Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK /7. DERS İLAÇ METABOLİTLERİ

Transkript

1 1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK /7. DERS İLAÇ METABOLİTLERİ

2 İlaç Metabolitleri 2 Bütün biyolojik sıvılar araştırılan ilacın metabolitlerinin potansiyel varlığına sahiptir. Analizci belirli bir ilaçtan üretilecek metabolit tipinden haberdar olmalıdır. Bu oldukça kompleks bir konudur. Herhangi bir ilacın tamamlanmış metabolizması sadece yapısından tahmin edilemez. Metabolizma devam eden bir işlemdir ve metabolitler kendi kinetiklerine sahiptirler. Bu yüzden metabolitin ana ilaçla ilişkili olan miktarı zamanla değişebilir.

3 İlaç Metabolitleri 3 Transformasyon olaylarının büyük çoğunluğu suda kolay çözünen bileşiklerin üretilmesi ve atılmasının kolaylaştırılması ile ilgilidir. Metabolik transformasyon molekülün deaktivasyonu için garantili bir yol değildir. Her bir reaksiyon türü farmakolojik olarak daha aktif veya daha toksik olan bir türevini oluşturabilir. İlaç metabolizması için söz edilecek reaksiyon türleri, herhangi bir ilaç için meydana gelebilir. Ancak reaksiyon türü veya reaksiyon zinciri, ilacın kendi veya ara metabolitinin herhangi bir enzim için substrat olarak davranabilme yeteneğine ve substratın metabolizma yerinden uzaklaştırılma hızına bağlıdır.

4 İlaç Metabolitleri 4 Metabolizma basamakları iki faz olarak sınıflandırılır. 1. fazda ilaç yapısında basit bir değişikliği sağlayacak tek bir enzimin atağı ile reaksiyon gerçekleşir. Böyle reaksiyonlar genellikle oksidasyon, redüksiyon ya da hidroliz biçimindedir ve ilaç yapısında uygun bir fonksiyonel grubun 2. fazda kullanılmasına neden olur. 2. faz ilacın fonksiyonel grubuna suda çözünebilir fonksiyonel grubun katıldığı ya da faz 1 metabolitinin suda çözünebilir konjugatını (glukuronidasyon, asetilasyon, sulfat oluşumu) oluşturduğu ve böylelikle idrarla kolayca vücuttan atıldığı sentetik bir basamağı içerir. Metabolizmanın her iki fazının ana yeri karaciğerdir.

5 FAZ I METABOLİTLERİ 5 Oksidasyon: Aromatik bileşikler doğrudan hidroksilasyon ile metabolizmaya uğrar. Benzen fenole, naftalen b-naftole dönüşür. Alifatik bileşikler w-hidroksilasyon ile primer alkollere dönüşür. Alkoller, aldehit ve ketonlara yükseltgenir ve ardından asitlere dönüşür. Aldehit ve ketona yükseltgenme tersinir bir reaksiyondur. Aromatik eterler O-dealkilasyon ile birlikte fenole dönüşür. Aromatik tiyoeterler de benzer şekilde davranır. Aromatik aminler hidroksillenerek hidroksilamino türevlerini oluşturur. Tersiyer aminler N-oksit yapısına, sekonder aminler dealkillenme sonrası karşılık gelen aldehide dönüşür. Tiyoeterler sülfoksit yapısına okside olurlar.

6 Faz I metabolitleri 6 Redüksiyon: Alkollerin ketonlara oksidasyonu tersinirdir, bu yüzden ketonların metabolizmasında alkollerin oluşumu beklenebilir. C=C yapısı doygun türevine indirgenebilir, ancak bu nadiren görülür. N=N yapısı hidrazin üzerinden primer amine dönüşür. Nitro grupları özellikle aromatik nitro grupları primer amine indirgenir.

7 Faz I metabolitleri 7 Hidroliz: Esterlerin tamamı spesifik veya nonspesifik esterazların farklı türleri ile kolayca hidrolize uğrar. Amitler esterler kadar kolay olmamakla birlikte hidroliz olur.

8 FAZ II METABOLİTLERİ 8 Glukuronidasyon: Glukuronik asit ile konjugasyon Faz II metabolizmada en fazla karşılaşılan durumdur. Alkoller ile eter tipi, asitler ile ester tipi bağlanma gerçekleşir. Meydana gelen türev suda kolay çözünür ve idrar ile atılır. Bu tip konjugatların önemli bir özelliği seyreltik bazik ortamda kolayca hidroliz olmasıdır. Bekletilen idrar bazik olduğunda hidroliz sonrası değişmeyen ilacın son derece yüksek derişimleri ile karşılaşılabilir. Hidroksil amin yapısı glukuronik asit ile kolayca konjugat oluşturur. Tiyoller S-glukuronit, alkoller O-glukuronit oluşturur. N-glukuronitler nötral ph dışında çok dayanıksızdır.

9 Faz II metabolitleri 9 Sülfat oluşumu: Sülfürik asit ile konjugasyon ilaçların ve metabolitlerinin özellikle fenol ve alkollerin ikinci önemli konjugasyon yoludur. Aromatik aminler bu metabolizma yolu ile sülfamatları oluşturur.

10 Faz II metabolitleri 10 Asetilasyon: Asetik asit ile konjugasyon faz II metabolizma içinde sınıflandırılır ancak bu olay metabolizma yolunda ikinci basamak olması yerine ilacın doğrudan asetillenmesi ile ilgilidir. Aromatik aminler ve sulfonamitlerin asetillenmesi yaygın görülen bir durumdur. Asetillenme sadece yabancı bir bileşiğin atılma yolu değil, aynı zamanda bireylerin metabolik kapasitesinin karakterizasyonunda önemli bir konudur. Glisin karboksilik asitlerle hippurik asit oluşturmak üzere konjuge olur. Bunun en basit örneği benzoik asitin kendiliğinden hippurik aside dönüşümüdür. Klorpromazin, 7-hidroksilasyon, S-oksidasyon ve N-demetilasyon ile metabolizmaya uğrar. Bu üç dönüşüm ile sekiz adet olası metabolit oluşumu beklenir, ancak klorpromazin için 20 adet metabolit karakterize edilmiştir ve 200 adet metabolit oluşumu ile ilgili raporlar mevcuttur.

11 Metabolitlerin Önemi 11 İlaç analizinde metabolitin kendi aktivitesi varsa, ana ilacın ölçümü yanında metabolit derişiminin ölçümü önemli olabilir. Bileşikler eşit aktivitede olduğunda ve benzer farmakokinetikler sergilediğinde tayin için kullanılan analitik yöntem bileşiklerin birlikte tayinine imkan vermelidir. Ancak bileşikler eşit aktivitede değilse bu tip ölçümlerden türetilen farmakokinetiklerin önemini yorumlamak zor bir konudur. Sigara kullanmak da ilaç metabolize eden enzimleri indüklediği için terapötik önemi olan bir çok maddenin farmakokinetiğini ve metabolizmasını değiştirir.

12 Diğer İlaçların Varlığı 12 Araştırılan ilaç için özellikle yeni bileşiklerin farmakokinetiğinin araştırılmasında diğer ilaçlar bilindiği takdirde analiz bakımından bir problem yaşanmaz. Diğer ilaçların ne olduğunun bilinmediği adli toksikoloji ve benzer konularda diğer ilaçların varlığı problemlerin önemli bir parçası haline gelir. Yeni bileşikler için yapılan klinik çalışmalarda yaşlı ve genç gönüllülerdeki farmakokinetiklerin aynı olmadığı, diğer ilaçları kullananlar için analitik yöntemde potansiyel girişim oluşturma durumu dikkate alınmalıdır. Özellikle belirli bir ilaçtan oluşan metabolitlerin izlenmesinde bu durum daha fazla önem kazanır. Kombine ilaçların geliştirilmesi ile ilgili çalışılmalarda bir bileşiğin diğerinin kinetiğini (formülasyon veya biyolojik) potansiyel olarak etkilemesi kontrol edilmelidir. Bu durum için ideal çözüm aynı tayin yöntemi ile kombinasyonu oluşturan bileşiklerin izlenmesidir.

13 Analiz Öncesi Degredasyon 13 İlacın kendi dayanıksızlığı, idrar gibi sıvıların uç ph değerlerinde bulunması, plazma proteinlerine bağlanmanın koruyucu etkisinin kaybedilmesinden kaynaklanır. İdrara koruyucu olarak asit eklenmesi barbituratların N- glukozitlerini stabilize etmesine karşın diğer ilaçların kolayca hidroliz olmasına neden olur. Degredasyon, numunenin alınmasından sonra devam eden enzimik aktiviteye de bağlı olabilir. Özellikle plazma ve serumda bulunan esterazlar bu duruma neden olur. Konjugatların analiz için hidroliz edilmesinde spesifik enzimler serbest ilacı açığa çıkarmak için kullanılır.

14 Yöntem Seçimi Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için yöntem seçiminde validasyon parametreleri, hız ve kolaylık için farklı gereksinimler söz konusudur. Örneğin, aşırı doz için yapılan işlemlerde bol miktarda plazma numunesi ile ekstraksiyon, kromatografik saflaştırma ve analiz basamakları izlenir. Yüksek düzeyde kesinlik ve duyarlılık gerektiğinde ucuz olmayan ve uzmanlık gerektiren yöntemlere ihtiyaç duyulur. Analitik verilerin çok önemli olmadığı durumlarda ucuz bir yöntem veya rutin bir deney protokolü kullanılır.

15 Yöntem Seçimi Her analizcinin uzmanlık alanı ile ilgili olan favori bir tekniği vardır. Uzmanlık (Expertise), yöntem seçiminde belirleyici unsurdur. Laboratuvar olanakları ve cihazlar da seçimi etkiler. Ancak daha hızlı, daha az işlem gerektiren daha ucuz bir yöntem karmaşık bir yönteme tercih edilir. Gerekli duyarlılık düzeyi seçimi etkileyen diğer önemli noktadır. İlaç tahmin edilmeyen şekilde büyük oranda metabolizmaya uğradığında yüksek dozlar verilse bile plazma ve idrardaki derişimi az olacaktır. Yöntem seçiminin yeniden gözden geçirilmesi gerekir. Her 10 yıl boyunca, duyarlık düzeyinde 10 misli azalma sağlanmıştır mol-yocto-6 molekülün ölçülmesine karşılık gelir. İlacın bilinen kimyasal karakteristiklerini incelemek yeni bir yöntem geliştirmede önemli bir basamaktır.

16 Yöntem Seçimi İlacı sentezleyen kimyacı NMR ve kütle spektrumu yardımı ile gerekli yapısal bilgileri sağlar. UV spektrumu bilindiğinde sonraki kromatografik çalışmanın saptama basamağı için önemli bir veri elde edilir. ITK ile ön ilaç formu, yan ürünler ve parçalanma ürünleri veya metabolitler ilgili bileşikten ayrılabilir. Stabilite hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir.

17 Analitik Profil Bileşiğin Karakterizasyonu Fizikokimyasal karakteristikleri UV-görünür bölge spektrumu Floresans spektrumu ITK HPLC GC Kütle Spektrometri NMR Çözünürlük

18 Fizikokimyasal Karakteristikler Çalışılan bileşik için, Çeşitli çözücülerde çözünürlük İyonize olabiliyorsa bileşiğe ait pka değeri Molekül ağırlığı Optikçe aktif formun varlığı analizi yürüten tarafından bilinmelidir.

19 Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrometri Absorpsiyon düzeyi incelenir, yüksek mi? HPLC de UV detektör dalga boyuna buradan karar verilir. Spektrum ph değişikliklerinden etkilenir mi? Absorpsiyonu ve duyarlılığı artırmak için yararlıdır. Absorpsiyon spektrumu spesifik değildir, ancak spesifik bir ekstraksiyon işleminden sonra veya ilaç metabolizmaya uğramadığında uygulanabilir. Absorpsiyon spektrumu metabolizmadan az etkilenir.

20 Floresans Spektrum Floresans ışın yayma özelliği olan maddeler, kendilerine özgü dalga boyundaki ışınlarla uyarılabilir ve tayin edilebilirler. Floresans özelliği olmayan maddeler, üzerinde taşıdığı çeşitli fonksiyonel gruplar kullanılarak türev oluşturabilen ajanlar ile türevi oluşturulduktan sonra tayin edilebilir. Örn primer amin grubu taşıyan maddeler, floreskamin ve dansil klorür ile türev yapılabilir. Ancak türevin kolayca oluşması ve stabilitesi değerlendirilmelidir. Metabolizma floresans karakteristiklerini değiştirebilir.

21 ITK Analog ve potansiyel metabolitlerin yanı sıra parçalanma ürünleri ile ilgili veri sağlar. Lekelerin görünürleştirilmesinde kullanılan sprey reaktifler olası kolorimetrik tayin için fikir verebilir. Kantitatif sonuçlar için uygun değil (!) Plazma analizi için nadiren densitometre ile kullanılır. Densitometre, özellikle idrar numunelerinde ilaç suistimalinin araştırılmasında, kolay, ucuz ve kullanışlı bir yol ile incelemeye imkan sağlar.

22 HPLC Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için en uygun yöntemdir. Özellikle ters-faz sistemler (C8 ve C18 kolon ile) ayırma ve tayin başarıyla gerçekleştirilir. Metabolitler polardır ve ana bileşikten önce elüe olur. Kısa analiz süresi için yöntem optimize edilebilir. ph etkisi dikkate alınmalı, iyon çifti kromatografi uygulanabilir. Türevlendirme nadiren kullanılır

23 GC Uçucu olmayan veya labil bileşiklerin türevleri için uygulanır. Nonpolar sabit fazlar ( örn. OV-1) Seçici sabit fazlar (örn. OV-101) Türevlerin alıkonma karakteristikleri kullanılır. Cihaz karakteristikleri biyolojik analizler için uygundur. GC için bir yöntem geliştirilemiyorsa HPLC nin uygulanması da zordur.

24 Kütle Spektrometri Bileşiklerin kütle spektrumları standart koşullarda belirlenmelidir. KS nin bir cihaz olarak ilk uygulamaları biyolojik sıvılarda ilaç analizinde saflaştırılmış metabolitlerin karakterizasyonu ile ilgilidir. Daha sonra daha basit rutin işlemlerin spesifikliğini değerlendirmek için spesifik bir detektör olarak kullanılmıştır. Selective ion monitoring ve Tandem mass spectrometry nin kullanılması, KS nin spesifikliğinin analiz yöntemlerinde hayati olduğunu göstermiştir. Farklı tipteki iyonlaştırma işlemleri ve farklı türevler spesifik iyon verimini artırmak için kullanılır ve eğer spektrum elde edilebiliyorsa analitik profil derlemesinde yerini alabilir.

25 NMR BSİA için fazla değerli bir yöntem değildi. MS gibi, metabolitlerin karakterizasyonu için kullanılırdı. İzole edilen metabolitin miktarı cihazdaki analiz için yetersiz düzeyde olurdu. Modern yüksek alanlı cihazlar, bilgisayar teknikleri, NMR spektroskopisinin daha iyi anlaşılması ile NMR kullanımı temel teknikler arasında yer almaktadır.

26 Çözünürlük Belirli çözücüler kullanılarak ilacın çözünürlüğü incelenmelidir, böylece en iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenebilir. En uygun ekstraksiyon çözücüsü ilacın tamamını yada büyük bir kısmını endojen bileşik veya metabolitlerden çekip alan çözücüdür. Ekstraksiyonda geri kazanım düşük ise kesinlik de düşüktür Zayıf asit ve bazlar için ph seçimi önemlidir. ph-çözünürlük profili çıkarılmalıdır. Organik çözücü ile belirli bir ph deki tampon çözelti arasında ilacın dağılımı için organik faza geçen ilaç miktarı ölçülerek ph ya karşı grafiği çizilir. İlacın radyoaktif işaretlenmiş formu ile bu işlemleri yapmak özelikle düşük derişimlerde kolaylık sağlar.

27 İlginiz için teşekkür ederim.