HPLC KOLONLARI VE AYRIM MEKANİZMASI Suna Uçan

Transkript

1 HPLC KOLONLARI VE AYRIM MEKANİZMASI Suna Uçan

2 HPLC Kolon Tipleri Kullanımı% Silica 75 Polymer 20 Alumina 1 Others 4

3 HPLC Kolonları different pore sizes, particle sizes and bonding chemistries Kromasil C18

4 Silika Particle shape Particle size Pore size Surface area Bonding chemistry

5 Silika Düzensiz Küresel Düşük performans ve sağlamlık Yüksek performans ve sağlamlık Düşük fiyat - preparatif aplikasyonlarında Yüksek tekrarlanabilirlik Kontrol edilebilir homojenlik

6 Silika Pore Size Surface Area Application (Å) (m 2 /g) Small molecules Large molecules e.g. proteins Gözenekler küçüldükçe yüzey alanı artacağından tutunma ve yükleme kapasitesi artar.

7 Silika OH Si O OH Si O O Si O OH Si O O Si OH Silica Gel Chemically Modified Surface Silica Gel Pores Si CH 3 Si Si - O - Si - (CH ) CH Si CH 3 Si Si 7

8 Poroshell Kolon Protein peptide analizi-düşük akış-verimli pik.

9 Silika Yüzeyi-Silanoller ASSOCIATED GEMINAL FREE CHELATED Least Acidic Most Acidic

10 Silika Bağı-Monomerik Tek noktadan bağlanma Tekrarüretilebilir bağlanma

11 Silika Bağı-Polimerik Daha yüksek karbon yükü Daha stabil (düşük ph)

12 Silika Bağı-Endcapping Kalıntı silanollerin uzaklaştırılması Genelde trimethylchlorosilane (TMS) kullanılır Basik maddelerin kromatografik olarak şeklini düzeltir.

13 Bağlı fazın bozunması Düşük ph bağ kopması Yüksek ph silika çözünmesi

14 Kolonun Temizlenmesi Mobil fazınızdan daha güçlü bir solvent ile yıkayın. Ters-Faz solvent seçimi Analitik kolon için herbir solventten ez az 25ml kullanılmalıdır. Tampon çözeltisiz mobil faz 100% Metanol 100% Asetonitril 75% Asetonitril:25% Izopropanol 100% Izopropanol 100% Metilen Klorür* 100% Hekzan* * Kolon hekzan veya metilen klorür ile yıkandığı zaman Ters-Faz taşıyıcı fazına dönmeden önce kolon izopropil alkol ile yıkanmalıdır Slide 14

15 Kromatografik Rezolüsyon ve Ayrılma Kolon: ZORBAX 300SB-C3 5 µm, 4.6 x 150 mm Gradyen: 19 dak.da % 15-35B Mobil Faz: A: 95 : 5 H 2 O : % 0.1 TFA lı ACN B: 5 : 95 H 2 O : % TFA lı ACN Lösin Enkefalin 2. Angiotensin 3. Rnaz A 4. Insulin 5. Sitokrom C 6. Lizozim 7. Miyoglobin 8. Karbonik Anhidraz Time (min.)

16 Bu bölümde aşağıdaki hususlar tartışılacaktır: Numune bileşenleri arasındaki rezolüsyonu etkilen faktörlerin neler olduğu. Kapasite faktörünün (alıkonma faktörü), seçiciliğin ve verimliliğin rezolüsyonu nasıl etkilediği. Ayrılma süreçlerinin nasıl daha iyi hale getirileceği. 16

17 KROMATOGRAFİK AYIRIM Elüent Kolon dolgu maddesi Mobil Faz Örnek Sabit Faz 17

18 KROMATOGRAFİK AYIRIM Maddelerin ayırımı

19 Kromatografçıların Birincil Endişesi - Kromatofrafik Pikler Arasındaki Rezolüsyon R = Rezolüsyon mau R = 2 t RB t RA t RB - t RA w A + w B R = t RB - t RA w 1/2A + w 1/2B t RA = Alıkonma zamanı bileşen A t RB = Alıkonma zamanı bileşen B w = Bazdaki genişlik w 1/2 =yarı yükseklikteki genişlik t o zaman 19

20 Rezolüsyon Değerleri Eşit pik alanları için 1.5 değerindeki R başlangıç ayrılmasını verir

21 İzokratik Elüsyon İçin Temel Rezolüsyon Denklemi R = 1/4 N x - 1 x Verimlilik Seçicilik k' 1 + k' Kapasite N: Mevcut olan toplam teorik plaka sayısı; kolon verimliliği k : Kapasite faktörü (alıkonma faktörü), pik alınkonma fonksiyonu piklerin rölatif ayrılması; seçicilik fonksiyonu 21

22 Rezolüsyon Faktörleri Kapasite Seçicilik Verimlilik 22

23 Kapasite Alıkonma R = 1/4 N x - 1 Verimlilik Seçicilik x k' 1 + k' Kapasite Inject t R2 t R1 t O Kapasite faktörü (alıkonma faktörü) bir bileşiğin belli bir mobil faz da, sıcaklık ve kolon tipinde karekteristik bir özelliğidir. Kapasite faktörü kolon boyutlarının ve akış hızının etkilerini yokeder. Kapasite faktörü: durağan faz içindeki madde miktarı mobil faz içindeki madde miktarı değerine eşittir. k' = t - t O R t O 23

24 Kapasitenin Rezolüsyon Üzerindeki Etkisi k deki değişiklikler en büyük etkiye sahiptir R İdeal k Aralığı k deki değişiklerin rezolüsyon üzerindeki etkisi azdır k' 1 + k' Kapasite k Rezolüsyonu artırmak üzere alıkonmanın kullanılması en çok k 0 ila 5 aralığında iken etkili olmaktadır. 24

25 mau mau Daha Zayıf Çözücü Bileşimi Kapasite Mobil Faz Bileşimi % 60 Asetonitril % 40 Su Zaman (dak.) Daha Güçlü Çözücü Bileşimi % 80 Asetonitril % 20 Su Kromatografik bir pikin kapasitesini değiştirmenin tek önemli yolu mobil faz karışımını değiştirmektir: Mobil faz kuvvetinin artırılması elüentler için kapasite faktörünü düşürür. Ters fazlı için, %10 oranında organik artışı her bir kromatografik pik için k yı 2 ya da 3 lük bir faktörle düşürür Zaman (dak.) 25

26 Seçicilik R = 1/4 N x - 1 Verimlilik Seçicilik x k' 1 + k' Kapasite = 1.1 =1.4 =1.8 = k B k A Mobil Faz Bileşimi Mobil Faz Mobil Faz ph sı Kolon Sıcaklığı Kimyasal Etkiler Katkı maddeleri Durağan Faz 26

27 Seçiciliği Etkileyen Parametreler Mobil faz bileşimindeki değişiklik Daha güçlü çözücüler Daha zayıf çözücüler IPA/Su ACN/Sur MeOH/Su AZALAN ARTAN Durağan fazın değiştirilmesi Kolay aşırı yüklenir C-2 Kolay aşırı yüklenmez C-18 Düşük Organik Durağan Faz Yüksek Organik Durağan Faz 27

28 Bağlı Fazlardaki Değişiklik Sonucu Buğday Proteininden İyileştirilmiş -gliadin Rezolüsyonu Koşullar: ZORBAX 300SB, 4.6 mm ID x 150mm; Doğrusal Gradyen, 60 dakikada % 23 - %48 B A= Su içinde %0.1TFA; B= Asetonitril içinde %0.1 TFA; Sıcaklık: 50 C; Akış: 1 ml/dak; Det.: UV-210 nm Marchylo, B.A., D.W. Hatcher, J.E. Kruger, and J.J. Kirkland. Cereal Chemists, Inc., 69 (1992)

29 Seçiciliği Değiştirmek İçin Kolonların Değiştirilmesi ZORBAX 300SB-CN ZORBAX 300SB-C18 Optimize Gradyen Koşulları Kullanılarak 9 Peptidin Ayrılması Koşullar: Her bir peptitten 2 µg enjekte edilir, 1 ml/dakb 40 C, 30 dakika içinde % 0-36B; A %0.1 TFA/H 2 O, B %0.1 TFA/ACN Boyes, B.E., D.G. Walker, Journal of Chromatography A, 691 (1994)

30 Durağan Fazın Değiştirilmesi 30

31 Kolon Termostatının Ayrılma üzerindeki Etkisi 40º C A B 65º C B A Zaman, dak. 31

32 Rezolüsyonun İyileştirilmesi için Sıcaklığın Kullanılması 35 C Resolution 10 8 Improvement º C 300 SB-CN SB-C

33 Inject Detector Response Verimlilik R = 1/4 N x x k' k' Verimlilik Seçicilik Kapasite Düşük Verimlilik Yüksek Verimlilik Zaman 33

34 Inject Verimliliğin Hesaplanması N= 16 2 t R w =5.54 B t R W 1/2 2 =2 h p t R A 2 t R HETP = L N W i/2 N = Verimlilik; Plaka Sayısı HETP = Teorik Bir Plakaya Eşdeğer Yükseklik L = Kolon uzunluğu h p = Pik yüksekliği A=Pik Alanı Zaman WB 34

35 Dispersiyon Akış Varyasyonu Eddy Difüzyonu İlk Bant Gen. Laminar Flow H ET P A = Akış Varyasyon Etkisi Au 0.33 Doğrusal Hız Son Bant Genişliği Sıkıca doldurulmuş kolonlar kullanın. Dar kolonlar kullanın Küçük parçacık büyüklüğü kullanın 35

36 Tipik Akış Hızları mm i.d.(5um parçacık) ml/dak akış hızı 2 = i.d. 2 i.d. 1 akış hızı 1 36

37 Artan Akış Hızı ile Analiz Süresinin Kısaltılması LC: HP1090 Kolonlar: 4.6 x 150, 5 µm Akış: 1.0 ml / dak. A: 0.1% TFA B: 97.5% MeOH : 2.5% H2O (0.1% TFA) Sıcaklık.: 30 C Detek.: 254 nm mau 30 DAD1 A, Sig=254,16 Ref= mau Zorbax SB-CN C G T A F = min F = min DAD1 A, Sig=254,16 Ref=3 mau 20 DAD1 A, Sig=254,16 Ref= F = min min 01576S1.PPT 37

38 Ekstra-Kolon Hacimlerinin Etkisi 10 µl Numune Hacmi Bağlayıcı Borunun Hacmi Detektör Hacmi Detektör hızı 20 µl 2.1 x 150 mm F = 0.2 ml / dak. Zaman, dak. 38

39 PW 1/2 Por Büyüklüğü ve Moleküler Büyüklüğün Pik Genişliği Üzerindeki Etkisi MA > 4,000 için geniş bir por büyüklüğü seçin SB-C18 (300Å) SB-C18 (80Å)

40 Adsorbance Absorbance Kolon Uzunluğu ve Rezolüsyon SB-C x 15 mm 4.6 x 30 mm Koşullar: LC: Hewlett-Packard HP1100 Kolonlar: Zorbax SB-C18, 3.5 µm Mobil Faz : 1 mm oktan sülfonik asit, Na tuzu, ph 2.5 : ACN (80:20) UV: 275 nm; Akış: 2.0 ml / dak.; 70 C Enj. Hacmi: 1 µl DAD1 A, DAD1 A, 4.6 x 50 mm Numune: 1. Asetaminofen (4-asetaminofenol) 2. Kafein 3. 2-Asetamidofenoll 4. Asetaniid 5. Aspirin (asetilsalisilik asit) 6. Salisilik asit 7. Fenasetin (asetofenetidin) DAD1 A, 4.6 x 75 mm DAD1 A, 4.6 x 150 mm DAD1 A, min 40

41 Pik Simetrisi S = B/A A B Pik yüksekliğinin %10 u Mükemmel S = Kabul edilebilir S = 1.2 Kabul edilemez S = 2 Çok kötü S = 4 41

42 Rezolüsyonu Artırma k yı artırma Verimliliği artırma Seçiciliği artırma 42

43 Çalışma sayfası 1 Her bir durumda rezolüsyon denkleminin hangi bileşeninin değiştiğini tanımlayın: N, k, ya da. Her bir durumda, başlangıç ayrılmasını iyileştirme için hangi parametreyi (mobil faz bileşimi) değiştirirdiniz? Başlanggç Değiştirme? Artırma? Artırma? t 0 t 43

44 Çalışma sayfası 2 mau 0 time Analiz 100 x 4.6 mm i.di., 10 um, C-8 kolon üzerinde yapılmıştır. Akış hızı, 70/30 IPA/su ile 2 ml/dakikadır. Ayrılma sürecini iyileştirecek yöntemleri sıralayınız. 44

45 Çalışma sayfası 3 1. Bir numune bileşeninin alıkonmasını artırmak için göz önünde bulundurulması gereken üç hususu sıralayın. 2. Kromatografik pik bant genişliğini azaltmak için yapılması gereken dört hususu sıralayın. 3. Bu parametrelerden hangisi kolon verimliliğini etkiler? Mobil faz kuvveti Mobil faz viskozitesi Durağan fazın parçacık büyüklüğü Kolon uzunluğu Kolon sıcaklığı Ekstra kolon hacmi 45

46 TEŞEKKÜRLER 46