ÖZET. Yüksek Lisans Tezi. Sevilay ÜSTÜNBAŞ. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı. Danışman: Doç. Dr.

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BATI TÜRKİYE DE YAYILIŞ GÖSTEREN SU SIÇANI, Arvicola terrestris (Linnaeus, 1758) (Mammalia: Rodentia) POPULASYONLARININ RAPD-PCR ANALİZİ Sevilay ÜSTÜNBAŞ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her Hakkı Saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BATI TÜRKİYE DE YAYILIŞ GÖSTEREN SU SIÇANI, Arvicola terrestris (Linnaeus, 1758) (Mammalia: Rodentia) POPULASYONLARININ RAPD-PCR ANALİZİ Sevilay ÜSTÜNBAŞ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Reyhan ÇOLAK Su sıçanları (Arvicola terrestris) Palearktik bölgede geniş yayılış gösterirler. A. terrestris in Türkiye de 3 alt türü bulunmaktadır. Avrupa ile Asya arasında yer alan Türkiye de, A. terrestris genetik düzeyde çalışılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, Trakya ve Anadolu da yayılış gösteren A. terrestris in genetik yapısını DNA düzeyinde incelemek, populasyon genetiğine ve taksonomisine katkıda bulunmaktır. Bu çalışma ile A. terrestris in Türkiye populasyonları ilk kez RAPD-PCR tekniği kullanılarak analiz edildi. Türkiye deki 9 lokaliteden toplam 38 birey çalışıldı. Çalışılan 23 RAPD markerinin 17 tanesi tutarlı sonuçlar vermiş olup 146 polimorfik RAPD bandı ortaya koymuştur. Çalışılan populasyonlar arasındaki genetik ilişkileri göstermek için Nei nin genetik mesafe ve genetik benzerlik hesaplamaları kullanıldı. Hesaplamalar POPGENE ve POPULATION bilgisayar programlarıyla yapıldı. A. terrestris populasyonları için hesaplanan genetik çeşitlilik Denizli populasyonunda H= (P= %12.33) ile Afyon populasyonunda H= (P= %23.9) aralığındadır. A. terrestris populasyonlarındaki toplam genetik çeşitlilik H t = olarak hesaplandı. Çalışılan populasyonlar arasındaki genetik farklılaşmayı gösteren G ST değeri olarak bulundu. Genetik mesafe değerleriyle çizilen dendogramda A. terrestris populasyonları 2 küme oluşturdu. Birinci kümede Trakya populasyonu tek başına yer alırken, ikinci kümede Anadolu populasyonları alt kümeler oluşturdu. Sonuç olarak, RAPD-PCR marker sistemi A. terrestris alttürlerini birbirinden ayırdı. Aralık 2008, 98 sayfa Anahtar Kelimeler: Su Sıçanı, Arvicola terrestris, Evrim, RAPD-PCR i

3 ABSTRACT Master Thesis RAPD-PCR ANALYSIS OF WATER VOLE, Arvicola terrestris (LİNNAEUS, 1758) (MAMMALIA: RODENTIA) DISTRIBUTED IN WESTERN TURKEY Sevilay USTUNBAS Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Reyhan COLAK Water vole, Arvicola terrestris is distributed widely in Palearctic region. There are three subspecies of A. terrestris in Turkey. In Turkey located between Europe and Asia, there is no any study on this species at the level of genetic structure. The aim of the present study was to survey genetic structure at DNA level and to contribute to the taxonomic status, population genetics of A. terrestris, in Thrace and Anatolia. The Turkish populations of A. terrestris is analyzed for the first time by using RAPD technique with this study. A total of 38 specimens from 9 locations were studied. 17 of the 23 RAPD markers tested yielded 146 polymorphic RAPD bands. The estimates of NEI s standard genetic identity and genetic distance were calculated to show the genetic relationships between populations studied. All estimations were calculated with the POPGENE and POPULATIONS soft wares. The estimated genetic diversity in A. terrestris populations ranged from H= (P= %12.33) in Denizli to H= (P= %23.9) in Afyon population. The total gene diversity in A. terrestris populations was calculated as H t = G ST value calculated was Dendogram constructed with genetic distance data formed two clusters. The first cluster included Thrace population and the second cluster (Anatolia) was divided into subgroups. Consequently, RAPD-PCR marker system separated two subspecies of A. terrestris. December 2008, 98 pages Key Words: Water vole, Arvicola terrestris, Evolution, RAPD-PCR ii

4 TEŞEKKÜR Çalışmalarımda, bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan daima bana destek olan danışmanım Doç. Dr. Reyhan ÇOLAK a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi); laboratuarlarını kullandığım ve örneklerin temin edilmesini sağlayan değerli hocalarım Prof. Dr. Ercüment ÇOLAK a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi) ve Prof. Dr. Nuri YİĞİT e (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi); bilgilerini paylaşan ve istatistik analizlerimde yardımcı olan değerli hocam Doç. Dr. İrfan KANDEMİR e (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi), laboratuar çalışmalarımda ve istatistik analizlerimde bana yardımcı olan Gül OLGUN a; manevi desteğini her zaman yanımda hissettiğim Ufuk GÜNDURU ya; jel görüntüleme sistemlerini benimle paylaşan Prokaryot Genetiği Laboratuarı ndaki, her türlü laboratuar ihtiyaçlarımı karşılayan ve kapılarını bana her daim açık tutan Biyoteknoloji Laboratuarı ndaki ve Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı ndaki değerli hocalarıma ve arkadaşlarıma; beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan ve hiçbir fedakarlığı esirgemeyen her adımımda yanımda olan aileme teşekkür ederim. Sevilay ÜSTÜNBAŞ Ankara, Aralık 2008 iii

5 SİMGELER DİZİNİ AFLP Amplifiye Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Lenght Polimorphism) Bç Bazçifti βme β-merkapto etanol cdna Komplementer DNA C: IAA Kloroform: izoamil alkol CTAB Setil Trimetil Amonyum Bromid D Genetik mesafe DAF DNA Amplification Fingerprinting datp Deoksiadenintrifosfat dctp Deoksisitozintrifosfat dgtp Deoksiguanintrifosfat dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asit dntp Deoksinükleotid trifosfat dttp Deoksitimintrifosfat EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik Asit G ST H HCI H I H S H T I MgCI 2 M ml mm Na Alt populasyonlar arasındaki genetik farklılaşmanın nisbi büyüklüğü Genetik çeşitlilik Hidroklorik asit Populasyondaki bir bireyin gözlenen heterozigotluğu Populasyondaki bir bireyin beklenen heterozigotluğu Tüm populasyonda bir bireyin beklenen heterozigotluğu Shanon information indeksi Magnezyum klorür Molar Mililitre Milimolar Her örnek için gözlenen allel sayısı iv

6 NaCl Sodyum klorür Ne Etkili allel sayısı ng Nanogram Nm Gen akışı nm Nanometre OPA Operon A OPB Operon B OPD Operon D PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polimerase Chain Reaction) pmol Pikomol RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RFLP Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (Rescriction Fragment Lenght Polimorphism) rpm Dakikadaki dönüş hız birimi (revolotion per minute) SNP Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism) SSCP Tek İplik Konformasyon Polimorfizmi (Single Stranded Conformation Polymorphism SSR Basit Zincir Tekrarları (Simple Sequence Repeats) STR Kısa Tekrar Dizileri (Short Tandem Repeat) TAE Tris-Asetik asit-edta TE Tris-EDTA UV Ultra viyole µl Mikrolitre µm Mikromolar µmol Mikromol VNTRs Değişken Sayıda Ardışık Tekrarlar (Variable Number Tandem Repeats) v

7 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ.... xi 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Ordo: Rodentia Familya: Muridae Altfamilya: Arvicolinae Genus: Arvicola Lacépède, Species: Arvicola sapidus Species: Arvicola terrestris Linnaeus, Arvicola terrestris hintoni Aharoni, Arvicola terrestris persicus de Filippi, Arvicola terrestris cernjavskii Petrov, Genetik Marker (Belirteç) Genetik marker tipleri Hibridizasyona dayalı moleküler markerler PCR (Polimeraz chain reaction) kullanımına dayalı moleküler markerler PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) PCR uygulamalarında kullanılan reaksiyon karışımları Taq polimeraz Primerler Deoksinükleotid trifosfat Magnezyum iyonları PCR ın avantaj ve dezavantajları PCR ın kullanım alanları RAPD-PCR vi

8 2.9.1 RAPD-PCR tekniğinin avantajları ve dezavantajları RAPD-PCR yönteminin kullanım alanları MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem DNA İzolasyonu DNA Miktarının Belirlenmesi RAPD Primerleri RAPD-PCR Amplifikasyonu Agaroz Jel Elektroforezi Jellerin Yorumlanması Veri Analizleri ARAŞTIRMA BULGULARI İstatistik Analizi Sonuçları TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR EK 1: 17 Primer ile Ortaya Çıkan Bantların Sonuçları...87 ÖZGEÇMİŞ...98 vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Arvicola sapidus Şekil 2.2 A. terrestris in yaşam alanı Şekil 2.3 Arvicola terrestris Şekil 2.4 PCR aşamaları Şekil 2.5 PCR aşamaları (denatürasyon, bağlanma, uzama) ve bu aşamaların gerçekleştiği sıcaklık değerleri Şekil 2.6 PCR reaksiyonunda her bir siklustaki kalıp sekansın kopyalanma sayısı Şekil 3.1 Arvicola, Microtus, Mus örneklerinin toplandığı lokaliteleri gösteren harita Şekil 4.1 A. terrestris örneklerinin OPA-02 (5'-TGC CGA GCT G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.2 A. terrestris örneklerinin OPA-03 (5'-AGT CAG CCA C-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.3 A. terrestris örneklerinin OPA-04 (5'- AGG GGT CTT G- 3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.4 A. terrestris örneklerinin OPA-07 (5'-GAA ACG GGT G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.5 A. terrestris örneklerinin OPA-08 (5'-GTG ACG TAG G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.6 A. terrestris örneklerinin OPA-16 (5'-AGC CAG CGA A-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü viii

10 Şekil 4.7 A. terrestris örneklerinin OPB-15 (5'-GGA GGG TGT T-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.8 A. terrestris örneklerinin OPB-16 (5'-TTT GCC CGG A-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.9 A. terrestris örneklerinin OPB-18 (5'-CCA CAG CAG T-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.10 A. terrestris örneklerinin OPB-19 (5'-ACC CCC GAA G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.11 A..terrestris örneklerinin OPB-20 (5'-GGA CCC TTA C-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.12 A. terrestris örneklerinin OPD-08 (5'-GTG TGC CCC A-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.13 A. terrestris örneklerinin OPB-09 (5'-CTC TGG AGA C-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.14 A. terrestris örneklerinin OPD-10 (5'-GGT CTA CAC C-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.15 A. terrestris örneklerinin OPD-11 (5'-AGC GCC ATT G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.16 A. terrestris örneklerinin OPD-12 (5'-CAC CGT ATC C-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü ix

11 Şekil 4.17 A. terrestris örneklerinin OPD-14 (5'-CTT CCC CAA G-3') primeri ile elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsü Şekil 4.18 Nei (1972) ye göre çalışılan tüm populasyonlara ait genetik mesafe değerleriyle oluşturulmuş dendogram Şekil 4.19 Nei (1978) ye göre A. terrestris in Anadolu ve Trakya populasyonları ile dış gruplara ait genetik mesafe değerleriyle oluşturulmuş dendogram x

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan Arvicola terrestris örneklerinin laboratuar kayıt numaraları ve örneklerin toplandığı bölgeler Çizelge 3.2 Çalışmada dış grup olarak kullanılan türlerin (M. macedonicus, M. guentheri, M. epiroticus) laboratuar kayıt numaraları ve örneklerin toplandığı lokaliteler Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan A. terrestris ten elde edilen DNA örneklerinin spektrofotometre ile ölçüm sonuçları Çizelge 3.4 Çalışmada dış grup olarak kullanılan Mus macedonicus, Microtus epireticus ve Microtus guentheri den elde edilen DNA örneklerinin spektrofotometre ile ölçüm sonuçları Çizelge 3.5 Analizlerde kullanılan primerler ve baz dizileri Çizelge 3.6 Kaya and Neale (1995) tarafından uygulanan PCR döngü programı Çizelge 3.7 Bu çalışmada kullanılan PCR döngü programı Çizelge 3.8 Optimum reaksiyon karışımı Çizelge 4.1 Her bir primerden elde edilen polimorfik bant sayısı Çizelge 4.2 A. terrestris populasyonları için genetik varyasyon analizleri (Nei 1987) Çizelge 4.3 A. terrestris alt populasyonları için genetik farklılaşma analizi (Nei 1987) Çizelge 4.4 Genetik mesafe ve genetik benzerlik hesaplamaları (Nei 1972) Çizelge 4.5 A. terrestris in Anadolu ve Trakya populasyonlarının genetik varyasyon analizleri (Nei 1987) Çizelge 4.6 A. terrestris in Anadolu ve Trakya populasyonlarının genetik mesafe ve genetik benzerlik hesaplamaları (Nei 1978) xi

13 1. GİRİŞ Su sıçanları (Arvicola terrestris) Palearktik bölgede çok geniş yayılış gösteren kemirici türlerinden biridir (Hinton 1926). Avrupa nın tamamından Batı Sibirya ve Güneybatı Asya ya kadar yayılış göstermektedir (Miller 1912, Corbet 1978, Ellerman and Morrison-Scott 1951, Harrison and Bates 1991). A. terrestris, Britanya da çok iyi bilinen bir memeli türü olup son dönemlerde populasyonunda çok hızlı ve önemli derecede düşüşler gözlenmiştir (Woodroffe 2000). A. terrestris e İskoçya nın kuzey bölgelerinde az rastlanırken, İrlanda da ise hiç rastlanmamıştır (Strachan and Jefferies 1993). A. terrestris, kesintili yayılış göstermektedir ve kesintili yayılış gösteren populasyonlarda, populasyonun genetik yapısı tespit edilerek, populasyonda genetik bir dar boğazın olup olmadığı belirlenmeye çalışılmaktadır. Su sıçanlarının başlıca yaşam yerleri yıl boyunca suyun bulunduğu nehirlerin, kanalların, göllerin ve bataklıkların kıyılarıdır (Corbet and Harris 1991, Woodroffe 2000). Bunun yanı sıra yüksek dağ sıralarındaki çayırlıklarda ve meyve bahçelerinde yaptıkları tünellerde yaşadıkları tespit edilmiştir (Airoldi et al. 1976, Meylan 1977). Su sıçanları yaşadığı habitata yakın tarım alanlarına zarar verebilmektedirler. Ayrıca Rusya da beslenmek için fakir orman vejetasyonlu, alt kısmı otlarla kaplı alanları tercih ettikleri, yaşadıkları alanlarda çam, kayın gibi ağaçların bulunduğu hızlı akan akarsuları tercih etmedikleri, buna karşın çalılarla kaplı su baskınına uğrayan alanlarda yaşadıkları belirlenmiştir (Ognev 1948). Ayrıca, göl ve baraj kıyılarındaki galerilerde ve kuru otlardan yapılmış yuvalarda yaşadıkları da gözlenmiştir (Özkurt vd. 1999). Su sıçanları, su kenarında bulunan vejetasyonun büyük bir kısmıyla beslenmektedirler. Ayrıca başlıca besinini çayır ve bataklık bitkilerinin oluşturduğu belirlenmiştir (Ognev 1948). A. terrestris morfolojik olarak iki alt gruba ayrılmaktadır. Scherman grubu Orta ve Güneydoğu Avrupa nın dağlık kesimlerinde, terrestris grubu ise Avrupa ve Asya nın ova ve tepelerinde bulunmaktadır (Van den Brink 1955). Arvicola Lacépède, 1799, 1

14 cinsinin Avrupa da Arvicola terrestris ve Arvicola sapidus olmak üzere iki türünün bulunduğu tespit edilmiştir (Corbet 1978). Birçok çalışmada A. terrestris in Avrupa, Rusya, Türkiye, İran ve Filistin de yayılış gösterdiği kaydedilmiştir (Ellerman 1948, Ellerman and Morrison-Scott 1951, Corbet 1978, Harrison and Bates 1991, Musser and Carleton 2005). Arvicola terrestris in dünyada 60 alttürü bulunmaktadır (Wilson and Reeder 1993); bu alttürlerden Arvicola terrestris persicus (de Filippi, 1865) İran dan, Arvicola terrestris hintoni (Aharoni, 1932) ise Amik gölü (Hatay) nden kaydedilmiştir. Bunların dışında batıdan Türkiye ye en yakın alttür Arvicola terrestris cernjavskii (Petrov, 1949) ise eski Yugoslavya dan kaydedilmiştir (Wilson and Reeder 1993). Warmerdam (1982) Hollanda da; Kratochvil (1980, 1983), Nikolaeva (1982), Kryštufek and Tvrtkovic (1984) ve Ventura (1991) Avrupa da bu türün morfolojik varyasyonlarını ortaya koymuşlardır. Bu çalışmaların yanında Romanya da Raicu et al. (1971), Azerbaycan da Kuliev et al. (1978), Avrupa da Zima and Kral (1984) su sıçanları üzerinde karyolojik çalışmalar gerçekleştirmişlerdir. İber yarımadasında sadece A. t. manticola alttürünün yaşadığı bilinmesine rağmen, Ventura and Gosalbez (1989) yaptıkları morfolojik ve biyometrik araştırmalar sonucu bu yarımadanın dağlarının Cantabrian çevresinde bu alttüre çok benzeyen fakat morfolojik farklara sahip olan A. t. cantabriae alttürünü kaydetmişlerdir. Birçok kaynakta su sıçanı populasyonlarının yoğunluğunda dalgalanmalar olduğu bildirilmiştir (Stewart et al. 1999; Berthier et al. 2004, 2005, 2006 ve Aars et al. 2006). Bu yüzden su sıçanı populasyonları ile metapopulasyon (bir türün lokal populasyonlarından oluşan her bir grup) düzeyinde de çalışmalar yapılmıştır. Stewart et al. (1999) İskoçya nın kuzeydoğusunda yayılış gösteren A. terrestris in metapopulasyon genetik yapısıyla ilgili bir çalışma yapmışlardır. Berthier et al. (2004, 2005, 2006) Fransa da yayılış gösteren A. terrestris populasyonlarında hem lokal olarak hem de metapopulasyon ölçeğinde genetik farklılığın temporal değişimini belirlemek için 17 mikrosatellit lokusu kullanmışlardır. Aars et al. (2006) ise İskoçya da yayılış gösteren A. terrestris metapopulasyonlarını 2

15 mikrosatellit özelliklerine dayanarak analiz etmişlerdir. Yapılan tüm bu metapopulasyon çalışmalarında populasyonlar arasındaki gen akışı seviyeleri ve genetik yapıları ortaya konmuştur. Moleküler seviyedeki filogeni araştırmalarında mitokondriyal genler Muridae familyasında kullanılmaktadır. Martin et al. (2000) Avrupa Muroid kemiricilerinin (Arvicolinae ve Murinae altfamilyaları) 18 türü arasındaki filogenetik ilişkiyi mitokondriyal sitokrom b gen dizisini kullanarak belirlemişlerdir. Piertney et al. (2005) İngiltere, Fransa, İspanya, İsviçre ve Finlandiya A. terrestris populasyonlarının mt DNA kontrol bölgesini analiz etmişlerdir. Araştırıcılar 27 haplotip belirlemişlerdir. Bu haplotipler sayesinde A. terrestris populasyonları iki farklı filogenetik gruba ayrılmıştır. Bu gruplanma ile İskoç populasyonları İngiltere ve Galler populasyonlarından ayrılmıştır. Fransa, İspanya ve İsviçre populasyonları İskoçya populasyonlarıyla, Finlandiya populasyonları İngiltere-Galler populasyonlarıyla kümelenmiştir. Pfunder et al. (2004) tüm ökaryotlar için genel bir genetik belirteç olan sitokrom oksidaz I ve sitokrom b genlerini kullanarak microarray analizi yapmışlardır. Araştırıcılar, microarray çipi olarak sitokrom oksidaz I sekansını kullanarak çalışmışlardır. Ayrıca çalışmada sitokrom oksidaz I in sitokrom b ye alternatif bir belirteç olduğu vurgulanmıştır. Türkiye de ise Steiner and Vauk (1966) Beyşehir Gölü nden A. terrestris in 2 örneğini kaydetmişlerdir. Mursaloğlu (1975) A. terrestris in Türkiye de 3 alt türünün; A. terrestris hintoni (Güneydoğu Anadolu Bölgesi), A. terrestris persicus (Doğu, Orta ve Batı Anadolu Bölgeleri) ve Arvicola terrestris cernjavskii (Trakya) nin yaşadığını tespit etmiştir. Ayrıca, Özkurt vd. (1999) Kırşehir yöresinden bir lokaliteye ait örneklerin karyolojik özelliklerini ortaya koymuşlardır. Bu çalışmaya göre Kırşehir yöresinde A. t. persicus yayılış göstermektedir. İyigün ve Çolak (2004) yine Kırşehir yöresindeki örneklerin total proteinleri ve esteraz enzimlerindeki varyasyonları elektroforetik olarak belirlemişlerdir. 3

16 Bütün bu bilgilere göre, Batı Türkiye de A. t. persicus ve A. t. cernjavskii alttürleri yayılış göstermektedir. Türkiye de A. terrestris üzerinde morfolojik, karyolojik, biyometrik çalışmalar yapılmıştır. Serum proteinleri ve allozim özellikleri üzerinde moleküler düzeyde yapılan tek çalışmada ise sadece küçük bir bölgedeki populasyonlar karşılaştırılmıştır. Son yıllarda ise Avrupa da mt DNA ve mikrosatellit gibi genetik belirteçler kullanılarak tür içi genetik farklılaşmaları ve türün kökenini belirleme yönündeki çalışmaların, özellikle de metapopulasyon düzeyinde evrimsel çalışmaların yoğunluk kazandığı anlaşılmaktadır. Türkiye de çok geniş yayılış gösteren, A. terrestris in yaşam alanları su kaynaklarının yanlış kullanılması nedeniyle daralmakta, bu da türün neslini tehlike altına sokmaktadır. Bu türün, Trakya ve Batı Anadolu da yayılış gösteren iki alttürü arasındaki genetik farklılaşmalarının derecesi ve birbirinden bağımsız akarsu ve göllerin tür içi farklılaşmadaki etkisinin belirlenmesi, çözülmesi gereken problemler olarak gözükmektedir. Ayrıca Avrupa ile Asya arasında yer alan Türkiye de, A. terrestris in genetik düzeyde çalışılmamış olması literatürde bilgi eksikliğine neden olmaktadır. Bu nedenle RAPD-PCR yöntemi kullanılarak taksonomik bakımdan A. terrestris e ait Trakya ve Batı Anadolu da yayılış gösteren iki farklı alttürün taksonomik statülerinin belirlenmesine katkı sağlanması tezin amacını oluşturmaktadır. Ayrıca farklı akarsu ve göl sistemlerindeki su sıçanı kolonileri arasındaki genetik farklılaşmaların seviyesini belirlemek amaçlanmaktadır. Bunun dışında global ısınmanın su sıçanı populasyonu üzerindeki gelecekteki etkisinin belirlenebilmesi için temel bir çalışma olacaktır. 4

17 2. KURAMSAL TEMELLER Regnum: Animalia Classis: Mammalia Subclassis: Eutheria 2.1 Ordo: Rodentia Rodentia kelimesi Latince rodere (kemirmek) kelimesinden gelmektedir. Rodentia ordosu 29 familya, 400 ü aşkın cins ve 2800 ün üzerinde türüyle memeli sınıfının en büyük takımıdır (Ognev 1947, Wilson and Reeder 1993). Antartika ve Kutuplar, Yeni Zelanda ve birkaç okyanus takımadası hariç tüm karalara yayılmış olarak bulunurlar. Bu hayvanlar kara, ağaç, toprak altı ve yarı sucul olarak çok farklı habitatlarda yayılış gösterirler (Wilson and Reeder 1993). Rodentia takımını diğerlerinden ayıran en önemli diagnostik karakter, köpek dişleri ve ön azı dişlerinin kaybolması ile oluşan diastema boşluğudur. Kesiciler altta ve üstte tek bir çifte indirgenmiştir. Bu dişler, açık köklerden sürekli olarak gelişirler ve keski şeklinde bir kesici kısma sahiptirler. Alttaki kesiciler özellikle geriye doğru çenenin boğumlu bir kısmına ulaşıncaya kadar uzayan uzun bir oyuk içinde yer alırlar. Diş formülleri I 1/1, C 0/0, Pm 0/0, M 3/3 x 2 =16 ile I 1/1, C 0/0, Pm 2/1, M 3/3 x 2 =22 arasında çeşitlilik göstermektedir (Wilson and Reeder 1993). Bazı türlerde besinin toplanmasına yarayan yanak keseleri vardır. Mideleri basit, körbağırsakları uzundur. Kuyrukları uzun ve türlerin bazılarında kuyruk pullarla örtülüdür. Toprak altında tüneller kazarak yaşayanlarda tırnaklar gelişmiştir. Gözler yaşam biçimine bağlı olarak farklı büyüklükte olabilir. Toprak altında yaşayanlarda gözler küçülmüş hatta bazı türlerde körelerek deri altında kalmıştır. Gececil olanlarda ise gözler oldukça büyüktür. Gözler başın yan taraflarında yer aldığından hem önü hem de arkayı aynı şekilde görebilirler. Suda yaşayanlarda gözler başın üst kısmındadır. Kulaklar da yaşam biçimine göre değişik şekiller gösterir. Örneğin suda ve toprak 5

18 altında yaşayanlarda kulaklar oldukça küçülmüştür. Genellikle kısa bacaklarla sıkı bir vücuda sahiptir. Tipik olarak ön ayaklarında 4-5 parmak ve arka ayaklarında 3-5 parmağa sahiptir. Genellikle ayak pençeleri çıplaktır (Demirsoy 1996). Kemiriciler genellikle herbivor ya da omnivordurlar. Üreme kapasiteleri çok yüksektir. Gebelik süreleri gün arasında değişir. Çoğunlukla yılda birkaç defa doğururlar ve her doğumda 1 18 yavru yaparlar. Küçük kemiriciler iki yıldan daha az yaşarlar (Demirsoy 1996). Kemiriciler, insanların besinlerine, tahtadan, kağıttan, deriden, kumaştan yapılmış malzemelere ve eşyalara, yer altı telefon kablolarına, elektrik tellerinin yalıtım kaplamalarına ve diğer nesnelere keskin dişleriyle kemirerek zarar vermeleri ve bazı hastalıkları bulaştırmaları açısından çok önemlidir. Bazı türleri insanlar için hastalık taşımaları nedeniyle ya da ekonomik yönden zararlıdır (Buckie and Smith 1994). 2.2 Familya: Muridae Muridae familyası günümüzde tanımlanan 301 cins ve 1336 türü ile memeliler ve kemiriciler içindeki en geniş familyadır. Kutup bölgeleri, Batı Hindistan ın bazı bölgeleri, Yeni Zelanda ve bazı Okyanus adaları dışında dünyanın tüm bölgelerinde çok geniş bir yayılış gösterirler. Familyanın orijinal olarak bulunmadığı birçok bölgede bile bu familyaya ait türler insanlar aracılığıyla bu bölgelere ulaşarak bu bölgelerde de yaşamlarını sürdürebilmişlerdir. Arvicola terrestris in dahil edileceği gruplar ve bunlar arasındaki ilişkiler hala devam eden tartışmalara rağmen kesinlik kazanamamıştır. Ellerman and Morrison-Scott (1951) Arvicola terrestris i Muridae familyasında yer alan Microtinae alt familyasına dâhil etmişlerdir. Niethammer and Krapp (1978) bu türü Arvicolidae familyasına; Mursaloğlu (1975) Muridae, Harrison and Bates (1991) Cricetidae familyası içinde Microtinae altfamilyasına dâhil etmişlerdir. Kryštufek and Vohrālik (2001) bu türü Muridae 6

19 familyâsının Arvicolinae alt familyasına dahil etmişlerdir. Bu çalışmada Kryštufek and Vohrālik (2001) in yaptığı sınıflandırma kullanılmıştır. Muridlerin vücut büyüklüğü ev faresinden sıçan büyüklüğüne kadar değişir. Kuyruk uzunluğu, vücudun 2/3 kadarıdır. Kulaklar, gözler ve ard ayaklar nispeten büyüktür. Molar dişleri daima köklü ve çiğneme yüzeylerinin üstü kabarık çıkıntılıdır. Muridae familyası için genel diş formülü; I 1/1, C 0/0, Pm 0/0, M 3/3 x 2=16 şeklindedir. Tüm muridlerde molarlar köklü ya da köksüz ve yuvarlak, sivri uçlu ya da prizmatik olabilir (Demirsoy 1996). Muridler çok farklı habitatlarda yaşarlar. Çoğu tür öncelikle karasal habitatları tercih ederken ağaçlarda yaşayanlar ve yarı sucul habitatları tercih eden türler de vardır. Tünellerde ya da çatlaklarda, kütük ya da benzeri uygun nesnelerin altında, uygun ağaç gövdelerinde ya da kovuklarında ve çalılarda, toprakta ya da ağaçlarda yaptıkları yuvalarda barınırlar. Kış uykusuna yatmazlar. Muridler gündüz ya da gececil davranışlar gösterirler ve genellikle tüm yıl boyunca aktiftirler. Bu familyada bulunan cinslerin çoğu otçuldur ve çok çeşitli tohum ve meyveleri tercih ederler. Bunun yanında bazıları omurgasızlarla da beslenirler. Bazılarıysa balıklar gibi küçük omurgalıları yiyebilirler. Bazen tohumları ve benzer diğer bitkisel yiyecekleri kışın kullanmak üzere depo edebilirler. Muridae familyasının bazı üyeleri toplu halde yaşarlar ve oldukça sosyalleşebilmişlerdir. Diğer üyeleri ise yalnız ya da çiftler halinde yaşamaya eğilimlidirler. Yılın sıcak geçen dönemlerinde çiftleşirler. Üreme potansiyelleri yüksektir ve iki yıldan fazla hayatta kalamazlar. Buna rağmen özellikle küçük muridlerde görülen yüksek üreme potansiyeli sayesinde bazen sayıları fark edilir derecede artabilmektedir. Yüksek sayılara ulaşmış populasyonlarda genellikle yaşadıkları alandaki besinin yetersizliğinden populasyon büyüklüğünde ani düşüşler görülür. 7

20 İnsanlar için tehlikeli birçok hastalık bu familyadaki kemiricilerden insanlara taşınabilir. Bu familyadaki belli türler ekinlere, genç ağaçlara ve insanların depoladıkları besinlere zarar verirler (Buckie and Smith 1994, Nowak 1999). 2.3 Alt Familya: Arvicolinae Arvicolinae alt familyasında 28 cins ve 151 tür bulunmaktadır (Nowak 1999, Musser and Carleton 2005). Bu alt familya holoarktikte yayılış göstermektedir. Ilıman, kuzey ve dağlık habitatlarda geniş dağılış gösterirler. Bu habitatlar; yaprak döken ve konifer ormanlar, çalılık ya da kayalık dağ etekleri, çayırlar, ovalar, stepler, tarımsal alanlar, yarı çöller, tundralar ve sucul ekosistemlerdir (Carleton and Musser 1984, Nowak 1999). Arvicolinae lerin görünüşleri çok farklıdır; bir kısmı köstebeklere bir kısmı sıçrayan farelere benzemektedirler. Baş ve vücut uzunlukları 70 mm den 300 mm ye kadar sıralanan orta büyüklükteki muroid kemiricilerdir ve kuyruk uzunlukları 5 mm den 295 mm ye kadar sıralanır. Kuyruk genellikle baş ve vücuttan daha kısadır. Arvicolinae lerin ağırlığı 15 gr ile 1.8 kg arasındadır. Yuvarlak kulaklara, keskin olmayan buruna, kısa bacaklara ve tombul bir bedene sahiptirler. Gözleri büyüktür. Diş formülü / =16 dır. Yetişkin erkekler ve bazen dişilerde kalça, böğür ya da kuyruk bölgesinde büyük yağ bezleri bulunmaktadır. Erkekler ve bazen dişiler yağ bezindeki salgılarıyla teritorilerini belirlerler. Birçoğunda koşmaya adapte olmuş ayaklar ve kazmaya yarayan uzun tırnaklar bulunur (Demirsoy 1996). Kamuflaj görevi gören kürkleri uzun-kısa, yumuşak-sert olabilir. Bazı türlerde, mevsimlerle doku değişiklikleri olur, yazın tüyler kısalmaya ve incelmeye başlar. Birçok türde kuyruk kürkle kaplıdır. Kürkün dorsal yüzeyi kahverengi ya da gri tonlarında, bazı türlerde de sarı ve açık kızıl tonlarında; ventral yüzeyi yüzeyi açık kahverengi, beyaz, krem, deve tüyü sarısı, sarımsı ya da gridir. Bazı türler üst tarafın alttan daha koyu olduğu iki renkli kuyruğa sahiptir. Aynı alanda yaşayan iki ya da daha fazla renkli morfolojiye sahip polimorfik populasyonlar vardır (Gruder-Adams and Getz 1985). Gebelik süreleri kısa, 8

21 çoğalma hızları yüksektir. Gebelik süreleri gündür, 1-18 yavru doğururlar. Yaklaşık 2 yıl yaşarlar (Kryštufek and Vohrālik 2001). Bazı türleri omnivor olmasına rağmen aslında Arvicolinae ler herbivordur. Yaprak, çimen, kök, çiçek soğanı, ağaç kabuğu, sürgün, çam iğnesi, etli ve zarlı kabuksuz meyve, kabuklu yemiş, liken, mantar, böcek, kerevit, midye ve küçük balıkları tüketmektedirler. Bazı türler ise yuvalarına besin depolamaktadır (Nowak 1999). Arvicolinae ler, orman dinamiğindeki anahtar türleri oluştururlar. Tohum dağıtımı için önemlidirler ve orman rejenerasyonunda etkilidirler (Manson et al. 2001). 2.4 Genus: Arvicola Lacépède, 1799 Palearktik bir cins olan Arvicola nın Güneybatı su sıçanı Arvicola sapidus ve Avrupa su sıçanı Arvicola terrestris olmak üzere iki türü vardır (Cubo et al. 2006). Kürkleri sucul yaşama uyum sağlamak için yumuşak veya kalındır. Kulakları kısa ve böğürlerinde yağ bezleri vardır. Çene dişleri kompleks ve prizmatiktir. Diş formülü I 1/1 C 0/0 Pm 0/0 M 3/3 olmak üzere 16 dır (Harrison and Bates 1991). 2.5 Species: Arvicola sapidus A. sapidus, paleontolojik ve filogenetik verilere göre semiakuatik yaşama adapte olmuştur. Kazıcı (fossorial) populasyonlar olan A. terrestris ten daha büyük hayvanlardır (Şekil 2.1) (Cubo et al. 2006). 9

22 Şekil 2.1 Arvicola sapidus AAADw/x8PE49EiB8/s3RATA+deagua.jpg 2.6 Species: Arvicola terrestris Linnaeus, 1758 Su sıçanları (Arvicola terrestris) orta ve batı Avrupa nın çoğunu, Sibirya, Moğolistan ve Güneybatı Asya nın bir kısmını kapsayan palearktik bir yayılış göstermektedirler (Nowak 1999). A. terrestris, nehirlerin, çayların, göletlerin ve suyla ilişkili diğer yerlerin kıyılarında yaşamaktadır. Vejetasyon örtüsünün iyi olduğu alanları tercih etmektedirler (Şekil 2.2). Çoğunlukla su kenarlarındaki düz arazilerde bulunmakla beraber bazen bahçe ve tarlalarda da bulunmaktadırlar (Niethammer 1990). Bu türe ait bireyler ev sıçanı (Rattus rattus) büyüklüğünde olmakla birlikte küt burnu ve daha kısa kuyruğu ile ev sıçanından ayrılmaktadır. Ayrıca ev sıçanlarının yaşadığı alanlarda bulunmazlar. 10

23 Şekil 2.2 A.terrestris in yaşam alanı images/boathouse%20survey2.jpg Su sıçanı populasyonları kesintili yayılış göstermektedir. Populasyonlar herhangi bir engelle bölünürse su sıçanları karayı da kullanabilmektedir. Kara parçalarının tarıma açılması, binaların ve yolların yapılması, doğal afetler gibi nedenlerle habitat devamlılığı ortadan kalkar başka bir deyişle habitat parçalanır. Türlerin yok olmasının en büyük sebebi de habitat kaybıdır. Habitat parçalarındaki azalma, parçalanmanın diğer bir sonucudur ve bu olay populasyonları da diğerlerinden izole eder. Habitatların parçalanmasının populasyonlar üzerindeki etkisi iç kısımlardan çok kenar kısımlarda daha fazla görülmektedir (Stewart et al. 1999). Genel görünüşleri tıknazdır. Boyları cm; kuyrukları cm; ağırlıkları 180 gr kadardır. Genellikle çok koyu renkli ya da tamamen siyahtır. Gözleri ve kulakları küçüktür; kulakları kılların içine gömülmüştür. Başları kısa; ağız-burun kısımları küttür. Ağız kenarları, ağız boşluğunu, kesici dişlerin arka kısmında kapattığı için, hayvanın 11

24 ağzına su kaçmadan, su altında dişlerini kullanabilirler. Kuyrukları gövdenin yarısı uzunluğundadır. Ön ayakları 4, arka ayakları 5 parmaklıdır. Ön ve ardayak tırnakları belirgin bir şekilde uzundur. Parmak aralarında perde yoktur. Kürk sık ve kısa kıllardan oluşmaktadır. Sırt kürkü kahverengi olup aralarda siyah kıllar bulunmaktadır (Şekil 2.3). Bu renk karın altına doğru gittikçe açılmakta ve karın altında beyazımsı gri olmaktadır. Kuyrukları kısa kıllarla kaplıdır ve dorsal ile ventral arasında belirgin bir renk farkı vardır. Su sıçanları iyi yüzerler ve iyi dalarlar. Tehlike sırasında su üzerine çıkarak, kıyıdaki otların altına kaçarlar. Kıyıda, hem su üzerine hem de su yüzeyinin altına bağlanan galeriler açarlar. Sulardan uzak yerlerde açtıkları galeriler, toprak yüzeyinin hemen altındadır ve bu galerilerin çıkışına yığdıkları topraklar köstebeklerinkine benzer. Kış uykusuna yatmazlar. Rastgele çiftleşirler (Stewart et al. 1999). Gebelikleri 21 gündür. Yılda bir kaç defa (3 4) ve her defasında 2 8 yavru doğururlar; 2 4 yıl yaşarlar (Demirsoy 1996). Şekil 2.3 Arvicola terrestris 12

25 Türkiye de Arvicola terrestris türünün üç alttürü yaşamaktadır Arvicola terrestris hintoni Aharoni, 1932 Türkiye de Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde yayılış göstermektedir (Mursaloğlu 1975). Kürkleri uzun kıllı ve seyrektir. Vücut derisi ve kıl dipleri koyu gri ve örtü kılları parlak siyah renktedir. Örtü kıllarındaki renkli bant kızılımsıdır. Bu kızıllık örtü kıllarının daha fazla bulunduğu yanak, omuz ve böğürlerde iyice bellidir. Ventral, postun seyrekliği ve derinin koyu renginden dolayı koyu gri renklidir. Omuzlar hizasından karna doğru uzanan akıtmanın rengi de aynı yanlardaki gibi kızıldır. Kuyruk derisi ve kuyruktaki kıllar koyu kahverengidir. Kuyruk iki renkli değildir. Parietal kemikler, frontallere doğru sivri uçlarla uzanmaktadır (Mursaloğlu 1975) Arvicola terrestris persicus de Filippi, 1865 Türkiye de Doğu, Orta ve Batı Anadolu Bölgeleri nde yayılış göstermektedir (Mursaloğlu 1975). Vücudunun her tarafında daha sık ve daha kısa kıllar bulunur. Örtü kıllarındaki renkli bant deve kürkü renginde sarıdır. Bu yüzden kürkün en koyu kısmı olan dorsal tarafı grimsiden hafif deve kürkü sarısına doğru giden bir renktedir. Yanlara doğru siyah örtü kılları yoktur. Omuzlar ve böğürler hizasında renk belirli olarak deve kürkü sarısına yakındır. Ön ve ard ayakların ve kısmen de kuyruğun üstleri grimsi, deri üzerinde çok açık grimsi beyaz görünen kıllarla örtülüdür. Vücudun ventralinde de beyaz renk hâkimdir. Kıl diplerindeki grilik bu beyazlığı hafif grimsi beyazlığa çevirir. Bu renk ağızdan kuyruğa kadar aynıdır. Kuyruğun alt tarafı seyrek uzun beyaz kıllarla örtülüdür. Kuyruğun dorsal ve ventral renkleri çok az farklıdır ve kuyruk iki renklidir. Bu alttürde ergin başları diğer alttürlerinkinden daha az keskin kenarlı ve köşeli görülmektedir. Parietal kemiklerin frontal kemiklere doğru yaptıkları ön çıkıntıları küt uçludur (Mursaloğlu 1975). 13

26 2.6.3 Arvicola terrestris cernjavskii Petrov, 1949 Türkiye de Trakya da yayılış göstermektedir (Mursaloğlu 1975). Kılların boyu oldukça uzundur. Bütün vücut derisi ve bütün kıl dipleri koyu gri ve örtü kılları parlak siyah renklidir. Örtü kıllarındaki renkli bant kızılımsıdır. Ventral, postun seyrekliği ve derinin koyu renginden dolayı koyu gri renkteyken kızıl örtü kılı bantlarından dolayı ventralde kızılımsı bir renk serpintisi göze çarpar. Kuyruk, üstten koyu, alttan daha açık kahverengi olmak üzere iki renklidir. Bu alttür diğer iki alttürden de başının kenarlarının ve köşelerinin daha fazla keskin olmasıyla ayrılır. Bu türün parietal kemiklerinin frontallere doğru uzanan ön uçlarının şekli de çok özeldir (Mursaloğlu 1975). 2.7 Genetik Marker (Belirteç) Sistematikçiler türler arasındaki filogenetik ayrımları yapabilmek için protein ve nükleik asitlerin karşılaştırmalarını kullanırlar. Bu protein ve nükleik asitler, marker olarak adlandırılırlar (Vignal et al. 2002). Bir bireyi ya da ona ait karakteristik bir özelliği deneysel olarak belirleyici kılan bir allel, jeldeki bir bant ya da bir özellik genetik marker olarak adlandırılır. Genetik belirteçler bir bireyin genotip ve/veya fenotipinin diğer bireylerin genotip ve/veya fenotipinden ayırt edilmesini sağlayan özelliklerini belirlemektedir. Son 10 yıldır moleküler markerler hayvan genetiğinde, DNA seviyesindeki polimorfizmleri ortaya çıkarmada anahtar rol oynamışlardır (Vignal et al. 2002). Yaşayan organizmaların karşılaştırmalı çalışmalarında, taksonomik durum ve filogenetik ilişkilerin doğru bir şekilde belirlenmesi için ileri modern metodlar yardımcı olur. Son zamanlarda kullanılan sitogenetik metodlar, genel olarak kabul edilen taksonomik durum, türleşme ve evrim gibi kavramların sadece türlerde değil, aynı 14

27 zamanda süpertür taksonlarında da önemli bir yaklaşım sağlamaktadır. Ancak benzer kromozom morfolojisi olasılığı ve fonksiyonel kromozom analizlerinin zorlukları açısından bu metodlar her zaman taksonomik amaçlarda kullanılamamıştır (Potapov et al. 1999). Biyokimyasal genetik metodlar, genomun sadece bir kısmını temsil eden yapısal genlerle sınırlıdır. Moleküler genetik metodların kullanımı yapısal genlerden başka DNA dizisindeki yapısal farklılıkların belirlenmesine ve genomik polimorfizme dayanır ve filogenetik analizlerin güvenilirliğini önemli ölçüde artırır (Potapov et al. 1999). Polimorfizmler, DNA daki yer değiştirmeler, ters dönmeler, parça eksilmeleri ve parça ilaveleri (eklenmeleri) ile meydana gelir ve genleri, onların düzenlenmelerini, biyokimyayı, gelişmeyi, morfolojiyi ve davranışı etkileyeceğinden evrim sürecinde fenotipik varyasyonun da kaynağıdır (Britten 1986). Genetik varyasyonlar, bir populasyonun bireyleri arasında genotipik farklılıklara bağlı varyasyonlardır. Küçük memelilerin biyoçeşitlilik çalışmaları genellikle canlı yakalama ve fenotipik karakterlerle tanımlama esasına dayanmaktadır. Son zamanlarda yapılan birçok moleküler çalışmada; fare (Murinae, Rodentia), tarla faresi (Arvicolinae, Rodentia) ve kır faresi (Soricidae, Insectivora) türlerinin tanımlanması ve türlerin akrabalıklarının çözülmesi sağlanmıştır (Martin et al. 2000, Pfunder et al. 2004, Piertney et al. 2005). Moleküler metodlar, memeli türlerinin tanımlanması için yaygın olarak kullanılır. Genetik varyasyon çalışmalarında sıklıkla kullanılan bazı nükleer ve mt genler ve diziler vardır. Bunlar arasında en önemlileri; D-Loop kontrol bölgesi, sitokrom b ve rrna genleridir (Martin et al. 2000, Piertney et al. 2005). Bunların yanında sitokrom oksidaz I de, tüm ökaryotlar için genel bir belirteç olarak kullanılan önemli genlerden biri olmuştur (Pfunder et al. 2004). Bu sayılan teknikler ve spesifik genlerin çalışılması deneyim gerektirir, pahalıya mal olur ve uzun süreçlidir. Genetik varyasyonları tespit amacıyla, sitolojik veriler, izoenzimler, sekonder metabolitler gibi biyokimyasal işaretleyiciler ve Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP), Rastgele 15

28 Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD-PCR), Basit Dizi Tekrarları (SSR), Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP), Farklı Sayıda Ardarda Tekrar Eden Dizilimler (VNTR) gibi moleküler markerler kullanılmaktadır (Stuber 1992). Bu markerler, ayrı genotipe sahip bireylerin genetik haritalarının çıkartılmasında ve tür ayrımında da kullanılmaktadır (Grajal-Martin et al. 1998). İzozim, RAPD gibi teknikler doğal populasyonların genetik varyasyon çalışmalarında sıklıkla kullanılan nisbeten daha ucuz ve kolay tekniklerdir. Özellikle RAPD-PCR tekniği dizi bilgisi gerektirmez, rastgele primerlerle çalışılır ve kısa sürede sonuç alınır (Welsh and McClelland 1990, Sunnucks et al. 2000, Vignal et al. 2002). Genetik varyasyon çalışmaları; 1. Türlerin filocoğrafik yapı ve evrimsel süreçteki yerlerinin belirlenmesi, 2. Taksonomik sorunların çözülmesi, 3. Türlerin korunmaları için gerekli stratejilerin geliştirilmesi için yapılmaktadır. Markerlerin kullanım amaçları çok fazla olmasına rağmen bazıları şu şekilde sıralanabilir: Genlerin klonlanması Evrimsel gelişim Genom analizleri Genetik varyasyon çalışmaları Populasyonlar arası genetik mesafenin veya filogenetik benzerliğin hesaplanması Genetik haritalama Genetik parmak izi analizleri Doğrudan gen etiketlenmesi Kromozomların yeniden yapılandırılması Genetik kaynakların ve çeşitlerin korunması çalışmaları 16

29 Genetik markerlar; morfolojik markerler, biyokimyasal markerler ve moleküler markerler (DNA markerleri) den oluşur Genetik marker tipleri 1) Morfolojik markerler: Tek bir lokus tarafından kontrol edilen morfolojik özellikleri belirleyen markerlerdir. Sayıları azdır. Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenirler. Çoğunlukla dominant özelliktedirler, yani sadece dominant fenotipi (AA ve Aa) resesif fenotipten (aa) ayırabilirler. Morfolojik markerlerin, analizlerinin kolay olması ve genetik haritalama çalışmalarında populasyonda yapılacak bir gözlem ile kolayca belirlenebilmeleri en büyük avantajıdır. 2) Biyokimyasal markerler: Depo proteinleri ve enzim proteinleri olarak iki ana gruba ayrılırlar. Buğday tohumunda bulunan iki depo protein grubu olan gliadin ve glutenin, depo protein markerleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Enzim markerleri kendi içinde alloenzimler ve izoenzimler olarak iki ana grup altında incelenebilir. Allozim aynı genin farklı protein formları; izoenzimler ise farklı genler tarafından üretilen; ancak birbirine çok benzeyen protein formlarını ifade eder. Enzim markerlerinin temel avantajları analizlerinin çabuk, ucuz ve güvenilir olmasıdır. Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler. En büyük dezavantajları sayılarının çok az olmasıdır. Ayrıca özel dokularda ve belli bir gelişme döneminde gözlenebilir olması da bir dezavantajdır. 3) DNA markerleri: DNA melezleme (hibritleme) markerleri ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA markerleri olmak üzere iki grup altında incelenir. Sayıları çok fazladır ve çevreden etkilenmezler. Genellikle nötrdürler. Lokuslar arası interaksiyon oluşmaz. En büyük dezavantajı pahalı bir laboratuar alt yapısı gerektirmesidir ( DNA markerleri, hibridizasyona dayalı moleküler markerler ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA markerleri olmak üzere iki grup altında incelenirler. 17

30 2.7.2 Hibridizasyona dayalı moleküler markerler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): DNA belirteçleri içerisinde ilk keşfedilen markerdır (Saiki et al. 1998). Restriksiyon parça uzunluk polimorfizm analizi restriksiyon endonükleazların çift iplikli DNA yı spesifik tanıma bölgelerinden kesmesi esasına dayanmaktadır. Restriksiyon endonükleazlar çift sarmal DNA moleküllerinin 4 ile 8 baz çifti (bç) arasındaki spesifik bölgelerini tanıyarak kesen enzimlerdir. PCR ile çoğaltılan DNA bölgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Her bir restriksiyon endonükleaz enzimi spesifik palindromik kısa DNA dizisini tanır ve keser. Ancak farklı uzunluklarda DNA fragmentleri oluşur. Bu oluşan DNA fragmentleri jel elektroforezi ile fragment büyüklüklerine göre ayrılırlar. Kesim bölgelerindeki tek bir nükleotidin bile sebep olduğu mutasyonlardan dolayı restriksiyon nükleotidlerinin uzunluğundaki varyasyon saptanır (Jones et al. 1991). Southern Blot tekniği ile uygun bir membrana aktarılan DNA lar işaretlenmiş ve radyoaktif olmayan veya radyoaktif problarla (genellikle P 32 ile işaretlenmiş, bç uzunluğundaki kısa DNA zincirleri) hibritleştirilir. Prob DNA nın en önemli özelliği genomda az sayıda bulunmasıdır. Oluşan bu radyoaktif hibritler otoradyografi tekniğiyle gözlenir. Böylece türlere özgü restriksiyon bantları belirlenir. Tekniğin en önemli avantajı güvenilir olmasıdır yani farklı laboratuarlarda da aynı sonuçlar elde edilebilmektedir. Tekniğin dezavantajı ise, genomlarda az kopya olan dizilişler belli noktalarda kümelendikleri için RFLP belirteçleri genom üzerinde rastgele dağılış göstermezler. DNA mutasyonları enzimin kesme noktasını ortadan kaldırabilir veya yeni bir enzim kesme noktası oluşturabilir, böylelikle kesim sonucu oluşan fragment sayısını değiştirirler. Restriksiyon bölgeleri arasındaki insersiyon veya delesyon mutasyonları da fragment büyüklüklerini değiştirirler. Genomda kodlama yapan ve yapmayan bölgelerde restriksiyon enzim tanıma bölgelerinin dağılımı insanlar arasında farklıdır. Bu farklılıklar doğal genomik çeşitliliği yansıtır ve genellikle fenotipik bir sonucu olmayan RFLP leri oluşturur ( 18

31 2.7.3 PCR (Polimeraz Chain Reaction) kullanımına dayalı moleküler markerler 1985 yılında bilim adamları in-vitro koşullarda çoğaltmaya bağlı olarak bir DNA amplifikasyonu prosedürü geliştirmişlerdir. PCR (Polimeraz Chain Reaction) yani Polimeraz Zincir Reaksiyonu olarak da bilinen bu metod, basit enzimatik bir reaksiyonla, kompleks bir DNA kalıbından, çok sayıda spesifik bir DNA parçasını oluşturabilmektedir (Arnheim and Erlich 1992). PCR tekniğinin kullanımıyla DNA amplifikasyonun gelişimi, 100 yıllık veya daha eski populasyonlardaki genetik değişikliklerin araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Ayrıca canlıyı öldürmeden alınacak çok küçük bir doku parçası bile bu teknik için yeterli olmaktadır. Moleküler biyoloji tekniklerindeki ilerlemeler sayesinde, genetik polimorfizmi saptamak için oldukça yararlı çok sayıda DNA markerleri geliştirilmiştir. (Bardakçı 2001). PCR a dayalı moleküler markerler arasında en yaygın olarak kullanılanlar RAPD, SSR-STR-VNTR olarak adlandırılan mikrosatellitler, AFLP, SNP, DAF ve SSCP dir. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA olarak adlandırılmaktadır. Bu yöntem, dizisi bilinmeyen DNA parçalarının çoğaltılmasını kapsar. RAPD yöntemi, tek, kısa ve rastgele (9-10 bç) oligonükleotid primerler kullanılarak DNA dizilerinin çoğaltılması esasına dayanır. Çoğalan DNA lar agaroz jel veya poliakrilamid jel elektroforezi ile birbirinden ayrılır ve uygun boyalarla boyanarak izlenebilir. Reaksiyon ürünleri, oligonükleotidlerin dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına bağlıdır. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda marker sağlamasıdır. Mikrosatellitler (SSR-STR-VNTR): Genom içinde dağılmış tekrar eden kısa DNA baz segmentleridir. Minisatellit ve mikrosatellit olmak üzere ikiye ayrılırlar. Minisatellitlerin oluşturduğu tekrar dizilimleri genellikle 9-64 bç lik motiflerden oluşmaktadır. Bunlar VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) olarak bilinmektedir. Mikrosatellitler ise genellikle bç ne ulaşan yapılara sahiptir. 19

32 Tekrar motifleri ikili, üçlü, dörtlü veya beşli olabilmektedir. SSR (Simple Sequence Repeat, basit dizi tekrarları) ya da STR (Short Tandem Repeat, kısa tekrar dizileri) ökaryotik genomlarda bulunur ve 2-6 nükleotidli gruplardır. Mikrosatellitler genoma yayılmış ve bol olarak bulunurken; minisatellitler ise kromozomların telomerik ve sentromerik bölgelerinde toplanır. Mikrosatellit lokuslar kodominant markerlerdir. Mikrosatellitler ayrıca evolusyonla ilgili çalışmalarda, akrabalık seviyelerinin ve ebeveynlerin belirlenmesinde, genomdaki gen haritalarının çıkarılmasında, populasyonun genetik parametrelerinin tahmini ve populasyon farklılıklarının belirlenmesi gibi çalışmalarda kullanılmaktadır (Çiftçi 2004). AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi denilen bu yöntem, restriksiyon enzimleri ile kesilmiş olan DNA fragmentlerinin seçici olarak çoğaltılması esasına dayanmaktadır. AFLP primerleri nükleotid uzunluğundadır. AFLP, güvenilir ve zor bir tekniktir. Kısa sürede çok fazla lokus incelenebilmektedir. Bu yöntem, PCR ve RFLP tekniklerinin temel esaslarına dayanmaktadır. SNP (Single Nucleotide Polymorphism): SNP ler (tek nükleotid polimorfizmi) transisyonlar (bir pürin bazın (A,G) diğer bir pürin bazına veya bir pirimidin bazın (C,T) diğer pirimidin bazına değişmesi) ve transversiyonlar (bir pürin bazının bir pirimidin bazına değişimi veya tersi) gibi baz değişimlerini içermektedir. Bir populasyondaki tek baz değişiminin frekansı %1 den büyükse bu değişim SNP, %1 den küçük ise mutasyon olarak adlandırılır. SNP ler evrimsel olarak mikrosatellit markerlarına göre daha stabildirler ve daha düşük mutasyon oranına sahiptirler ( DAF (DNA Amplification Fingerprinting): PCR ın tek primerle kullanımı esasına dayanır. DAF tekniğinde ise 5-10 bç lik primerler kullanılır ve RAPD e göre daha fazla DNA parçasının amplifikasyonu sağlanır (Çiftçi 2004). 20

33 SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism): Sekans farklılığı gösteren DNA örneklerinin belirlenmesinde kullanılan ucuz, kolay, duyarlı ve güvenilir bir yöntemdir (Sunnucks et al. 2000). Bu yöntemle bç lik DNA dizisi çoğaltılır. Bir fragmentte tek bir nükleotid farklılığı dahi belirlenebilmektedir. Bu metodun prensibini, tek iplikçikli DNA nın şekil ve büyüklüğüne bağlı olarak, denatüre olmayan jel içerisindeki elektroforetik hareketi oluşturmaktadır. Sekans farklılıklarının belirlenmesinde büyük avantajları bulunmaktadır (Orita et al. 1989). 2.8 PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) PCR, canlı organizma kullanmadan enzimatik olarak DNA çoğaltan moleküler biyolojik bir tekniktir. Teknik, çok az bir kalıp DNA ile bu DNA molekülünün birçok kopyasının hızla artan bir biçimde yapılmasına izin verir li yıllarda genlerin klonlanma tekniklerinin gelişimi, daha önceleri araştırılması mümkün olmayan gen aktivitelerinin araştırılmasını olanaklı hale getirmiştir. Genetik alanında ikinci devrim ise aynı şekilde 1980 lerde PCR ın icadı ile yaşanmıştır li yıllarda Kary Mullis tarafından geliştirilen Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) hiç kuşkusuz ki genetik çalışmaların ivmesini artıran en önemli tekniklerden biridir. PCR la birlikte DNA nın küçük bir bölgesini DNA polimeraz enziminin de kullanımı ile birlikte milyonlarca defa kopyalamak mümkün olmuştur. Fakat burada önemli olan şey çalışılacak olan DNA parçasının her iki ucunun nükleotid diziliminin bilinmesidir. Bu bilgi ilgilenilen DNA parçasının her iki ucu için primer geliştirilmesini zorunlu kılar. Primerler oluşturulduktan sonra iki uç arasındaki bölüm PCR kullanılarak çoğaltılabilir (Çiftçi 2004). PCR ile belirli bir bölgeyi çoğaltabilmek için hedef DNA nın nükleotid dizisi hakkında bazı bilgilere ihtiyaç vardır. Bu bilgi, tek zincirli hale getirilmiş DNA ya bağlanacak olan iki oligonükleotid primerin sentezi için kullanılır (Arnheim and Erlich 1992). Oligonükleotidler, DNA polimeraz enzimi tarafından katalize edilen bir seri DNA sentez reaksiyonlarında primer olarak görev yaparlar. Bu oligonükleotidlerin baz dizileri birbirlerinden farklı olup her bir oligonükleotid, kalıp görevi gören çift sarmal DNA nın tek sarmalına komplementerdir. İki oligonükleotid primere ilaveten, reaksiyonda ısıya 21