YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİNE GİRİŞ Suna Uçan

Transkript

1 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİNE GİRİŞ Suna Uçan

2 HPLC EĞİTİM PROGRAMI Kromatografik proses HPLC Sistemine genel bakış HPLC bileşenleri Sıvı Kromatografi çeşitleri

3 Kromatografi Nedir? Kd= Cs Cm 3

4 Ayırım Teknikleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi mi Gaz Kromatografisi mi? Hangisini kullanmalıyım? 4

5 HPLC ve Gaz Kromatografi nin Karşılaştırılması HPLC Polar ve apolar bileşikleri ayırır Numune uçucu olmayabilir Numune, hareketli faz içinde çözünebilir olmalıdır Oda sıcaklığı veya daha düşük bir sıcaklıkda çalışılabilir MW üst limit yoktur Numune filtre edilmeli Hareketli faz ve mobil faz ikisi de ayırımda önemlidir GK Polar ve apolar bileşikleri ayırır Numune uçucu olmalıdır. Numune yüksek sıcaklıkta bozunmamalıdır Genelde MW<500 Çözücü genelde analitlere göre daha uçucu olmalı Hareketli faz sadece numuneyi taşır 5

6 HPLC ve Gaz Kromatografi nin Karşılaştırılması 6

7 HPLC Uygulamaları Kimyasal polistirenler boyalar fitalatlar Biyolojik bilimler proteinler peptitler nükleotidler Çevresel Farmasötikler poliaromatik hidrokarbonlar inorganik iyonlar herbisitler tetrasiklinler kortikosteroidler antidepresanlar barbitüratlar Klinik amino asitler vitaminler homosistein Tüketici Ürünleri lipitler antioksidanlar şekerler 7

8 Kromatografik Proses Enjektör Ayırma işlemi sabit ve mobil fazlar arasındaki farklı göçe dayanır. Mikser Sabit Faz kolon,c18, Silica gibi Pompalar Mobil Faz kolon içinde hareket ederken numuneyi taşır. Kolon Detektör Çözücüler Atık 8

9 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 9

10 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 10

11 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 11

12 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 12

13 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 13

14 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 14

15 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 15

16 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 16

17 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 17

18 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 18

19 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 19

20 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 20

21 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 21

22 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Kolon Enjeksiyon başlangıcı zaman Detektör Çözücüler 22

23 Kromatografik Proses Enjektör Kromatogram Mikser mau Pompalar Start Injection time Kolon Detektör Çözücüler 23

24 Kromatogram t o alıkonmamış pikin elüsyon zamanı t R - alıkonma zamanı numunenin kimliğini belirler t R mau t R Alan ya da yükseklik analit miktarıyla orantılıdır. t o Enjeksiyon zaman 24

25 Örnek 25

26 HPLC Sistemine Genel Bir Bakış/Analize Hazırlık Genel Model Örnek Çözücü rezervuarları Kontrolör Çözücü Kabini Vakumlu Degaze Edici İkili pompa Otosampler Termostatlı Kolon Kompartımanı Detektör 26

27 Bu bölümde aşağıdaki konular anlatılacaktır Aşağıdaki süreçler de dahil olmak üzere bir numune enjeksiyonu için HPLC sisteminin nasıl kurulması gerektiği: Çözücü özellikleri Hareketli Fazın hazırlanması HPLC nin çalışmaya hazırlanması Kolonun Takılması Dengeleme Sistem Performans kontrolleri 27

28 Çözücü Özellikleri Çözücü Özellikleri (Spesifikasyonlar): Saflık Viskozite Kaynama Noktası Toksisite UV Geçirgenliği/UV-Cutoff u Çözünürlük 28

29 İsim Asetik asit Aseton Asetonitril Benzen Butil alkol Karbon Tetraklorür Kloroform Siklohekzan Siklopentan Dikloroetan Diklorometan Dimetilformamid Dimetil Sülfoksit Dloksan Etilasetat Etil Alkol Di-Etileter Heptan Hekzan Metil Alkol Metiletil Keton I-Oktan Pentan I-Propil Alkol Di-Propileter Tetrakloretan Tetrahidrofuran Tolüen Trikloroetan Su KSilen Çözücü Karışabilirliği Karışmayan Karışabilen 2-Propanol mükemmel bir ara çözücüdür 29

30 Hareketli Fazın Hazırlanması Başlıca Adımlar: Her bir çözücünün uygun hacimleri ölçülür Çözücüler karıştırılır Tamponlar ve katkı maddeleri* ilave edilir Hareketli faz filtre edilir Hareketli faz degaze edilir 30

31 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması Purge Flow Tasfiye Valfi(purge valf) Atık Kapilleri 31

32 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması(Yıkanması) 32

33 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 33

34 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 34

35 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 35

36 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 36

37 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 37

38 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 38

39 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 39

40 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 40

41 HPLC Sisteminin Çalışmaya Hazırlanması 41

42 Numunenin Hazırlanması Numuneler filtre edilir: Naylon hidrofilik yapılar 121ºC de otoklavlanabilen, ph aralığı 3-12 olan ve konsantre asit olmayan sulu ve çözücü temelli numunelerde kullanılır. PTFE- çözücülere, asitlere ve alkalilere yüksek ölçüde dirençli hidrofilik bir membrandır. Bu filtre genellikle sulu olmayan numuneler için kullanılır. ph aralığı 4-8. Selüloz Asetat- protein tutumu çok düşük olan sulu biyolojik numuneler için iyi bir filtredir. ph aralığı 4-8. PVDF- çoğu çözücüye yüksek oranda dirençlidir, düşük protein bağlama özelliği sergiler. ph Ultrafiltre Membranlar- biyolojik numuneler için moleküler ağırlıklı cut-off filtrelerdir. Nitroselüloz- yüksek protein tutumu sergiler. Katı Faz Ekstraksiyonu. 42

43 Numunenin Hazırlanması Numune mobil fazda ya da mobil fazdan daha zayıf bir çözücü içinde çözülür. Numune hacmi pik şekli bozulmayacak şekilde ayarlanmalıdır. Mobil Faz içindeki Numune Daha Güçlü Çözücüler içindeki Numune 43

44 Kolonun Saklanması Kolonda olabilecek tüm fiziksel stresten kaçınılmalıdır. Kuruluktan kaçınmak için iki ucu da kapatılmalıdır. Kolon, uygun bir çözücüyle muamele edilmiş şekilde saklanmalıdır. Kolonun öyküsü kaydedilmelidir. 44

45 Kolonun Takılması Her kolonun tanımlanmış bir akış yönü bulunmaktadır! 45

46 Kolonun Takılması Gerekli olanlar: Olabilecek kaçaklardan ya da ölü hacimden kaçınmak için doğru konektörler Ana kolonu korumak için koruyucu kolon Doğru araçlar 46

47 Kolonun takılması (devam) Parmakla sıkıştırma Anahtarla 1/4 dönüş 47

48 Kolonun Dengelenmesi Mobil fazla şartlandırılır. Kolona basınç şoku uygulanmamalıdır. Ters fazlı dengeleme için 5-10 kolon hacmi. 48

49 HPLC Cihaz Bileşenleri Hareketli Fazlar Akış Hızı Bileşimi Enjeksiyon Hacmi Kolon Fırın Sıcaklığı Dalga Boyu 49

50 Vakumlu Gaz Uzaklaştırma 50

51 Emicilik Detektör Sinyali Üzerindeki Etki Çözücü: metanol; UV signal: 210 nm gaz uzaklaştırma yok helyum gazını uzaklaştırma On-line gaz uzaklaştırma Zaman (dak) 51

52 Pompanın Görevi Çözücü dağıtım sisteminin üç temel işlevi bulunmaktadır: 1. Doğru ve sabit akış sağlamak. 2. Doğru hareketli faz bileşimi sağlamak. 3. Sıkıca paketlenmiş kolon içinde mobil fazı itmek için gerekli olan kuvveti sağlamak. 52

53 Gradiyen Oluşumu Düşük Basınçlı Gradiyen Yüksek Basınçlı Gradiyen 53

54 Numune Enjektörleri Otomatik Enjektörler ya da Manüel Enjektörler 54

55 Manüel Enjektörler Numune Loopu Önden Görünüş Yükleme enjeksiyon Arkadan Görünüş Enjeksiyon 55

56 Otomatik Enjektörler Adım 1 Adım 2 Adım 3 56

57 Kolon Fırını Tekrarlanabilirlik Analiz süresi Kolon değiştirme valfi Kolon tanımlama modülü Peltier(hız-ısıtma-soğutma)

58 Kolon Fırını 58

59 Dedektör İdeal bir detektör aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır; Hassas ve seçici olmalı Sıcaklıktaki ya da mobil faz kompozisyonundaki değişikliklerden etkilenmemeli Eser miktarda analiti tespit edebilmeli Kromatografik pik yayvanlaşmasına etkisi olmamalı Dar kromatografik pikleri tespit edebilecek kadar hızlı reaksiyon gösterebilmeli Sağlam olmalı ve bakımı kolay olmalı

60 Yaygın kullanılan HPLC detektörleri UV-VIS Diode Array Çoklu Dalga boyu Değişken Dalga boyu Kütle Spektrometreleri Kırılma İndisi Flüoresans Işık Saçınımı Elektrokimyasal Radyoaktivite İletkenlik 60

61 WL 241/394 WL 270/388 WL 248/411 WL 302/420 WL 247/504 Birden Fazla Detektör Gerekliliği Duyarlılık Pyrene Chrysene Benzo(e)pyrene Perylene Benzo(k)fluoranthene Benzo(a)pyrene Benzo(ghi)perylene Indeno(123-cd)pyrene UV-signal Fluorescence PAH's extracted from soil; Sup.LC-PAH 150x4.6mm; Solv.: H2O/CH3OH= 10:90 61

62 Birden Fazla Detektör Gerekliliği Seçicilik Flecainide in Serum UV signal FL signal Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected UV and fluorescence signal 62

63 Birden Fazla Detektör Gerekliliği Nicel Bilgiler Nicel Bilgiler Klortoluran? Atrazin? Pik spektrumunu alınır (UV) Pik spektrumu alınır (MS) Dalga boyu (nm) Kütle / Yük 63

64 Saptama Limiti Ölçüm Limiti Saptama limiti (LOD) yalnızca detektör performansının değil, tüm kromatogram sisteminin bir sonucudur Ölçüm limiti (LOQ) özgül bir amaca yönelik kullanılan bir yöntem için tanımlanmış bir limittir. Yanıt Doğrusal aralık Eğim = duyarlılık MQL örnek, RSD<10%, S/N > 20 Kesme MDL örnek, S/N > 3 Miktar 64

65 UV-Vis Detektörleri İlkeler: Detektör hücresi içinden yayılan ışık fraksiyonu Beer Yasası doğrultusunda solüt konsantrasyonuyla ilişkilidir. I 0 Detektör Akış Hücresi c b I Log I 0 = A = abc I Özellikler: iyi stabilite, gradiyen yetkinliği. 65

66 UV-Vis Detektörleri Tasarım İlkeleri Değişken Dalga Boylu Detektör UV Lambası Cut-off filtresi Holmiyum oksit filtresi Slit Numune diod Ayna 1 Çoklu veya tekli dalga boyu deteksiyonunun yapılabilir. Dalga boyu kalibrasyonu holmiyum filtresi kullanımıyla otomatik olarak yapılır. Akış hücresi Referans diod Grating Ayna 2

67 Sıvı Kromatografi Çeşitleri Bileşik tipleri Nötrler Zayıf Asitler Zayıf Bazlar İyonikler, Bazlar, Asitler Suda tamamen çözülemeyen bileşikler, Organik İzomerler İyonikler, İnorganik İyonlar Yüksek Molekül Ağırlığına sahip Bileşikler, Polimerler Faz Tipi Sabit Faz Mobil Faz Ters Faz C-18, C-8, C-4, C-2 Su/Organik çözücüler İyon Çifti C-18, C-8 Su/Organik İyon çifti reaktifleri Normal Faz İyon Değişimi Boyutsal Dışlama (SEC) Silika, Amino, Siyano, Diol Anyon ve Katyon Değiştirici Rezin Polistiren Silika Organik Çözücüler Sulu Çözeltiler, Tamponlu Çözeltiler, Karşı İyon Gel Filtrasyon (GFC) için Sulu, Gel Geçirgenlik (GPC) için Organik Çözücüler 67

68 Ayırımın hedefi: Örnek bileşenlerinin birbirlerinden ayrılması ( Rezolüsyon ) R t B t A W W 1/2 rezolüsyon bileşen B nin tutunma süresi bileşen A nin tutunma süresi Pik tabanındaki genişlik (sn) Pik yarı yüksekliğindeki genişlik A t RA t RB B 0 R=2 t RB - t RA W + W A B R=1.176 t RB - t RA W + W 1/2A 1/2B 68

69 Ters Fazlı HPLC Uygulamaları Ters Fazlı aşağıdaki yapılar için ilk seçenektir: Moleküler ağırlığı 2000 den az olan nötral, polar ve polar olmayan bileşikler. Homologlar ve Benzologlar. Zayıf asitler ve bazlar. Güçlü asitler ve bazlar (İyon çifti HPLC). Proteinler ve peptitler. Aşağıdakilerle çalışmak daha zordur: Aminler Suda çözünmeyen bileşikler. 69

70 Ters Fazlı Ayırma Mekanizması Mekanizmanın Bölümlendirilmesi Durağan Faz Oktadesilsilil Oktil silil Siyano Amino C4 Mobil Faz Su Organik Çözücüler Tamponlar Değiştiriciler Durağan faz mobil fazdan daha az polardır. O O O O O Si Si Si Si O O O 70

71 Ters Fazlı HPLC için Alıkonma Sırası > Karbon sayısı Aminler, Aldehitler, Ketonlar Alkoller Fenoller Karboksilik Asitler Çoğu alıkonmuş Doymamış Dallanmış H H C NH 2 H H C OH O C OH En az alıkonmuş Daha Fazla Alıkonma Suda Artan Çözünürlük 71

72 Ters Fazlı HPLC İçin Kullanılabilir Çözücüler Su/Tampon Elüsyon Su Kuvveti Metanol Asetonitril Isopropanol Tetrahidrofuran Mobil Fazın Polaritesi Güçlü solvent(mobil Faz): Bir maddenin kolondan çıkmasını eşit şartlar altında hızlandıran solvent (mobil faz) güçlü solventtir (mobil fazdır) 72

73 mau mau mau Çözücü Kuvveti % 60 MeOH % 40 Su Zaman (dak) % 60 Asetonitril % 60-Propanol 1000 % 40 Su % 40 Su Zaman (Dak.) Zaman (dak.)

74 Tipik akış değerleri mm i.d.(5um particles) ml/min flow rate = i.d. ( bore) i.d. (analytical) 2 flow rate (analytical) 74

75 Mobil Fazın Bant Aralığı Üzerindeki Etkisi BP u P DPP N 65% MeOH 7 mm phosphate Ac A 7 Bileşenli Numune Zorbax XDB-C8 P P BP A DPP N 50% ACN 7 mm phosphate A DPP & N BP Ac Ac 38% THF 7 mm phosphate u = urasil P = propranolol BP = butilparaben DPP = dipropilfitalat N = naftalen Ac = asenaften A = amitriptilin 75

76 Ters Fazlı Kolonlar Silika Temelli CH 3 Si O Si R CH 3 R = CH 2 (CH 2 ) 16 CH 3 CH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 (CH 3 ) 3 CH 2 (CH 2 ) 2 CH3 C-18, En tutucu, hidrofobik, sağlam En çok tercih edilen kolon C-8, sağlam, C18 den daha az tutucu C-3, C-4,Proteinler ve peptitler, daha az stabil daha az tutucu CN ya da (CH 2 ) 3 CN Siyano, yeterince sağlam, en polar ters fazlı karışık fonksiyonel gruplar için uygun NH 2 ya da (CH 2 ) 3 NH 2 Amin, zayıf anyon değiştiricisi, şeker kolonu Seçicilik farklılıkları Polimer Temelli Polistiren -divinilbenzen ph 1 13 aralığında stabil, daha az verimli 76

77 Monomerik ve Polimerik Bağlı Fazlar CH 3 Si Si Si OH OH OH CH 3 + Cl Si R CH 3 Si Si Si O OH O Si CH 3 CH 3 Si R R Monomerik CH 3 Si OH Si OH + Cl Cl Si R Si OH Cl H 2 O Si Si Si O OH O Si R O Si O Si R R OH Polimerik 77

78 Farklı Kolonlarda Küçük Peptidlerin Ayrılması 300 SB-C SB-C8 300 SB-C3 Koşullar: Kolonlar: ZORBAX 300SB, 4.6 x 150mm Mobile Phase: Gradyen, 30 dakikada % 0-26 B. A = Su içinde % 0.1 TFA B = Asetonitril içinde % 0.1 TFA Sıcaklık: 40 C Numune: Her peptitden 2µg Akış hızı: 1.0 ml / dak. Deteksiyon: UV-210nm 300 SB-CN 78

79 Mobil fazın gücü - Normal Faz Solvent Gücü º Silika Alumina Flüoroalkanlar n-pentan Chlorobutan Mobil Fazın Gücü Ksilen Tolüen Benzen Kloroform Metilen Klorür Tetrahidrofuran Asetonitril Metanol

80 Mobil fazın gücü - Normal Faz X + T + B H C CH 3 3 X = Xylene CH 3 T T = Toluene B = Benzene X B = 0.42 Methylene Chloride Mobile Phase = 0.00 n-pentane 80

81 İyon-Çifti (Ion-Pair) Kromatografisi Counter ion + Stationary phase - Solute ion + + İyon-çifti Reaktifleri: Ion-Pair Reagents: Tetrabütilamonyum fosfat Güçlü ve zayıf asitler Tetrabutylammonium phosphate Strong and weak acids Alkylsulphonic acids Strong and weak bases Alkilsülfonik asitler Güçlü ve zayıf bazlar - + Solute ion 81

82 İyon Degişimi (Ion Exchange) Kromatografisi N + Cl - Mechanism: Mekanizma: İyonik İyonik etkileşim Ionic Interaction N + Cl - Sabit Sabit Faz-İyonik gruplar gruplar Sülfonatlar (SCX) (SCX) Trialkilamonyum Stationary (SAX) Phase: (SAX) Karboksimetil Sulfonates (WCX) (WCX) (SCX) Dietilaminoetil (WAX) (WAX) Triaklyammonium (SAX) - SO 3 H - H SO 3 - H SO Carboxymethyl (WCX) Mobil Mobil Faz Faz İyonik İyonik solüsyonlar Tamponlar Organik Organik modifiye ediciler ediciler Diethylaminoethyl (WAX) Mobile Phase: İnorganik ve organik ve organik anyon anyon veya katyonların veya katyonların analizinde analizinde Ionic Solutions (Counterion) Buffers Organic Modifiers 82

83 Boyutsal Dışlama Sıvı (SEC) kromatografisi Mekanizma: Elüsyon sırası molekül boyutuna göre olur. Sabit Faz Belirli partikül boyutundaki çapraz bağlı jeller Mobil faz ile reaksiyona girmemelidir Büyük moleküller ilk önce sonra orta sonra küçük moleküller çıkar. Mobil Faz Sulu solventler (GFC) Organik solventler (GPC) Analit ile uyumlu bir mobil faz seçilir. 83

84 HPLC Çalışma Modları Gradyen Elüsyon Izokratik Elüsyon

85 Bu bölümde aşağıdaki hususlar tartışılacaktır: Gradyen elüsyon süreci ve avantajları. Gradyen ayırma sürecinin nasıl optimize edileceği. Uygulamaya yönelik hususlar.

86 Genel Elüsyon Problemi Erken çıkan piklerin zayıf rezolüsyonu. Daha geç çıkan piklerle ilişkili olarak pik genişliğinde artış ve pik yüksekliğinde düşüş. k daki geniş aralığa bağlı olarak uzun analiz süreleri. Kolonun, tutulan bileşenlerle kontaminasyonu. İzokratik Elüsyon Mobil faz pikler çıkana kadar değişmez,sabit kalır. 86

87 Polipeptitlerin Gradyen Ayrılması Gradyenlerin Özellikleri Gradyen geliştirme için iki çözücü kullanılır Mobil faz kuvveti zamanla artar Gradyenin şekli Yüzde gradyen bileşimi zamanla değişir Kolon: ZORBAX 300SB-C3 5 µm, 4.6 x 150 mm Gradyen: 19 dak.da % 15-35B Mobil Faz: A: 95 : 5 H 2 O : % 0.1 TFA lı ACN B: 5 : 95 H 2 O : % TFA lı ACN Lösin Enkefalin 2. Angiotensin 3. Rnaz A 4. Insulin 5. Sitokrom C 6. Lizozim 7. Miyoglobin 8. Karbonik Anhidraz Time (min.) 87

88 Gradyen Yürütme Sırasında Ne Olur? % Org Organik değiştirici % si artar 100 k' Mobil faza doğru partitisyon kayması Time (min) Bileşiğin hızı artar 88

89 Gradyen Analiz Geliştirme Uzun ve basit bir gradyen % 5 Organik % 100 Organik Aşağıdakileri belirlemek gereklidir: Organik Çözücüler Başlangıç Kompozisyonu Gradyen Süresi Gradyenin Dikliği Gradyenin Şekli Akış Hızı Kolon Uzunluğu Kolon Tekrar Şartlanma Süresi 89

90 Gradyen Dikliğini Seçiniz Dik 100% B 100% B t G = 5 t G = 20 0% B 100% B 0% B Sığ 100% B t G = 10 t G = 40 0% B % B min

91 Bu gradyenlerden her birine uygulayacağınız profil hangisidir? Doğrusal Gradyen Doğrusal Gradyen Doğrusal Gradyen 91

92 Gradyen Dik ise Rezolüsyon Genellikle Daha Kısa Kolon Kullanılarak İyileştirilebilir (Azalan V m ) 300SB-C8, 3.5 µm Gradyen: 4.6 x 150 mm 1 k* = 2.6 k* = UV: dakikada % 2-75 B Mobil Faz: A= 5:95, ACN : H 2 O 0.1% TFA B= 95:5, ACN : H 2 O 0.085% TFA Akış Hızı: 1 ml / min. Ehjeksiyon: her biri 10 µl, 2.6 µg Sıcaklık: 35 C 215 nm 4.6 x 50 mm k* = 4.5 k* = GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-ß PROTEIN AMYLOID FRAGM [TYR 8 ] BRADYKININ 5. MET-ENK 6. LEU-ENK 7. ANGIOTENSIN II 8. KINETENSIN 9. RNASE 10. INS (EQUINE) dak. 92

93 Doğru Kolon uzunluğu hangisidir? Belli bir zaman diliminde maksimum ayrılma: Kısa zaman dilimi = kısa kolon ve yüksek akış hızı Uzun zaman dilimi= uzun kolon ve normal akış hızı 93

94 { Gradyen Performasına Katkı Sağlayan Cihaz Dwell Volume Extra Column Volume Dwell Hacim (ölü hacmi) = Gradyen oluşumundan(pompadan) kolonun baş kısmına kadar olan hacim. Başlangıç konsantrasyonunun artırılması ayrılma süresini kısaltır ancak ölü hacim ve gradyen gerçekleşmeden önceki izokratik adım nedeniyle ayırım süreci daha fazla cihaza bağlıdır. 94

95 Gradyen Elüsyona İlişkin Pratik Noktalar Çözücüler saf olmalıdır yoksa hayalet pikler çıkar. Tamponun son gradyen mobil faz bileşiminde çözünür olduğundan emin olun. Yoksa çökelti oluşur. Yürütmeler arasında kolonun yeniden şartlanması için gerekli süreyi göz önünde bulundurun. Hayalet Pikler % 0 MeOH %

96 Paracetamol,ACA,Ascorbik asit, MF:35:65(MeOH:Su)+%10 fosforik asit Akış:1.8 ml/dk UV Dalga boyu:235 Kolon:300mm*3.9mm C18

97 Amino asitler ZORBAX Eclipse-AAA 4.6 x 150 mm, 3.5 μm A: 40 mm Na2HPO4 ph 7.8 [5.5 g NaH2PO4, monohydrate + 1 liter water, adjust to ph 7.8 with NaOH solution (5 N)] B: ACN: MeOH: water (45:45:10, v/v/v) gradient Oven Temperature: 40 C

98 Barbituratlar

99 99