flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum,

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Burhanettin YALÇINKAYA BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI Burhanettin YALÇINKAYA tarafından hazırlanan Atmosferde En Çok Rastlanan Mikrofungus Cinslerine Ait Bazı Türlerin Protein Profillerinin Karşılaştırılması adlı tez çalışması 09/11/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Jüri üyeleri: Başkan: Prof. Dr. Kadriye SORKUN Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Üye : Prof.Dr. Nur Münevver Pınar Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Üye : Yrd. Doç. Dr. Ahmet Emre YAPRAK Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Özer KOLSARICI Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Burhanettin YALÇINKAYA Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR Bu çalışmada Atmosferde en çok rastlanan mikrofungus cinslerine (Acremonium kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum), ait taksonların protein profillerinin karşılaştırılması, SDS-Page yöntemiyle yapılmıştır. Bu yönteme göre, Acremonium kliense, örneğinden SDS-Page yöntemi ile 19, Aspergillus flavipes örneğinden 17, Aspergillus niger den 10, Aspergillus oryzae den 13, Alternaria alternata dan 31, Cladosporium herbarum dan 25, Cladosporium obtectum dan 16, Cylindrocladium floridanum dan 14 ve Penicillium chrysogenum dan 20 farklı protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen verilere göre toplam 82 farklı protein bandı elde edilmiş, 24kDA büyüklüğündeki protein bandının 7 taksonda (Acremonium kiliense, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) ortak olduğu gözlemlenmiştir. Kasım 2012, 69 sayfa Anahtar Kelimeler: Atmosfer, Mikrofungi, Protein, SDS-Page, Türkiye i

4 ABSTRACT Master Thesis COMPARİSON OF PROTEİN PROFİLES OF SOME MİCROFUNGİ SPECİES BELONGİNG TO MOST OBSERVED GENERA İN ATMOSPHERE Burhanettin YALÇINKAYA Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof.Dr. N. Münevver PINAR In this study, the protein profile comparison of most commonly found microfungus genera taxa in the atmosphere (Acremonium kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) was conducted using SDS-Page. According to this method, different protein bands for Acremonium kliense (19), Aspergillus flavipes (17), Aspergillus niger (10), Aspergillus oryzae (13), Alternaria alternata (31), Cladosporium herbarum (25), Cladosporium obtectum (16), Cylindrocladium floridanum (14) and Penicillium chrysogenum (20) were obtained. Based on data, 82 different protein bands were obtained and 24kDA-sized protein band was determined to be common for 7 taxa (Acremonium kiliense, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum). November 2012, 69 pages Key Words: Atmosphere, Microfungi, Protein, Morphology, SDS-Page, Turkey ii

5 TEŞEKKÜR Bu çalışmanın gerçekleşmesindeki her aşamada bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyen her şeyden öte hem akademik hemde insani olarak yetişmemde çok değerli katkıları olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nur Münevver PINAR a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), bilgi ve deneyimlerinden her zaman yararlandığım Sayın Prof. Dr. Özlem YILDIRIM a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), çalışmalarım boyunca hep yanımda olan ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Yrd. Doç. Dr. Şenol ALAN a (Bülen Ecevit Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), Sayın Yrd. Doç. Dr. Talip ÇETER e (Kastamonu Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), fungusları hayatıma sokan ve örneklerimin temininde yardımcı olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Adem İmalı ya (Kilis 7 Aralık Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), çalışmalarım sırasında hertürlü desteği aldığım dostum Ferudun KOÇER e, Çalışmalarım süresince maddi ve manevi fedakârlıklar gösteren aileme ve hep yanımda olan eşim Saliha YALÇINKAYA ya, en derin duygularla teşekkür ederim. Bu tez çalışması, TUBİTAK SBAG-COST ES (109S265) Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesi Atmosferik Polen ve Mantar Sporlarının İncelenmesi konulu proje tarafından desteklenmiştir. Burhanettin YALÇINKAYA Ankara, Kasım 2012 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET....i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii KISALTMALAR DİZİNİ... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI Kaynak Araştırmaları Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları Fungal protein çalışmaları Kuramsal Temeller Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri MATERYAL VE YÖNTEM Örneklerin Temini Örneklerin Çoğaltılması Besiyerlerinin hazırlanması Örneklerin üretilmesi Örneklerin özütlenmesi Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) MVSP (MultiVariate Statistical Package) BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

7 KISALTMALAR DİZİNİ APS EDTA N-PAGE ME PAGE SDS SDS-PAGE TAE TEMED MVSP kda MEA SDA Amonyum Persülfat Etilen Diamin Tetraasetik Asit Native-Poliakrilamid Jel Elektroforez Merkaptoetanol Poliakrilamid Jel Elektroforez Sodyum Dodesil Sülfat Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez Tris Asetikasit EDTA Tetra Etil Metilen Diamin MultiVariate Statistical Package Kilodalton Malt Ekstrakt Agar Sabouraud Dekstroz Agar v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar... 4 Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere göre dağılımı... 5 Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre elde edilen dendrogram Şekil 4.2 a. Acremonium kliense nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium kliense nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı Şekil 4.4 a. Alternaria alternata nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria alternata nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternaria alternata dan SDS- Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes in sıvı besiyerinde görüntüsü c.aspergillus flavipes den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı Şekil 4.8 a. Aspergillus niger in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger in sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus niger den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium herbarum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum dan SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium obtectum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum un SDS- vi

9 Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cylindrocladium floridanum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cylindrocladium floridanum un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri Şekil 4.17 Cylindrocladium floridanum total protein miktarı Şekil 4.18 a. Penicillium chrysogenum un katı besiyerinde görüntüsü b. Penicillium chrysogenum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Penicillium chrysogenum dan SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değeri Şekil 4.19 Penicillium chrysogenum total protein miktarı Şekil 5.1 Çalışmada kullanılan örneklerin özütleme işlemi sonucu total protein miktarları vii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Türkiye de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları... 5 Çizelge 2.2 Türkiye de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar... 6 Çizelge 2.3 Türkiye de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan aerofungus çalışmaları... 7 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler Çizelge 3.2 Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları viii

11 1. GİRİŞ Bitkiler aleminin Mycota bölümünde iki alt bölüm (Myxomycotina ve Eumycotina) halinde incelenen mantarlar, daha sonraları Protista aleminin bir bölümü (divisio) olarak kabul edilmiştir. Günümüzde ise ayrı bir alem Fungi olarak ele alınmaktadır. (Alexopoulos ve Mims 1979). Funguslar özellikle nemli yerleri sevmelerine rağmen, değişik habitat ve substratlarda gelişebilme özelliklerinden dolayı dünyanın birçok yerinde havada, karada, suda, bitkide, hayvanların ve insanların üzerinde rastlayabiliriz. Fungusların bazıları mikroskobik bazıları ise makroskobik canlılardır (Ökten ve Asan 2009). Yaklaşık 1,5 milyon fungus türü olduğu tahmin edilse de 80 bin kadar türü tanımlanmıştır. Bunlardan makrofungus, ise mikrofungus dur. Yeryüzündeki 80 bin fungusdan 112 fungusun alerjik reaksiyona neden olduğu saptanmış olup, bunlardan da 50 fungusa atmosfer çalışmalarda daha fazla rastlanmıştır (Acremonium, Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Aspergillus, Boletus, Botrytis, Cercospora, Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia, Cylindrocladium, Dictyosporium, Didymella, Drechslera, Epicoccum, Exosporium, Fusarium, Ganoderma, Helminthosporium, Leptosphaeria, Melanomma, Melanospora, Monilia, Mucor, Mycelia, Myrothecium, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria, Penicillium, Periconia, Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Rhizopus, Rhodotorula, Scopulariopsis, Sporormiella, Stemphylium, Tetracoccosporium, Torula, Trichoderma, Ulocladium, Ustilago, Venturia ve Xylaria). Bu funguslardan Türkiye de Adana atmosferinde 34, Samsun 29, Kastamonu ve Ankara atmosferinde 35 i saptanmıştır (Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Boletus, Botrytis, Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia, Dictyosporium, Didymella, Drechslera, Epicoccum, Exosporium, Fusarium, Ganoderma, Leptosphaeria, Melanomma, Melanospora, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria, Periconia, Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Sporormiella, Stemphylium, 1

12 Tetracoccosporium, Torula, Ustilago, Venturia, Xylaria, 1-septalı askospor) (Çeter vd. 2004, Çeter vd. 2006, Erkan vd. 2006, Çeter vd. 2008,). Genellikle toprakta yaşayan funguslar çeşitli çevresel faktörlerin etkisiyle atmosfere dağılabilir ve havayla taşınabilirler ve üremeyi garanti altına almak için çok miktarda sporu atmosfere verirler. Örneğin Ganoderma applanatum (Persoon) Patouillard, bir günde 30 milyar, Daldinia concentrica(balt. ex Fr.) Ces. et De Not. günde 100 milyon, Tilletia caries (De Candolle) Tulasne 12 milyon, Penicillium Link ise 400 milyon spor üretebilmektedir (Smith 2000). Bu sporların solunması kronik bronşit, astım, fungal alerjiler, aşırı duyarlı pnömoni ve Aspergillosis gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir (Sen 2001, Sakiyan 2003, Bavbek 2006, İnal vd. 2008, Başbülbül 2011). Fungusların atmosferdeki yoğunlukları meteorolojik şartlara bağlı olarak da değişmektedir. Sayıları yaklaşık m 3 de milyon arasında bulunan mikroskobik mantar sporları, birçok bireydeki astım ve alerjik rahatsızlıkların başta gelen nedenlerindendir. Atmosferdeki spor miktarı, semptom şiddeti ile ilişkilidir. Funguslara bağlı alerjik solunum hastalıkların prevalansı, genel populasyonlarda %6, atopik kişilerde ise %20-30 olduğu düşünülmektedir (Wuethrich 1989). Adana ilinde ise solunum alerjisi gösteren çocukların %11,6 da funguslara duyarlılık saptanmıştır (İnal 2008). Avrupa ülkelerinde Cladosporium ve Alternaria duyarlılığının %3-30 olduğu saptanmıştır. Ankara ilinde Cladosporium ve Alternaria ya duyarlılık erişkinlerde %14,8 dır (Bavbek 2006). Ülkemizde henüz mikrofungusların protein profilleri ile ilgili bir çalışma bulunmamaktadır. Buna karşın yurt dışında birçok mikrofungusun protein profilleri çıkartılmış ve duyarlı kişilerde alerjik reaksiyonlara neden olan bantlar belirlenmiştir. Ülkemizdeki bu eksikliği gidermek üzere atmosferde rastladığımız, Acremonium kliense Grütz, Alternaria alternata Keisler, Aspergillus flavipes (Bainier & R. Sartory) Thom & Church, Aspergillus niger Van. Tighem, Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn, Cladosporium herbarum (Pers) Link ex Gray, Cladosporium obtectum Rabenh, Cylindrocladium floridanum Sobers&Seymour 1967, Penicillium chrysogenum Thom, türleri bu tezde çalışılmıştır. Elde edilen veriler yapılan çalışmalarla karşılaştırılarak 2

13 benzer ve ortak bantlar belirlenmiştir. Bu tez ile aynı zamanda çalışılacak türlerde bulunabilecek muhtemel yeni alerjenlerin belirlenmesi için gerekli olan ön verilerin sağlanacağı düşünülmektedir. Ayrıca funguslar her yıl tarımsal ürünlerde milyonlarca dolarlık zarara neden olmaktadır. Bu organizmaların neden olduğu hastalıkların kontrolü için, fungal türlerin teşhisi ve karakterizasyonu gereklidir. Fungusların morfolojik karakterlerine göre yapılan sınıflandırmalar, moleküler sistematikle belirlenen filogenetik ilişkilerle birlikte yeniden değerlendirilmeye başlamıştır. Taksonlar arasında morfolojik karakterlerin birbirine anlamlı olmayan benzerliği, indirgenmiş olabileceği ya da taksonlar arasında ortadan kalkmış olduğu durumlarda, filogenetik analiz için moleküler karakterlerin kullanımı önem kazanmaktadır (Blackwell vd. 2007). Fungi alemi içindeki grupların belirlenmesi ve sınıflandırılma çabaları oldukça eski olmakla birlikte, 2004 yılında başlatılan ve şu anda da devam eden AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) adı verilen ortak bir çalışma ile (yeni moleküler filogenetik yöntemler kullanılarak) fungusların tüm gruplarının en yüksek seviyede moleküler (filogenetik) sınıflandırılması hedeflenmiştir. Bu çalışmada toplam 195 taksonu içeren bir fungus grubuyla çalışılmış ve sonuçda 7 filum [Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota, Dikarya: (Ascomycota, Basidiomycota)] 10 subfilum, 35 sınıf, 129 ordo şeklinde bir sınıflandırma elde edilmiştir (Hibbett vd. 2007, Kılıçoğlu ve Özkoç 2008). Birçok fungus türünün sporlarının veya hiflerinin kendi aralarında birbirlerine benzemesi akla, akrabalık ilişkilerini getirmektedir. Bu tezde protein bantlarından elde edilen verilere göre istatistiksel analiz yapılmış ve protein profilleri çıkarılan fungusların birbirleri ile biyokimyasal özellikleri bakımından akrabalık ilişkileri de araştırılmıştır. 3

14 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI 2.1 Kaynak Araştırmaları Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları Ülkemizde atmosferdeki mantar sporlarını belirlemeye yönelik farklı yöntemlerle yapılmış birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik yöntemler kullanılmıştır. Gravimetrik yöntemde, kültür besiyeri (petri) açma ve Durham aleti ile ölçüm olmak üzere 2 yöntemden faydalanılırken, volümetrik yöntemde Burkard veya Lanzoni aletleri kullanılmıştır (Şekil 2.1). a. b. Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar c. a. Kültür besiyeri (petri) açma yöntemi, b. Durham aleti, c. Burkard aleti Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas, Zonguldak ve Trabzon illerinde gravimetrik yöntemin uygulama aracı olan Durham aleti ile yapılan çalışmalarda Cladosporium, Alternaria ve Ustilago cinsi sporları dominant olarak görülmüştür (Çizelge 2.1 ). Ankara, Çorum, Edirne, Eskişehir, Isparta, İstanbul, İzmir, Manisa, Samsun ve Trabzon gibi illerde petri açma yöntemi ile yapılan çalışmalarda, genel olarak Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Alternaria, Mycelia ve Scrohulariopsis cinsleri dominant olarak tespit edilmiştir (Çizelge 2.2). Adana, Ankara, Bursa, Diyarbakır, Kastamonu ve Samsun illerinde 4

15 volümetrik yöntemle atmosferdeki spor konsantrasyonları çalışılmış, Cladosporium, Alternaria, Leptosphaeria, Periconia, Ustilago, Fusarium, Exosporium ve Epicoccum cinsi sporlarına dominant olarak rastlanmıştır (Çizelge 2.3) (Şekil 2-2). Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere göre dağılımı Çizelge 2.1 Türkiye de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları Şehir AKSARAY ANTALYA BURDUR BURSA ÇANKIRI DÜZCE ESKİŞEHİR KARABÜK SİVAS ZONGULDAK TRABZON Araştırıcılar Pehlivan ve Koç 2000 İnce ve Pehlivan 1991 (Serik) Tatlıdil vd Bıçakçı vd (İnegöl İlçesi); Tatlıdil vd., 2000 (İznik); Bıçakçı vd (Kemalpaşa) Altın vd Serbes ve Kaplan 2008 Asan vd (Merkez); Erkara vd (Sivrihisar) Özdoğan ve Kaplan 2008 Pehlivan ve Özler 1999 Alan ve Kaplan 2004 Ayvaz vd Fungus sayısı Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus cinsleri Alternaria Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Alternaria, Ustilago, Cladosporium Cladosporium, Alternaria Alternaria, Cladosporium, Ustilago Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria 5

16 Çizelge 2.2 Türkiye de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar Şehir Araştırıcılar Fungus sayısı ANKARA Özkaragöz 1969a, b Okuyanvd ÇORUM İmalı vd EDİRNE ESKİŞEHİR Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus cinsleri 14 Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Monilia, Mycelia, Hormondendrum 20 Penicillium, Aspergillus, Mucor, Oospora, Nigrospora, Fusarium, Alternaria 10 Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Monilia, Penicillium, Rhizopus, Scolecobasidium, Stachybotrys, Torula, Ulocladium Asanvd Aspergillus, Penicillium, Alternaria Öktenvd Cladosporium, Alternaria, Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Rhizopus Asanvd.2004 ISPARTA Şimşekli vd İSTANBUL Çolakoğlu 1996 (Anadolu yakası) Asan vd.2002 (Terkos gölü) Çolakoğlu 2003 (Belgrad ormanı) Çolakoğlu 1996 (Avrupa yakası) İZMİR Ayata vd MANİSA Kalyoncu 2008 SAMSUN Ulutan vd (Çarşamba) TRABZON Topbaş vd Mycelia, Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Scopulariopsis 25 Cladosporium, Alternaria, Mycelia, Penicillium, Aspergillus 17 Cladosporium, Alternaria, Epicoccum, Botrytis, Leptosphaeria 9 Scopulariopsis, Penicillium, Cladosporium, Sphaerospermum, Aspergillus 13 Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Rhizopus, Trichoderma 18 Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alternaria, Rhizopus, Fusarium 13 Cladosporium, Alternaria, Mycelia, Penicillium, Phoma, Aspergilus 21 Cladosporium, Aspergillus, Alternaria 12 Penicillium, Alternaria, Scopulariopsis, Fusarium 11 Penicillium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus, Cladosporium 6

17 Çizelge 2.3 Türkiye de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan aerofungus çalışmaları (Çeter ve Pınar 2009 b). Şehir ADANA ANKARA BURSA KASTAMONU Araştırıcılar Beyoğlu vd ( ) Çeter vd Şakıyan ve İnceoğlu 1995 ( ) Tekin ve İnceoğlu1995 ( ) Ceylan ve İnceoğlu 1996 ( ) Pınar ve Koçak 2000 ( ) Karakuş vd ( ) Ekiz vd ( ) Koçak ve Pınar 2003 ( ) Çeter ve Pınar 2004 ( ) Ataygül vd Fungus sayısı Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus cinsleri Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria, Epicoccum, Exosporium, Drechslera, Periconia Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria Cladosporium, Alternaria, Leptosphaeria, Ustilago, Exosporium, Pleospora Cladosporium, Alternaria, Aspergillus/Penicillium, Fusarium, Epicoccum DİYARBAKIR Bursalı ve Doğan Cladosporium, Alternaria Pınar vd Çeter ve Pınar 2008 SAMSUN Erkan vd Cladosporium, Alternaria, Leptosphaeria, Periconia, Ustilago Cladosporium, Alternaria, Leptosphaeria, Periconia, Ustilago 7

18 2.1.2 Fungal protein çalışmaları Mikrofungusların protein profillerinin belirlenmesi amacıyla ülkemizde henüz kapsamlı bir çalışma yapılmamıştır. Ancak yurt dışında bazı cinslere ait taksonların protein profillerinin belirlenmesini amaçlayan çalışmalar mevcuttur. Mikrofungusların protein yapılarının belirlenmesindeki en önemli etken, hem mikrofungusların moleküler düzeyde çalışılarak morfoloji çalışmalarına sistematik açıdan yarar sağlanacağı düşüncesi, hem de alerjen bantların ortaya çıkarılarak astım ve alerji alanındaki uzman hekimlere yardımcı olma düşüncesi ön plana çıkmıştır. Bendorf vd. (2008), iç ortam atmosferik mantarı Aspergillus versicolor un spor allerjenlerini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada, spor proteinleri için 2 boyutlu jel elektroforezi ve hasta serumlarından immünoblot yapmış ve 20 den fazla alerjen tanımlamış ve bunların %90 ından fazlasının hasta serumlarıyla pozitif etki gösterdiğinin sonucuna varmışlardır. Li vd. (2008), Alerjenlerin başında gelen Cladosporium cladosporioides in immünolojik analizi ve kütle spektrometrisini tanımlamak amacıyla yaptıkları çalışmada, Cladosporium cladosporioides i karbonat tampon çözeltisi ile ekstrakte etmişler. Daha sonra bu ekstrakttan SDS-PAGE yöntemiyle protein bantlarını belirlemişlerdir. Elde edilen jel görüntüsünde 14 bant olduğu kaydedilmiş ve bunların en belirginlerinin 72 kd, 61 kd, 42 kd, 36 kd, 35 kd, 34 kd, 24 kd, 22 kd, 18 kd ve 14 kd luk protein bantları olduğunu belirtmişlerdir. Al-Suwaini vd. (2001), Riyad atmosferindeki funguslar ve bunların ekstraktlarının allerjenik tepkilerini araştırdıkları çalışmalarında, örnekleri Riyad atmosferinden izole etmişlerdir. Atmoferden elde ettikleri mikrofunguslardan Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Penicillium ve Ulocladium cinslerini ekstrakte etmiş ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez analizi sonucunda elde 8

19 edilen protein bantlarının 13 ile 80 kda arasında olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca elde edilen ekstraktlarn sıvı ve liyofilize formları steril edilerek, bronşiyal astımı ve alerjik riniti olan hastalara deri testi olarak uygulamışlardır. Deri testi sonucunda hastaların %13 ü bu fungal ekstraktlara pozitif tepki göstermiş, alerjik duyarlılıklarının olduğunu göstermişlerdir. El-Kazzaz vd. (2008), moleküler biyoloji teknikleriyle bazı Fusarium taksonlarının tanımlanması için yaptıkları çalışmada, Fusarium cinsine ait 7 taksonu (F. semitectum, F. culmorum, F. moniliforme, F. solani, F. graminearum, F. oxysporum f.sp. lycopersici ve F. oxysporum f. sp. vasinfectum) morfolojik ve patolojik karakterlerine göre tanımlamışlardır. Bu taksonları tanımlamak için SDS-Page Poliakrilamid jel elektroforez yöntemini uygulamış ve elde ettikleri protein bantlarının ölçülmesi sonucu elde ettikleri verileri UPGMA kümeleme (cluster) analizi yapmışlardır. Kümeleme analizi sonucu dendrogramları çıkarılan Fusarium izolatları arasında %93,8 benzerliğin olduğunu saptamışlardır. Gupta vd. (2002), önemli bir inhalant alerjen olan Curvularia türlerindeki IgG ve IgE bağlayan komponentleri araştırmışlardır. 7 farklı Curvularia türünde (C. lunata, C. andropogonis, C. clavata, C. lunata var. lunata, C. pallescens, C. geniculata, C. senegalensis), yarı sentetik bir ortamda 13 günde geliştirilen kültür örneklerinin SDS-PAGE, immunoblat ve ELISA analizlerini yapmışlardır. Farklı Curvularia türlerindeki protein bandı SDS-PAGE yöntemi ile çıkarmışlardır. Elde edilen proteinlerinin 12, 20, 31, 45, 53, 78 ve 97 kd luk özellikle IgE bağlayıcı ajanlar olduklarını saptamışlardır. 2.2 Kuramsal Temeller Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri Acremonium Link ex Fr. 9

20 Yaklaşık 100 kadar türü olan Acremonium cinsi, genellikle yavaş gelişen ve hoş olmayan kokusuyla tespit edilebilir. Acremonium cinsi yutulduğunda toksik etki yapabilir ve ayrıca mantar alerjisi olan bireylerde mide bulantısı, kusma ve ishale neden olabilir. Tırnak enfeksiyonlarına ve menenjite neden olabilir (Hee vd. 2012, ). Çürümüş ya da ölü bitkikerde, toprakta, gıdalarda, nem düzeyi yüksek olan iç ortamlarda üreyebilirler. Saman nezlesi, astım, enfeksiyon ve diğer ciddi hastalıklara neden olabilen alerjendir. trichothecene denilen mikotoksin üretme potansiyeline sahiptir. Penisiline çok benzer bir çalışma mekanizması olan Sefalosporin denilen antibiyotik yapmak için kullanılırlar ( 2012). Acremonium kiliense Grütz Sabouraud dekstroz agar, glucose ve malt extrakt besiyerlerinde yavaş gelişirler. Kolonileri malt extrakt agar üzerinde 20 C de 10 günde cm olmakta, pembemsi, az ya da çok ıslak görünümlü bazen merkezde kümeli, Sabouraud agar ve daha az olarak MEA üzerinde kahverengi renkte olmaktadır. 12 gün inkübasyondan sonra çok sayıda şeffaf, kromofil çeperli 4-8 µm çapında klamidosporlar oluşmaktadır. Konidiler silindirik x µm ölçülerindedir. A. tubaki ye benzer ancak A. tubaki çok daha fazla ve genellikle zincirler halinde klamidospor oluşturur ve besiyerinde herhangi bir kahverengi renk oluşturmaz. A. kiliense, yaygın bir toprak fungusu olup çayırlardan, tahıl ekili tarlalardan vs. izole edilmiştir (Hasenekoğlu 1991). Bu fungus türü, saçta kepeklenme, deri ve tırnak enfeksiyonları, eklem ve alerjik rahatsızlıklara sebep olmaktadır (Pastorino vd. 2005). 10

21 Alternaria Nees ex Fr. Dış ortam havası fungusların başında gelse de kolay bir şekilde açık olan camdan içeri girebilir, insan ve hayvan üzerine yapışan sporları sayesinde iç ortama girebilirler. Alternaria cinsi yaklaşık olarak 50 türden oluşmaktadır ve bunlar çoğunlukla saprofit veya bitki patojenidirler. Alternaria alternata yaygın olarak bitkilerde, odun, odun hamuru, tekstil ve besinlerde saprofitik olarak bulunur. Dağılımı kozmopolitandır ( A.alternata, Deuteromycetes in bir üyesi, en önemli alerjenik mikrofunguslardan birisidir. (Achatz vd., 1995, Yunginger vd.,1980, Bush vd., 1997, Paris vd.,1991). A. alternata yaprak dış yüzeylerinde gelişir ve havada özellikle de Temmuz ve Ağustos aylarında bölgeye bağlı olarak pik yapar (metre küpte 500 spora ulaşabilir). A. alternata nın alerjenleri duyarlı kişilerde çok düşük dozda bile reaksiyon verebilir (Gelişken 2008). Genellikle ekstrinsik astıma neden olur. Akut semptomları ödem ve bronşial spazmı içerir, kronik hastalarda pulmonarik amfizem gelişebilir Havada ve yaprak yüzeylerinde bulunan A. alternata AAL toksin üretemez. Fitotoksin alternariol (bitkiler için toksik bir bileşiktir) ve benzer metabolitler üretir. Ayrıca A. alternata tenuazonic asid ve ürettiği diğer toksik metabolitleri ile hayvanve insanlarda hastalıklara neden olabilir (Gelişken 2008). Alternaria sporlarının burun, ağız verespiratör cihazı üstünde birikebileceği ileri sürülmektedir ( Kolonileri yaygın, genellikle gri, koyu siyahımsı kahverengi veya siyah görünümlüdür. Miselyum tamamen batık veya kısmen yüzeysel, hifler renksiz, zeytinimsi kahverengi veya kahverengidir. Nadiren stroma oluşmaktadır. Konidiyofor koyu renkli, bölmeli, bazen belirsiz, dallı veya dalsız olduğunda uçta tek bir por vardır ve bu pordan tek bir konidi oluşmakta veya uçtaki hücrenin pora lateral pozisyondaki bir bölgesinden uzaması sonucu genikulat olabilmektedir. Yeni oluşan bu dal uçta bir konidi oluşturacağı gibi, başka bir genikulat uzantının başlangıcı olabilmekte, konidiyumlar da doğrudan doğruya fonksiyoner konidiyofor oluşturabilmektedir. Konidiler tek tek oluşabildiği gibi daha sık olarak basit veya dallı zincirler meydana getirmektedir. Koyu pigmentli (kahverengi tonları, siyahımsı, kırmızımsı, yeşilimsi ve sarımsı) ovid, distal uca doğru keskin veya yumuşak şekilde sivrilmekte, düz veya pürüzlü, ovoid şekil genellikle gelişmenin çok erken evrelerinde 11

22 ve genellikle ilk bölmenin oluşumundan önce belirgin bir şekilde gaga şeklini almaktadır. Kültürde sporlanan türler kısa sürede sporlanma yeteneklerini kaybederler. Bu yüzden yulaf agar, mısır unu agar, ve patates-havuç agar gibi doğal besiyerlerinde üretilmeleri ve UV ye yakın ışıkta inkübe edilmeleri önerilmektedir (Rao 1965, Özmay 2007). Alternaria alternata (Fr.) Keissl. Majör alerjen olan Alternaria alternata kolonisi genellikle siyah veya zeytinimsi siyah, bazen de gri renklerde olabilir. Konidiyoforlar tek veya küçük gruplar halinde, dallı veya basit, düz veya kıvrımlı, bazen genikulat soluk veya orta derecede altınsarısı, dış çeperli 50 µm a kadar uzunlukta olabilir. 3-6 µm kalınlığında, 1 veya birkaç apikal por u vardır. 1-3 bölmelidir. Konidiler genellikle uzun sık dallanan zincirler halinde, obklavat, obpriform, ovoid veya elipsoidal, genellikle kısa konik veya silindirik bir gagaya sahip, bazen bu gaga konidinin üçte biri kadar uzun olmakta, konidiler, soluk veya orta dereceli altın sarısı renginde, düz veya verrükuloz çeperli, 8 e kadar enine, ve birkaç tane de boyuna veya oblig bölmeli bütün uzunluk µm, eni ise 7-18 µm, gaga soluk renkli 2-5 µm kalınlığındadır (Ellis 1971, Donsch vd. 1980). Yaygın olarak bulunan Alternaria alternata sporlarına toprak, bitki, gıda ve iç ortam havalarında rastlanılabilir. Önemli bir alerjen olan A. alternata nın spor ve misel parçaları solunduğunda duyarlı kişilerde ciddi hassasiyette astıma neden olabilir, hatta ölümcül astıma neden olabilir (Kılıç 2008). Atmosferik çalışmalarda sık karşılaşılan bu tür son derece yaygın bir saprofit olup, birçok bitki artığı, gıda, toprak, tekstil maddeleri üzerinde bulunmaktadır. 12

23 Aspergillus Mich. ex Fr. Aspergillus lar yeryüzünde hemen her yerde yaygın olarak bulunan hifli mantarlardır. Doğal yaşam ortamları toprak ve çürüyen bitki materyalidir. Doğadaki temel işlevleri karbon ve azot çevrimiyle ilgilidir. Bu mantarlar ürettikleri enzimler sayesinde tüm organik maddeleri ayrıştırarak kullanır ve saprofit olarak yaşarlar. Hayvan ve insanlarda patojen hale geçebilirler. Üreme hız ve kapasiteleri yüksektir. Atmosfere dağılan konidiumlar havada asılı kalabilir, toz ve diğer parçacıklarla her yere taşınabilirler. Havada en yüksek yoğunlukta bulunan mantarlardan biridir. Ortam çalışmalarında insanların solunumla günde en az birkaç yüz konidi aldıkları belirlenmiştir (Chazalet vd. 1998, Hosphental vd. 1998, Kantarcıoğlu vd. 2003). Koloniler ekseri hızla gelişirler, renkleri türlere ve gelişme koşullarına bağlı olarak beyaz, sarı, sarımsı kahverengi, siyaha yakın kahverengi, kırmızı veya yeşiltonlarında harelidir. Sık konidiyoforların oluşturduğu bir keçe görünümündedir. Besiyerine dağılan pigment üretebilirler ve bu pigmentin rengi koloninin hava misellikısmının renginden farklı olabilir. Hifler bölmelidir, ince veya kalın olabilir. Hifhücreleri genellikle çok çekirdeklidir. Miselyum çeşitli enzimler ve bazı mikotoksinler üretme yeteneğine sahiptir. Vejetatif hifin ayak hücresi denen özelleşmiş bir hücresinden dik olarak çıkan konidiyofor denen konidiyum taşıyıcı hiflerin ucu şişkinleşmiştir. Yukarı doğru oluşturdukları yuvarlak veya ovalbiçimdeki baş kısmına vezikül adı verilir. Vezikül üzerindeki üreyebilen bölüm, türlere göre farklıdır ve bu özellik tür tanımında kullanılır. Konidiyum yapıcı hücreler olan fiyalidler ya doğrudan vezikülün üzerinde veya metulaların üzerinde doğarlar ve altındaki sap hücre ile birlikte konidiyumlu baş denen tipik görünümüoluştururlar. Konidiyoforun uzunluğu; bölmeli, bölmesiz veya dallanmış oluşu veduvarının düz, pürtüklü, dikenli olması gibi özellikleri türe göre farklıdır. Konidiyumlar bir hücreli, duvarları düz veya pürüzlü, dikenli; şeffaf veya pigmentli olabilirler (Kantarcıoğlu vd. 2003). Aspergillus türleri doğada geniş bir bölgeye yayılmış olan saprofit mantarlardır ve Aspergillosis e (Solunum problemleri, Öksürük, Ateş, Baş Ağrıları, Göğüs ağrısı, Tükenme ve düşük enerji) neden olabilir ayrıca bağışıklık sistemi zayıf olan kişilerde ve 13

24 akciğer rahastsızlğı olan kişilerde de zararlı olabilirler. ilgilidirler ( 2012). Aspergillus, ascomycetlerin eşeysiz devresi gibidir. Aspergillus türleri dünyanın her yerinde yaygın olduğu halde ılık iklimlerde daha yaygındırlar. Bu türler organik materyallerin üzerinde gelişirler. Birçok türü kozmopolitandır. Kabul edilmiş 182 türü olmasına rağmen sadece 40 tanesi sık sık tespit edilmiştir. Aspergillus türlerinin bir kaçının oldukça büyük etkileri vardır. A. flavus güçlü bir karsinojenolan aflotoksinin başlıca üreticisidir. A. fumigatus hızla yayılan aspergillozis hastalığına neden olduğundan önemlidir. Aspergillus fumigatus un küçük konidia demeti genellikle üst solunum yolunda birikmekte, küçük sporlar tek başına aşağı solunum yollarına ulaşmaktadır (Burge, 1989; Kurup vd., 1993). A. versicolor, A. fumigatus gibi inşaat malzemelerinin üzerinde yaygın olan birkaç tür, bazı bölgelerde son baharda havada yaygın olarak bulunurlar ( Bu cins kısaca dik konidiyoforları, uçlarında vesikülleri ve vesiküllerin üzerinde bunları kaplamış sterigmaları ile karakterize edilirler. Sterigmalar bir tabaka üzerinde gelişebilir veya doğrudan doğruya vesiküllerden çıkabilirler, fiyalidlerden (sterigma) bazipetal konidi zincirleri olşur. Vejetatif miselyum dallı ve bölmeli hiflerden oluşmuş renksiz, parlak renkli veya birkaç türde kahverengimsi hale dönüşmektedir. Konidiyoforlar ayak hücrelerinden gelişmektedir. Ayak hücreleri özelleşmiş, genişlemiş, kalın çeperli hif hücreleridir. Konidiyoforlar bu hücrelerden dik olarak gelişirler. Aspergillus türleri ılıman iklimlerde toprakta çok yaygın olarak bulunur. Ayrıca kompostlarda, çürüyen bitki atıklarında, depolanmış tahıllarda v.s. de bol miktarda bulunurlar. Koloni özelliklerinden, koloninin rengi, koloni altının rengi, büyüme hızı, büyüme şekli, bazal miselyum, yüzey miselyumu, konidi başlarının nisbi bolluğu ve düzenlenmesi, konidi başlarının şekli gibi kriterler önem arzeder (Raper ve Fennell 1965, Özmay 2007). 14

25 Aspergillus niger Van. Tighem Aspergillus niger, organik maddeler üzerinde aerobik koşullar altında gelişen flamentli bir fungustur. Doğada toprak, çürüyen bitki materyalleri gibi organik yüzeylerden gelişirler. Substrattan gelişen sporlar atmosfere dağılır ve bu sayede atmosferde de sık rastlanılır. A. niger geniş bir sıcaklık aralığında gelişebilir (6-47 C) ancak optimum sıcaklığı C gibi yüksek bir değerdir. Büyümeyi sınırlayan su aktivitesi diğer Aspergillus türleri ile karşılaştırıldığında yüksek bir değerdir. (0,88). Ayrıca A. niger 1,4-9,8 gibi geniş bir ph aralığında gelişebilir. Bu özellikler ve hava ile dağılan konidiosporların verimli üretimi bu türün sıcak ve nemli bölgelerde daha sı ve geniş bir yayılım göstermesini sağlar (Schuster vd. 2002). Aspergillus niger kolonileri Czapek agar besiyerinde yavaş gelişmekte ve 10 gün-2 haftada oda sıcaklığında 2,5-3 cm olmaktadır. Oldukça gevşek-kompakt beyaz-hafif sarı bazal miselyum ve bol miktarda dik ve genellikle yığınlar halinde toplanmış konidi yapıları bulunmaktadır. Tipik olarak karbon siyahına yakın siyah renkte veya bazen koyu kahverengimsi siyah renkte, koloni yüzeyini dar bir kenar hariç tamamen kaplamakta ve koloni altı genellikle renksizdir. Bazen merkezde soluk sarı, konidi başları tipik olarak büyük ve siyah, özce globoz, daha sonra radiyat veya yaşlandığında iki veya daha fazla gevşek iyi belirlenmiş sütun halinde yarılmaktadır. Ayrıca A. niger Otomikoz (Kulakta görülen mantar enfeksiyonu), denen daha çok tropikal ve subtropikal bölgelerde görülen kronik bir mantar enfeksiyonuna neden olabilir (Ayberkin 2009). Aspergillus flavipes Thom ve Church Czapek agar besiyerinde koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. 10 gün- haftada oda sıcaklığında 3-5 cm olmaktadır. Nispeten derin bazal misellerden ve havai hiflerden bol miktarda sporlanma olmaktadır. Deve tüyü- soluk fındık renginde, koloni yüzeyi beyaz konidi başları veya ırklarında kahverengi konidiyoforların renginde, bazı ırklarda özellikle yeni izole edilmiş olanlarda sıkı yünümsü sarı- portakal renkli hif kitleleri, çok 15

26 sayıda dallanma göstererek iç içe girmiş şekilde gelişmekte, kalın çeperli uzamış hif elementlerinden ibarettir. Koloni altı genellikle sarı- kahverengi- kırmızı- kahverengi tonlarındadır. Bazende oldukça koyu renkli, konidi başları gevşek şekilde kolumnar. Bazı ırklarda kısa, bazı ırklarda ise radiyat olma eğilimi göstermektedir. Devamlı olarak beyaz veya çok soluk deve tüyü renginde, sarı-kahverengi konidiyoforlar ile kontrast oluşturmaktadır x µm ölçülerindedir. Havai hiflerden gelişenler daha incei konidiyoforlar genellikle x µm ölçülerinde, bazen daha küçük, ancak yaşlı kolonilerin kenarlarında gelişenler 2-3 mm uzunlukta, çeper nisbeten kalın µm, mikroskop altında sarı- açık kahverengi renkte, renkler daha çok çeperin dış tabakasında toplanmıştır. Bunun dışında çeper düz veya hafif granüllü, vesiküller subgloboz-vertikal olarak uzamış, genellikle açık renklidir. Büyük başlarda µm çapında, globoza çok yakın küçük başlarda ise konidiyoforların genellikle iki katı kadar çapta, sterigma iki seridir. Bazı ırklarda renksizdir. Diğerlerinde hafif renklidir. Küçük başlarda vesikülün üst kısmından gelişmektedir. Büyük başlarda ise vesikülü kaplamaktadır. Birinci seri sterigma x µm. İkinci seri ise 5-7 x µm ölçülerindedir. Konidiler globoz-subgloboz, 2-3 µm çapındadır. Düz çeperli, renksiz veya renksiz gibi hülle hücreleri geliştiğinde şişmiş ve genellikle düzensiz dallı hif elementleri veya daha büyük ve kalın çeperli uzamış hücreler şeklindedir. Askoma (kleisotesyumlar) sadece birkaç izolatta görülmektedir. Üç hafta içersinde hif kitlelerinin arasından gelişmektedir. Çeper birkaç tabaka sarı ve ince çeperli hiflerden oluşmuş, askuslar genellikle 4 sporlu, askosporlar subgloboz, belirsiz bir ekvator olukları vardır. Düz çeperli şeffaf soluk sarı, x µm ölçülerindedir. Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn Czapek agar besiyerinde koloniler hızlı gelişmekte ve 10 günde oda sıcaklığında 5-6 cm olmaktadır. Vejetatif miseller çoğunlukla batık ancak tipik olarak derin gevşek yapılı, uzun saplı konidi yapıları yüzeyden gelişmekte önce beyaz, birçok ırkta soluk yeşilimsi sarı, zeytin yeşili deve tüyüne yakın, zeytin yeşili-sarı veya sarımsı limon renkli, diğer ırklarda sarımsı limon sarısına yakın-donuk limon sarısı, bazı ırklarda ise biraz yeşil 16

27 renk göstermekte ve hızla koyu zeytin yeşili-deve tüyü haline dönüşmektedir. Daha sonra tipik olarak açık-donuk kahverengi tonlarına kaymakta, koloni altı renksiz, konidi divergent veya gevşek şekilde yapışık konidi zincirlerinden oluşmaktadır. Nadiren gerçek sütunlar oluşmakta, konidiyoforlar genellikle batık misellerden gelişmekte, renksiz, tipik olarak uzun ve 4-5 mm, bazı ırklarda 2-5 mm yi nadiren geçmekte, tabandan itibaren 4-6 µ kalınlıktan yukarıya doğru genişleyerek vesikülün altında µm olmaktadır. Çeper nispeten ince bazı ırklarda bütün çeper boyunca veya büyük bir çoğunluğunda belirgin şekilde pürüzlü, diğer ırklarda hemen tamamen düz, sadece terminal bölgede pürüzlük izleri farkedilmekte, vesiküller tipik olarak globoz, daha az olarak şişe şeklinde, sterigmalar bütün yüzeyini veya üstten ¾ kısmını kaplamış, genellikle ince çeperli ve kolayca deforme olmakta, µm veya bazı ırklarda µm çapında (uzun saplar üzerinde büyük başlarda), sterigma değişken, genellikle bir seri, x 3-5 µm ölçülerinde veya iki seri, birinci seri 8-12 x 4-5 µm, ikinci seri 8-10 x µm ölçülerinde, her iki durum aynı ırkta ve hatta aynı konidi başında görülmekte. Yaşlı yapılarda sterigmalar homojen şekilde şişmemiş, konidiler az veya çok priform veya eliptikal, ve bazı ırklarda böyle kalmakta, diğer bazı ırklarda ise olgunlaştığında genellikle subgloboz veya globoz olmakta, farklı ırklarda büyüklükleri değişmekte, genellikle globoz veya subgloboz olduğunda µm, eliptikal olduğunda 8.0 bazen de 10.0 µm uzun eksenli, bazı ırklarda düz çeperli, diğerlerinde ise az veya çok pürüzlü, gençken genellikle daha fazla ekinulat, genellikle yeşilimsikahverengimsi sarı tonlarında, çok nadir olarak sklerosyum gelişmektedir Cladosporium Link ex Fries: Link Cladosporium ların çoğu saprofit veya bitki patojeni olan yaklaşık olarak 500 türden oluşan bir cinstir. Bunların sadece 20 tanesi yaygındır. Cladosporium sphaerosphermum, C. cladosporoioides ve C. herbarum en yaygın türlerdir. Hepsi bitkiler, odun, odun tozu ve besinler üzerinde bulunur. Üç tür içinde C. sphaerosphermum türü özellikle inşaat malzemeleri üzerinde bulunur. Diğer ikisi yaprak yüzeylerinde bulunurlar. Haziran, Temmuz veya Ağustos aylarında pik yaparak havada yüksek düzeylerde bulunurlar (metre küpte spora ulaşabilirler) 17

28 ( Koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. Genellikle yeşilimsikahverengi, siyahımsı-kahverengi, bol miktarda konidi geliştiğinde tozlu bir görünüm almaktadır. Vejetatif hifler, konidiyoforlar ve konidiler aynı şekilde pigmentli, konidiyoforlar vejetatif hiflerden az veya çok farklı, dik, düz veya dalgalı, dalsız veya apikal olarak dallı, çok sayıda dallanmış konidi zinciri oluşturmaktadır. En alttaki konidi en büyük ve bölmeli olup ramokonidi adını almakta, üstteki konidiler ise tek hücreli, elipsoidal veya fusiform, konidiyoforlar ucunda bulunan 1-3 sayıda geniş şekilde konik dentiküller üzerinde veya subapikal olarak bir bölmenin altından veya daha önce gelişmiş konidilerin uçlarından Blastokonidiler gelişmekte, blastokonidiler bir bölme ile ayrılmakta, bölme kalın çeperli ve koyu renkli, konakçı bitkilerde ve invitro olaraközellikle amonyum sülfat bulunan besiyerlerinde stomatik yapılar oluşmaktadır (Ellis 1971, Domsch ve ark, 1980, Von Arx, 1981, Barron 1983,). Dik, pigmentli, ağaç benzeri blastospor zincirlerden oluşmuş dalları olan konidiyoforlar bu cins için karakteristik bir özelliktir. Cinsin tanımı genellikle sadece konidiler ile yapılabilir. Konidilerinde çok belirgin bağlantı kalıntıları görülmektedir (konidi çıkıntıları), konidiler büyüklük ve bölmemelilik bakımından önemli değişim gösterir Organik atıklar üzerinde yaygın olan bir cinstir. Aynı zamanda birçok konakçı üzerinde yaşayan parazit birçok türü vardır (Barron 1983, Özmay 2007). C. herbarum çok farklı antijen üretebilir ve yaklaşık olarak toplumun %10 u Cladosporium a duyarlıdır. Yaprak yüzeylerinde bulunan Cladosporium türleri materyal toksisitesi gösteren metabolit üretimi yapmaz ( Cladosporium herbarum (Pers.) Link ex S.F. Gray Bitki patojeni olan C. herbarum, toprakta çürümüş bitkiler üzerinde gelişebilirler. Tabii ortamlarda ve kültürlerde koloniler yaygın, zeytin yeşili veya zeytinimsi kahverengi renklerinde bulunur. Velvet, koloni altı malt ağar besiyerinde yeşilimsi siyah, stroma bazen özellikle otsu gövdelerde iyi gelişmekte, konidiyoforlar düz veya dalgalı, bazen genikulat, çoğunlukla nodoz, soluk-orta zeytinimsi kahverengi veya kahverengi düz çeperli, 250 mikrona kadar uzunlukta, 3-6 mikron kalınlıkta, terminal veya interkalar şişkinlikler varsa 7-9 mikron çapındadır. Konidiler oldukça uzun, genellikle dallanmış 18

29 zincirler halinde, elipsoidal veya oblong, uçlarda yuvarlak soluk- orta kahverengi veya zeytinimsi kahverengi oldukça kalın çeperli, belirgin şekilde verrukuloz, uzun olmayan siğilli, tamamiyle 0-1 bölmeli, bazen daha fazla bölmekler de oluşabilmektedir. 5-23x 3-8 (çoğunlukla 8-15x4-6) mikron bir ucunda veya iki ucunda çıkıntılı, çıkıntılar küçük fakat açık şekilde dışarıya çıkmış, çok kozmopolit bir türdür. Özellikle ılıman zonlarda yaygın, otsu ve odunsu bitkiler üzerinde, havadan, topraktan gıda maddelerinden tekstil maddelerinden vs. izole edilmektedir (Ellis 1971). Cladosporium herbarum ve Alternaria alternata türleri alerjiye neden olan mikrofungusların başında gelmektedir. Şimdiye kadar tespit edilmiş alerjenlerin büyük bir kısmı C. herbarum un hücre içi proteinleridir (Breitenbach 2002). Cladosporium obtectum Rabenh Koloniler yaprakların altında, yaygın, soluk zeytinimsi kahverengi, ince, konidiyoforlar dalgalı, genellikle dallı, çok soluk veya orta soluk kahverengi, düz çeperli, çok sayıda belirgin ve koyu renkli çıkıntılı, 50 µm a kadar uzunluktadır. Ancak genellikle daha kısa, 3-7 µm kalınlıkta, konidiler zincir şeklinde, elipsoidal veya silindirik, 0-5 bölmeli, soluk-orta kahverengi, düz veya verrukuloz, 8-34 x 5-8 µm, artemisia maritima yaprakları üzerindedir (Ellis 1976) Penicillium Link ex Gray Penicillium, Ascomyceteslerin eşeysiz devresini gösterir ve Penicillium türleri dünyanın her yerine dağılmış olduğu halde ılıman iklimlerde dahayaygındırlar. Bu türler organik materyallerin üzerinde gelişirler. Doğada; hava, toprak ve bitkilerde yaygın şekilde bulunduğu gözlenmiştir (Erbakan,1994). Birçok türü kozmopolitandır. Kabul edilen 225 türü var iken sadece 70 ine sık rastlanmıştır. Penicillium türlerinden bazılarının ekonomik önemi vardır ( 19

30 Katı besiyerinde hızlı ürerler. Çoğunlukla koloni yüzeyleri önceleri beyaz sonradan mavi-yeşil ve tümü pudramsı bir görünüm alır. Kolonilerin tabanları genellikle beyazdır. Septalı hifler, dallanan ve dallanmayan konidiyoforlar ve konidiyoforlarda metula adı verilen ikinci dallanmalar görülür. Konidiyumların oluşturduğu ve dallanma göstermeyen diziler veya zincirler bulunur. Tüm bu yapı Penicillium veya fırça görünümündedir (Erbakan 1994, Hifler bölmeli, dar, genellikle 2-3 µm eninde, renksiz veya parlak renkli, düzensiz dallanmakta ve yoğun ve kompakt miselyum oluşturmaktadır. Koloni kenarı genellikle çok belirgin, konidiyoforlar farklılaşmamış yüzey altı veya havai hiflerden gelişmekte, saplar nispeten dar ve ince çeperli, genellikle 1-2 bölmeli, bazı türlerde apikal olarak şişkin, ancak vesiküller daima 10 µm dan küçük çapta, karakteristik şekilde penisillat dallanmış ve penisillus denilen yapılar gelişmektedir. Bunlar genellikle terminal ve doğrudan saplar üzerinde gelişmekte veya bir, iki ve daha fazla metula üzerinde gelişmekte, fiyalidler terminal ve komptakt vertisiller halinde, nispeten kısa, nadiren 15 µm u geçmekte, ampuliform, çok nadir olarak silindiroidal, düz çeperli, uç kısmı genellikle 3 µm dan kısa ve daima düz, konidiler bazipetal olarak gelişmekte, genellikle uzun zincirler halinde, tek hücreli, çok küçük, genellikle 2-4 µm çapında, nadiren 6 µm u geçmekte, küresel, elipsoidal, priform veya apikulat, nadiren silindiroidal, kitle halinde gri-yeşil, gri-mavi veya gri, nadir olarak zeytin veya kahverengidir (Pitt 1979, Hasenekoğlu 1991). Penicillium chrysogenum Thom Eskiden Penicillium notatum bilinen Penicillium chrysogenum kolonileri tipik olarak velvet az veya çok saplı sıkı yapıdadırlar. Konidiyoforlar substrattan bir ekin şeklinde gelişmektedir. Bazı ırklarda koloniler az veya çok früktoz, bunlarda konidiyoforlar havai hiflerden gelişmektedir. Genellikle radiyat şeklinde oluklu, eksudat genellkile bol miktarda oluşur. Parlak sarı damlalar halinde, koloni altı gelellikle eksudatla aynı renkte parlak sarı renkte, yaşlandığında ise kahverengiye döner. Yüksek su koşulları olan ortamlarda iyi yetişir (Hasenekoğlu 1991, Ward vd. 2010). 20

31 Cylindrocladium Morgan Vejetatif miselyum yünümsü, önce beyaz, yaşlandığında kahverengi olmaktadır. koloni hızlı yayılmakta ve merkezde açık-koyu kahverengi, zincirler halinde çok sayıda klamidospor ve mikrosklerezyum kümeleri oluşmaktadır. konidiyoforlar iyi gelişmiş ve farklılaşmış dik veya die yakın, uç kısmına yakın defalarca dallanmakta ve penisillat bir şekil oluşturmaktadır. konidiyoforların ekseni genellikle uzamakta ve ucu şişmiş bir uzantı oluşturmakta, konidiler silindirik çok bölmeli, palizat benzeri bir küme oluşmakta ve mukusla bir arada tutulmakta, simetrik olarak yuvarlak veya hemen hemen tamamen turunkat uçları vardır (Hasenekoğlu 1991). Cylindrocladium türlerinin büyük çoğunluğu bitki paraziti olup özellikle ılıman kuşakta yaygındır. Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour Konidiyofor dalları bir saptan lateral olarak gelişmektedir. primer ve sekonder dallar bölmesiz veya bir bölmelidir. 10,2-26,0 µm uzunluğunda, tersiyer dallar bölmesiz, 7,8-10,2 µm, fiyalidler şeffaf, 7,8-15,6 µm, konidiler şeffaf, silindirik, bir bölmeli, 36,4 57,2 x 2,6-4,6 µmsteril flamentlerin ucunda, globoz bir vezikül vardır. Ekseri izolatlarda sekonder steril flamentler bulunmaktadır. Dünyada tropik ve subtropik bölgelerde yaygın olmakla beraber, birçok bitki çeşitlerinde patojendir. 21

32 3. MATERYAL VE YÖNTEM Çalışmada 6 farklı mikrofungus cinsine ait 9 farklı tür kullanılmıştır. Kullanılan mikrofungus örnekleri, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası çalışmalarında elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler içerisinden, atmosferde sık rastlanan taksonlar arasından seçilmiştir. Çalışma 6 aşamada gerçekleşmiştir. 1. Mikrofungusların üremesi için uygun besiyerlerinin hazırlanması. 2. Özütlenecek mikrofungusların üretilmesi. 3. Üretilen mikrofunguslardan protein özütlemesi. 4. Elde edilen özütlerin total protein miktarlarının belirlenmesi. 5. Elde edilen özütlerin SDS-Page yöntemi ile protein profillerinin belirlenmesi. 6. Protein profilleri belirlenen örneklerin elde edilen veriler kullanılarak MVSP istatistik programında dendrogramlarının çizilmesi. 3.1 Örneklerin Temini Çalışmada, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası araştırmalarından elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan örnekler çizelge 5 de gösterilmiştir. Çalışılan örneklerin uzun süre saklanması için steril şartlarda birer yedekleri yatık Malt extract agarlı tüplere inoküle edimiştir (İmalı 2005). 22

33 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler Örnek adı Acremonium kiliense Grütz Alternaria alternata Keisler β Aspergillus flavipes Bain ve Sartory Aspergillus niger Van. Tighem Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray Cladosporium obtectum Rabenh. Cylindrocladium floridanum Sobres ve Seymour Penicillium chrysogenum Thom Örneklerin Alındığı Üniversite ve Teşhis Eden (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd. 3.2 Örneklerin Çoğaltılması Besiyerlerinin hazırlanması Çalışma boyunca 3 farklı özellikte besiyeri kullanılmıştır. Kullanılan besiyerleri; Malt extract agar (MEA), Malt extract broth ve Czapek - dox agar (CA) dır. Besiyerlerinin içeriği ve hazırlanması aşağıda belirtilmiştir. Malt extact agar (MEA) Distile Su Malt Extract Pepton Agar agar 1000ml 30 gr 3gr 15 gr Tartımı yapılan maddeler ve distile su 1000 ml. lik erlene konulup, ısıtıcılı manyetik 23

34 karıştırıcı ile çözdürülür. Otoklavda 1.1 atmosfer basınç altında 121ºC de 15 dakika sterilize edilir. Stok kültür için hazırlanacak olanlar ise ısıtıcılı manyetik karışıtırıcıda eritildikten sonra 15 ml falkon tüplere, içerisinde 10'ar ml besiyeri olacak şekilde dağıtıldıktan sonra otoklavda sterilize edilir ve otoklavdan çıktıktan sonra tüpler yatırılarak dondurulur (Rapp1974). Malt extact broth (MEB) Distile Su Malt Extract 1000ml 17 gr Dehidre besiyeri, 17,0 g/l olacak şekilde damıtık su içinde eritilir ve amaca uygun kaplara (erlen, tüp vb.) dağıtıldıktan sonra, otoklavda 115ºC de 10 dakika sterilize edilir. Aşırı ısıtılmamalıdır. Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarı renkli olup, 25 C da ph'sı 4,8±0,2 dir (Rapp1974). Czapek - dox agar (CA) Distile Su NaN0 3 K 2 HP0 4 MgS0 4 KCl FeS0 4 Sukroz Agar agar 1000ml 3 gr 1 gr 0,5 gr 0,5gr 0,01 gr 30 gr 13 gr 24

35 Dehidre besiyeri, 48,0 g/l olacak şekilde ısıtılarak damıtık su içinde eritilir ve otoklavda 121 C'da 15 dakika sterilize edilir. Otoklav sonrasında C'a soğutulup, sterilpetri kutularına 12,5'er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeri bulanık ve beyazımsı olup, 25 C'da ph'sı 7,3±0,2'dir (Czapek 1902, 1903) Örneklerin üretilmesi Protein ekstraksiyonu için örnekler steril koşullar altında önce hem katı hem de sıvı Malt extract besiyerlerine ekilerek 7 gün 25 C de inkübasyona tabi tutulmuştur. Katı besiyerinden örneklerin geri kazanım oranı, sıvı besiyerine oranla daha az ve zor olması nedeniyle örnekler çalışma boyunca Malt extract broth besi yerlerinde inkübe edilmiştir. Daha önceden hazırlanarak steril edilmiş içerisinde Malt extract broth (250 ml) bulunan 500ml lik erlenlere bünzen bek alevi yanında ekim yapılmıştır. Ekim yapıldıktan sonra erlenlerin ağızları steril pamuklarla kapatılıp etüvde (25 C sıcaklıkta), 7 gün süre ile inkübasyona tabii tutulmuştur Örneklerin özütlenmesi İnkübasyon sonrası üreyen mikrofungus örnekleri çeker ocak altında bek alevinin yanında Whatman no. 1 filtre kâğıdı yardımıyla süzülmüştür. Elde edilen filtratlar, steril filtre kâğıtlarıyla beraber alüminyum folyolara sarılarak 25 C lik etüvde 24 saat süre ile kurutulmuştur. Kurutulan örnekler daha sonra hassas terazide tartılmış ve 0,2M fosfat tamponu (PBS) ph 7.5 ile içerisinde steril kum bulunan soğuk havanlarda öğütülerek özütlenmiştir. 3.3 Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler Ham özüt 15000g de 30dk santrifüjlenmiştir. Üst sıvı alınarak spektrofotometrede (NanoDrop) total protein miktarları ölçülmüştür. Protein kaybı yaşanmaması ve 25

36 yapılarının bozulmaması için Sigma marka kokteyl proteaz inhibitörü kullanılmıştır. Örneklerin protein profilleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi yöntemine göre çıkarılmıştır Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi Örnekler SDS-PAGE ile ayrılmadan önce, her kuyucuğa aynı miktar protein yüklemek amacıyla total protein miktarları ölçülmüştür. Total protein miktarı ölçümü için, NanoDrop 1000 Spectrofotometre cihazı kullanılmıştır. Protein miktarları ölçümünde ilk olarak, kör örnek olarak özütleme sırasında tampon çözeltisi olarak kullanılan, pbs kullanılmış, daha sonra her örnek için pipetle 2µl hacimde numune alınarak cihazda okutma yapılmıştır. ( dmarshall/ nd-1000-users-manual.pdf 2012) Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Elekroforez, bir elektrik alanının etkisi altında yüklü bir partikülün göç etmesi olarak tanımlanabilir. Aminoasitler, peptitler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller iyonize gruplar içerirler Bu sayede herhengi bir ph da elektrikçe yüklü katyonlar (+) veya anyonlar (-) olarak olarak bulunurlar. Bir elektrik alan etkisine maruz bırakılan bu moleküller net yüklerine bağımlı olarak katoda veya anoda doğru göç ederler. Bu moleküllerin elektriksel alanda göç hızları veya mobiliteleri; alanın şiddetine, moleküllerin net yüküne, büyüklüğüne, şekillerine, viskozitesine vb. bağlıdır. Elektroforezde, örnek bir destek matriksi üzerinde göç eder. Bu matriks, kağıt, selüloz, aselat, nişasta, jel, agaroz veya poliakrilamid jeli olabilir (Zihnioğlu 1996, Balkan 2008). Elektroforezde, örnek moleküller, belli bir protokole göre hazırlanmış agaroz ya da poliakrilamid bir jel üzerine uygulanır. Jel burada durgun fazdır. Hareketli faz olarak elektrik akımı kullanılır. Tampon çözeltiler elektrik akımının geçişini sağlarlar. 26

37 Elektroforezde, bazik ph da çalışılarak, moleküllerin negatif yüklü (-) olması sağlanır. bu sayede elektrik akımı verildiğinden moleküller pozitif kutba doğru göç ederler. Göç sırasında jel, gözenekli yapısı (yapılacak işleme göre değişebilir) ile süzgeç gibi çalışır ve ayrışmayı sağlar. Moleküllerin jelden çıkmasını önlemek için küçük molekül ağırlığına negatif yüklü boya (brom fenol mavisi) kullanılır. Boya en önde gider ve jel sonuna gelince elektrik akımı kesilir. Daha sonra protein bantları uygun boya ile boyanarak görünür hale getirilir (Balkan 2008). Elektroforezde büyük ve asimetrik moleküller yavaş, küçük moleküller ise, hızlı hareket ederler. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protein ve 1 akb ın altındaki DNA fragmentlerinin ayrımında kullanılabilen, bir dizi işlem içerir. Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı bisakrilamidin kopolimerizasyonu ile hızlanır. Akrilamid ve bis akrilamid yüzdeleri değiştirilerek amaca göre çeşitli por çaplarında jeller hazırlanabilir. Jel yoğunluğu arttıkça, por çapı küçülür. Proteinler, sodyum dodesilsülfat (SDS) ve bir tiol reaktifi (2- merkaptoetanol ya da dithiothreitol=ddt) içeren ortamda ısıtılarak denatüre edildiklerinde, yaklaşık her iki aminoasit için bir molekül SDS bağlar. Bağlanan SDS, proteinin negatif elektrik yüklenmesine neden olur. Bu sayede proteinler elektrik akımı verildiğinde yalnız molekül ağırlığına göre jelde hareket ederler. Molekül ağırlıkları bilinen standartlardan, molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin molekül ağırlığı çeşitli programlar kullanılarak hesaplanır. (Zihnioğlu 1996, Balkan 2008). Özütleme 0,2 M Fosfat Buffered Saline (PBS) Na 2 HPO 4.12H 2 0 NaH 2 PO 4.2H 2 O NaCl dh 2 O 2,75 gr 8,32 gr 9 gr 997 ml Hazırlanan çözeltinin ph sı 6 N HCl kullanılarak 7,5 olarak ayarlanır. 27

38 Proteinlerin Jele Yüklenmesi ve Ayrılması Stok Çözeltiler A. %30 luk Akrilamid Çözeltisi Akrilamid Bisakrilamid dh 2 O 29,2 gr 0,8 gr 100 ml B. 1,5 M Tris Tamponu, ph 8,8 Tris SDS dh 2 O 18,17 gr 0,4 gr 100 ml Hazırlanan çözeltinin ph sı 6 N HCl çözeltisi ile 8,8 e ayarlanır. C. 0,5 M Tris Tamponu, ph 6,8 Tris SDS dh 2 O 6,06 gr 0,4 gr 100 ml Hazırlanan çözeltinin ph sı 6 N HCl çözeltisi ile 6,8 e ayarlanır. D. %10 luk Amonyum persülfat Amonyum persülfat dh 2 O 0,1 gr 1 ml Bu çözelti kullanımdan hemen önce, taze olarak hazırlanır. 28

39 E. Örnek Uygulama Tamponu 2x SDS %4 Tris 0,125 M Gliserol % 20 2-merkaptoetanol %10 Bromofenol mavisi %0,2 Geri kalan hacim saf su ile tamamlanır. F. Tank Tamponu 5x, ph 8,3 Tris Glisin 0,025 M 0,192 M SDS %0,1 G. Fiksatif Metanol Asetik asit (glasiyel) dh 2 O 500 ml 100 ml 400 ml H. Boyama Çözeltisi Metanol Comassie Brillant Blue Asetik asit (glasiyel) dh 2 O 500 ml 1 gr 100 ml 400 ml Comassie Brillant Blue nun iyice çözünmüş olması gerekir. 29

40 İ. Yıkama Çözeltisi Metanol Asetik asit (glasiyel) dh 2 O 120 ml 175 ml 2200 ml 1 mm kalınlığında jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları Çizelge 1 de verilmiştir. Çizelge 3.2.Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları Ayırma Jeli %12,5 Yığma Jeli %4,5 A Çözeltisi 7,5 ml 0,9 ml B Çözeltisi 4,5 ml - C Çözeltisi - 1,5 ml D Çözeltisi 0,07 ml 0,018 ml TEMED 0,01 ml 0,01 ml Saf su 6 ml 3,6 ml Jellerin Hazırlanması Ayırma Jeli Yukarıdaki tablodaki oranlara göre amonyum persülfat (D) çözeltisi hariç olmak üzere diğer çözeltiler karıştırılır ve bir peristaltik pompa yardımıyla havası alınır. Daha sonra içine amonyum persülfat çözeltisi eklendikten sonra hızlı bir şekilde jel dökme sistemi üzerinde bulunan camlar arasına bir enjektör ya da pipet yardımıyla dökülür. Polimerizasyon yüzeyini düzleştirmek amacıyla jelin üzerine suyla doymuş n-butanol çözeltisi dökülür. Polimerizasyondan sonra ne butanol çözeltisi dökülür. Yığma Jeli Yine yukarıdaki tabloda yığma jeli sütunundaki çözeltiler D çözeltisi hariç karıştırılır ve 30

41 peristaltik bir pompa yardımıyla karışımın içerisinde bulunan hava uzaklaştırılır. Daha sonra D çözeltisi ilave edildikten sonra cam plaklara arasına yerleştirilen uygun tarak aparatının kenarından iki cam arasına akıtılır. Polimerizasyon işlemi tamamlandıktan sonra bu tarak dikkatli bir biçimde çıkarılır. Jel dökme sisteminden çıkarılan camlar dikey elektroforez tankına yerleştirilir ve tankın tampon hazneleri 5 kat seyreltilen tank tamponu ile elektrotların üzerine kadar doldurulur. Örneklerin Hazırlanması ve Jele Yüklenmesi Özütleme sonrası elde edilen örnekler eşit miktarda protein içerecek şekilde örnek tamponu (E) ile karıştırılır. Mikrosantrifüj tüpü içerisinde 5-10 dakika kaynatılan örnekler tarakların çıkartıldığı yerlerdeki kuyucuklara yüklenir. Daha sonra uygun akım verilerek proteinlerin jelde ayrımı sağlanır. Bu işlem örnek tamponu içerisinde yer alan izleme boyası bromofenol mavisinin jelin alt ucuna 0,5 cm kalana dek devam edilir. İşlem tamamlandıktan sonra tank güç kaynağından ayrılır. Cam plakalar dikkatli bir şekilde birbirinden ayrılır ve jelin bir kenarı karışıklığı önlemek amacıyla kesilir. Jellerin Comassie Brillant Blue ile Boyanması Jel alkole ve aside dayanıklı plastik veya cam bir kapta, hacminin 3-5 katı fiksatif içinde 2 saat boyunca düşük hızda çalkalanır. Fiksatif dökülerek plastik kabın içerisine boyama çözeltisi katıldı ve oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat çalkalanarak bekletilir. Daha sonra boya çözeltisi uzaklaştırılarak 1-2 dakika fiksatifle çalkalanır. Fiksatif dökülür ve 2 saat yıkama çözeltisinde hafifçe çalkalanır. Yeni bir yıkama çözeltisine alınan jel, zemindeki boya çıkıp bantlar belirgin hale gelene dek bu işlem yıkama çözeltisi yenilenerek yapılır (Temizkan ve Arda 2007). 31

42 Elde Edilen Bantların Molekül Ağırlıklarının Hesaplanması Yürütülen jeller daha sonra fotoğraflandıktan sonra Macromedia Flash programı yardımıyla ölçülmüş ve rf değerleri belirlenmiştir. Elde edilen bu rf değerleri, bantların molekül ağırlıklarının tahmin edilmesinde kullanılmıştır. Molekül ağırlıkları hesaplanırken, elektroforez markerlarının rf değerlerine göre çizilen standart eğri denklemi kullanılmıştır. 3.4 MVSP (MultiVariate Statistical Package) MVSP (İngilizce açılmıyla: Multi Variate Statistical Package), araştırma geliştirme ve dağıtım, veri madenciliği, metin analizi, istatistiksel analiz ve işbirliği ve dağıtım (toplu ve otomatik skorlama hizmetler) için kullanılan bir bilgisayar programıdır. MVSP bilimsel alanlarda çok değişkenli sayısal analizler yapan ucuz ve kullanımı kolay bir programdır. Sağlık araştırmalarında, fen bilimlerinde, sosyal bilimlerde, pazar araştırmalarında, anket şirketleri, hükümetler ve eğitim kurumları olmak üzere pek çok kurum tarafından istatiksel analiz için kullanılan bir bilgisayar yazılımdır. Kullanımı grafiksel bir kullanıcı arayüzüne bağlı olup, açılır menüler yardımıyla kolaylaştırılmıştır. Ayrıca makro dilleri yardımıyla kullanıcı kendi amaçları doğrultusunda programı yönlendirebilmektedir. Bu program ile, mevcut veriler, t-testi, ANOVA, Korelasyon, Cluster (kümeleme) analizi ve daha birçok istatistiki analizleri uygulayabilir, verileri grafiksel olarak ifade edilebilmektedir. ( 2012) Bu çalışmada MVSP programı kullanılarak jellerden skorlanan verilere göre, örneklerin istatistiksel analizleri yapılmıştır. 32

43 4. BULGULAR Tez çalışmasında, atmosferde sık rastlanan mikrofunguslar gerek yurt içi gerekse yurt dışı çalışmalar da da araştırılmış, elde edilen verilerene göre tez de kullanılacak funguslar belirlenmiştir. Belirlenen fungusların protein profilleri sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), yöntemi ile çıkarılmıştır. MVSP programında ikili veri için benzerlik ölçüsüne (Jaccards katsayısına) göre benzerlikler hesaplanmış ve UPGAMA kümeleme metodu kullanılarak dendrogramlar çizilmiştir (Şekil 4.1). Jaccard katsayısı f01 = farklı sınıfta aynı kümede bulunan obje çifti sayısı f10 = aynı sınıfta farklı kümede bulunan obje çifti sayısı f11 = aynı sınıfta ve kümede bulunan obje çifti sayısı Çalışmada kullanılan örneklerin; sıvı besiyerinde görüntüsü, katı besiyerinde görüntüsü, SDS-Page yöntemiyle elde edilen bant görüntüleri ve elde edilen bantların molekül ağırlıklarının hesaplanırken, elektroforez markerlarının rf değerlerine göre çizilen standart eğri denklemi her örnek için ayrı sayfada olmak üzere aşağıda verilmiştir. 33

44 UPGMA Acremonium kiliense Cylindrocladium floridanum Cladosporium obtectum Aspergillus oryzae Aspergillus flavipes Penicillium chrysogenum Cladosporium herbarum Alternaria alternata Aspergillus niger 0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1 A. Jaccard's Coefficient UPGMA Acremonium kiliense Cylindrocladium floridanum Alternaria alternata Cladosporium obtectum Cladosporium herbarum Aspergillus niger Aspergillus flavipes Aspergillus oryzae Penicillium chrysogenum B. 0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1 Jaccard's Coefficient Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre elde edilen dendrogram 34

45 Örneklerin; petride ve sıvı besiyerinde görüntüsü, kullanılan marker ile elde edilen bantların görüntüleri; Acremonium kiliense Grütz A. B. 2,5 2 y = -1,4898x + 2,1659 R² = 0,9424 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 C. D. Şekil 4.2 a. Acremonium kliense nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium kliense nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 35

46 Acremonium kliense Grütz 1925, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 209 kda, 120 kda, 85 kda, 61 kda, 52 kda, 46 kda, 43 kda, 35 kda, 32 kda, 30 kda, 29 kda, 27 kda, 26 kda, 25 kda, 24 kda, 22 kda, 21 kda, 20 kda ve 19 kda dur (Şekil 4.2). Ayrıca Acremonium kliense özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.3). Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı 36

47 Alternaria alternata Keisler β A. B. D. C. Şekil 4.4 a. Alternaria alternata nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria alternata nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternariaa alternata dan SDS- proteinlerin log MW Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart değerlerinee karşı, Rf değerleri 37

48 Alternaria alternata den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 160 kda, 142 kda, 132 kda, 123 kda, 116 kda, 108 kda, 103 kda, 99 kda, 92 kda, 88 kda, 84 kda, 81 kda, 72 kda, 66 kda, 64 kda, 61 kda, 56 kda, 52 kda, 50 kda, 46 kda, 44 kda, 43 kda, 41 kda, 37 kda, 34 kda, 31 kda, 26 kda, 23 kda, 14 kda, 11 kda, 9kDa dur (Şekil 4.4). Alternaria alternata, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.5). Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı 38

49 Aspergillus flavipes Bain ve Sartory A. B. 2,5 2 y = -1,4898x + 2,1659 R² = 0,9424 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 C. D. Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes in sıvı besiyerinde görüntüsü c.aspergillus flavipes den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 39

50 Aspergillus flavipes den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 218 kda, 115 kda, 81 kda, 59 kda, 46 kda, 39 kda, 35 kda, 31 kda, 29 kda, 28 kda, 26 kda, 25 kda, 24 kda, 23 kda, 22 kda, 21 kda, 19 kda dur (Şekil 4.6). Aspergillus flavipes özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.7). Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı 40

51 Aspergillus niger Van. Tighem A. B. C. D. Şekil 4.8 a. Aspergillus niger in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger in sıvı besiyerindee görüntüsü c. Aspergillus niger den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 41

52 Aspergillus niger, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarnın molekül ağılıkları; 103 kda, 92 kda, 89 kda, 75 kda, 64 kda, 61 kda, 47 kda, 41 kda, 24 kda, 14 kda dur (Şekil 4.8). Aspergillus niger Van. Tighem 1867, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.9). Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı 42

53 Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn A. B. 2,5 2 y = -1,4898x + 2,1659 R² = 0,9424 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 C. D. Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 43

54 Aspergillus oryzae den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları; 234 kda, 134 kda, 97 kda, 74 kda, 50 kda, 40 kda, 37 kda, 32 kda, 29 kda, 27 kda, 26 kda, 24 kda ve 23 kda dur (Şekil 4.10). Aspergillus oryzae özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.11). Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı 44

55 Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray A. B. C. D. Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium herbarum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum dan SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 45

56 Cladosporium herbarum den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları; 89 kda, 85 kda, 83 kda, 82 kda, 78 kda, 73 kda, 69 kda, 62 kda, 61 kda, 55 kda, 47 kda, 44 kda, 41 kda, 36 kda, 33 kda, 31 kda, 30 kda, 28 kda, 25 kda, 23 kda, 17 kda, 14 kda, 11 kda, 10 kda ve 9kDa dur (Şekil 4.12). Cladosporium herbarum özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.13). Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı 46

57 Cladosporium obtectum Rabenh. A. B. 2,5 2 y = -1,4898x + 2,1659 R² = 0,9424 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 C. D. Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium obtectum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum un SDS- Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 47

58 Cladosporium obtectum den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının büyüklükleri; 246 kda, 136 kda, 89 kda, 71 kda, 45 kda, 35 kda, 31 kda, 28 kda, 27 kda, 26 kda, 25 kda, 24 kda, 23 kda, 22 kda, 21 kda ve 20 kda dur (Şekil 4.14). Cladosporium obtectum, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.15). Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı 48

59 Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour A. B. 2,5 2 y = -1,4898x + 2,1659 R² = 0,9424 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 C. D. Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum un katı besiyerinde görüntüsü b. Cylindrocladium floridanum un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cylindrocladium floridanum un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri 49