A+B KROMATOGRAFİ

Transkript

1 KROMATOGRAFİ Bir karışımdaki maddelerin, biri sabit diğeri hareket eden iki faz arasında farklı dağılmaları esasına dayanan ayırma yöntemine kromatografi denir. Hareketli faz = mobil faz Hareketsiz faz = duran faz = stasyoner faz SF SF MF Esası: B A ve B maddelerinden oluşan bir karışım fazlardan biri sabit, diğeri hareketli olan bir sisteme uygulandığında, A maddesinin stasyoner faza olan ilgisi B maddesininkinden fazla, B maddesinin A+B A de mobil faza olan ilgisi A maddesinden fazla ise, karışım mobil faz tarafından sürüklendiğinde A ve B maddeleri ayrılırlar. Kromatografinin Sınıflandırması A. Mobil fazın tipine göre: Kromatografinin Sınıflandırması B) Uygulama biçimine göre 1. Sıvı Kromatografisi (LC) 1.1. Sıvı- katı 1.2. Sıvı- sıvı 1) Kağıt kromatografisi 2) İnce tabaka kromatografisi (İTK) 3) Sütun (kolon) kromatografisi (CC) 4) Gaz kromatografisi (GC) 2. Gaz Kromatografisi(GC) 5) Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) 2.1. Gaz-katı 2.2. Gaz-sıvı C. Ayrılma mekanizmalarına göre 1. Adsorpsiyon kromatografisi 3. Süperkritik Akışkan Kromatografisi (SFC) Kritik sıcaklık ve basınçtaki maddelerin (CO 2 ) kullanıldığı kromatografi türüdür. 2. Dağılma (Partisyon) kromatografisi 3. İyon değiştirme kromatografisi 4. Moleküler eleme kromatografisi (Jel krom.) 5. Afinite kromatografisi (Kimyasal krom.) 1

2 KAĞIT KROMATOGRAFİSİ (Paper Chromatography) Stasyoner faz: Sellüloz + su Yüzeyi temizlenmiş sellülozdan yapılmış özel bir süzgeç kağıdıdır. Belli oranda su tutar. Mobil faz: Apolar bir organik çözücü Genellikle belli oranda su içerir. Kağıt kromatografisinin esası dağılmadır. İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ (İTK) Thin Layer Chromatography (TLC) Stasyoner faz: Adsorban maddeler Cam veya Aluminyum plak üzerine belli kalınlıkta kaplanılarak kullanılırlar Mobil faz: Apolar yada polar çözücü karışımı. Esası adsorpsiyondur. Her iki yöntem de kalitatif amaçlar için daha uygun olmakla beraber kantitatif tayinler için de kullanılırlar. 2

3 Kantitatif tayinler iki grupta toplanır. 1. Endirek Yöntem: Analiz edilecek madde, KK yada İTK dan uygun bir çözücü ile elüe edildikten sonra miktarı tayin edilir. Lekeler, kağıttan kesilir / tabakadan kazınır. Uygun bir çözücüde çözündürülür. Süzülür (kağıt yada adsorbandan temizlenir). Süzüntü belli hacme tamamlanır ve analiz edilir. İşlem boş bir kağıt yada adsorbana da yapılır. Standart çözeltiler yardımıyla madde miktarı bulunur. 2. Direk Yöntemler: Ölçmeler doğrudan tabaka üzerinde yapılır. A) Gözle Kıyaslama: Renkli maddeler yada bir reaktifle renklendirilebilen maddeler için uygulanır. Madde miktarlarındaki küçük değişmelerin leke alanlarında büyük değişmeler oluşturması istenir. Sonuçlar yarı kantitatiftir ve hata yüzdesi yüksektir B) Leke Alanlarının Ölçülmesi: 1. Planimetre ile ölçülerek 2. Kağıt kesilip tartılarak (İTK için lekeler kağıda kopya edildikten sonra) 3. Lekeler milimetrik kağıda çizildikten sonra, kareler sayılarak 4. Standart büyüklüklerle kıyaslayarak yapılabilir. C) Dansitometrik Yöntemler: Leke alanları, doğrudan KK yada İTK dan absorbans/fluoresans şiddetinin ölçülmesi ile bulunur. UV-Görünür alan absorbsiyonu olmayan, Fluoresans göstermeyen maddeler kromatografi işleminden önce veya sonra absorbsiyon veren veya Fluoresans gösteren türevlerine dönüştürülerek tayin edilirler. Dansitometrik metodlar ikiye ayrılır: 1. Spektrofotometrik metodlar (Kromatogram spektrofotometrisi) 2. Fluorimetrik metodlar (Fluorodansitometrik metod) Spektrofotometrik metodlar: Ölçmeler iki yöntem ile yapılır: A. Reflektans Yöntemi: Lekeye gelen ışın ile yansıyan ışının şiddetleri farkı ölçülür. Plastik, metal veya cam plaklar kullanılır. B. Transmitans Yöntemi: Lekeye gelen ışın ile transmite olan ışının şiddetleri farkı ölçülür. Cam plaklar veya saydam materyaller için uygundur (İTK nın negatif fotoğrafları, elektroforogramlar vs). 3

4 Her iki yöntemde de ölçmenin esasları spektrofotometriktir: Lekeler bir monokromatik ışınla taranır. Boş alandan yansıyan / transmite olan ışığın şiddeti ile lekeden yansıyan / transmite olan ışığın şiddeti arasındaki fark ölçülür ve bunlar yazıcıda pik şeklinde kaydedilir. Pikin yüksekliği leke renk şiddetinin bir ölçüsü, genişliği ise tarama yönündeki lekenin genişliği ile orantılıdır. Pikin alanı veya integrasyonu madde miktarı ile doğru orantılıdır. Fluorimetrik metot: Madde lekesi ile çevresindeki adsorbanın emisyon farkı ölçülür. Ölçmenin esasları fluorimetriktir. Yöntem fluoresans özellik gösteren yada bazı reaktiflerle (dansil klorür, fluorescamine vs) fluoresans veren türevler oluşturabilen maddeler için uygundur. Fluorodansitometrik ölçmeler iki şekilde yapılabilir. A. Madde fluoresans gösterir, zemin fluoresans değildir. Maddeye en uygun eksitasyonla (366 veya 254 nm) tarama yapılır ve lekelere tekabül eden pikler elde edilir. 4

5 Fluorodansitometrik ölçmeler iki şekilde yapılabilir. B. Madde fluoresans göstermez, zemin fluoresans gösterir. GF254 plaklar kullanılır. Pikler ters olur (UV lamba altında bakıldığında zemin parlak madde lekeleri gri görünür-söndürme etkisi). İTK nın kullanım alanları : *İlaç etken maddelerinin teşhis ve saflık kontrollerinde, *Bitkisel ve hayvansal drogların incelenmesinde, *Farmasötik preparatlardaki maddelerin kalitatif ve kantitatif analizlerinde kullanılır. SÜTUN KROMATOGRAFİSİ İlk uygulanan kromatografi tekniğidir da Al 2 O 3 - CaCO 3 doldurulmuş bir sütundan, yeşil yaprakların petrol eterindeki çözeltisi geçirilmiş ve klorofil ile karotenin ayrı bölgelerde toplandığı görülmüştür. Bu kromatografide silindirik, altında mobil faz akış hızını ayarlayan bir musluk bulunan cam borular kullanılır. 5

6 Çalışma tekniği: *Adsorban madde, sütuna mobil faz ile süspande edilmiş halde doldurulur. *Ayrılması istenen karışımın mobil fazdaki konsantre çözeltisi sütunun üzerinden ilave edilir. *Musluk istenen akış hızına ayarlanır ve belli hacimlerde mobil faz fraksiyonları (elüat) toplanır. En çok kullanılan adsorbanlar: Silikajel, Al 2 O 3,CaCO 3, selüloz tozu, poliamid tozu, aktif kömür, magnezyum silikat Adsorbanın parçacıkları ne kadar küçük olursa ayrılma da o kadar iyi olur. Ancak buna paralel olarak mobil fazın hareket hızı yavaşlayacağı için kromatografi süresi uzar. Sütunun boy/çap oranının 40/1 olması uygundur. *Sütunun kurumaması için mobil faz sütuna sürekli olarak ilave edilmelidir. [High performance (pressure) liquid chromatography] En yaygın kullanılan Analitik yöntemdir. MF : Polar yada Apolar bir sıvı SF : 4 ayrı tipte olabilir: 1.Katı adsorban: Sıvı-Katı Kromatografisi (Adsorpsiyon): Genellikle silika dolgular kullanılır. 2.Sıvı : Sıvı-Sıvı Kromatografisi (Dağılma): C8, C18, CN gibi fazlarla kovalent bağlanarak sıvanmış silika dolgular kullanılır. 3.Jel : Jel geçirgenlik : jel filtrasyon kromatografisi. jel kaplı silika dolgular veya polimerler kullanılır. 4.İyonik bileşik : İyon değiştirme kromatografisi. İyonik fonksiyonel grup bağlanmış silika ya da reçine dolgulu kolonlar kullanılır. Polimer iyon değiştiricilerin en bilineni divinil benzen-stiren polimeridir. Molekül ağırlığı <1000 olan küçük bileşenler Adsorpsiyon, Dağılma ve iyon değiştirme kromatografisi ile; Molekül ağırlığı >1000 olan büyük bileşenler İyon değiştirme ve Jel kromatografisi ile tayin edilirler. 6

7 HPLC cihazının bölümleri: 1. MF haznesi ve çözücü sistemi 2. Pompa 3. Enjeksiyon bölmesi 4. Kolon 5. Detektör 6. Kaydedici MF haznesi ve çözücü sistemi MF içindeki çözünmüş gazların giderilmesi için gaz giderme düzenekleri kullanılır: Bunlar; a) vakum pompası sistemi, b) inert bir gaz ile üfleme tertibatı olabilir. Gaz giderme sistemleri çoğunlukla bir süzme düzeneği de içerirler. Sabit bileşimde tek bir çözücü sistemi kullanılarak yapılan ayırmaya izokratik elüsyon, polariteleri birbirinden farklı iki veya üç çözücü sistemi ile yapılan ayırmaya da gradient elüsyon denir. 7

8 Pompalama sistemleri a) Sürgülü pompalar b) Pistonlu pompalar c) Pnömatik pompalar Enjeksiyon bölmesi: Örneğin kolona tekrarlanabilir hacimlerde gönderilmesi için önemlidirler. Manüel ya da otomatik olabilir. Otomatik numune örnekleme sistemleri en tekrarlanabilir sonuçları verir. Soğutmalı olan türleri tüm örneklerin akşamdan analiz için cihaza konulabilmesi ve örneklerin bozunmaması gibi bir üstünlük sağlar. Kolonlar SF ın katı olduğu adsorbsiyon kr.de silikajel kolonlar kullanılır. Dolgu maddesi poröz yada peliküler olabilir. Ticari adları; LiChrosrb Si, Micropak Si, Porasil, Partisil, Zorbax... SF ın sıvı olduğu bağlı faz kr.de silikajelin aktif silanol gruplarına çeşitli polaritedeki gruplar bağlanır. Bağlanma sililleme reaksiyonları ile olur. En fazla kullanılanlar; oktil (C8 zinciri), oktadesil (C18 zinciri), fenil, alkilamin ve alkilnitritlerdir. Ticari adları: LiChrosorb RP8 Bondopak C18 Nukleasil ODS Bondapak CN, Bondopak NH 2 8

9 Bağlı faz Kromatografisi; SF ve MF ın polarlığına bağlı olarak iki kısma ayrılır: 1. Normal faz (NP) kromatografi; SF: Polar (Silikajel), MF: Apolar (Hekzan, isopropil eter), 2. Ters faz (RP) kromatografi. SF: Apolar (C8, C18 gibi hidrokarbonlar), MF: Polar (Su, metanol, asetonitril vb) Tüm HPLC yöntemlerinin dörtte üçü RP uygulamalardan oluşur. Bağlı Faz Kromatografisi Detektörler a) Absorbans detektör b) Fluoresans detektör c) Refraktif indeks detektörleri d) Elektrokimyasal detektör e) Optikçe aktiflik detektörleri f) Kütle spektrometrik detektörler 9

10 Absorbans detektörler : Bu detektörlerde, kolonda ayrılan madde çözeltisinin detektörün içinden geçtiği sırada absorbansı ölçülür. Çeşitleri: a) Filtreli UV Absorbans Detektörleri; b) Monokramatörlü UV Absorbans Det. (diyod-serili cihazlar : DAD) c) İnfrared absorbans Det. (Fourier dönüşümlü : FTIR) En belirgin avantajı: Kullanım alanı geniştir. En yaygın HPLC detektörleridir. Dezavantajları Seçici değildir Duyarlığı düşüktür Fluoresans Detektörler: Kolonda ayrılan madde çözeltisinin detektörün içinden geçtiği sıradaki emisyonu ölçülür. Avantajları: Duyarlığı yüksektir. Seçicidir. Dezavantajı Fluoresans gösteren yada fluoresans türev verebilen maddelerle kullanılabilir. Refraktif İndeks detektörü: Bu detektör, kolon yolu üzerinde iki yarım bölmeli bir hücre içerir. Çözücü bir yarım bölmeden, eluat diğer yarım bölmeden geçerken iki çözeltinin kırılma indisleri farklı olduğundan gelen ışın demeti yolundan sapar ve sinyal değişir. Bu sinyal değişiklikleri kaydedilerek kromatogram elde edilir. Avantajları: Tüm maddelere cevap verebilirler. Güvenlidirler. Dezavantajı Akış hızından ve sıcaklıktan etkilenirler. Duyarlığı azdır. 10

11 Kütle spektrometrik detektörler: Cihaz LC/MS adını alır. En hassas detektörlerden biridir. Cihaz GC-MS düzeneği gibidir. Tek farkı mobil faz gaz olmadığı için bir mobil faz giderme bölümü eklenmiştir. KROMATOGRAFİNİN TEORİSİ Kromatogram: Detektör cevabına karşılık zamana veya çözücü hacmine karşı çizilen grafiktir. t, V = Bir maddeye ait pikin maksimumuma karşı gelen süre yada hacim. t 0, V 0 = Mobil fazın kendisinin kolondan çıkması için geçen süre yada harcanan hacim. (ölü hacim= boşluk hacmi) w = Madde pikinin taban genişliği Dağılma katsayısı K = Cs /Cm Kapasite faktörü k = (V-V 0 )/V 0 (V = zaman x akış hızıdır) k = (t-t 0 )/t 0 Elüsyon hacmi V = V 0 (1+ k ) Kolon verimliliği = Etkinlik Bir kromatografi sütununun verimliliğini yada etkinliğini belirten değer, Teorik Plato Eşdeğer Yüksekliği (=High Equivelent of one Theorical Plate = HETP) dir. HETP = H = L/N L = Kromatografi Kolonunun uzunluğu N = Teorik plato sayısıdır ve bir kromatogramdan bulunabilir. N = 16 (t/w) 2 Teorik plato sayısı 1. Sütunun uzunluğuna, 2. Stasyoner fazın parçacık büyüklüğüne 3. Mobil fazın akış hızına bağlıdır. Ayırma gücü (Resolution): Kromatogramdaki birbirine yakın iki pikin birbirlerine göre durumlarını tanımlayan ülçüdür (Ayrılmanın ölçüsüdür). R = 2 Δt R /w ort Kantitatif bir ayırma için R>1-1,5 olmalıdır. (R=1 olduğunda 2 pik yaklaşık %2 kayıpla birbirlerinden ayrılırlar). 11

12 GC VE HPLC DE KALİTATİF ANALİZ: Retansiyon zamanı (alıkonma zamanı = Rt, t R ) Retansiyon hacmi (alıkonma hacmi = Rv, v R ) GC VE HPLC DE KANTİTATİF ANALİZ: Kantitatif yöntemler maddenin pik alanı yada yüksekliğinin bir yada daha fazla standart ile kıyaslanmasına dayanır. Analizler; Pik yüksekliği Pik alanı ölçülerek yapılır. Kullanılan yöntemler: 1. Alan Normalizasyonu yöntemi: 2. Eksternal (dış) standart yöntemi 3. İnternal (iç) standart yöntemi 4. Standart katma yöntemi Alan Normalizasyonu yöntemi: %A= (A) nın pik alanı x 100 / (A+B+C..) pik alanlarının toplamı Bu yöntemin kullanılması için numunedeki tüm bileşenlerin tam olarak elue edilmesi gereklidir. Uygulamaları kısıtlıdır (safsızlık analizleri). Eksternal (dış) standart yöntemi: Maddeye ait standardın/standartların belli miktarları sisteme önceden enjekte edilerek ya tek standarda göre bir pik alanı/yüksekliği değeri yada birçok standarda göre bir ölçü eğrisi hazırlanır. Daha sonra numunedeki madde miktarı ya tek standart pik alanı/yüksekliği ile oranlanarak yada ölçü eğrisinden hesaplanır. Standart ve numune analizleri aynı şartlarda ve aynı günde yapılmalıdır. 12

13 İnternal (iç) standart yöntemi: Bu yöntemde, fiziksel ve kimyasal yapı olarak analiz edilecek maddeye benzer bir internal standart madde seçilir. Her bir standart ve numune analizine İnternal std. maddenin belirli miktarları eklenir. Konsantrasyona karşı madde pik alanının / yüksekliğinin internal standardın pik alanına / yüksekliğine oranı kullanılarak bir ölçü eğrisi hazırlanır ve numunedeki madde mikarı bu ölçü eğrisiyardımıyla bulunur. Ön işlemlerden ve enjeksiyondan kaynaklanan belirsizlikleri önler (Tayinde ekstraksiyon, türevlendirme gibi ön işlemler varsa bu yöntem tercih edilmelidir). Standart katma yöntemi: Önce örnek uygun koşullarda sisteme enjekte edilir. Sonra referans standart maddeden belirli miktar eklenerek analiz yapılır. Pik alanı yada yüksekliğinin farkından miktar tayinine geçilir. Biyolojik materyallerde bazen zorunlu olarak kullanılabilir. Bu yöntemde de enjeksiyondan ve ön işlemlerden gelen hataları ortadan kaldırmak için ortama bir inernal standart madde katılabilir. Bu durumda şu formül kullanılır: Pik Alan Oranı = Madde Pikinin Alanı / İç Standart Pikinin Alanı A = A b -A a A a = Madde pik alanı / Std. pik alanı A b = Madde(bilinmeyen+bilinen) pik A. / std pik A Madde miktarı = İlave edilen madde miktarı x A a / A b 13

14 14