birlikte, antibakteriyel antimikrobiyal zenginleştirmesi olmaksızın, besiyeri yalnızca zayıf bir seçiciliğe sahiptir. BD Sabouraud Glucose Agar kullanıcının plak veya tüp besiyeri hazırlayabileceği, şişelerde tedarik edilmiş kısmen tamamlanmış (=yarı-bitmiş) bir besiyeridir. Gentamisin (0,04 g/l) ve kloramfenikol (0,4 g/l), tetrasiklin (0,1 g/l) veya benzilpenisilin (0,1 g/l) gibi antimikrobiyal ajanlar seçiciliği artırmak için tamamlanmadan önce eklenebilir. REAKTİFLER BD Sabouraud Glucose Agar 1 Litre Saf Su için Formül* Bacto Neopeptone 5,0 g Glikoz (=Dekstroz) 40,0 Agar 19,0 ph 5,6 +/- 0,2 *Performans kriterlerini karşılamak üzere gereken şekilde ayarlanmış ve/veya desteklenmiştir. ÖNLEMLER. Yalnızca profesyonel kullanım içindir. Mikrobiyal kontaminasyon belirtileri, renk değişimi, kuruma, çatlama veya diğer bozulma belirtileri görülen şişeleri kullanmayın. Bu kısmen tamamlanmış şişe besiyerinin tamamlanması için, PROSEDÜR Reaktifin Hazırlanması nda açıklanan yöntemleri uygulayın ve uyarılara dikkat edin. Aseptik kullanma prosedürleri, biyolojik tehlikeler ve kullanılmış ürünün atılmasıyla ilgili olarak GENEL KULLANIM TALİMATLARI na bakın. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ Alındıktan sonra, şişeleri karanlıkta 5 ila 25 C de saklayın. Dondurmaktan ve aşırı ısıtmaktan kaçının. Besiyeri son kullanma tarihine kadar kullanılabilir ve önerilen inkübasyon sürelerinde inkübe edilebilir. Açık ambalajlardaki şişeler son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Açılmış şişeler ise hemen kullanılmalıdır. Şişe besiyerinden plaklar veya tüpler hazırlamak için, ilk olarak besiyeri sıvılaştırılmalıdır. Katılaştırdıktan sonra besiyerini bir defadan fazla sıvılaştırmayın.

2 KULLANICI TARAFINDAN KALİTE KONTROLÜ Yarı bitmiş besiyerinden hazırlanan plaklar her bir C. albicans ve A. niger suşu plağı için 10 ila 100 cfu ile inoküle edilmelidir. S. cerevisiae ve T. mentagrophytes için, MacFarland 0,5 standardına ayarlanmış süspansiyonun on kat seyreltimini kullanın ve plak başına 10 µl (yaklaşık olarak 10 3 CFU) inokülasyon yapın. Daha fazla bilgi için, GENEL KULLANIM TALİMATLARI belgesine başvurun. Plakları tablonun dipnotunda belirtildiği şekilde inkübe edin. *Candida albicans ATCC İyi ila mükemmel gelişim *Saccharomyces cerevisiae NCPF 1211 veya DSM 1333 İyi ila mükemmel gelişim ** Aspergillus niger ATCC16404 İyi ila mükemmel gelişim ***Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 İyi ila mükemmel gelişim İnoküle edilmemiş Kehribar; şişe besiyeri opak olabilir İnkübasyon: *48 s / **3 ila 4 gün / ***5 ila 7 gün, 25 C - 30 C, aerobik olarak PROSEDÜR Sağlanan Malzemeler BD Sabouraud Glucose Agar (kısmen tamamlanmış şişe besiyeri). Dolum hacimleri ve ambalaj için TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ kısmına bakın. Sağlanmayan Malzemeler Otoklav (100 +/- 2 C ye ayarlı), gaz ocağı veya elektrikli ocak; su banyosu (48-50 C); steril cam malzemeler ve steril plastik Petri kutuları veya tüpler. Yardımcı reaktifler ve gerekli laboratuvar ekipmanı. Reaktif Hazırlanması BD Sabouraud Glucose Agar ı (Şişe Besiyeri) bir otoklav veya gaz ocağında ısıtarak sıvılaştırın. Alternatif olarak, şişe sıcak bir plağa yerleştirilen su içeren uygun bir kaba koyulup kaynama sıcaklığına getirilebilir. Basınç değişimini sağlamak için ısıtmadan önce kapağı hafifçe gevşetin. Uyarı: Besiyerinin sıvılaştırılması için mikrodalga fırınların kullanılması önerilmemektedir. Besiyeri şişelerini mikrodalga fırına metal kapaklar ile koymayın. Aşırı ısıtma içeriği bozabileceğinden ve muhtemelen yetersiz mikrobiyal performansa yol açabileceğinden, otoklav kullanırken sıcaklığı en fazla 100 +/- 2 C ye ayarlayın. Sıcak plak ve/veya su banyosu kullanırken, tüm besiyerini çözmeye yetecek kadar uzun süre kaynatın. Besiyerinin tamamen sıvılaşması için ihtiyaç duyulan süre önemli ölçüde değişebilir ve ısıtma cihazının kullanımdan önceki gerçek sıcaklığına, vat gücüne, boyutuna ve kaptaki besiyerinin hacim ve sıcaklığına bağlıdır. İlk kullanımdan sonra sıvılaştırma için ihtiyaç duyulan sürenin test edilmesi ve kaydedilmesi önerilir. Tamamen sıvılaştıktan sonra, kabı ısıtma cihazından çıkarın ve 48 ila 50 C ye ayarlanmış su banyosuna yerleştirin. Uyarı: Isıya karşı koruyucu eldivenler giyin! Camın çatlamasına neden olabileceğinden, soğutmayı hızlandırmak için sıcak kabı buz banyosuna veya soğuk suya koymayın. Ciddi yanma riski! Kabı su banyosunda tüm besiyerinin ayarlanan sıcaklığa soğuması için yeterli süre bekletin. Plak besiyerinin hazırlanması için ısıya duyarlı ilaveler eklenmişse, besiyerinin sıcaklığı en fazla 50 C olmalıdır. Gentamisin (0,04 g/l) ve kloramfenikol (0,4 g/l), tetrasiklin (0,1 g/l) veya benzilpenisilin (0,1 g/l) gibi antimikrobiyal ajanlar seçiciliği artırmak için eklenebilir. Antimikrobiyalleri az miktarda (10 ila 15 ml) su içerisinde tamamen çözün, çözeltiyi filtreleyerek sterilize edin ve besiyerine ekleyin. Desteğin eklenmesi ve plaklara dökme sırasında aseptik koşullar uygulayın! Steril kaplar ve tüpler kullanın. Desteğin eklenmesinden sonra besiyerini hafifçe karıştırın, fakat köpük ve kabarcık oluşmasından kaçının. Yüzey inokülasyonu isteniyorsa besiyerini kaplara dökün. 90 ila 100 mm normal bir kap için, 19 ila 21 ml uygun bir hacimdir. Tamamlanmış besiyerini katılaşmaya bırakın, plakları ters çevirin ve yeterli süre oda sıcaklığında kurumaya bırakın (tamamen katılaşma için, gece BA

3 boyunca 18 ila 23 C de saklayın). Yeni plastik torbalara sarın ve 2 ila 8 C de saklayın. Bu besiyerinin hazır plakları 5 ila 7 gün kullanılabilir. Plağa dökme yöntemi uygulanacaksa, test edilecek maddeyi veya seyreltimini boş kaba ekleyin, üzerini besiyeri ile kaplayın, karıştırmak için kabı hafifçe çevirin ve tamamen katılaşmasını bekleyin. Tüplerde yatık agar hazırlanması için tüplere 48 ila 50 C ye soğutulmuş uygun miktarda sıvılaştırılmış besiyeri (antibakteriyel destek olmaksızın) ekleyin ve istenen yatık pozisyonda katılaşmaya bırakın. Tüpler vida kapakları ile sıkıca kapatıldığında, karanlıkta oda sıcaklığında veya 2 ila 8 C de saklandığında 2 ila 3 hafta kullanılabilir. Kullanımdan önce, besiyeri yüzeyleri aşırı ıslak olmamalıdır. Şişe besiyerini yalnızca bir defa sıvılaştırın. Tekrarlanan ısıtma besiyerinin içeriğine zarar vererek yetersiz mikrobiyal performansa yol açacağından, sonrasında hiçbir artığın ikinci defa katılaşma ve sıvılaşmasına izin vermeyin. Örnek Türleri Petri kutularına veya tüplere dökülen zenginleştirilmemiş besiyeri çeşitli prosedürlerde, örn. farmasötik testler için, kullanılabilir. Klinik mikrobiyolojide, Petri kutularında hem zenginleştirilmemiş besiyeri hem de antibakteriyel ajanlarla zenginleştirilmiş besiyeri bütün klinik örnek tiplerinden mantarların izolasyonunda kullanılabilir. Örnekler çok sayıda bakteriyel kontaminant içeriyorsa, gentamisin ve kloramfenikol ile zenginleştirilmiş plak besiyeri kullanılmalıdır. Örneklerin alınması ve işlenmesi için referanslara bakın. 7,8 Tüplere doldurulan besiyerleri doğrudan klinik örneklerden mantar izolasyonu için kullanılmamalıdır fakat yalnızca mantar kültürlerinin gelişimi ve idamesi için kullanılır. Test Prosedürü Agar yüzeyleri düz ve nemli olmalıdır fakat birleşik gelişime neden olabileceğinden aşırı nemli olmamalıdır. Örnek laboratuvara ulaştığında olabildiğince kısa sürede örneği sürme yöntemi ile ekin. Sürme plak, temel olarak karışık flora içeren örneklerden saf kültürleri izole etmek için kullanılır. Alternatif olarak, eğer materyal doğrudan swabdan geliştirilecekse, swabı kenarın yüzeyinde küçük bir alanın üzerinde döndürün; ardından bu inoküle edilmiş alandan sürme yöntemi ile ekim yapın. Tüpleri veya plakları seçilen koşullarda inkübe edin. Örneklerin işlenmesi ve inokülasyon hakkında daha ayrıntılı bilgi için ilgili referanslara bakın. 2-8 Klinik örneklerde mayaların (örn., Candida türleri) saptanması için kullanılacaksa, 30 ila 35 C de 48 saat inkübe edin. Dermatofitler de dahil olmak üzere filamentöz mantarlardan şüpheleniliyorsa, 25 ila 30 C de bir hafta veya daha uzun süre inkübe edin. Dermatofitler bazen gelişim göstermek için 3 hafta veya daha fazlasına ihtiyaç duyarlar. Hijyen izlenmesi için kullanılacaksa, 7 güne kadar 20 ila 25 C de inkübe edin. Dermatofitlerin izolasyonu için BD Dermatophyte Agar da kullanılmalıdır. 3 günden uzun süre inkübe edilirse, yeterli nem sağlayın. Kurumayı önlemek için plaklar yapışkan plastik bantla kapatılabilir. Gelişim sıcaklığı ve inkübasyon hakkında detaylı bilgi için, referanslara başvurun. 2-8 Tüplerdeki yatık besiyeri mantar kültürlerinin kültivasyonu ve idamesi için kullanılır. Suşu doğrudan steril su veya tuz çözeltisinde süspansiyondan sonra tüm yatık yüzeye sürme yöntemiyle ekin. İzolat için gerektiği şekilde inkübe edin. İnkübasyon sırasında, havalanmaya izin vermek için kapaklar hafifçe gevşetilmelidir. İnkübasyondan sonra ve saklama sırasında, tamamen kapatın. Sonuçlar İnkübasyondan sonra, plaklar birleşik gelişim alanı gösterebilir. Sürme yöntemi ile ekim yapma prosedürü, aslında, bir seyreltme tekniği olduğundan, sürme yöntemi ile ekim yapılan alanlarda sınırlı miktarda organizma birikir. Dolayısıyla bu alanlardan bir veya daha fazlası, örnekte bulunan organizmaların izole kolonilerini göstermelidir. Ayrıca, her organizmanın BA

4 gelişimi, sürme yöntemi ile ekim yapılan her alanda gelişim temelinde yarı kantitatif olarak puanlanabilir. Uygun inokülum ile inoküle edilmişse, yatık besiyerleri tüm yüzeyde gelişim gösterecektir. İnoküle edilen tüpler kültür canlılığı kaybı olmaksızın birkaç ay buzdolabında saklanabilir. Hayatta kalma süresi suşlara göre değişir. BD Sabouraud Glucose Agar dan (Şişe Besiyeri) hazırlanan tamamlanmış besiyerinde gelişen mantarların sayısı ve tüpleri çok fazladır. Bu sebeple, burada görünüş hakkında hiçbir spesifik detay verilemez. Referanslara bakın. 2,4,8-10 Plak besiyerinde elde edilen izolatlar için, izole edilen mantarların daha detaylı tespiti ve belirlenmesi içi uygun alt kültürler oluşturulmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ VE PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR BD Sabouraud Glucose Agar (Şişe Besiyeri) klinik olmayan çeşitli prosedürlerde kullanılır. 5,6 Klinik mikrobiyolojide, plak besiyeri bütün klinik örnek tiplerinden mantar izolasyonu için kullanılabilir. 2-4,8-10 Tüplerde yatık besiyeri doğrudan klinik örneklerle kullanılmaz fakat yalnızca saf mantar kültürlerinin gelişimi ve idamesi için kullanılır. Zenginleştirilmemiş besiyeri yalnızca zayıf seçicidir; bu sebeple özellikle uzayan inkübasyondan sonra bakteriler gelişebilir. Eğer örneklerin, malzemelerin veya araştırma alanlarının bakteriyel kontaminasyonundan şüpheleniliyorsa, antibakteriyel antimikrobiyaller ile, örn., gentamisin ve kloramfenikol, tetrasiklin, benzilpenisilin veya gerektiği şekilde diğerleri ile kullanmadan önce besiyeri zenginleştirilmelidir (bkz. Reaktifin Hazırlanması). Bulaşıcı ajanlar olarak oluşan mantarların geniş gelişme sıcaklığı aralığına bağlı olarak, aynı besiyerinin çeşitli plaklarını inoküle etmek ve farklı sıcaklıklarda inkübe etmek gerekebilir. Test Prosedürü bölümüne ve uygun referanslara bakın. 2,4,8,10 REFERANSLAR 1. Sabouraud, R Contribution a l'etude de la trichophytie humaine. Etude clinique, microscopique et bacterioloqique sur la pluralité des trichophytons de l'homme. Ann. Dermatol. Syphil. 3: Haley, L.D., J. Trandel, and M.B. Coyle Cumitech 11, Practical methods for culture and identification of fungi in the clinical microbiology laboratory. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. MacFaddin, J.F Media for isolation-cultivation- identification-maintenance of medical bacteria. vol. I. Williams & Wilkins, Baltimore. 4. Ajello, L., L.K. Georg, W. Kaplan, and L. Kaufman CDC laboratory manual for medical mycology. PHS Publication No. 994, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 5. U.S. Pharmacopeial Convention, Inc The U.S. Pharmacopeia 24/The national formulary U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md. 6. Council of Europe, European Pharmacopoeia, 4 th edition, and Supplement European Pharmacopoeia Secretariat. Strasbourg/France. 7. Sutton, D.A Specimen collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P.R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Pfaller, M.A., and R.A. Fromtling (section ed.) Mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Downes, F.P., and K. Ito (ed.) Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D.C. 10. Larone, D.H Medically important fungi: a guide to identification. 4 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. BA

5 AMBALAJ/TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ BD Sabouraud Glucose Agar (kısmen tamamlanmış şişe besiyeri) Kat. No cpu ml düz şişede 250 ml dolum hacmi Kat. No cpu ml şurup şişesinde 100 ml dolum hacmi Kat. No cpu ml laboratuvar şişesinde 400 ml dolum hacmi EK BİLGİ Daha fazla bilgi için lütfen yerel BD temsilcinizle temasa geçin. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: BD, and BD logo are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Bacto is a trademark of Difco Laboratories, division of Becton, Dickinson and Company. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection Becton, Dickinson and Company BA