SÜT İNEĞİ RASYOLARINDA 2-HYDROXY-4-(METHYLTHİO) BUTANOİC ACİD İN İZOPROPİL ESTERİ (HMBi) NİN KULLANILMASI

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜT İNEĞİ RASYOLARINDA 2-HYDROXY-4-(METHYLTHİO) BUTANOİC ACİD İN İZOPROPİL ESTERİ (HMBi) NİN KULLANILMASI Alper ÇAĞLAYAN HAYVAN BESLEME VE BESLENME HASTALIKLARI ANA BİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Adnan ŞEHU ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜT İNEĞİ RASYOLARINDA 2-HYDROXY-4-(METHYLTHİO) BUTANOİC ACİD İN İZOPROPİL ESTERİ (HMBi) NİN KULLANILMASI Alper ÇAĞLAYAN HAYVAN BESLEME VE BESLENME HASTALIKLARI ANA BİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Adnan ŞEHU ANKARA

3 KABUL VE ONAY

4 ii ÖNSÖZ Tarihte ruminantlarda metiyonin ile ilgili çalışmalar 1960 lı yılların sonu ve 1970 li yılların başlarına dayanır. Abomasal, intestinal ve intravenöz çalışmaların yapıldığı o yıllarda metiyoninin ruminantlarda optimum düzeyde absorbe edilemediği görülmüştür. Bu çalışmalarda kükürtlü amino asitlerin koyunlarda yapağı gelişimi ve vücut büyümesi, sığırlarda ise süt verimini ve yine büyümeyi sağladığı, eksikliği halinde ise bu fonksiyonları sınırlandıran önemli bir amino asit olduğu gösterilmiştir. Bu sebeple çeşitli laboratuarlarda rumen korunmuş metiyonin ihtiva eden çeşitli ticari ürünler üzerinde çalışılmıştır. Bunu takip eden gelişme ise eksikliğinde kuzu ve buzağılarda büyümeyi ineklerde süt verimini sınırlandıran ikinci amino asidin lizin olduğu anlaşılmış ve korunmuş lizin üzerinde çalışmalara başlanmıştır. Metiyonin ve lizini ruminal parçalanmadan korumak için birçok yaklaşım denenmiştir. Başlangıçtaki girişimler metiyonini lipitler ile koruma üzerinde odaklanırken sık sık inorganik maddeler, karbonhidratlar, stabilizatör ve dolgu maddeleri kullanılmıştır. Örneğin 1960 lı yıllarda Kanada da Delmar Chemical firması, ortasında DL-Metiyonin olan koloidal kaolin ve tristearin ile sarılmış bir ürün geliştirmiştir. Bu ürün %20 metiyonin içermekteidi. Kısa süre sonra Norveç de ketonin isimli bağırsaklarda salınan kapsüle edilmiş metiyonin geliştirilmiştir ki bu ürün %30 DL-Metiyonin, %2 glikoz, %4 antioksidan, stabilizatör ve tatlandırıcı, %6 CaCO3, %58 tristearin ve oleik asit içermekteydi. O yıllarda en etkili yaklaşım metiyoninin yüzeyini enzime dirençli phduyarlı sentetik polimerler ile kaplamaktı. Bu polimerler yüksek ph da stabil fakat abomazumun düşük ph sında yüksek çözünürlüğe sahip maddelerdi. Bu yaklaşım enzim sistemlerinden bağımsız olarak rumen ve abomazum arasındaki ph farkı sayesinde rumen korunmuş ve bağırsakta salınım katsayısı diğerlerine oranla daha yüksek olan ürünlerdir ve günümüzde ph duyarlı polimerler besin maddelerini ruminal parçalanmadan korumak amacı

5 ile Adisseo Inc. tarafından Smartamin M ticari ismi ile halen kullanılmaktadırlar. iii Ruminantlarda yeterli düzeyde metiyonini sağlamak amacı ile bulunan bir diğer metod ise metiyonin analogları ve türevleridir. Amino asit türevleri serbest amino asitlerin alfa amino gruplarına kimyasal engelleyici grup takılarak veya acyl grupları modifiye edilerek elde edilirler. Metiyonin türevleri örneklerinin (isopropyl-dl-metiyonin, t-butyl-dl-metiyonin, N-stearoyl-DL- Metiyonin, N-oleoyl-DL-Metiyonin ve capryl-caproylic-dl-metiyonin) ruminal parçalanmaya karşı bir miktar dirençli oldukları gösterilmiştir. Bununla birlikte post ruminal metiyonin miktarını vaat edildiği üzere yeterli düzeyde sağlayıp sağlayamadıkları konusunda henüz yeterli düzeyde araştırma yapılmamıştır. Metiyonin analogları ise amino asitin alfa amino grubu yerine nonnitrojen bir grup yerleştirilerek elde edilir. Örneğin hidroksil grubu. En sık çalışılan metiyonin analoğu ise metiyonin hidroksi analoğudur ve 2-hydroxy- 4-(methylthio)-butanoik asit (HMB) olarak isimlendirilir. Doktora eğitimim süresince bana Başkent Üniversitesi Hastanesi ve Per Çiftliğinin bütün imkanlarını sunan, gerek maddi gerekse manevi desteğini üzerimden hiç esirgemeyen çok değerli hocam Başkent Üniversitesi kurucu rektörü Sayın Prof. Dr. Mehmet HABERAL a en içten teşekkürlerimi bir borç bilirim. Doktora öğrenimim süresince ve tez çalışmamda bana her konuda destek veren ve yardımlarını esirgemeyen çok değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. Adnan ŞEHU ya, yine doktora öğrenimim boyunca ilgi ve alakasını esirgemeyen Prof. Dr. Şakir D. TUNCER, Prof. Dr. Ahmet ERGÜN e değerli hocalarım Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. İrfan ÇOLPAN, Prof. Dr. Seher KÜÇÜKERSAN, Prof. Dr. Sakine YALÇIN, Prof. Dr. Gültekin YILDIZ, Prof. Dr. Kemal KÜÇÜKERSAN, Doç. Dr. Pınar SAÇAKLI, tez izleme komitesi üyesi Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU na ve tez jürimde bulunan Prof. Dr. Behiç COŞKUN a teşekkür ederim.

6 iv Ayrıca doktora eğitimim süresince bana yardım ve desteğini esirgemeyen Atilla CİVELEKOĞLU na ve nezdinde tüm Per çiftliği çalışanlarına teşekkürü bir borç bilirim. Süt analizleri için imkan sağlayan Cengizhan YORUMAZ a, tezimin dizgisinde yardımcı olan Ayşegül GENÇ e de ayrıca teşekkür etmek isterim. Tüm hayatım boyunca en mutlu ve en sıkıntılı zamanlarımda yanımda olan beni yetiştirip bu günlere getirmek için her tür fedakarlığı yapan, benim için dünyanın en değerli insanları olan sevgili babam Yener ÇAĞLAYAN ve annem Ülker Suzan ÇAĞLAYAN a çok teşekkür ederim. Yine doktora öğrenimim süresince yardım ve desteğini esirgemeyen kız kardeşim Nilüfer DOĞAN ve değerli eşi Bület DOĞAN a teşekkür ederim. Çalışmamın her aşamasında manevi desteğini esirgemeyen değerli eşim Müge ÇAĞLAYAN a da ayrıca teşekkür ederim.

7 v İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ÖNSÖZ İÇİNDEKİLER SİMGELER VE KISALTMALAR ÇİZELGELER 1. GİRİŞ Genel Bilgiler Amino Asitler Süt Sığırlarında Sınırlandırıcı Amino Asitler Laktasyondaki Süt Sığırlarının Amino Asit İhtiyaçları Metiyonin kaynakları Korunmuş Metiyonin Kaynağı Olarak Kullanılan Ticari Ürünler Korunmuş Ürünlerin Bioyararlanım Değerleri Korunmuş Metiyonin Kaynağı Olarak Kullanılan Ticari Ürünler İçin Metiyonin Bioyararlanımı Metabolize Olabilir Metiyonin in Yeni Kaynağı HMB nin İzopropil Esteri: HMBi HMBi ile Beslemeden Sonra Kanda HMB nin Yükselişi HMBi ile Beslemeden Sonra Kanda Metiyoninin Yükselişi HMBi nin Emilim Mekanizması Metiyonin Hidroksi Analoglarının Rumen Mikro Organizmaları, Uçucu Yağ Asiti Sentezi ve Seluloz Sindirimi Üzerine Etkileri Metiyonin Hidroksi Analoglarının Süt Verimi, Süt Bileşenleri ve Plazma Metiyonin Düzeyleri Üzerine Olan Etkileri Metiyonin Hidroksi Analoglarının Lipid Metabolizması Üzerine Etkileri Metiyonin Hidroksi Analoglarının Kullanımı ile Yapılmış Diğer Çalışmalar Besi Sığırlarında Metiyonin Hidroksi Analoglarının Kullanımı GEREÇ VE YÖNTEM GEREÇ Hayvan Materyali Yem Materyali YÖNTEM Deneme Hayvanlarının Beslenmesi ve Deneme Süresi Araştırma Rasyonlarının Hazırlanması Karma Yemlerin Besin Madde Miktarlarının ve Metabolize Olabilir Enerji Düzeylerinin Belirlenmesi Süt Veriminin Belirlenmesi Süt Kuru Madde, Yağsız Kuru madde, Süt Yağı Süt Proteini ve Laktoz İçeriği Belirlenmesi Rumen Uçucu Yağ Asitlerinin Belirlenmesi Kan serumunda Glikoz, Üre Nitrojeni, Kreatinin ve Trigliserit Miktarlarının Belirlenmesi 26 i ii v vii viii

8 vi İstatistik Analizler BULGULAR TARTIŞMA Süt Verimi Düzeltilmiş Süt Verimi Süt Kuru Madde ve Yağsız Kuru Madde İçeriği Süt Yağ İçeriği Süt Protein İçeriği Süt Laktoz İçeriği Plazma Üre Azotu Kreatinin Glikoz ve Trigliserid İçeriği Rumen Uçucu Yağ Asiti İçeriği SONUÇ VE ÖNERİLER 65 ÖZET 68 SUMMARY 70 KAYNAKLAR 71 ÖZGEÇMİŞ 81

9 vii SİMGELER VE KISALTMALAR AOAC g HMB HMBi Kg ME MP PDI INRA NRC CNCPS Offical Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists Gram 2-Hydroxy-4-(Methylthio) Butanoic Acid 2-Hydroxy-4-(Methylthio) Butanoic Acid in İzopropil Esteri Kilogram Metabolize Olabilir Enerji Metabolize Olabilir Protein Ruminantlarda rasyon ile alınan ve ince bağırsaklara ulaşan sindirilebilir protein miktarı Institue National Reserch Agronomique National Reserch Council Cornell Net Karbonhidrat ve Protein Sistemi

10 viii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Süt sığırı rasyonlarında sıkça kullanılan ham maddelerin ince bağırsaklarda sindirilebilen metiyonin ve lizin konsantrasyonları 7 Çizelge 2.1. Araştırmada kullanılan konsantre yemin bileşimi 23 Çizelge 2.2. Deneme hayvanlarına verilen günlük yem miktarı 24 Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Denemede kullanılan kaba ve konsantre yemlerin besin madde bileşimi ve metabolize olabilir enerji değerleri 28 Denemede kullanılan kesif yemlerin hesapla bulunan ME ve besin madde değerleri 28 Çizelge 3.3. Deneme gruplarının deneme ortalaması süt bileşenleri 33 Çizelge 3.4. Deneme gruplarının haftalık ortalama süt verimleri 34 Çizelge 3.5. Deneme gruplarının %4 yağa göre düzeltilmiş haftalık ortalama süt verimleri 35 Çizelge 3.6. Deneme gruplarında haftalık süt kuru maddesi verimi ortalaması 36 Çizelge 3.7. Deneme gruplarının haftalık ortalama yağsız kurumadde verimleri 37 Çizelge 3.8. Deneme gruplarının haftalık ortalama yağ verimi 38 Çizelge 3.9. Deneme gruplarının haftalık ortalama süt proteini verimleri 39 Çizelge Deneme gruplarının haftalık ortalama süt laktoz verimleri 40 Çizelge Deneme gruplarının kan serumlarında glikoz,trigliserid, kreatinin ve üre azotu düzeyleri 41 Çizelge Deneme sonunda grupların rumen uçucu yağ asit düzeyleri 42

11 1 1. GİRİŞ 1.1. Genel Bilgiler Geviş getiren hayvanlarda rasyon ile alınan proteinleri iki gruba ayırabiliriz, birinci grupta rumende parçalanabilen ve mikro organizmalar tarafından kullanılan proteinler, ikinci grupta ise rumenden mikrobial sindirimden etkilenmeyen ve direkt olarak ince bağırsaklarda sindirilen korunmuş proteinlerdir (Kamalak ve ark., 2005). Ruminant rasyonları hesaplanırken 1980 li yılların öncesinde, ham protein yada görünür sindirilebilir protein kullanılırdı. Hayvanların genetik özelliklerinin yükselmesi ile birlikte verimlilik artmış ve özellikle 1980 lerin başında ruminant sindirim fizyolojisinde rasyonda gereksinim duyulan proteinin hesaplanması için ortak temel kavram olarak metabolize olabilir protein (MP) kullanılmaya başlanmıştır. Metabolize olabilir protein, rumen sonrası sindirilen gerçek protein ve ince bağırsaklardan emilen aminoasit bileşenleri olarak tanımlanmıştır. Rumende üretilen mikrobial protein, yem ile alınan korunmuş protein ve endojen ham protein bağırsaklarda metabolize olabilir proteinin kaynaklarıdır. Bu yüzden Fransa PDI sistemi gibi sistemler, protein ihtiyacının sindirilebilir protein üzerinden hesaplanmasını önermektedirler (Verite ve Peyraud, 1989) Amino Asitler Ruminantlarda amino asitler; rumende sentezlenen mikrobial proteinden, rumen korunmuş proteinden, ve endojen sekresyondan sağlanmaktadır. Bu kaynaklardan gelen proteinlerin emilebilmesi için mutlaka ince bağırsaklarda sindirilerek serbest amino asitlere parçalanması gerekir. Bu amino asitler doku ve süt proteininin sentezinde yapı taşı olarak kullanılırlar. Hayvan dokularında ve süt proteininde 20 amino asite rastlanmaktadır, bunlardan 10 tanesi esansiyel olarak dikkat çeker. Esansiyel amino asitler, esansiyel olmayanlardan farklı olarak hayvan dokularında sentezlenmesi mümkün

12 2 değildir veya hayvan dokularında metabolik ihtiyacı karşılayabilecek düzeyde sentezlenemezler. Ruminantların beslenmesinde amino asitler hedef gösterildiğinde, kalitatif ve kantitatif bileşenler bütün olarak ve alternatifsiz biçimde ele alınmalıdır. Tüm esansiyel ve nonesansiyel amino asitler metabolik düzeyde yeterli miktarda sağlanmalıdır. Kalitatif esansiyel amino asit ifadesi, esansiyel amino asitlerin büyüme ve laktasyon payı hariç emilen esansiyel amino asitlerin ideal profili ve miktarını içermektedir. Bu ideal esansiyel amino asit profili, süt sığırlarında sabittir. Fakat, bilinmektedir ki iki faktör duodenal proteinin amino asit içeriği üzerinde etkili olmaktadır. Bu faktörlerden biri, total proteine katkıda bulunan korunmuş protein miktarı ve diğeri ise korunmuş proteinin amino asit kombinasyonudur (Rulquin ve ark., 1998; NRC, 2001; Kamalak ve ark., 2005). Esansiyel amino asitler ideal profil ve miktarda emildiklerinde bunların etkisi ile protein sentezi en yüksek düzeylere ulaşmaktadır, aksi durum sözkonusu olduğunda ise ilk sınırlandırıcı amino asit proteinin sentezi sürecini belirleyecektir. Rasyon hazırlanırken etkin olarak intestinal amino asit profili dikkate alınırsa yüksek verimlilik sağlanabileceği gibi korunmuş protein ihtiyacı da azaltılabilir (Gransworthy ve Wiseman, 2004) Süt Sığırlarında Sınırlandırıcı Amino Asitler Metiyonin eksikliğinde birinci sınırlandırıcı amino asit olarak tanımlanmıştır, fakat lizin ve çoğunlukla histidin de sınırlandırıcı amino asitler olarak belirtilmektedir (Polan ve ark., 1991; Wu ve ark., 1997). Schwab ve ark. (1976), post ruminal amino asit infüzyonu tekniğini kullanarak metiyonin ve lizinin süt protein sentezi için çoğunlukla rasyonda birincil sınırlandırıcı amino asitler olduklarını göstermişlerdir. Takip eden birçok çalışma da amino asitlerin ya da rumen korunmuş metiyonin ve lizininin ayrı ayrı post ruminal infuzyonu yapılmış ve çalışmalar sonucunda ruminant rasyonlarında en önemli sınırlandırıcı iki amino asitin metiyonin ve lizin olduğu gösterilmiştir (Rulquin ve ark., 1993; Pisulewski ve ark., 1996).

13 3 Beklenildiği gibi, rasyonda bulunan korunmuş proteinin miktarı ve amino asit içeriği de sınırlandırıcı amino asitlerin ortaya çıkmasında takip eden çalışmalarda gözlenmiştir (Aikman ve ark., 2002; Trınacty ve ark., 2009; Schwab ve ark., 2011). Süt sığırlarının fazla miktarda kaba yem ya da soya temelli rasyonlarla beslenmesi sonucu metiyoninin süt protein sentezi için birinci sınırlandırıcı amino asit olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda metiyoninin süt sığırlarında birincil sınırladırıcı amino asit olduğu yapısal korunmuş protein kaynağı büyük ölçüde soya proteininine ya da hayvansal kökenli proteine veya her ikisinin kombinasyonu ile oluşmuş rasyonlar kullanılarak da gösterilmiştir. Soya küspesinin korunmuş protein ana kaynağı olarak kullanılması sonucunda metiyonin, açık bir şekilde sınırlandırıcı amino asit halini almıştır (Papas ve ark., 1984; Robert ve ark., 1995; Armentano ve ark., 1997; Yang ve ark., 2010). Mısır kaynaklı proteini rasyon protein bileşenlerinin ana kaynağını oluşturması durumunda ise lizin süt protein sentezini sınırlandıran birincil amino asit olarak karşımıza çıkar (Rulquin ve ark., 1990; Schwab ve ark., 1992). Süt sığırları mısır silajı temelinde ve düşük protein ilavesi ile beslenmeleri sonucunda metiyonin ve lizin birlikte sınırlandırıcı amino asit olarak tanımlanırlar (NRC, 2001). Metiyonin ve lizinin birlikte sınırlandırıcı rol oynaması aynı zamanda mısır hasılının enerji kaynağı olarak tek başına kullanıldığı ve soya küspesinin de tek protein kaynağı olarak kullanıldığı durumlarda da tanımlanmıştır (Donkın ve ark., 1989; Polan ve ark., 1991). Son zamanlarda çayır otu silajı ile birlikte arpa ve yulafın ilave edildiği rasyonlara tüy ununun korunmuş protein kaynağı olarak tek başına kullanılması durumunda yada kullanılmasa dahi histidin eksikliğinin, lizin ve metiyoninden daha fazla sınırlandırıcı rol üslendiği tespit edilmiştir (Kim ve ark., 1999; Korhonem ve ark., 2000), fakat histidinin süt protein sentezinde sınırlandırıcı rol oynaması şüphelidir, süt verimi üzerinde artışa sebep olmasına rağmen kesin gereksinimi henüz tam olarak belirlenmemiştir (Rulquin ve ark., 2001).

14 Laktasyondaki Süt Sığırlarının Amino Asit İhtiyaçları INRA tarafından Fransa da arasında PDI sistemi geliştirilerek metabolize olabilir amino asit sistemi ortaya konmuştur (Rulquin ve ark., 1993; Rulquin ve ark., 1998; Kamalak ve ark., 2005). Bu sistem, süt sığırı rasyonlarını metabolize olabilir metiyonin ve lizin açısından formule edebilmek için bir araçtır. Ham materyal içersinde sindirilebilir amino asit, özellikle sindirilebilir metiyonin ve sindirilebilir lizin düzeyleri sistemik metodolojik yaklaşım kullanılarak tahmin edilebilir (Rulquin ve ark., 1998). Metabolize olabilir metiyonin ve metabolize olabilir lizin ihtiyacı katsayısal süt protein verimi ve içeriği göz önünde bulundurularak literatürden elde edilen artan miktarlarda sindirilebilir metiyonin ve lizin düzeylerine dayanarak hesaplanabilir (Rulquin ark., 1993). INRA sistemi ideal protein kavramını temel alır ve ihtiyaçlar ile kaynakları, hayvanlarda enerji kaynaklarının izin verdiği metabolize olabilir protein düzeyleri açısından ifade eder. Metiyonin için belirlenmiş katsayısal ilişki değişken sindirilebilir metiyonin ve sabit sindirilebilir lizin değerleri kullanılarak belirlenmiş olup sadece sindirilebilir lizin düzeyinin %6.5 in üzerinde olması durumunda geçerlidir. Düşük sindirilebilir lizin konsantrasyonları için sindirilebilir metiyonin değeri karşılığı yoktur (Rulquin ve ark., 1993). Bu araştırmacılar tarafından sindirilebilir metiyonin ve sindirilebilir lizin düzeyleri sırası ile %2.5 ve %7.3 olarak belirlenmiştir. Sağmal süt sığrılarında NRC (2001) nin önerdiği ihtiyaç duyulan metabolize olabilir protein içersindeki metiyonin ve lizin düzeyleri Rulquin ve ark. (1993) tarafından indirekt doz cevabı yaklaşımı kullanılarak belirlenmiştir. Metabolize olabilir metiyonin düzeyi arttırılarak süt protein salgısı cevabı gözlenmiştir. Veri tabanı 27 deneme ve 87 gözlem sonucunda metiyoninin abomazum yada duodenuma devamlı infuzyonu şeklinde veya rumen korunmuş metiyonin kullanılarak elde edilen verilerden oluşmaktadır. Bu çalışmalarda regresyon sonuç analizlerinde sindirilebilir lizin düzeyi %6.5 ile sınırlandırılarak yapılmıştır. Birçok model test edilmiş ve düz çizgi halinde

15 5 olan sonuç kabul edilmiştir. Süt proteini maksimum verim ve içeriği için tahmin edilen metabolize olabilir metiyonin ihtiyacı kırılma noktası %2.4 olarak belirlenirken, metabolize olabilir lizinin belirlenmesi için aynı metot uygulanmış ve metabolize olabilir metiyoninin %1.95 lik limit değeri için lizin miktarı %7.2 olarak bulunmuştur. NRC (2001) tarafından önerilen bu değerler Rulquin ve ark. (1993) verileri ile de örtüşmektedir. Cornell Net Karbonhidrat ve Protein Sistemi (CNCPS) sığır rasyonlarını değerlendirmek ve rasyonu amino asit alt modelleri ile ilişkilendirmek için tarif edilmiş dinamik bir modeldir (O Connor ve ark., 1993). Holstein ineklerin esansiyel amino asit ihtiyaçları Schwab (1996) tarafından cornell net karbonhidrat ve protein sistemi kullanılarak tahmin edilmiştir. İhtiyaçlar günlük miktar (g/gün) temelinde ve her bir esansiyel amino asit için toplam esansiyel amino asit içersindeki yüzdesi ile ifade edilmiştir. Araştırmacılar total esansiyel amino asit içerisinde metiyonin ihtiyacını %5.2 ve lizin ihtiyacını %16.3 olarak tahmin etmişlerdir, kabaca bu miktar sindirilebilir metiyonin için %2.4 - %2.5 ve sindirilebilir lizin için %7.7 - %7.9 düzeylerine karşılık gelmektedir. Yakınlarda, Lapierre ve ark. (2006) yapılan çalışmada NRC (2001) de tahmin edilen amino asitlerin duodenal akış değerleri ile ölçülen portal akış değerleri arasında tutarsızlıklar tespit etmişlerdir. Araştırmacılar verimlilik transferinin öngörücü modellerle birleştirilmesi için değişken yerine sabit faktörleri önermektedirler. Hanigan (2005) geçerli besleme sistemimizin iç organ dokularının metabolik karmaşıklığını göz önünde bulundurmak sureti ile daha doğru bir şekilde geliştirilebileceğini iddia etmektedir. Bununla birlikte Rulquin ve ark. (1993) tarafından önerilen %2.5 ve %7.3 lük sırası ile metiyonin ve lizin sindirilebilirliği değerleri günümüzde iyi tahminler olarak görülmektedir. Süt sığırlarında sindirilebilir aminoasitlerin formulasyonu için hayvanların optimum performansı ve maliyet göz önünde bulundurulduğunda pratik önerilen sindirilebilir metiyonin ve sindirilebilir lizin ihtiyacı miktarı sırası ile %2.2 ve %7 düzeylerinde önerilmektedir.

16 Metiyonin kaynakları INRA tarafından önerilen metabolize olabilir amino asit sistemi kullanılarak metabolize olabilir metiyonin ve metabolize olabilir lizin kaynakları rasyon kompozisyonu ve süt sığırları ihtiyaçları karşılaştırılarak hesaplanabilir. Bu amaçla INRA yaygın kullanılan tüm hammaddeler için veritabanları yayınlamıştır (Rulquin ve ark., 1993, 1998). Bazı hammaddeler metabolize olabilir metiyonin için iyi birer kaynaktır fakat pratik formulasyonlarda metabolize olabilir metiyonin ve metabolize olabilir lizin konsantrasyonlarının uygun düzeyde bir arada bulunması sentetik amino asit ürünleri kullanılmadığı taktirde imkansız görünmektedir. Örneğin mısır gluteninde metabolize olabilir metiyonin düzeyi yüksektir, fakat metabolize olabilir lizin düzeyi çok düşüktür. Balık unu metiyonin ve lizin bakımından zengindir. Fakat hayvansal protein kullanımı Avrupa da yasaklanmıştır. Ham madenin içerdiği proteininin rumen parçalanabilirliği ve amino asit profili de önemlidir. Örnek olarak, mısır proteini tahıllar arasında rumen parçalanabilirliği çok düşük olması sebebi ile istisnadır ve yüksek miktarda mısır içeren rasyonlarda metabolize olabilir amino asit katkısı yüksek olmaktadır. Mısır gluteni, metabolize olabilir lizin açığına, metabolize olabilir metiyonin ile birlikte ihtiyacın altında olması sebebi ile katkıda bulunacaktır. Bu ihtiyaç mısır gluteninin yüksek protein içeriği ve düşük rumen parçalanabilirliği sebebi ile daha belirginleşir. Bu durum mısır gluten yemi için yüksek rumen parçalanabilirliği sebebi ile geçerli değildir. Kaba yemler yüksek rumen parçalanabilirlikleri sebebi ile metabolize olabilir amino asit profilleri açısından rumen mikro organizmaları ile benzerlik gösterir. Bazı hammaddeler çok etkili amino asit profiline sahip olabilirler bunlar konsantre korunmuş protein kaynağıdır. Soya küspesi metabolize olabilir lizinin dengeli bir kaynağıdır, fakat diğer bitkisel orijinli protein kaynakları metabolize olabilir metiyonin ve lizin bakımından yetersiz olma eğilimindedirler (Çizelge 1.1.).

17 Çizelge 1.1. Süt sığırı rasyonlarında sıkça kullanılan ham maddelerin ince bağırsaklarda sindirilebilen metiyonin ve lizin konsantrasyonları (Gransworthy ve Wiseman 2004). g/kg KM g/100g Lizin Metiyonin Lizin Metiyonin Ot silajı Mısır silajı Yonca Şeker pancarı posası Buğday Tane mısır Mısır gluten yemi Mısır gluten unu Soya küspesi Kolza tohumu küspesi Kan unu Tüy unu Balık unu Avrupa rasyonlarının çoğunda özellikle soya küspesi ve mısır silajı kullanılıyor ise metabolize olabilir lizin açığı yoktur fakat metabolize olabilir metiyonin açığı oluşmaktadır. Pratik formulasyonlarda metabolize olabilir metiyonin ve lizin miktarlarını önerilen düzeylere yükseltebilmek için rasyonda kullanılan ham madde olarak lizin açısından zengin kombinasyonlar kullanılmalı ve iyi kaliteli korunmuş metiyonin kaynağı ilave edilmelidir (Gransworthy ve Wiseman, 2004) Korunmuş Metiyonin Kaynağı Olarak Kullanılan Ticari Ürünler Rasyonlarda metiyonin açığını dengelemede korunmuş metiyonin ilavesi amacı ile değişik teknolojiler kullanılarak üretilmiş birçok ürün bulunmaktadır (Schwab ve Ordway, 2011). - Met-Plus (Nisso America, Inc.) Lipit korumalı ürünlere bir örnektir. %65 DL-Metiyoninin uzun zincirli yağ asidi kalsiyum tuzu, laurik asit ve butylated hydroksitoluene

18 8 (antioksidan) ile sarılması sonucu elde edilmiştir. Diğer lipit kaplı ürünlerde olduğu gibi teknolojisi rumen korunmuş ve bağırsaklardan salınım prensibine dayanır ve böylece ruminal ve dışkı ile en az kayıp oluşmasını sağlar. - Mepron M85 (Degussa Corporation, Germany) Yüzeyi karbonhidrat ile kaplanarak rumen korunma sağlanan ürünlere bir örnektir. Pelet yapısındadır ve her bir pelet 1.8 mm çapında 3.4 mm uzunluğundadır. Metiyonin, nişasta, etilseluloz ve stearik asit ile kaplanarak peletler oluşturulmaktadır ve son ürün minimum %85 DL- Metiyonin ve yaklaşık %8.5 yapısal olmayan karbonhidrat, %3.5 NDF, %1.5 kül, %1 nem ve %0.5 ham yağ içermektedir. Bu teknoloji fazla miktarda metiyonin taşınmasına izin verir. Son ürün rumende yavaş parçalanır ve ince bağırsaklarda metiyonin salınır. - Smartamine M (Adisseo, Inc., Antony France) Bu ürün ph duyarlı polimer kaplı metiyonin formuna bir örnektir. 2mm lik peletler halindedir. DL-Metiyoninin 2-vinylpyridine-co-styrene ile kaplanması sonucu elde edilir %75 DL-Metiyonin içerir son üründe %3 oranında yardımcı polimer bulunur ve ürünün düşük ph da abomazumda çözünmesini sağlar. - Alimet (Novus International, Inc. St. Louis, MO, USA) ve Rhodimet Her ikisi de HMB nin likit formudur.daha çok tavukçuluk endüstrisinde ve domuz yetiştiriciliğinde metiyonin yerine kullanılmaktadırlar. Fakat Ailmet ruminant kullanımı için patent almıştır. - MetaSmart (Kemin) 2-hydroxy-4-methylthio butanoic acid in isopropyl esterine örnek bir ticari üründür.

19 Korunmuş Ürünlerin Bioyararlanım Değerleri Bu ürünler rasyonu metabolize olabilir metiyonin açısından dengelemek amacı ile kullanılmaktadır. Buradaki amaç, sağlanan ekstra metiyoninin meme bezlerinde kazein sentezini artırmasıdır. Rasyon hazırlarken korunmuş metiyonin ürünlerini ekonomik dozlarda kullanabilmek için ürünün bioyararlanım değerlerine ihtiyaç duyulur. Metiyonin bioyararlanımı ürün içersindeki metiyoninin bağırsak duvarından kan dolaşımına emilen miktarı olarak tanımlanır. Rumen korunmuş metiyonin içeren ürünler için çeşitli bioyararlanım tahmin metodları önerilmektedir: - ph duyarlı kaplanmış ürünlerde ph laboratuar testi uygulaması - Rumen simulasyon teknikleri (sadece rumen direncini ölçer) - Mobil naylon kese yöntemi tüm rumen direncini ve sindirilebilirliğin ölçümüne izin verir - Sindirim kanalı akış ölçümleri: duodenal, ileal, sekal. Bu metodlar sadece emilim düzeyi hakkında fikir sahibi olmamızı sağlar. Sindirim kanalı akış çalışmaları kullanışsız ve maliyetli olarak değerlendirilebilir (Gransworthy ve Wiseman, 2004). Aminoasitlerin biyoyararlanımını kan testleri ile daha güvenilir bir şekilde ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir : Kalitatif incelemede metiyonin ilavesi sonrası beş gün kan metiyonin konsantrasyon değişiklikleri ölçümü yapılarak sonuçlar değerlendirilir (Blum ve ark., 1999; Sudekum ve ark., 2004).

20 10 Rulquin ve Kowalczyk (2003) ın önerdiği kantitatif kan metodu, emilen plazma metiyonin konsantrasyonunu temel alır. Dört gün boyunca duodenuma artan dozlarda metiyonin infüzyonunu takiben plazma metiyonin konsantasyonu değişimi belirlenerek elde edilen veriler değerlendirilir (doygunluk metodu). Kan kinetik testi de kalitatif bir metod olup tek doz sabit miktar metiyonin eşdeğer korunmuş ürünün uygulanmasını takiben ölçülen kan metiyonin konsantrasyonu ile bioeşdeğerliği bilinen referans ürün SmM uygulanması sonrası elde edilen değerler karşılaştırılır (Robert ve ark., 2001a) Korunmuş Metiyonin Kaynağı Olarak Kullanılan Ticari Ürünler İçin Metiyonin Bioyararlanımı Metiyonin bioyararlanımı bilinen günümüzde geçerli üç ürün vardır. Bunlardan ph sensitif kaplanmış korunmuş metiyonin (SmM) ile farklı metodlarla yapılan ölçümlerde tutarlı sonuçlar elde edilmiştir (Robert ve ark., 2002; Rulquin ve Kowalczyk, 2003), genel kanı olarak uygulamalarda SmM nin bioyararlanımı %80 düzeyinde kabul edilmiştir. Mepron M85 için yerinde hareketli kese değerlendirmelerinde metiyonin bioyaralanımı %25 (Koenig ve Rode, 2001) ile %50 (Overton ve ark., 1996; Berthiaume ve ark., 2000) arasında değişen çelişkili sonuçlar gözlenmiştir. Sindirim kanalı akış çalışmalarında %50 düzeylerinde bir oran bulunurken (Berthiaume ve ark., 2001) kan testleri %20-35 değerleri arasında bioyararlanım düzeyi gözlenmektedir (Bach ve Stern, 2000; Koenig ve Rode, 2001). HMB ile ilgili olarak da değişik metodlar kullanan yazarlara göre çelişkili sonuçlar gözlenmiştir. İn vitro rumen simulasyon tekniği kullanılarak yapılan ölçümlerde inkubasyon zamanına bağlı olarak üretilen rumen direnç değerleri %22 ile %43 arasında bulunmuştur (Vasquez-Anon ve ark., 2001). İn vivo

21 11 rumen korunmuş miktarı %40 ile %50 olarak değerlendirilmiş, bununla birlikte duodenumda %12 ile %45 oranında ölçülmüşdür (Koenig ve ark., 1999, 2002). Yazarlar ruminal ve duodenal ölçümler arasındaki farklılıkları omazal yada abomazal emilime bağlamaktadır. Yakın zamanda, Noftsger ve ark. (2004) süt sığırlarında toplam rasyona günlük pratik doz HMB ilavesi sonucu %5 oranında HMB nin rumen korunmuş olduğunu tespit etmişlerdir. HMBi de bulunan metiyoninin bioyararlanımı kuantitativ kan kinetik metodu ile belirlenmiştir (Robert ve ark., 2001c, 2002). Elde edilen değerler HMBi nin likit formu için %50 ve toz formu için ise %56 olarak bulunmuştur. Schwab ve ark. (2001) süt protein konsantrasyon cevap tekniğini kullanarak HMBi nin artan dozlarda kullanılması sonucu bioyararlanımı %50 civarında bulmuşlardır. Guyot ve ark. (2004) yedi ürünün meta-analiz yöntemi ile süt protein cevabını değerlendirmişler ve HMBi için metiyonin bioyararlanımını %50 olarak bulmuşlardır Metabolize Olabilir Metiyonin in Yeni Kaynağı HMB nin İzopropil Esteri: HMBi HMB nin kullanımı sonucu kanda HMB ve metiyoninin sırası ile yükselmesi çeşitli araştırmalarla ortaya konmuştur (Robert ve ark., 2001b ve d ; Noziere ve ark., 2004). Devam eden çalışmalarda HMBi nin çeşitli organ ve dokularda metiyonine dönüştürüldüğü araştırmacılar tarafından bildirilmiştir (Belasco, 1972; Saunderson, 1985; Dupuis ve ark., 1989; Mc Collum ve ark., 2000; Wester ve ark., 2000a ve b) HMBi ile Beslemeden Sonra Kanda HMB nin Yükselişi Gebe olmayan kuru dönem ineklerde yapılan çalışmada spot doz HMBi nin rumene verilmesini takiben kısa bir sürede periferik kan dolaşımında HMB nin artışı gözlenmiştir (Robert ve ark., 2001d). HMBi uygulaması öncesi

22 12 plazma konsantrasyonu sıfır iken uygulamayı takiben plazma HBM konsantrasyonu 1.4 mg/100 gr a yükselmiş ve yükseliş 1 saat 15 dakika sonunda kan HMB plazma konsantrasyonu 3 mg/100 gr pik değere ulaşana kadar devam etmiştir, HMBi uygulamasını takip eden 8 saat sonrasında ise kan plazma HMB konsantrasyonunun kademeli olarak bazal seviyeye düştüğü gözlenmiştir. HMBi nin rumene uygulanmasını takiben çok kısa bir sürede (1 ila 2 saat) kan plazma HMB düzeyinin maksimum konsantrasyona ulaşması yapılan çalışmada gözlenmiştir (Noziere ve ark., 2004) HMBi ile Beslemeden Sonra Kanda Metiyoninin Yükselişi Robert ve ark. (2001b) yaptıkları çalışmada HMBi alımını takiben plazma metiyonin konsantrasyonu, HMB konsantrasyonunun artmasını takiben pik yapmış, ve metiyoninin kanda HMB yi takiben daha yüksek bir konsantrasyonda görünmüştür: Metiyonin kanda 4 saat sonra pik düzeye ulaşırken HMB nin pik düzeye 1 ila 2 saatte ulaştığı gözlenmiştir, ve metiyonin pik (3.2 mg) konsantrasyona ulaştığında HMB 1,5 mg düzeylerinde ölçülmüştür. HMB ve metiyoninin kan kinetiklerinin birbirinden farklı olduğu kaydedilmiştir. HMB keskin birşekilde yükselip düşerken metiyonin için bu seyir daha geniş bir zamana yayılmıştır. Gözlenen bu durum büyük olasılıkla HMB nin metiyonine dönüşümüne karşılık gelmektedir. Bu dönüşümün metabolik basamakları geniş ölçüde tek mideli hayvanlarda çalışılmıştır. Buna göre HMB 2-keto-4 (methylthio) butanoic asid isimli ara bileşiğe dönüştürülmekte, daha sonrasında transaminasyon ile L Metiyonine dönüştürülmektedir (Dupuis ve ark., 1989). McCollum ve ark. (2000) da yaptıkları çalışmada ruminal ve abomazal epitelyumun ve ayrıca karaciğer ve böbreklerin HMB yi 2-keto-4-(methylthio) butanoik aside çeviren enzimler içerdiği yönündedir. Bu dönüşümün kanatlılarda büyük ölçüde karaciğer ve böbreklerde gerçekleştiği düşünülmektedir (Saunderson, 1985), fakat söz konusu dönüşümde diğer dokular ve parsiel olarak intestinal mukozanın da görev alıyor olabileceği tahmin edilmektedir (Dupuis ve ark., 1989). Ruminantlarda, Belasco (1972) yaptığı in vitro çalışmalarda karaciğer

23 13 enzimatik sistemlerinin ve böbrek mikrozomlarının HMB yi metiyonine dönüştürebilme yeteneğine sahip olduklarını gözlemlemiş. Wester ve ark. (2000a ve b) koyunda HMB nin büyük ölçüde ekstra hepatik dokularda metiyonine dönüştürüldüğünü göstermişlerdir HMBi nin Emilim Mekanizması Mc Collum ve ark. (2000) yaptıkları çalışmada HMB nin koyunlarda omazum ve rumen epitelyumundan geçişini incelemişlerdir. Sonuçlar göstermektedir ki HMB nin absorbsiyonu yalnızca pasif transport yolu ile gerçekleşmemektedir. Yapılan çalışmada omazum epitelinde doygunluk gözlenmektedir ki bu büyük olasılıkla mediyatör aracılı transport ile bir kısım HMB nin omazumdan emildiğinin göstergesidir. Diğer mekanizmalar ise difuzyon ve paraseluler absorbsiyondur. Bu çalışmada ayrıca görülmüştür ki omazal epitelyumun HMB absorbsiyon kapasitesi ruminal epitelyumun absorbsiyon kapasitesinden daha yüksektir. Koenig ve ark. (1999) dört adet kanül yerleştirilmiş süt ineği kullanılarak yaptıkları çalışmaların ilkinde rumen içerisine değişen miktarlarda metiyonin hidroksi analoğu infüzyonunu takip eden 16., 20. ve 24. saatlerde duodenal içeriği muayene etmişler ve metiyonin hidroksi analoğuna rastlamamışlardır. Araştırmacılar bu durumu, metiyonin hidroksi analoğunun rumenden hızla geçtiği yönünde yorumlamışlardır. HMB, HMBİ ve DL-Metiyonin kullanıldığı bir çalışmada ise HMB nin omazuma geçmeden rumende tükendiği tespit edilmiş, sadece küçük miktar HMBi kaynaklı HMB omazumda bulunmuştur. Bu da göstermektedir ki HMBi nin absorbsiyonunun büyük kısmı preomasal bölgede gerçekleşmektedir (Noftsger ve ark., 2005). Kuru dönem ineklerde HMBi ve SmM nin rumene uygulanmasını takiben metiyoninin perifer dolaşımda ortaya çıktığı ve pik yaptığı zaman açısından karşılaştırılmıştır. SmM için metiyoninin kanda ortaya çıkış süresi 8 saat ve pik zamanı ise ortalama 20 saat olarak gözlenmiş, HMBi için, HMB ve metiyoninin kanda görünme süresi çok daha kısa 10 dakika ve altında bir

24 14 süre ölçülmüştür. HMB ve metiyonin pik süreleri ise sırası ile 90 dakika ve 4 saat olarak gözlenmiştir (Robert ve ark., 2001c ve 2002). SmM rumen inert olarak bilinen bir maddedir ve metiyoninin ince bağırsaklarda açığa çıkmasından sonra emilmesi sebebi ile perifer dolaşımda uzun süre sonunda görülmesini açıklayabilir. Önceki yapılan çalışmalara göre HMBi incebağırsaklardan değil büyük olasılıkla rumen duvarından emilmektedir. Bu durum Kristensen ve ark. (2000) nın boşaltılmış-yıkanmış rumen tekniği ile gebe olmayan kuru dönemdeki jersey ineğe tek doz HMBi uygulamak sureti ile doğrulanmıştır. Graulet ve ark. (2004) HMBi nin rumenden emildiğini ruminal ve jugular vene kateter uygulanmış iki holstein inek kullanılarak yapılan çalışmada da doğrulamışlardır; HMBi nin rumene yüksek doz da uygulanmasını takiben jugular vende herhangi bir ize rastlanmazken sadece ruminal vende tespit edilmiştir. Sonrasında her iki vende de HMB ve metiyonin konsantrasyonu hızlı bir şekilde artış göstermiştir. Ruminal vendeki yüksek konsantrasyondaki HMB (8.5 mg/100 g), jugular vendeki HMBi konsantrasyonu ile (5.0 mg/100g) karşılaştırıldığında HMBi nin rumenden emildiği doğrulanmaktadır. Ruminal vende HMB ye isopropanolün eşlik ettiğinin tespiti ise HMBi nin rumen duvarında hidrolize olduğunu akla getirmektedir. Noziere ve ark. (2004) da koyunlarda yaptıkları çalışmada HMBi nin aynı şekilde rumenden emildiğini ve rumen duvarında hidrolize olduğunu gözlemlemişlerdir. Digenis ve ark. (1974) ve Patterson ve Kung (1988) yaptıkları in vitro çalışmalarda gösterilmiştir ki HMBi nin bir kısmı rumende kalarak HMB ve isopropanole hidrolize olmaktadır, bu durum diğer metiyonin türevleri ve HMB için de gözlenmiştir. İn vitro çalışmalar aynı zamanda göstermiştir ki HMBi den kaynaklanan HMB rumen mikro organizmaları tarafından substrat olarak kullanılmakta ve rumen fermentasyonunu situmule etmektedir (Noftsger ve ark., 2005). Rumen mikro organizmalarının HMB kullanımı literatürlerde geniş ölçüde yer almıştır (Vasquez ve ark., 2001; Noftsger ve ark., 2003; Fowler ve ark., 2010). Noftsger ve ark. (2004) süt sığırlarında total rasyona günde hayvan başı 22 gr HMBi ilave ederek yaptıkları bir çalışmada omazum

25 15 da HMBi ye hiç rastlamamış yalnızca çok küçük miktar (%2-3) HMB ye rastlamışlardır, bulunan bu sonuç da HMBi nin bir kısmının rumende HMB ye parçalanarak rumen mikro organizmaları tarafından kullanıldığı görüşünü desteklemekterdir Metiyonin Hidroksi Analoglarının Rumen Mikro Organizmaları, Uçucu Yağ Asiti Sentezi ve Seluloz Sindirimi Üzerine Etkileri Dört adet devamlı fermentasyon kültürünün kullanıldığı çalışmada HMB nin organik materyal sindirilebilirliği, nötral deterjan fiber (NDF), asit deterjan fiber (ADF) hemiseluloz ve mikrobiyel azot sentezi için optimal konsantrasyonunun belirlenmesi istenildiği çalışmada üç farklı konsantrasyon HMB (%0, %0.055 ve 0.11) ve tek konsantrasyon DL-Metiyonin (%0.097) fermenter kültürler üzerine infüze edilmiştir. Organik materyal, hemiselüloz ve NDF büyük ölçüde denemeden etkilenmemiş, ADF sindiriminin %0.055 lik HMB konsantrasyonda katıldığı grupta diğerlerine oranla daha düşük bulunmuştur. Toplam uçucu yağ asidi üretimi HMB ilavesinden etkilenmemiştir fakat bireysel uçucu yağ asidi üretimi ve konsantrasyonunda farklılıklar gözlenmiştir. İsobutyrate HMB ilavesindeki artışa paralel olarak lineer bir şekilde artmış, propionat ise ters orantılı olarak düşmüştür. Fakat DL- Metiyonin ile HMB nin yüksek konsantrasyonlarındaki karşılaştırmalarında ise DL- Metiyonin kullanılan grupta asetatın arttığı tespit edilmiştir. DL- Metiyonin, HMB ile karşılaştırıldığında, isobutyrate ve butyrate konsantrasyonunu azalttığı görülmüştür. Mikrobiyal etkinlik açısından çalışmalar arasında fark gözlenmemiştir. HMB ilavesindeki artış ile birlikte NH3 den bakteriyel azot sentezi oranı lineer olarak düşmektedir. DL- Metiyonin ilave edilen kültürde ise NH3 den azot sentezi artmaktadır (Noftsger ve ark., 2003). Rumen kanülü uygulanmış üç adet laktasyondaki inek 3x3 latin kare metodu kullanılarak metiyonin hidroksi analoğu, DL-Metiyonin ve sodyum sülfat kullanılarak denemeye alınmı, araştırmacılar DL-Metiyoninin diğerlerine

26 16 oranla rumen silliatalı protozoon sayısını daha fazla arttırdığını gözlemlemişlerdir. Bütirik asit ve isobutirik asitin rumen konsantrasyonunun DL-Metiyonin kullanımında diğer metiyonin hidroksi analogları ve sodyumsülfata oranla daha fazla arttırdığını tespit etmişlerdir. İsovalerik asit miktarı ise aynı şekilde DL-Metiyonin kullanımı esnasında metiyonin analoglarına oranla yüksek bulunmuştur (Lundquist ve ark., 1985b). HMB, HMBi ve DL-Metiyoninin kullanıldığı bir diğer çalışmada rumen uçucu yağ asiti profili ve NH3 konsantrasyonu çalışma boyunca benzer bulunmuştur. Organik materyal ve NDF sindirimi açıkça metiyonin analogları kullanılan grupta kontrole oranla yüksek bulunmuştur. Rumen ve omazumdaki protozoa sayısı metiyonin kaynaklarından belirgin düzeyde etkilenmemiş, bakteriyel omazal azotda ise belirgin bir fark gözlenmemiştir (Noftsger ve ark., 2005) Metiyonin Hidroksi Analoglarının Süt Verimi, Süt Bileşenleri ve Plazma Metiyonin Düzeyleri Üzerine Olan Etkileri Lundquist ve ark. (1985a) yaptıkları çalışmada rasyona değişen konsantrasyonlarda DL-Metiyonin ve metiyonin hidroksi analoğu ilave etmişler ve her iki ürünün de süt verimini etkilemediği, bununla birlikte her iki ürünün de süt yağını arttırdığı fakat metiyonin hidroksi analoğu için artış değerinin daha yüksek bulunduğunu bildirmişlerdir. Çeşitli formlarda metiyoninin süt sığırlarındaki laktasyon performansının incelendiği bir diğer çalışmada rasyona Smartamine M, HMB ve HMBi ilavesi yapılmış, plazma metiyonin konsantrasyonu HMBi kullanımında %110, Smartamine M kullanıldığında ise %65 oranında bulunmuş. Süt protein miktarları HMBi kullanımında 32 g/gün, Smartamine M kullanıldığında 41 g/gün olarak tespit edilmiştir. HMB kullanımının ise süt protein sentezi üzerine etkisinin olmadığı belirtilmiştir. Ayrıca HMB, ve SmartamineM kullanımı sonucu sütte kısa ve orta zincirli yağ asidi miktarı azaldığı C18 yağ

27 17 asidi doygunluk derecesi ve kararlılığının arttığı belirtilmiştir. Araştırmacılar sonuç olarak HMBi nin korunmuş metiyonin kaynağı olarak ruminant rasyonlarında rumen korunmuş metiyonin kaynağı olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir (Rulquin ve ark., 2006). St-Piere ve Sylvester (2005) HMB ve HMBi nin süt verimi ve kompozisyonu üzerine etkilerini karşılaştırmak amacı ile 61 inek üzerine deneme yapmışlar ve HMBi uygulanan grupta süt verimi protein içeriği ve miktarı ile süt yağı ve laktoz miktarında belirgin artışlar gözlemiş HMB kullanılan grupta ise bahsedilen verim özellikleri yönünden çok az yada hiç fark gözlenmediğini kaydetmişlerdir. Araştırmacılar ayrıca HMBi kullanılan grupta plazma serbest metiyonin düzeylerinde de artış tespit etmişler fakat HMB kullanılan grup için bunun geçerli olmadığını belirtmişlerdir. Lundquist ve ark. (1983) birbirini takip eden yıllarda yapılan üç çalışmada metiyonin hidroksi analoğunun süt verimini süt yağını ve düzeltilmiş süt verimini arttırdığını tespit etmişlerdir. Kaba yem tipi rasyonlarda metiyonin hidroksi analoğu ilavesinin performans üzerine etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada ise rasyonda %50-60 oranında yonca samanı kullanıldığı taktirde metiyonin hidroksi analoğunun süt verimi ve süt yağını arttırırken aynı oranda brom otu samanı kullanılan rasyonlarda metiyonin hidroksi analoğunun süt verimi ve yağ oranı üzerine etki etmediğini bildirmişler (Hansen ve ark., 1991). HMB, HMBi ve DL-Metiyonin kullanıldığı bir diğer çalışmada süt verimi ve süt yağında kontrole oranla belirgin bir fark bulunmamış fakat HMBi kullanılan grupta süt proteininin belirgin olarak yükseldiği bildirilmiş (Noftsger ve ark., 2005). Brigham Young Üniversitesinde 100 sığır doğumu takiben günde 25 gr metiyonin hidroksi analoğu 150 gün boyunca rasyona ilave edildiği bir çalışmada, metiyonin analoğunun süt verimini etkilemeden süt yağını

28 18 yükselttiği kaydedilmiş. Ayrıca kan serumunda yapılan incelemede metiyonin hidroksi analoğu ile beslenen grupta kontrol grubuna oranla %10 daha fazla trigliserit tespit edilmiştir araştırmacılar süt yağındaki artışın sebebinin serumdaki lipoprotein ve trigliseritlerin büyük ölçüde plazmadan meme bezine alınması sonucunda ortaya çıkmış olabileceğini bildirmişlerdir. Aynı şekilde serumda yapılan incelemede kontrol grubuna oranla metiyonin, isoleucine ve leucin miktarları da yüksek bulunmuş ve meme bezlerine giden arterlerde metiyonin miktarı diğer amino asitlere oranla belirgin bir şekilde yüksek olduğu tespit edilmiştir (Huber ve ark., 1984). Elli adet lakasyon dönemindeki inekle yapılan bir çalışmada rasyona inek başı 30 gr metiyonin hidroksi analoğu ilave edilmiş ve 180 günlük dönemde süt verimi, süt yağı ve %4 yağa göre düzeltilmiş süt verimleri kontrol grubuna oranla yüksek bulunmuştur (Clark ve Rakes, 1982) Metiyonin Hidroksi Analoglarının Lipid Metabolizması Üzerine Etkileri Metiyonin hidroksi analoğunun lipit metabolizması üzerine etkilerinin incelendiği bir çalışmada elde edilen sonuçlara göre erken laktasyonda hepatik trigliserit sekresyonunun artmadığı gözenmiş ve metiyonin hidroksi analoglarının lipit metabolizması üzerine bir etkisinin olmadığı kanaatine varılmıştır (Pullen ve ark., 1989). Bir diğer çalışmada metiyonin hidroksi analoğu ve yağ asidinin kalsiyum tuzu kullanımı ile yağlı karaciğer sendromu arsasındaki bağlantı araştırılmış ve yağlı karaciğer sendromu oluşumunu önlemede herhangi bir olumlu etkisinin olmadığı belirtilmiştir (Bertics ve Grummer, 1999). Piepenbrink ve ark. (2004) yaptıkları çalışmada elde ettikleri verilere göre düşük metiyonin içeren rasyonlara HMB ilavesi ile tahmin edilen metiyonin ihtiyacı sağlanarak süt üretiminde artış elde edilebileceğini, fakat

29 hepatik enerji metabolizması için erken laktasyon dönemindeki ineklerde avantaj sağlanamayacağını belirtmişlerdir Metiyonin Hidroksi Analoglarının Kullanımı ile Yapılmış Diğer Çalışmalar Metiyonin hidroksi analoğu ile beslenen sığırların tırnaklarında kontrol grubuna oranla sistein ve prolin miktarı daha az bulunurken metiyonin lizin, tirosin ve glutamic asit miktarının daha çok olduğu görülmüş araştırmacılar bu sonuca dayanarak metiyonin hidroksi analoğu ile beslenen ineklerde tırnak dokusunda disülfit bağlarının oluştuğu bildirmişlerdir (Clark ve Rakes, 1982). Yağ asitlerinin kalsiyum tuzu ve metiyonin hidroksi analoğunun plazma PGF2-alfa metaboliti olan PGFM ve süt verimi üzerine etkileri incelenmiş ve her iki parametrenin de belirgin düzeyde arttığı tespit edilmiştir (Fahey ve ark., 2002). Seluloz oranının düşük tutulduğu rasyona metiyonin hidroksi analoğu katılmasının kan glikoz, insülin, asetat konsantrasyonu ve meme bezlerinin plazmadan asetat alması üzerine herhangi bir etkisinin olmadığını bununla birlikte düşük selüloz oranına sahip rasyon kullanımına rağmen süt yağında artışa neden olduğu bildirilmiştir (Ray ve ark., 1983). Erken laktasyon döneminde yüksek süt verimli ineklerde vücut proteinlerinde kayıp gözlenmektedir, bunu en aza indirmek için doğum öncesi 21 gün boyunca günde 20 gr metiyonin hidroksi analoğu rasyona katılmış, doğumu takiben 50 g/gün oranında metiyonin hidroksi analoğu kullanımına devam edilmiş ve kontrol grubuna oranla ineklerin erken laktasyon döneminde daha az vücut proteini kaybettiği ve doğumu takiben 60. günden 120. güne kadar sürdürülen denemede vücut yağ ve protein miktarının arttığı tespit edilmiştir (Phillips ve ark., 2003).

30 20 DL- Metiyonin ve metiyonin hidroksi analoğu abomazum veya rumene infüze edilerek toksisitesinin yem tüketimine oranla ölçülmeye çalışıldığı bir denemede üç gün boyunca devam eden DL- Metiyonin infüzyonu sonucu rasyon kuru maddesinin %2.5 ine ulaşıldığında toksik etki gözlenmiştir. Metiyonin hydroksi analoğu ise kuru maddenin %1 i ve üzeri dozlarda rumen veya abomasuma infüzyonu sonucu toksik etki oluşturmuştur. Rasyona yüksek miktarda metiyonin ilavesinin denendiği çalışmada ise yemin lezzetinin azaldığı ve kuru madde tüketiminin düşmesine bağlı olarak toksisite riskinin ortaya çıkmadığı ve bunun da bir avantaj olarak değerlendirilebileceği araştırmacılar tarafından kaydediliştir (Satter ve ark., 1975) Besi Sığırlarında Metiyonin Hidroksi Analoglarının Kullanımı Entansif ve ekstansif beside metiyonin hidroksi analoglarının metabolize olabilir metiyonin kaynağı olarak etkinliğinin araştırıldığı bir çalışmada entansif besi grubunda rasyona üre, et kemik unu ve metiyonin hydroksi analoğu ilave edilmiştir. Ekstansif besi grubu ise brom otu bulunan mera da güdülmüş ve ilave olarak enerji kaynağı, rumen korunmuş protein ve metiyonin hydroksi analoğu verilmiş her iki grupta da metiyonin hidroksi analoglarının kuru madde tüketimi ve büyüme üzerine etkisinin olmadığı gözlenmiştir (Can, 1998). Bu araştırmada HMBi nin süt sığırlarında metiyonini ikame edebilirliğinin süt verimi ve bileşenleri ve bazı kan parametreleri ile rumen uçucu yağ asitleri üzerine etkileri incelenerek sonuçların irdelenmesi amaçlanmıştır.

31 21 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. GEREÇ Hayvan Materyali Araştırmada yüksek süt verimine sahip 30 adet holstein ırkı süt sığırı kullanılmıştır. Süt sığırları her grupta 10 ar inek olacak şekilde 3 gruba ayrılmıştır. Gruplar kontrol grubu, pozitif kontrol grubu (korunmuş metiyonin in doğal kaynağı olarak mısır gluteni katkılı) ve deneme grubu (HMBi katkılı) şeklinde oluşturulmuştur. İnekler 150 sağmal içeren bir sürüden yüksek süt verimine sahip ikinci ve üçüncü laktasyonda olan, sağılan gün ve vücut ağırlıkları açısından birbirine yakın olacak şekilde guruplara homojen bir şekilde dağıtılmıştır. Gruplandırma sonunda geçiş periyodunu takiben grupların kendi içersinde haftalık sütverimleri ortlamalarının birbirlerine çok yakın olmasına özen gösterilmiştir. Bu amaçla deneme öncesi periodda, ineklerde gruplar arası gerekli kaydırmalar yapılmıştır. Denemeye her 3 grupta 10 ar inekle başlamıştır. Fakat ilerleyen günlerde kontrol grubundan bir inek yüksek ateş ve bir inek de artrit sebebi ile denemeden çıkarılmış ve denemeye 8 inekle devam edilmiştir. Mısır glutenli gruptan mastit olması sebebi ile bir inek denemeden çıkarılmış ve 9 inek ile deneme sürdürülmüştür. HMBi katılan grupta bir inek mastit sebebi ile ve bir inek ayak rahatsızlığı sebebi ile gruptan çıkarılmış ve denemeye 8 inekle devam edilmiştir.

32 Yem Materyali Deneme de kullanılan konsantre yem özel bir yem fabrikasına ürettirilmiştir. Kontrol grubunun yeminde herhangi bir metiyonin kaynağı kullanılmamıştır. Pozitif kontrol olarak düşünülen grubun yemine metiyonin içeriği ve korunmuş özelliği yüksel olan mısır gluteni %3.3 düzeyinde katılmıştır. HMBi ile yapıla çeşitli çalışmalarda rasyona %0.12 (Juranz ve ark.,2006), %0.13 (Piepenbrink ve ark., 2004; Noftsger ve ark.,2005), %0.15 (St-Pierre ve Sylvester, 2005; Wang ve ark., (2010), %0.20 (Piepenbrink ve ark., 2004) ve %0.25 (Lundquist ve ark., 1983) düzeylerinde katıldığı görülmüştür %1 ve üzeri dozlarda kullanımında ise toksik etki oluşturduğu bildirilmektedir (Satter ve ark., 1975). Deneme grubunun yemine söz konusu çalışmalar da göz önünde bulundurulmak sureti ile metiyonin kaynağı olarak ticari ismi Meta Smart Dry olan 2-hydroxy-4-methylthio butanoic acid in isopropyl esteri (HMBi) %0.2 düzeyinde katılmıştır (Çizelge 2.1) YÖNTEM Deneme Hayvanlarının Beslenmesi ve Deneme Süresi Deneme Başkent Üniversitesi kuruluşu olan Per Tarım Hayvancılık Süt ürünleri Gıda Sanayi Ticaret Limited Şirketine ait damızlık süt sığırı çiftliğinde gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar serbest dolaşım sistemli, kauçuk yataklıkları bulunan, gübre sıyırıcıları vasıtası ile sık sık temizliği yapılan havadar modern barınak koşullarında denemeye alınmışlardır. Aydınlatma gündüz gün ışığı, geceleri ise yapay ışık kaynakları vasıtası ile yapılmış ve 24 saat aydınlatma uygulanmıştır. Bir haftalık adaptasyon dönemi boyunca hayvanların tüketebilecekleri günlük kuru madde miktarları tespit edilmiş ve deneme boyunca aynı miktar

33 23 yem günlük olarak mikser vagon vasıtası ile tam yem şeklinde karıştırılarak hayvanlara verilmiş ve periodik olarak yemler iteklenerek yem tüketimi teşvik edilmiştir. İnek rasyonları konsantre yem, yonca kuru otu, kurutulmuş şeker pancarı posası ve arpa samanından oluşturulmuştur (Çizelge 2.2). Hayvanların su ihtiyacı ise otomatik suluklardan adlibitum olarak sağlanmıştır. Deneme 8 hafta sürdürülmüştür Araştırma Rasyonlarının Hazırlanması Rasyonlarının formulasyonu NRC (2001) ye göre besin madde gereksinimleri dikkate alınarak hazırlanmıştır. Deneme gruplarına ilave edilen HMBi ve mısır gluteni, toz haline getirilen 5 kg kadar kesif yeme ilave edilerek ön karıştırma ile seyreltilmiş, daha sonra mikser vagona ilave edilen bu katkı maddeleri 30 dakika boyunca tam yem ile karıştırılarak homojen bir karışım elde edilmesi amaçlanmıştır. Rasyon bileşiminde bulunan kuru şeker pancarı posası bir gece öncesinde kuru olarak tartılmış ve variller içersinde su ile ıslatılmak sureti ile yaş şeker pancarı posası elde edilmiştir. Araştırmada kullanılan konsantre yemin bileşimi Çizelge 2.1. de gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Araştırmada kullanılan konsantre yemin bileşimi, (%) KONTROL GLUTENLİ YEM DENEME (HMBi) ARPA MISIR SOYA KÜSPESİ BUĞDAY KEPEĞİ ŞEKER PANCARI MELASI MISIR GLUTENİ HMBi - - * KİREÇ TAŞI DCP TUZ VİTAMİN MİNERAL PREMİKS * İlave olarak hayvan başına günde 44 gr (yem tüketiminin yaklaşık %0.2 si) kadar verilmiştir.