Gen tedavisi, genetik defektlerin düzeltilmesi amacıyla

Transkript

1 XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma Gen tedavisi Dr. Ayşe Kars Gen tedavisi, genetik defektlerin düzeltilmesi amacıyla somatik hücrelere nükleotid dizilerinin aktarımı olarak tanımlanmaktadır, etik açıdan germ hücrelerine genetik madde aktarılması halen tartışmalı bir konudur. Bu tanıma göre gen tedavisi eksik genlerin yerine konması, yanlış veya fazla çalışan genlerin susturulması ve bazı genlerin işlevlerinin değiştirilmesini kapsar. Aslında klinikte kullanılan ilaçların çoğu gen düzeyinde kontrol sağlamaktadır. Aspirin ve benzeri non steroidal antiinflammatuar ilaçlar Cox- 1 ve Cox-2 genlerini inhibe etmekte, ve Cox-2 inhibisyonu ile tümör proliferasyonu, anjiogenez baskılanmaktadır. Bu özelliği nedeniyle aspirin, kolon kanseri kemoprevansiyonunda kullanılmaktadır. Kolesterol sentezinde ve Ras onkogeni sinyal iletiminde rol oynayan farnezil transferaz enzimini inhibe eden ilaçlar lösemi ve akciğer kanserlerinin tedavisinde önem kazanmaktadır. Son 25 yılda özellikle moleküler biyolojide, rekombinan DNA tekniklerinde kaydedilen gelişmeler, gen tedavisini kuramsal bir kavram olmaktan çıkarıp, uygulanabilir bir yöntem haline getirmiştir. Gen tedavisi, kistik fibrozis, Fanconi anemisi gibi tek gen defektinin söz konusu olduğu kalıtsal hastalıklarda yoğun araştırma konusudur. İlk faz 1 gen tedavisi klinik deneyi 1990 da adenozin deaminaz (ADA) enzim eksikliği olan bir kız çocuğuna uygulanmıştır. Bu enzimin eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan ciddi kombine immün yetmezlik sendromu çok nadir görülen bir hastalık olmasına karşın, hastalığa neden olan ADA geninin klonlanmış olması; genin in vitro koşullarda kolayca aktarılabileceği hematopoietik hücrelerin kemik iliği, hatta çevre kandan kolayca elde edilebilir olmaları; genin aktarıldığı hedef hücre olan T lenfositlerde %10 düzeyinde ekspresyon sağlanması durumunda bile etkinlik olması ve bu hücrelerin bozuk T lenfositlere göre yaşama şanslarının daha fazla olması ve son olarak bu hastalığın çok kötü gidişli ve tedavisi olmayan bir hastalık olması gibi nedenlerle seçilmiştir. Kalıtsal genetik hastalıkların tedavisi amacıyla yılları arasında 100 gen tedavisi protokolu onay almıştır. Bunların hepsi faz 1 çalışma niteliğinde olup, terapötik etkinlikten çok, kullanılan yöntemlerin toksisitesini belirlemeye yöneliktir. Bu çalışmalarda tedavi edilen başlıca genetik hastalıklar; ADA eksikliği, kistik fibrozis, hemofili B, alfa-1 antitripsin eksikliği, Fanconi anemisi, Gaucher hastalığı, Hunter sendromu ve LDL-reseptör eksikliği olan ailesel hiperkolesterolemidir. Gen tedavisi, kalıtsal hastalıklar dışında kardiyomyopatiler, nörolojik hastalıklar, kanser ve AIDS de uygulanmaktadır, kanser tedavisine yönelik gen tedavi protokollerinin çoğunluğu oluşturması dikkat çekicidir. Çok aşamalı bir süreç sonunda çok sayıda gen değişikliğinin birikimiyle ortaya çıkan kanser, aslında gen tedavi yaklaşımı için uygun bir hedef gibi görünmemektedir. Kanserli hücrelerde mevcut genetik bozukluğu tümüyle düzeltmek veya organizmada bulunan tüm kanser hücrelerini hedeflemek var olan teknoloji ile şimdilik olanaksızdır. Bununla birlikte kanserde gen tedavi stratejileri halen uygulanmakta olan tedavi yöntemlerine destek olmak, etki ve seçiciliklerini arttırmak gibi hedefler taşımaktadır. Gen tedavisi geliştirme programlarında en çok vektör tasarımında, bunu izleyerek genin regülasyonu ve immün yanıtın engellenmesinde sorun yaşanmaktadır. Gen transfer modelleri Genetik madde hücreye fiziksel, kimyasal yöntemler ve viral vektörler kullanılarak gönderilebilir. Gen tedavi modellerinde en önemli sorun vektörlerin uygun hücreye yönlendirilebilmesidir. Yaygın olarak kullanılan gen transfer sistemlerinin özellikleri tablo 1 de özetlenmiştir. DNA ve oligonükleotidler memeli hücrelerine, ex vivo veya in vivo olarak değişik vektörler kullanılarak yerleştirilebilir. Retrovirüsler, adeno-assosiye virüs (AAV), adenovirüs, herpes simpleks virüs en sık kullanılan virüsler olup, lentivirüsler, insan sitomegalovirüs, alfa-virüs ve herpesvirüs saimiri geliştirilmekte olan diğer viral vektörlerdir. Non-viral yöntemler arasında katyonik lipozomlar ve reseptöre yönlendirilen polilizin DNA kompleksleri en çok kullanılan vektör sistemleridir. Vektör tasarımında emniyetli gen aktarımı, in vivo gen aktarımında etkinliğin sağlanması, transdüksiyondan sonra gen kontrolünün sağlanması gibi aşılması gereken sorunlar mevcuttur. Kalıtsal hastalıklarda ve kanserde vektör, hücrelere aktarım in vitro ortamda yapıldıktan sonra vücuda verilmektedir ancak kistik fibroziste inhalasyonla adenovirüslar, katyonik lipozomlar veya AAV gibi vektörler, in vivo olarak akciğere yönlendirilmektedir. In vivo aktarımda yeterli terapötik etki oluşturma konusunda kuşkular mevcuttur. In vivo gen aktarımında, adenovirüsler, AAV ve lentivirüsler bölünmeyen hücreleri infekte edebilmeleri nedeniyle retrovirüslerin seçiciliğinden yoksun olup kanserli hücrelerin yanısıra normal hücreleri de infekte etme tehlikesi taşırlar. Çeşitli yöntemlerle vektörlerin seçiciliğinin artırılması ile bu sorunun üstesinden gelinebilir. Adenovirüslerin konakçıda immün yanıt uyarması aktarılan genin kısa ömürlü olmasına yol açmaktadır. Lipozomal vektörlerin toksisitesi düşüktür ama DNA ya integre olmadıkları için uzun süreli ekspresyon sağlanamamaktadır ve in vivo uygulama güçlükleri vardır. 59

2 Gen tedavisi In vitro uygulamalar daha emniyetli olmakla birlikte in vivo yöntemlere göre dezavantajları vardır. Gen aktarımı yapılacak hücrelerin cerrahi yöntemle çıkarılması, in vitro olarak hücrenin transdüksiyonu ve daha sonra hastaya verilmesi hasta açısından rahatsızlık ve ekonomik sorun yaratmaktadır. Viral vektörler Retrovirüsler RNA genomlarının DNA kopyasını ters transkriptaz enzimleri ile sentezleyerek konakçı hücrenin DNA sına integre olan retrovirüsler, viral vektörlerin prototipleridir. Çoğalma yeteneklerinin ortadan kaldırılması için özel yöntemler uygulanmaktadır. Yapısal genler olan gag, pol, env iki ayrı plazmid üzerinde ve virüsün kendi RNA sını sentezledikten sonra viral zarfın içine konmasını (paketlenmesini) sağlayan Ψ sekansı olmaksızın yardımcı hücreye gönderilmektedir. Bu yolla virüsün bağımsız çoğalması engellenirken, yapısal elemanlarını sentezlemesi sağlanır. Transdüksiyonu amaçlanan gen, Ψ sekansı ile aynı plazmidde yardımcı hücreye gönderildiğinde bu plazmidin taşıdığı genin virüsun zarfı içine girmesi sağlanmaktadır (Şekil 1). Böylece virüsün gerçek bir retrovirüs olarak çoğalması engellenirken istenen geni sentezleyen bir üretici hücre oluşturulmaktadır. Üretici hücrede retrovirüs vektörler kullanılarak yüksek titrede vektör üretimi başlatılmaktadır. Şekil 1. ψ Sekansı eksikliğinde viral partiküller kapside giremez. ψ Sekansı ile aynı plazmid üzerinde bulunan gen viral kapside girebilir. Retrovirüsler DNA ya integre oldukları için kalıcı, uzun süreli infeksiyon sağlamaktadır. Deneysel modellerde retroviral vektör 10 8 hücrede transdüksiyon sağlayabilmektedir. Kuramsal olarak retrovirüsün DNA nın rastgele bir bölgesine integrasyonu mutajenik bir etkiye yol açabilir bu çok nadir görülen bir durumdur ama gen tedavisi konusunda ciddi engel yaratmıştır. Retrovirüsler konakçıda immün tepki oluşturmadıkları halde kompleman ile hızla yıkılabilirler ve bu özellikleri bir dezavantaj oluşturmaktadır. Küçük olmaları nedeniyle taşıyabilecekleri genetik madde 4-8 kb kadardır. Retrovirüsler nükleer membrandan geçemedikleri için sadece bölünen hücrelere integre olabilirler. Retrovirüslerin HIV dahil bir alt grubu olan lentivirüsler bölünmeyen hücrelere integre olabilmektedirler. Lentivirüslerin çoğalmalarını sağlayan ve konakçıya zararlı diğer genleri de çıkarıldıktan sonra retrovirüslerle kimerik vektör sistemleri geliştirilebilir. Lentivirüslerin güvenilir bir vektör sistemi haline gelmesi için daha çok çalışmaya gereksinim olduğu bilinmektedir. Adenoviral Vektörler Retrovirüslerle birlikte en gelişmiş gen aktarım sistemlerinden birini oluştururlar. Çift sarmal DNA virüsleri olup, genomları 36 kb dır ve 49 serotipi mevcuttur. Deneysel modellerde ciddi hastalık ve tümör yapmadıkları için vektör sistemlerinde en çok 2. ve 5. serotipler kullanılmaktadır. Adenoviral vektörler, 1990 da ilk gen transfer deneyleri ile birlikte kistik fibrozisin gen tedavisinde akciğer dokusuna afiniteleri nedeniyle kullanılmışlardır. Bölünmeyen hücrelere genetik materyali nakletme yetenekleri nedeniyle ailesel hiperkolesterolemide, nörolojik ve kardiyovasküler sistem hastalıklarında kullanılmaları amacıyla çalışmalar yapılmaktadır. İmmünojeniteleri nedeniyle konakçıda inflammasyon ve toksik tepkilere yol açabilmektedirler. Bu etkilerden sorumlu olan E2 geni çıkarılarak vektör üretme çalışmaları yapılmaktadır. Adenovirüslerle yüksek titrede vektör oluşturulabilmekte (10 12 pfn/ml) ve 7-8 kb genetik madde taşıyabilmektedirler. Adenovirüs genomundan daha fazla gen çıkarılarak kapasiteleri arttırılmaktadır. Adeno-retrovirüs vektör kimeraları oluşturularak her iki sistemin avantajları birleştirilmeye çalışılmaktadır. Adeno-assosiye Virüs Gen tedavisinde sık kullanılan en küçük virüstür. Küçük olduğu için normalde bile çoğalmak için yardımcı virüse gereksinim duyar ve taşıyabileceği genetik madde küçüktür (4kb). Bölünmeyen hücrelere genomunu integre edebilmektedir. Normal virüsün 19. kromozom q kolunda özgün integrasyon bölgesi olduğu halde vektör halindeyken bu özellik kaybolmaktadır. Bu bölgeye affinite virüsün kendi genleri olduğu sürece korunmaktadır. Hepatosit ve nöronlara integre olabilir. Herpes virüs ve Vaksiniya virüs Büyük genomik yapıları nedeniyle vektör hazırlanması zor ve sıkıntılı bir süreçtir. Herpes virüsün nörotrop olması bir seçicilik yaratır. Bu virüslerle gen tedavisi kısa süreli ama yüksek titrede sağlanabilmektedir. İmmünojeniteleri ve sitopatik özellikleri sınırlayıcı faktörlerdir. Katyonik lipozomlar ve diğer non viral vektör sistemleri DNA ya integre olmadıkları için kısa süreli tedaviler için uygun olan katyonik lipozomlar değişik işlemlerle sınırsız genetik madde taşıyabilmektedirler. Oligonükleotidlerin taşınmasında kullanılmaktadırlar. Katyonik lipozomlar kistik fibrozis faz 1 çalışmalarda kullanılmıştır. Diğer non-viral vektör sistemleri reseptör aracılığıyla hücreye girip DNA bağlayan elemanlar, reseptörleri hedefleyen molekülleri kapsar. İnfeksiyöz olmadıkları için toksisiteleri düşüktür. Düşük titrede ve geçici gen ekspresyonu yapmaları dezavantajlarıdır. Reseptör hedefleyen sistemlerin avantajı hedefe seçicilik sağlayabilmeleridir. Örnek olarak folat reseptörlerinin yoğun olarak bulunduğu over kanser hücrelerine yönelik hazırlanan folat kapsayan vektörler bu tür bir seçicilik örneği oluşturmaktadırlar. Asialoglikoprotein-polilizin molekülünde, polilizinin pozitif yükü nedeniyle plazmid DNA bağlama ve asialoglikoproteinin, sialik asidlerini kaybetmiş proteinler için reseptörleri olan karaciğer hücrelerince bağlanma özellikleri kullanılarak, nonviral bir vektör sistemi oluşturulmaktadır. Hücreye giren DNA nın kalı- 60 XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma

3 A. Kars cılığının sağlanması hala çözümlenemeyen bir sorundur, bunda DNA nın büyük olasılıkla episomal bir yapı olarak taşınması rol oynamaktadır. Çıplak DNA ise çizgili kasa enjekte edildiğinde şaşırtıcı olarak 1 yıl süre ile eksprese edilmekte ve kas dokusu bir gen fabrikası gibi kullanılabilmektedir. Tablo 1. Başlıca vektör sistemlerinin özellikleri Vektörler Özellikler Dezavantajlar Retrovirüsler Adenovirüslar Adeno-assosiye virüsler Lentivirüsler Katyonik Lipozomlar Yüksek titre ( cfu/ml) Bölünen hücrelere gen transfer ve integrasyon oranı yüksek, stabil ekspresyon. Toksik etki yok. 4-8 kb transfer edilebilir. Çok yüksek titre (10 10 pfu/ml) Geçici olarak yüksek düzeyde gen ekspresyonu. Bölünmeyen hücreleri infekte edebilir. 7-8 kb transfer edilebilir. Rastlantısal insersiyona bağlı mutajenite olasılığı. Homolog rekombinasyon sonucu çoğalabilen virüs ortaya çıkabilir. Konakçıda immün yanıt uyardığı ve integrasyon olmadığı için uzun süreli ekspresyon olmaz. Genomu komplikedir. Bölünen ve bölünmeyen hücreleri Yüksek titrede hazırlamak infekte edebilir. zor; yardımcı virüse Latent infeksiyon insan 19. (adeno veya herpesvirüs) kromozunda, vektörde bu bölgeye gereksinim duyuyor. affinite kayboluyor. Patojen ve toksik Genomik madde taşıma değil. kapasitesi düşük (4kb). Genom 5kb çok küçük. Bölünmeyen hücreleri infekte Serum da HIV-1 e edebilirler. Virüse VSV veya retrovirüs dönüşebilir. İnsersiyonel zarfı takılabilir ve hücre tropizmi mutagenez olasılığı var. genişletilebilir. HIV-1 de olan tat, rev ve İntegrasyon nedeniyle stabil gen bazı yardımcı proteinlerin ekspresyonu (10 kb genomik transfer genleri var. mümkün İnfeksiyöz değil. Toksisitesi düşük. Aktarılacak DNA kapasitesi teorik olarak sınırsız. Kanserde gen tedavisi stratejileri Hedefe özgüllük yok. Transfeksiyon düşük ve geçici, in vivo uygulama zor. Kanserin çok aşamalı ve kümülatif özellik gösteren bir süreç sonunda ortaya çıkması ve çok sayıda genomik değişiklik içermesi gen tedavisi için uygun olmadığı izlenimi vermekle birlikte, halen gen tedavi protokollerinin büyük çoğunluğu kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılan başlıca stratejiler tablo 2 de özetlenmiştir. Tablo 2. Kanserde Gen Tedavisi Stratejileri 1. Gen işaretleme 2. İmmünmodülasyon-Kanser aşıları, polinükleotid immünizasyon 3. Biyoterapötik gen tedavisi 4. Normal doku toleransının artırılması 5. Seçici ilaç aktivasyonu- intihar genleri 6. Genetik defektin düzeltilmesi Onkogenler için antisens oligonükleotidler Tümör baskılayıcı genler için normal gen kopyaları Kanserli dokularda viral yöntemlerle transdüksiyon normal dokulara göre daha başarılı olmaktadır. Viral vektörler kanserli doku kültürlerinde her yönde kolayca yayılmakta ve infekte olmayan hücrelerde de bystander etki nedeniyle ölüm sağlanabilmektedir. Bunun yanısıra tek gen lezyonunun düzeltilmesi bile oldukça etkili yanıta yol açmakta ve tümörde gerileme sağlanabilmektedir. Gen İşaretleme Yöntemi İlk gen aktarımı deneylerinden olan gen işaretleme yöntemi, T lenfositlere neomisin direnç geninin aktarımını takiben işaretli hücrelerin izlenmesidir. Bu deney, gen aktarımının sürekliliğinin gösterilmesi açısından önem taşımaktadır ve kemik iliği aktarımı yapılan hastalarda, özellikle otolog nakillerde relaps durumunda hastalığın aktarılan hücrelerden kaynaklandığının gösterilmesi ve minimal rezidüel hastalığın izlenmesinde yararlı olmuştur. Genetik İmmünmodülasyon Tümör immünolojisi konusunda bilgilerin birikimi sonucu, immün sistemin tümör antijenlerini tanıyıp tümör hücrelerinin öldürülmesini amaçlayan gen tedavi stratejileri geliştirilmeye başlanmıştır. Bu başlık altında aktif ve pasif immünoterapi bulunmaktadır. Pasif immünoterapide, tümör hücrelerinin yüzeylerinde tip- I HLA molekülerince taşınan peptidler aracılığıyla T-hücre bağımlı hücresel bağışıklık uyarılması kullanılan bir yöntemdir. Bu küçük protein parçaları, peptid transkripsiyon birimlerinin vektörler aracılığıyla tümör hücrelerine transdüksiyonu ile sentezlenmektedir. Bu amaçla kanser hücreleri veya tümör infiltre eden lenfositler in vitro koşullarda hazırlandıktan sonra hastaya geri verilmektedir. Pasif immünoterapi çalışmaları, lenfositlere IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF, GM-CSF gibi sitokin genlerinin aktarımı ile CD8+ tümör infiltre eden lenfositlerin, antikor/t hücre reseptör kimerik genleri ile transdüksiyonundan sonra tümörlere yönlendirilmeleri konularında yoğunlaşmıştır. Sitokinlerin sistemik kullanımında hipotansiyon vb. istenmeyen yan etkiler nedeniyle tümörlü bölgeye yönlendirilen sitokin salınımı hem yerel etki sağlamakta hem de antitümör etkiyi ve tümöre karşı immünlojik savunma sistemlerini güçlendirmektedir. Bu amaçla otolog tümör hücreleri, fibroblastlar, tümör infiltre eden lenfositler kullanılmaktadır. GM-CSF hematopoietik öncü hücreleri, antijen tanıtıcı hücre olan dendritik hücrelere dönüştürür ve immünojeniteyi arttırır. Lenfositlerin, tümör antijenlerini tanıması için antijen-majör doku uygunluk kompleksi (MHC) ile kostimülatör moleküller, örneğin B7-1 ve 2 etkileşimleri gereklidir. Tümör hücrelerinde bu moleküllerin olmayışı immün yanıtın oluşmasını engeller. Tümör hücrelerinin B7-1 ve 2 ile transfeksiyonu immünojenitelerini arttırmakta kullanılmaktadır. Tümör antijenlerinin ve onları kodlayan genlerin belirlenmesi ile tümör hücrelerine bu genlerin transfeksiyonu ve dolayısı ile daha immünojenik olmaları sağlanabilmektedir. Bu bir aktif immünizasyon yöntemidir. Malign melanomda, MART- 1 antijeni bu amaçla kullanılmaktadır. Sitokinler ve kostimülatör moleküllerde bu amaçla kullanılmakta olmalarına rağmen, tüm bu yöntemlerin ışınlanmış tümör hücrelerinin verilmesinden daha etkili olduklarına dair veri yoktur. Normal doku toleransının arttırılması İlaç direnci ve normal dokuların ilaçlara duyarlı oluşu kemoterapötiklerin başarısız olmalarında en önemli etkenlerdir Mayıs

4 Gen tedavisi Tümör hücrelerini daha yüksek doz ilaçla öldürmek mümkün olsa bile normal doku toleransının aşılması bu yöntemi geçersiz kılmaktadır. Çoklu ilaç direnç geni (MDRI) hematopoietik kök hücrelere transfekte edildiğinde kemik iliği kemoterapötiklere dirençli hale gelmekte ve yüksek doz ilaç kullanmak mümkün olmaktadır fakat bu kez ilik-dışı organ toksisitesi sınırlayıcı olabilmektedir. Seçici ilaç aktivasyonu Kanser hücrelerine yerleştirilen özel intihar genleri aracılığıyla sistemik olarak verilen ve organizmaya toksik olmayan ilacın, sadece bu geni taşıyan hücrelerde aktivasyonu ve seçici toksik etki sağlanması stratejisidir. Kemoterapötiklerin klasik uygulanması sırasında normal doku-kanser dokusu arasında seçiciliğin olmaması ve ortaya çıkan yan etkiler bu yöntemi çekici hale getirmektedir. En çok kullanılan model herpes simpleks virüs tip I timidin kinaz (HSV-tk) genidir. Çoğalan hücrelere affiniteleri nedeniyle tercihen retrovirüsler kullanılarak kanserli dokulara HSV-tk transfeksiyonu yapıldıktan sonra, memeli timidin kinaz enziminin iyi bir sübstratı olmadığı için normal dokuda toksik olmayan gansiklovir sistemik olarak verilir. Sistemik gansiklovir HSV-tk geni olan hücrelerde sitotoksik gansiklovir trifosfata metabolize olup hücreleri öldürmektedir. Genin bulunmadığı uzak ve yakın kanser hücrelerinin ölmesi, bystander etkiye bağlanmaktadır. Uzak hücreler için immünolojik mekanizmalar, örneğin apoptozise uğrayan kanser hücrelerinin kalıntılarının antijen-sunan hücreler tarafından immün sisteme tanıtıldığını düşündürmektedir. Bu yöntemin aynı zamanda immünmodülasyon yöntemi olarak çalıştığı öne sürülebilir. Ölen tümör hücrelerine komşu ve transdüksiyonun olmadığı diğer kanser hücrelerinde ise farklı bir bystander etki, toksik metabolitin hücreden hücreye kanallar aracılığı ile geçmesi ile ortaya çıkmaktadır. HSV-tk modeli ile gen tedavisi, beyin tümörleri, mezotelyoma, akciğer kanseri, kolon kanseri, lenfoma ve lösemilerde uygulanmaktadır. Sitozin deaminaz, bakteri ve mantarlarda bulunan fakat memelilerde bulunmayan bir enzimdir. 5-fluorositozinin amin grubunu alarak toksik 5-fluorourasil haline getirir. Bu gen de intihar geni olarak kullanılmaktadır ve tümör hücrelerine yerleştirildiğinde selektif toksisite sağlamaktadır. Bu toksisiteyi daha selektif hale getirmek için bazı yöntemler geliştirilmektedir. Kolon kanser hücrelerinde bulunan karsinoembryonik antijen (CEA) geninin transkripsiyon kontrol bölgesi ve sitozin deaminaz geni kullanılarak kimerik gen oluşturulup 5-fluorositozin sistemik olarak verilerek sadece CEA taşıyan kanser hücrelerinde aktive olması sağlanmaktadır. Bu stratejide kullanılan diğer ilaçlar ve enzimler tablo 3 te özetlenmiştir. Tablo 3. İntihar genleri Gen Toksik metabolit Bystander etki HSV-tk GCV GCV trifosfat + Sitozin deaminaz 5FC 5FU + GPT 6-thioguanin 6tg-trifosfat + VZV-tk Ara M Ara M-MP? B-laktamaz Vinka sefaloid vinka alkaloid? Genetik defektin düzeltilmesi stratejisi Tümör Baskılayıcı Genler Mutasyonlar veya kromozomal kopmalar, kayıplar sonucu bazı genlerin eksikliği tümör oluşması sürecinde etkili olabilir veya tümörün hızla büyümesine yol açabilir. Tümör baskılayıcı genler çekinik özellik gösterdiği için söz konusu genin her iki kopyasının da kaybı gereklidir. Bu durumda kuramsal olarak eksik genin yerine konması bu süreci durdurabilir veya yavaşlatabilir. Bir çok tümörde p53 geninin mutasyonu bilinmektedir, p53 geni 393 aa ten oluşan bir fosfoprotein kodlamaktadır ve bu protein büyük-t antijeni ve EIB gibi viral proteinlerle kompleks oluşturabilmektedir. Bu kompleksler p53 ün işlevsel olarak etkisiz hale gelmesine yol açabilmektedirler. Missens mutasyonlar veya p53 ün belli bölgelerinin çeşitli proteinlerle etkileşimi DNA ya özgül bir şekilde bağlanan oligomerlerin ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Bu mekanizmaların herhangi birisi p53 ün işlev kaybına ve dolayısıyla transformasyona veya tümörün hızlı büyümesine yol açabilir. Retroviral-p53 vektörleri kullanılarak akciğer tümör hücre dizilerinde büyümenin baskılandığı çalışmalar bildirilmiştir. Deneysel tümör modellerinde p53-adenoviral vektörler, Rb genleri veya p16 gibi tümör baskılayıcı genlerin ürünleri kullanılarak tümör büyümesinin baskılanabildiği bilinmektedir. Over ve meme kanserinde sıklıkla mutasyona uğrayan BRCA-1 geninin, normal kopyasının gen teknolojisi ile transferinin sağlandığı modellerde, tümör büyümesinin baskılandığı veya gerilediği de bildirilmektedir. Bu nedenle over ve meme kanserinde BRCA-1 ile yürütülen faz 1çalışmalar vardır. Aktif onkogenlerin baskılanması Kanserlerin çoğunda ras, myc, fos gibi dominant onkogenlerde mutasyon veya ekspresyon artışı olduğu bilinmektedir. Bu genlerin çalışmaları DNA düzeyinde oligonükleotidlerle üçlü sarmal oluşturularak engellenebilir. Bunun için hedeflenen genlerin regülatör bölgelerine yönelik oligonükletid şeriti çift sarmal DNA ile bu özgül bölgelerde birleşerek DNA yapısını bozar. Myc, H-ras ve epidermal büyüme faktörü reseptör geninin başlatıcı kontrol bölgelerine yönelik tripleks-oluşturan oligonükleotidler kullanılmaktadır. Gen ürünü olan proteinlerin sentezinin baskılanması ise yine antisens oligonükleotidlerle mrna düzeyinde sağlanmaktadır. Ribozimler mrna yı endoribozomal olarak parçalayan enzimlerdir. Çekiç başlı ribozimler kıvrılma özellikleri nedeniyle bu şekilde adlandırılırlar, ve hedef RNA yı GUA, GUC veya GUU kodonlarının bittiği yerden parçalarlar. Ribozimlerle hedeflenen dominant onkogenler H-ras ve bcr-abl füzyon geni mrna larıdır. Endoplazmik retiküluma yerleştirilen tek zincirli antikor molekülleri ile hedef proteinler tutulup, hücre yüzeyine erişmeleri engellenerek otokrin büyüme faktör döngüsü ve dolayısıyla tümör büyümesi engellenebilir. Çeşitli büyüme faktörlerinin hücre düzeyinde reseptörlerinin sentezini mutasyonlu gen kopyaları ile bozmak benzer bir yaklaşımdır. 62 XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma

5 A. Kars Gen tedavisinde vektörün hedefe yönlendirilmesi ve seçicilik Mevcut vektörlerin gelişme aşamaları ve çeşitleri tedavide etkin bir şekilde kullanılmaları için yeterli değildir. Bunu sağlamak için, vektörün hedefe yönlendirilmesi, dokuya özgül promoterler kullanılması, vektörün verilme yolu, reseptörlerin modifikasyonu gibi aşamalarda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Viral vektörlerin, doku tropizminden kaynaklanan seçiciliklerinden yararlanılmaktadır. Adenovirüsler akciğer epiteli ve karaciğer parankimine yönelik tropizm gösterirler. Retrovirüslerin doku tropizmi yoktur ama bölünen hücrelerin DNA sına integre olmaları nedeniyle seçicilik göstermektedirler. Herpes simpleks virüsü birçok hücreyi infekte eder ama nöronlardaki infeksiyonları uzun süreli olmaktadır. Retrovirüslerin zarflarında değişiklikler yapılarak hedef hücrelere affiniteleri arttırılabilir. Non-viral vektörlerin özgüllükleri moleküler konjugatlar ve protein/dna kompleksleri kullanılarak arttırılabilir. Folat reseptörünü eksprese eden over kanser hücrelerine yüzeyinde folat bulunan vektörler kullanılarak seçicilik arttırılabilir. Asialoglikoprotein-polilizin molekülünde, asialoglikoproteinin, sialik asidlerini kaybetmiş proteinler için reseptörleri olan karaciğer hücrelerince bağlanma özellikleri kullanılarak, nonviral seçici bir vektör sistemi oluşturulmuştur. EGF/DNA kompleksleri, yüzeylerinde epidermal büyüme faktörü reseptörü taşıyan akciğer kanseri hücreleri tarafından hızla tutulur, burada reseptör aracılığıyla olan endositoz söz konusudur. Dokuya özgül promoterler kullanılarak hedefe yönlendirme daha etkili hale getirilebilmektedir. Kanser hücrelerine özgül CEA, AFP ve benzeri tümör belirleyicilerin promoter bölgeleri, intihar genleri olan TK, CD ile kimerik gen oluşturularak hedefe gönderilir. Bu genler seçici olarak tümör belirleyicilerin promoter bölgelerini aktif hale getiren transkripsiyon faktörleri ve proteinleri sitoplazmalarında barındıran kanser hücrelerinde çalışır duruma geçebilirler. Vektörlerin veriliş yolu ile seçicilik sağlamanın örnekleri, beyin tümörlerinde intrakraniyal, akciğer kanseri ve mezotelyomada, intraplevral ve over kanserinde intraperitoneal yolun kullanılmasıdır. Gen tedavisi ve kanserin ilaçlarla tedavisinde, ilacın verilmesi, hedefe ulaşması, seçiciliği ve etkisi gibi bazı ortak sorunlar vardır. Bu sorunlar kanserin genetik kökenleri ve kanser hücresinin biyolojisinin anlaşılmasıyla daha kolay aşılabilecektir. Bu konuda çalışmaların vektör tasarımı teknolojisine yoğunlaşmış olması, vektörlerin transgenlerini daha çok tümör hücresine aktarmalarını sağlamak ve tümör hücrelerinde tedavinin seçiciliğini arttırmayı hedeflemektedir. Bununla birlikte vektörler, gen transferi ve ekspresyonu konusunda bilinmeyenler, bilinenlerden daha fazladır. Sonuç olarak gen tedavisinin genel kabul gören tıbbi tedavi konumuna gelmesi için: 1. Vektör raftan alınıp hastaya injekte edilebilmeli ve bu vektör metabolik bozukluğun bulunduğu dokuya hedeflenmiş olmalıdır. 2. Vektör hücreye ulaştığı zaman ya kromozomda emniyetli bir bölgeye yerleşmeli veya bozuk gen ile homolog rekombinasyon sonucu doğru yere oturmalıdır. 3. Aktarılan gen metabolik değişikliklere uygun yanıt verebilmelidir. Örnek olarak kan şekeri değişikliklerine uygun yanıt verecek insülin genleri gibi. Bu koşullar sağlandığı zaman gen tedavisi, ilaç tedavisinin yüksek teknolojik uygulaması haline gelecektir. Tüm güçlüklere ve bilinmeyenlere karşın önümüzdeki yüzyıl gen tedavisinin yaygın kullanılacağı bir dönem olmaya adaydır. Kaynaklar 1. Berns A. Good news for gene therapy N Engl J Med 350; , Kay MA, Glorioso JC, Naldini L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Med 7:33-40, Marchisone C, Pfeffer U, Del Grosso F ve ark. Progress towards gene therapy for cancer. J Exp Clin Cancer Res 19(3): , Rustgi AK. Cyclooxygenase-2: the future is now. Nature Med 4: , Brenner MK. Gene Transfer and the treatment of haematological malignancy. J Int Med 249: , Dilber MS & Gahrton G. Suicide gene therapy: possible applications in haematopoietic disorders. J Int Med 249: ,2001 Gen tedavisinin etik yönü ve geleceği Halen gen aktarımı germ hücrelerine değil, somatik hücrelere yöneliktir. Genel olarak in vitro koşullarda aktarılan geni taşıyan hücreler hastaya daha sonra verilmektedir. Tedavi olanağı kısıtlı veya olmayan ciddi hastalıkların gen tedavisi etik kurallara uymaktadır. Genetik hastalıkların tedavisinde germ hücrelerinin manipülasyonu durumunda kişinin genetik yapısının parçası olacak bu değişiklik çocuklarına da aktarılacaktır, bu sakıncalı olabilir. Genetik mühendislik yöntemleri ile somatik hücrelerde ve hatta germ hücrelerinde yapılabilecek değişikliklerle boy, göz rengi ve zeka gibi özelliklerle oynamak ilerde mümkün olabilir ama bu tür yaklaşımın yoğun tartışmalara yol açacağı kesindir. Gen tedavisinin somatik hücrelere yönelik ve ciddi hastalıklarla sınırlı kalması bugün için en uygun durumdur Mayıs