TÜBĠTAK BĠDEB. KĠMYA LĠSANS ÖĞRENCĠLERĠ KĠMYAGERLĠK, KĠMYA ÖĞRETMENLĠĞĠ, KĠMYA MÜHENDĠSLĠĞĠ BĠYOMÜHENDĠSLĠK ARAġTIRMA PROJESĠ. KĠMYA 3 (ÇalıĢtay 2012)

Transkript

1 TÜBĠTAK BĠDEB KĠMYA LĠSANS ÖĞRENCĠLERĠ KĠMYAGERLĠK, KĠMYA ÖĞRETMENLĠĞĠ, KĠMYA MÜHENDĠSLĠĞĠ BĠYOMÜHENDĠSLĠK ARAġTIRMA PROJESĠ KĠMYA 3 (ÇalıĢtay 2012) KĠMYA PROJE RAPORU GRUP MORĠN PROJE ADI MALATYA KAYISISI ÜZERĠNE BAZI KĠMYASAL MADDELERĠN ĠNHĠBĠTÖR ETKĠSĠ VE ENZĠM KĠNETĠĞĠNĠN ĠNCELENMESĠ PROJE EKĠBĠ Mehtap UĞUR Kader ÖZGÜR PROJE DANIġMANLARI Prof. Dr. Nevin GÜRBÜZ Prof. Dr. Halit DEMĠR MALATYA 29 HAZĠRAN 8 TEMMUZ 2012

2 PROJENĠN AMACI Malatya kayısısından elde edilen polifenol oksidaz enzimi (E.C ; PFO) üzerine uygulanan bazı kimyasal maddelerin inhibitör etkilerinin araģtırılması, enzim substrat iliģkisinin ve reaksiyon kinetiğinin incelenmesi. 1. GĠRĠġ 1.1 Enzim Hücre içinde meydana gelen kimyasal değiģmeler metabolik olay olarak ifade edilmektedir. Metabolik olaylar ile birçok madde parçalanır ve yeni maddeler sentezlenir. Metabolik olaylar, hücre ve canlıya özgü olan kendi özel koģullarında gerçekleģen olaylardır. Bu olaylardan biyolojik ve biyokimyasal tepkimeler; vücut sıcaklığında, dar bir ph aralığında ve canlı için yeterli olabilecek bir hızla gerçekleģir. Hücresel olayların bu koģullarda gerçekleģmesi, enzim denilen biyolojik katalizörlerle olmaktadır. Meyve ve sebzelerin hasat edilmesi, taģınması, depolanması veya iģlenmesi sırasında meydana gelen doku zedelenmeleri, bir takım kimyasal reaksiyonlara maruz kalarak kahverengi veya esmerleģme olarak bilinen kararmalara neden olduğu bilinmektedir. KurutulmuĢ meyvelerde, elma, armut, Ģeftali, muz, kayısı gibi çeģitli ürünlerde oluģan esmerleģme istenmeyen olgulardır. Aynı zamanda çayın, çikolatanın tadı ve kokusu, kavrulmuģ kahve, bisküvi ve benzeri unlu mamullerin kavrulmuģ gibi olan renkleri, kavrulmuģ fındık, fıstık, ceviz ve patates cipsi gibi gıda maddelerinin kontrollü olarak kızartılmıģ renkleri açısından arzu edilen bir durumdur. Enzimatik esmerleģme, meyve ve sebzelerin üretim kayıplarının %50 sinden fazlasının sorumlusu olabilir. Zarar gören bitki dokularında meydana gelen kararma polifenol oksidaz enzimi katalizörlüğü eģliğinde gerçekleģen kimyasal bir reaksiyondur. Bunun nedeni gıda maddelerinde bulunan fenolik bileģiklerin oksijen varlığında kinonlara yükseltgenmesidir. Örneğin patateslerin kararmalarında kafeik asit ve klorogenik asit yanında tirozin de önemli rol oynamaktadır.

3 ġekil 1.1 Enzimatik kararmada polifenol oksidazın rolü Enzimlerin miktarı, aktiviteleri esas alınarak belirlenir ve enzim ünitesi (E.Ü) cinsinden verilir. 25 o C de ve optimal Ģartlarda 1 mikromol substratı 1 dakikada ürüne dönüģtüren enzim miktarı, 1 enzim ünitesi olarak kabul edilmiģtir. Enzimler katalizledikleri reaksiyonları açısından spesifiktirler. Enzimleri diğer katalizörlerden daha önemli özellikleri Ģunlardır: Enzim katalizli reaksiyonların hızları çok yüksektir, Reaksiyon sonucu yan ürün oluģmaz, %100 verimle çalıģırlar. 1.2 Polifenol Oksidaz Enzimi (E.C ; PFO) PFO enzimi ilk olarak 1856 yılında Schoenbein tarafından yemeklik mantarlarda bulunmuģtur. Polifenol oksidaz bitkilerde kararmaya sebep olan oksidoredüktaz sınıfından bir enzimdir. Birçok meyve ve sebzede bulunmasının yanı sıra ıstakoz, karides, yengeç gibi kabuklu deniz hayvanlarında ve bazı mikroorganizmalarda da bulunmaktadır. Meyve ve sebzelerin olgunlaģması süresince, içerdikleri PFO enziminin aktivitesi değiģmektedir. Ham meyvelerde, PFO aktivitesi ve dolayısıyla renklenme dahafazladır. Zeytinin olgunlaģması sırasında o-difenol konsantrasyonunun arttığı, enzim aktivitesinin azaldığı görülmüģtür.

4 1.3 Molekül yapısı Polifenol oksidaz, birden fazla alt birimden oluģan oligomerik yapıda bir enzimdir. PFO'nun içerdiği alt birimlerin sayısı enzimin izole edildiği kaynağa ve substrata bağlı olarak değiģmektedir. 1.4 Substratları Meyve ve sebzeler fenolik bileģiklerinin geniģ bir karıģımını içerirler. Ancak bunların çok az bir kısmı polifenol oksidaz enzimine substrat olarak uygundur. Meyve ve sebzeler, yapısında çeģitli fenolik bileģikler bulundurmaktadır. Bu substratlara baģta katekol, 4-metil katekol, pirogallol, dopa olmak üzere gallik asit, tirozin, kafeik asit ve sinnamik asit esterleri örnek verilebilir. Sinnamik asit türevlerinden klorojenik asit ve kafeik asit (3,4-dihidroksi sinnamik asit) PFO enziminin yaygın olarak kullanılan substratlarıdır. Katekol (o-dihidroksi fenol); enzimatik oksidasyon çalıģmalarında model substrat olarak kullanılmaktadır. Dopa ve tirozin hemen hemen bütün bitki dokusunda bulunan aminoasitlerdir ve PFO'nun substratlarıdır. Tirozin Katekol 4- Metil katekol Pirogallol Kayısı da bulunan PFO nun fenolik substratları; izoklorogenik asit, kafeik asit, 4-metil katekol, klorogenik asit, katekin, epikatekin, pirogallol, katekol, flavanol, p- koumarik asit türevleridir.

5 1.5 Aktivatörleri Aktivatörlerin, enzimin içerdiği monomerlerin Cu 2+ iyonu içeren oligomer oluģturacak Ģekilde etki gösterdiği ve enzimin aktivite göstermesi için gerekli polimerizasyonu sağladığı düģünülmektedir. 1.6 Ġnhibisyon Enzimlerin hücre içi ve hücre dıģı aktivitelerinin bazı bileģikler tarafından azaltılması ve hatta yok edilmesi olayına inhibisyon adı verilir. Buna sebep olan bileģiklere de inhibitör denilmektedir. Ġnhibitörler genelde küçük molekül ağırlığına sahip bileģikler ve iyonlardır. 1.7 Enzim Kinetiği Enzim reaksiyonları üzerinde ilk geniģ kinetik çalıģmalar 1913 yılında Michaelis-Menten tarafından yapılmıģtır. Michaelis-Menten kinetiğine göre baģlangıç enzim deriģimi sabit alınıp reaksiyon hızının substrat deriģimine bağlılığı incelenir. Sonuçta hiperbolik bir fonksiyon ve eğri elde edilir (ġekil 1.2). Bunun çözümü ile Michaelis-Menten bağıntısı bulunur. ġekil 1.2 Michaelis-Menten grafiği. Michaelis-Menten Bağıntısı Michaelis-Menten grafiği hiperbol olduğu için bağıntı doğru denklemi elde etmek amacıyla çeģitli Ģekillere dönüģtürülür. Bunlardan en çok kullanılanı Lineweaver-Burk denklemidir. Lineweaver-Burk denklemi

6 ġekil 1.3 Lineweaver-Burk grafiği V max ve K m bir enzimin aktivitesini belirleyen önemli enzim sabitleridir. V max maksimum hız olarak belirtilir. K m Michaelis-Menten sabiti olarak belirtilir ve maksimum hızın (V max /2) yarısına karģılık gelen substrat deriģimidir. 2. MATERYAL VE YÖNTEM 2.1 Kullanılan Materyaller Malatya kayısısı Benzoik asit Pirogallol NaCl KCl CaCl 2 Askorbik asit (Vitamin C) Fosfat tamponu (ph=7.5) Süzgeç kağıdı Spektrofotometre Isıtıcı Terazi Beher

7 Baget Huni Dereceli silindir Erlenmayer Mikropipet Damlalık 2.3 Polifenol Oksidaz Enziminin Eldesi Öncelikle kayısılar bagetle beherde ezildi. YumuĢayan kayısılar 50 ml fosfat tamponu eklenerek süzgeç kağıdına kondu ve süzülmeye bırakıldı. Kalıntılardan arındırılmak için süzüntü tekrar süzüldü. 2.4 Substratın Hazırlanması Substrat olarak baģlangıçta 0,04 M lık benzoik asit çözeltisi kullanıldı. Bunun için 0,4886 g benzoik asit 100 ml sıcak suda çözüldü. Ġkinci substrat olarak 0,01 M lık pirogallol çözeltisi hazırlandı. Miktar olarak katı pirogallolden 0,1260 g alınıp 100 ml suda çözüldü. 2.5 Ġnhibitörlerin Hazırlanması 0,5 M NaCl çözelitisi: 2,9225 g NaCl 100 ml suya tamamlandı. 1,0 M NaCl çözeltisi: 5,8439 g NaCl 100 ml suya tamamlandı. 0,5 M KCl çözeltisi: 3,7276 g KCl tartılıp 100 ml suda çözüldü. 1,0 M KCl çözeltisi: 7,4550 g KCl tartılıp 100 ml suda çözüldü. 0,5 M CaCl 2 çözelitisi: 5,5493 g CaCl ml suda çözülerek hazırlandı. 1,0 M CaCl 2 çözeltisi: 11,0980 g CaCl ml suda çözülerek hazırlandı. 0,5 M Askorbik asit çözeltisi: 2,2013 g askorbik asit alınarak 25 ml de çözüldü. 1,0 M Askorbik asit çözeltisi: 4,407 g askorbik asit alınarak 25 ml de çözüldü.

8 2.6 Ġnhibisyon Sodyum klorür (NaCl), potasyum klorür (KCl), kalsiyum klorür (CaCl 2 ) ve askorbik asit inhibitörleri kullanılarak polifenol oksidaz enziminin inhibisyonu, benzoik asit ve pirogallol substratları varlığında incelendi. 2.7 Spektrofotometrik Ölçümler Kör çözelti hazırlanması: 2,8 ml fosfat tamponu, 0,1 ml PFO ve 0,1 ml substrat, toplam hacim 3 ml olacak Ģekilde karıģtırıldı. Örneklerin hazırlanması: 2,7 ml fosfat tamponu, 0,1 ml PFO, 0,1 ml substrat ve 0,1 ml inhibitör, 3 ml olacak Ģekilde karıģtırıldı. Hazırlanan karıģımlar 3 ml lik, 1 cm ıģık yollu plastik küvete yerleģtirildi. Örneklerin Pharmacia Biotech Novaspec II spektrofotometresinde 420 nm dalga boyunda absorbans değerlerine bakıldı. 2.8 Enzim Kinetiğinin Ġncelenmesi Kinetik inceleme için; ilk numune 0,1 ml PFO enzimi, 2,8 ml tampon çözeltisi ve 0,1 ml substrat, toplam hacim 3 ml olacak Ģekilde karıģtırıldı. Sonraki örneklerde enzim miktarı sabit tutulup substrat miktarı arttırılarak tüm numunelerin 420 nm de absorbans değerleri ölçüldü ve böylece enzim-substrat iliģkisi incelendi. 3. BULGULAR Bu bölümde çalıģmalar sonucunda elde edilen deneysel veriler sunulmaktadır. 3.1 Benzoik Asit Substratı Varlığında Elde Edilen Enzim Aktivite Sonuçları Spektrofotometreden alınan absorbans değerleri kullanılarak enzim aktivite ve inhibisyon hesapları yapıldı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 3.1 de gösterilmiģtir. Sonuçlara göre NaCl ve askorbik asitin PFO nun aktivitesini inhibe ettiği, dolayısıyla bu inhibitörlerin PFO içeren meyve ve sebzelerin kararmasını geciktici olarak kullanılabileceği tespit edilmiģtir. Diğer taraftan sonuçlar gösteriyor ki 1,0 M KCl inhibitör etki gösterirken, 0,5 M KCl enzim aktivitesini arttırıcı özelliğe sahiptir.

9 0,5 M ve 1,0 M CaCl 2 ün enzimi aktif hale getirdiği ve bu özelliğinden dolayı Malatya kayısısında kararmayı önleyici olarak kullanılamayacağı gözlenmiģtir. Ġnhibisyon değerleri aģağıdaki bağıntı kullanılarak elde edildi; Çizelge 3.1 PFO enziminin benzoik asit substratlığında çeģitli inhibitörlere karģı aktivitesi ve inhibisyon değerleri PFO Aktivitesi Madde EÜ/mL Ġnhibisyon (%) Ham ekstrakt 0,112-0,5 M NaCl 0,035 31,25 1,0 M NaCl 0,040 35,71 0,5 M KCl 0, ,25 1,0 M KCl 0,093 83,04 0,5 M CaCl 2 1, ,68 1,0 M CaCl 2 2, ,04 0,5 M Vitamin C 0,050 44,64 1,0 M Vitamin C 0,022 19, Pirogallol Substratı Varlığında Elde Edilen Enzim Aktivite Sonuçları Diğer substrat çeģidi pirogallolde elde edilen aktivite ve buna bağlı olarak hesaplanan % inhibisyon değerleri Çizelge 3.2 de belirtilmiģtir. Aktivite birimi olarak l ml enzim çözeltisi baģına l dakikada absorbansta meydana gelen 0,001 birimlik değiģme kullanıldı. l Enzim ünitesi (U) reaksiyonun oluģtuğu küvette l dakikada meydana gelen 0,001'lik artıģ olarak tanımlandı. Genel olarak sonuçlara bakıldığında pirogallol substratı varlığında hesaplanan

10 değerler benzoik asit substrat verilerinden daha düģük sonuçlar verdiği gözlenmiģtir. Buna göre NaCl, KCl ve askorbik asitin değiģik konsantrasyonları dahi PFO enzim aktivitesini inhibe edici özelliğe sahiptir. Fakat yapılan çalıģmada CaCl 2 ün 0,5 M ve 1,0 M lık konsantrasyon değerlerinin ters etki gösterdiği saptanmıģtır. Ayrıca benzoik asitin inhibitör özelliğinin incelenmesi için pirogallol substratlığında aktivite tayini yapıldı ve sonuca göre %8,56 lık değerle inhibitör özelliğine sahip olduğu gözlendi. Çizelge 3.2 PFO enziminin pirogallol substratlığında çeģitli inhibitörlere karģı aktivitesi ve inhibisyon değerleri PFO Aktivitesi Madde EÜ/mL Ġnhibisyon (%) Ham ekstrakt 0,5 M NaCl 1,0 M NaCl 0,5 M KCl 1,0 M KCl 0,5 M CaCl 2 1,0 M CaCl 2 0,5 M Vitamin C 1,0 M Vitamin C 0,04 M Benzoik asit 0,327 0,051 0,031 0,106 0,102 0,203 1,179 0,025 0,066 0,028-15,60 9,48 32,42 31,19 62,08 360,55 7,65 20,18 8,56

11 1/V 3.3 Enzim Kinetiği Değerleri y = x R² = /S ġekil 3.1 Lineweaver-Burk grafiği Grafikteki (ġekil 3.1) doğru denklemi kullanılarak V max ve K m değerleri Lineweaver-Burk bağıntısına benzetilerek hesaplandı: Çizelge 3.3 Absorbans ölçümleri, V max ve K m değerleri Substrat Miktarı Absorbans V max (U/dk -1 ) K m (mm) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,290 0,413 0,454 0,505 0,514 0,886 0, ,5

12 4. SONUÇ VE TARTIġMA Bu çalıģmada Malatya kayısısından elde edilen polifenol oksidaz enziminin benzoik asit ve pirogallol substratlığında çeģitli kimyasallarla inhibisyonları gözlenmiģtir. Ayrıca pirogallol substratlığında enzim kinetiği hesapları yapılarak enzim-substrat iliģkisi incelenmiģtir. Ġnhibisyonla ilgili çalıģmalarda NaCl, KCl, CaCl 2 ve askorbik asit inhibitör olarak kullanılmıģ ve polifenol oksidaz enzimi üzerindeki etkileri araģtırılmıģtır. Aktivite hesaplamalarına göre NaCl ve askorbik asit meyve ve sebzelerin doğal renginin ve içeğinin korunmasında kararmayı önleyici madde olarak kullanılabileceği ispatlanmıģtır. Fakat CaCl 2 aktivatör etkiye sahip olduğu, dolayısıyla bu enzimi içeren sebze ve meyvelerin içeriğinin korunmasında kullanılacak bir madde olmadığı gözlenmiģtir. Yapılan çalıģmalarda elde edilen değerlerin literatür bulgularıyla paralel olduğu saptanmıģtır. Ancak çeģitli kayısı türlerinde polifenol oksidaz enziminin araģtırılması çalıģmaları literatürlerde kısıtlı sayıdadır. Bu yüzden çok fazla karģılaģtırma yapılamamıģtır. Enzim kinetiği hesaplamalarında ise substrat olarak pirogallol kullanıldı. Bu substratın çeģitli konsantrasyonları için ölçülmüģ reaksiyon hızlarının kinetik analizleri Lineweaver-Burk denklemi kullanılarak, grafiğin eğiminden V max ve K m değerleri hesaplandı. K m değeri 177,5 mm ve V max =0,7884 U olarak hesaplandı. TEġEKKÜR ÇalıĢtay koordinatörü: Prof. Dr. Mehmet AY a sunuları ve çalıģmalarıyla bizleri aydınlatan danıģmanlarımız: Prof. Dr. Nevin GÜRBÜZ, Prof. Dr. Halit DEMĠR, Teknisyen Zeynel ġahġn e, tüm çalıģtay ekibine, grup arkadaģlarımıza ve Malatya Üniversitesi ne teģekkür ederiz

13 KAYNAKÇA 1. ÇĠMEN Ç., Iğdır Kayısısından (şalak) SaflaĢtırılan Polifenol Oksidaz Enzimi Üzerinde Bazı Ġlaç ve Kimyasalların Ġnhibisyon Kinetiğinin AraĢtırılması, Yüksek Lisans Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Fen Bilimleri, ĠSTANBUL, TURAN P., Ocimum Basilicum L. den elde edilen Polifenol Oksidaz Enziminin SaflaĢtırılması, Kinetik ve Elektroforetik Özelliklerinin Ġncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri, BALIKESĠR, Meslekî Eğitim Ve Öğretim Sisteminin Güçlendirilmesi Projesi, KĠMYA TEKNOLOJĠSĠ, ANKARA, AKBULUT N., Dereotundan (Anethum Graveolens) Ġzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin Bazı Killerle Ġmmobilizasyonu Ve SeçilmiĢ Özelliklerinin Ġncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, ATATÜRK ÜNĠVERSĠTESĠ, Fen Bilimleri, ERZURUM, 2011 GRUP ÜYELERĠNĠN ÖZGEÇMĠġLERĠ Mehtap UĞUR ( Ġstanbul Üniversitesi- ĠSTANBUL ) 1989 yılında Ġstanbul da doğdu. Ġlköğretim ve liseyi Ġstanbul da tamamladı yılında Ġstanbul Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümünden mezun oldu. Bilim ve müzik tarihi ile ilgilenmeyi sever. Kader ÖZGÜR ( Ġzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü- ĠZMĠR ) 1989 yılında Bulgaristan da doğdu. Ġlkokul dördüncü sınıfa kadar Bulgaristan da okudu. Ortaöğretim ve liseyi Çorlu / Tekirdağ da tamamladı yılında Ġzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Kimya Bölümünü kazandı. Halen ĠYTE de öğrenimine devam etmektedir.