Eritropoietin reseptörleri, eritroid hücreler dýþýnda vasküler endotel hücrelerinde (13,14) ve kalpte (15,16) de bulunmaktadýr. Ýnsanlarda akut hipoks

Transkript

1 aziantep Medical Journal Gwww.gantep.edu.tr/~tipdergi Araþtýrma Makalesi/Research Article Anestezi Uygulanan Sýçanda Miyokardiyal Ýskemi ve Önkoþullamada Oluþan Aritmiler Üzerine Akut ve Kronik Eritropoietinin Etkileri Effects of Acute and Chronic Administration of Erythropoietin on Arrhythmias Induced by Myocardial Ischemia and Preconditioning in Anesthetized Rats Þeniz Demiryürek 1, Ali Fuad Kara 2, Cahit Baðcý 1, Ýbrahim Sarý 3, Mehmet Tarakçýoðlu 4 A. Tuncay Demiryürek 2 1 Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalý, 2 Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Farmakoloji Anabilim Dalý 3 Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Patoloji Anabilim Dalý 4 Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Biyokimya Anabilim Dalý Özet Eritropoietin, eritropoiesisde hormonal stimülatör olarak rol oynayan bir sitokindir. Rekombinant insan eritropoietini, kronik hemodiyaliz olan hastalarda anemiyi düzeltmek için kullanýlýr. Ýskemik önkoþullama, kýsa süreli iskeminin daha sonraki letal iskemiye karþý korumayý indükleyen güçlü bir endojen koruyucu fenomendir. Yoðun araþtýrmalara karþýn, iskemik önkoþullamanýn moleküler mekanizmasý henüz tam olarak belirli deðildir. Ýskemi veya hipoksi uygulamasýndan sonra oluþtuðundan, eritropoietinin iskemik önkoþullamanýn diðer bir endojen mediyatörü olduðu ileri sürülmüþtür. Kardiyoprotektif etkisini araþtýrmak için, bu çalýþmada anesteziye sýçanlarda oklüzyon aritmileri üzerinde akut ve kronik eritropoietin uygulamasýnýn etkileri incelenmiþtir. Eritropoietin, ventriküler taþikardiyi azaltmasý, ventriküler fibrilasyonu ortadan kaldýrmasý ve aritmi skorunu düþürmesi ile belirgin antiaritmik etki oluþturdu. Bizim sonuçlarýmýz, eritropoietinin kendisinin önkoþullama oluþturabileceðini, iskemik ve karbakol ile indüklenen farmakolojik önkoþullamanýn kardiyoprotektif etkilerini koruyabileceðini göstermiþtir. Kronik eritropoietin uygulamasý, hipertansiyon oluþturdu ve bu etki nitrik oksit sentaz inhibitörü L-NAME varlýðýnda belirgin olarak arttý. Fakat, L- NAME, anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kardiyoprotektif etkilerini inhibe etmedi. L-NAME ile plazma NO düzeyleri anlamlý olarak azalmasýna karþýn, kronik eritropoietin NO düzeylerinde artmaya yol açtý. Eritropoietin, oksijen radikallerini temizleyen enzimleri upregüle ederek de koruyucu etki oluþturabilir. Dolayýsýyla, bu çalýþmada eritrosit süperoksit dismutaz enzim düzeyleri ölçüldü fakat anlamlý bir deðiþiklik gözlenmedi. Kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda bütün gruplarda malondialdehit ve laktat düzeylerinde belirgin azalma vardý. Bu sonuçlar, eritropoietinin kalbi ventriküler aritmilere karþý koruyabildiðini ve kardiyak önkoþullama oluþturabileceðini düþündürmektedir. Anahtar kelimeler: Aritmiler, Eritropoietin, Ýskemi, Karbakol, Nitrik oksit, Önkoþullama Abstract Erythropoietin is a cytokine that is commonly associated with its role as a hormonal stimulator of erythropoiesis. Recombinant human erythropoietin is used to correct anemia in patients undergoing chronic hemodialysis. Ischemic preconditioning is a powerful endogenous protective phenomenon in which brief episodes of ischemia induce protection against future, lethal ischemia. Despite the intensive investigation, the exact molecular mechanisms underlying ischemic preconditioning are not well known. Erythropoietin has been suggested as another endogenous mediator of ischemic preconditioning since it is produced after ischemic or hypoxic insults. In order to determine its cardioprotective effects, we examined the effects of acute and chronic administration of erythropoietin on occlusion-induced arrhythmias in anesthetized rats in the present study. Erythropoietin produced marked antiarrhythmic effects with reduction in ventricular tachycardia, abolition of ventricular fibrillation and attenuation of arrhythmia scores. Our results showed that erythropoietin itself was able to induce preconditioning and preserved the cardioprotective effects of ischemic and carbachol-induced pharmacological preconditioning. Chronic erythropoietin administration generated hypertension and this effect was markedly augmented in the presence of NO synthase inhibitor L-NAME. However, L-NAME did not inhibit the cardioprotective effects of erythropoietin in anesthetized rats. Although plasma NO levels was markedly reduced with L-NAME, chronic erythropoietin led to an increased in NO levels. Erythropoietin could also act protectively by upregulating enzymes that scavenge oxygen radicals. Therefore, erythrocyte superoxide dismutase enzyme levels were measured in the present study, but no changes were observed. There were marked inhibitions in malondialdehyde and lactate levels in all groups when compared to control. These results suggest that erythropoietin is able to protect heart against ventricular arrhythmias and can produce cardiac preconditioning. Keywords: Arrhythmias, Erythropoietin, Ischemia, Carbachol, Nitric oxide, Preconditioning GÝRÝÞ Ýskemik önkoþullama, tek veya tekrarlayan kýsa süreli iskemik periyodun daha uzun süreli iskemik periyodlarda organ, doku ve hücrelerde nekroz geliþimine karþý belirgin bir direnç oluþturmasý ile gerçekleþen koruyucu bir mekanizmadýr. Ýskemik önkoþullama, ilk kez Murry ve arkadaþlarý tarafýndan 1986 yýlýnda köpek kalbinde gösterilmiþtir ve bu çalýþmadan sonra önkoþullama ile ilgili oldukça fazla araþtýrma yapýlmýþtýr (1). Bu mekanizmanýn, insanlarda da bulunduðu yapýlan bazý klinik çalýþmalarda ortaya konmuþtur. Miyokardiyal önkoþullama, kalbin daha uzun süreli bir iskemiye karþý oluþturduðu koruyucu mekanizmadýr ve mediyatörleri ile hücresel sinyal ileti mekanizmalarý halen araþtýrýlmaktadýr. Kardiyak iskemik önkoþullama ile görülen koruma, þimdiye kadar gözlenen en kuvvetli infarkt oluþumunu önleyici etkidir. Ýskemik önkoþullamanýn miyokarddaki en önemli özelliði, koroner arter oklüzyonuna baðlý olarak geliþen nekrozun azalmasýný saðlamasýdýr. Önkoþullama, iskemi ve reperfüzyonun yol açtýðý endotel disfonksiyonuna karþý da korunma saðlamakta (2) ve enerji baðýmlý hücre ölümünü (apoptozis) azaltmaktadýr (3). Önkoþullamanýn, iskeminin erken dönemlerinde enerji metabolizmasýný yavaþlattýðý, aritmileri azalttýðý, post-iskemik disfonksiyonun iyileþmesini geliþtirdiði, izole atrial trabekül kaslarýnda post-iskemik gerimi artýrdýðý ve iskeminin yanýsýra hipoksik hasara karþý da direnci artýrdýðý gösterilmiþtir (4,5). Önkoþullamanýn hücresel sinyal ileti mekanizmasýný aydýnlatmaya yönelik yoðun çalýþmalar sürmektedir (6). Adenozin, bradikinin ve opioid reseptörlerinin ayný anda aktivasyonlarý ve kýsa süreli iskemi-reperfüzyon boyunca oksijen radikallerinin ortama salýverilmesi iskemik önkoþullamayý tetiklemeye katkýda bulunur (7). Ýnsanlarda iskemik önkoþullama ile ilgili çalýþmalarýn sayýsý sýnýrlý olmakla beraber farklý organlardaki koruyucu etkisi gösterilmiþtir (8). Eritropoietin (epoetin), eritropoiezisin hormonal stimülatörü olarak rol oynayan bir sitokindir. Hipoksi, bir glikoprotein hormon olan eritropoietin salgýlanmasýný düzenleyen baþlýca faktördür (9) ve hipoksi ile indüklenen transkripsiyon faktörü (HIF-1) eritropoietin geninin oksijen baðýmlý düzenlenmesini kontrol eder (10-12). Þeniz Demiryürek, Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalý Adres: Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalý, Þehitkamil/GAZÝANTEP Tel: / Faks: E-posta: sdemiryurek@gantep.edu.tr Geliþ Tarihi: Kabul Tarihi: Received: Accepted:

2 Eritropoietin reseptörleri, eritroid hücreler dýþýnda vasküler endotel hücrelerinde (13,14) ve kalpte (15,16) de bulunmaktadýr. Ýnsanlarda akut hipoksik beyin hasarýnda vasküler eritropoietin ekspresyonu artmaktadýr (17). Hipoksiye yanýt olarak baþlýca böbreklerden sekrete edilen ve bir glikoprotein hormon olan eritropoietinin serebral iskemik hasara karþý koruyucu etki oluþturduðu (17,18) ve nöronal iskemik önkoþullamada rolü olduðu gösterilmiþtir (19,20). Yapýlan çalýþmalar, eritropoietinin koruyucu etkisinin retina (21), iskelet kasý (22) ve miyokardiyumda (23,24) da olduðu gösterilmiþtir. Eritropoietinin tavþan kalbinde infarkt alanýný azalttýðý, bu etkide kardiyak fibroblastlarýn rolü olduðu bildirilmiþtir (24). Eritropoietin ile oluþan korumanýn artmýþ olan hematokritten baðýmsýz olduðu, miyosit apoptozisini inhibe ettiði gösterilmiþtir (23). Bu çalýþmada, anestezi edilmiþ sýçanlarda koroner arter oklüzyonu ile iskemi oluþturulmasý ve iskemiyle oluþan aritmiler üzerinde eritropoietinin etkilerinin belirlenmesi amaçlanmýþtýr. Ayrýca önkoþullama deneylerinde de ventriküler aritmiler üzerinde eritropoietinin etkilerinin araþtýrýlmasý hedeflenmiþtir. MATERYAL VE YÖNTEM Deney hayvanlarý Deneylerde Gaziantep Üniversitesi hayvan bakým ve üretim ünitesinde üretilen, 21±1 C oda sýcaklýðýnda 12 saat aydýnlýk 12 saat karanlýk periyodundaki aydýnlatma ile senkronize edilen standart laboratuvar hayvan yemi ve istedikleri kadar içebilecekleri musluk suyu ile beslenen g aðýrlýðýndaki Wistar cinsi erkek sýçanlar kullanýlmýþtýr. Bu çalýþma için Gaziantep Üniversitesi Yerel Etik Kurulu onayý alýnmýþtýr. Sol inen koroner arter (left anterior descending, LAD) orjinine yakýn bölgeden 10 mm lik yuvarlak uçlu atravmatik 6/0 ipek ile sütüre edildikten sonra kalp derhal toraksa geri yerleþtirilmiþtir. Ýpek sütür materyalinin iki ucu bir polietilen borudan (10 mm uzunluðunda, 1 mm iç çapýnda) içerisinden geçirilerek sýkýþtýrýlmadan býrakýlmýþtýr. Bu aþamada cerrahi iþlemlerle belirgin aritmi oluþan veya kan basýncý 60 mmhg nýn altýnda olacak þekilde kalýcý bir düþme gözlenen hayvanlar çalýþma dýþý býrakýlmýþtýr. 15 dakikalýk stabilizasyon periyodundan sonra koroner arter etrafýna yerleþtirilen iplik bir klips yardýmýyla sýkýþtýrýlmýþ ve 30 dakika süreyle geçici bölgesel iskemi yapýlmýþtýr. Ýplerin gevþetilmesi ve borunun çýkarýlmasý ile reperfüzyon yapýlmýþtýr. Arteryel kan basýncýnda iskemi öncesi deðerlerle karþýlaþtýrýldýðýnda %20-30 luk azalma olmasý, baþarýlý bir oklüzyon yapýldýðýný kanýtlamaktadýr. Reperfüzyonda arteryel kan basýncýnýn iskemi öncesi deðerlere dönmesi de reperfüzyonun baþarýlý bir þekilde yapýldýðýnýn göstergesidir. Stabilizasyon döneminin ardýndan deney protokolüne geçilmiþtir. Ýskemi ve önkoþullama oluþturulmasý Bu çalýþmalarda kullanýlan deney protokolleri Þekil 1 de gösterilmiþtir. 30 dk lýk stabilizasyon periyodunun ardýndan plastik tüp içerisinden geçirilmiþ olan iplik bir klips yardýmý ile sýkýþtýrýlarak iskemi meydana getirilmiþtir. Ýskemi ile birlikte arteryel kan basýncýnda %20-30 civarýndaki düþüþ baþarýlý bir oklüzyonun göstergesi olarak kabul edilmiþtir (25). Yöntem Erkek sýçanlar tiyopental sodyum 120 mg/kg dozunda intraperitoneal olarak verilerek anesteziye edilmiþ ve anestezi gerektiðinde ilave tiyopental sodyum (~10 mg/kg, i.v.) enjeksiyonlarý ile devam ettirilmiþtir. Cilt insizyonunun ardýndan bez ve yað dokusu lateralize edilerek kas tabakalarý kesilmiþ ve trakea izole edilmiþtir. Trakea insizyonu ile endotrakeal tüp yerleþtirilmiþtir. Ýlaçlarýn i.v. olarak uygulabilmesi için sol juguler ven kanüle edilmiþ ve kanülün baðlý olduðu enjektör infüzyon pompasýna yerleþtirilmiþtir. Sol karotid arter kanülasyonu yapýlmýþ ve sisteme baðlý kan basýncý transduseri (BPT300 Blood pressure transducer) aracýlýðýyla ortalama arteryel kan basýncý sürekli olarak kaydedilmiþtir. Kanülasyon öncesinde kanül heparin ile yýkanmýþtýr. Sýçanlarýn standart II. derivasyon EKG si subkütan elektrodlarla bilgisayar baðlantýlý Biopac MP30 Data Acquisition Sistemi aracýlýðýyla sürekli olarak ölçülmüþ ve bilgisayara kaydedilmiþtir. Sisteme baðlý rektal sýcaklýk probu (TSD202A) anüsten yaklaþýk 3 cm ilerletilerek yerleþtirilmiþ ve vücut sýcaklýðý deney süresince izlenmiþ ve ýsýtýcý lamba ile 37±1 C de sabit olarak tutulmaya çalýþýlmýþtýr. Sýçanlara i.v. 200 IU/kg dozda heparin verilmiþ ve trakea kanülü solunum pompasýna (SAR-830, IITC Life Science, Kaliforniya, ABD) baðlanmýþtýr. Anesteziye sýçanlar solunum pompasý (70 kez/dk) (80) aracýlýðýyla oda havasý ile solutulmuþtur. Sternumun yaklaþýk 3 mm lateralinden olmak üzere 4. ve 5. kostalar sol torakotomi yapýlarak göðüs kafesi açýlmýþtýr. Perikardiyum uzaklaþtýrýlmýþ, toraks insizyonun iki ucu pens yardýmý ile geniþletilerek abdomene doðru basýnç oluþturulmuþ ve kalp nazikce göðüs kafesi dýþýna çýkartýlmýþtýr. Þekil 1. Deneysel protokol 20

3 Eritropoietinin önkoþullama üzerindeki etkilerinin araþtýrýldýðý deneylerde iskemik önkoþullamadan 10 dk önce eritropoietin 400 U/kg dozunda i.v. bolus þeklinde uygulanmýþ ve iskemik önkoþullamanýn ardýndan oklüzyon yapýlarak 30 dk lýk iskemi döneminde aritmiler incelenmiþtir (eritropoietin + iskemik önkoþullama). L-NAME in eritropoietin + iskemik önkoþullama üzerine olan etkilerinin incelenmesi de eritropoietin uygulanmasýndan 5 dk önce L-NAME 10 mg/kg (29) dozunda i.v. bolus þeklinde uygulanarak araþtýrýlmýþtýr (L-NAME + eritropoietin + iskemik önkoþullama). Farmakolojik önkoþullama deneylerinde, 20 dk lýk stabilizasyon periyodunun ardýndan karbakol 5 dk süreyle infüzyon tarzýnda 4 mg/kg/dk dozunda uygulanmýþ ve sonrasýnda 5 dk beklenilmiþ ve ardýndan 30 dk lýk oklüzyon yapýlmýþtýr (karbakol önkoþullamasý). Eritropoietinin karbakol önkoþullamasý üzerindeki etkileri, eritropoietinin 400 U/kg dozunda i.v. bolus þeklinde karbakol infüzyonundan 10 dk önce i.v bolus olarak verilmesi ile incelenmiþtir. Þekil 1. Deneysel protokol (Devam) 20 dk lýk dengeleme periyodunun ardýndan 5 dk iskemi periyodunu izleyen 5 dk lýk reperfüzyon periyodu ile iskemik önkoþullama oluþturulmuþ ve sonra 30 dk lýk iskemi uygulanmýþtýr. Reperfüzyonda arteryel kan basýncýnýn iskemi öncesindeki deðerine yükselmesi baþarýlý bir reperfüzyonun göstergesi olarak kabul edilmiþtir. Ýlaç uygulamasý Eritropoietin (Eprex flakon, Santa Farma, Ýstanbul) daha önce sýçanlarda akut etki için kullanýlan tek doz (400 U/kg) (26) ve kronik etki için uygulanan dozda (100 U/kg, sc, her iki günde bir 15 gün süreyle) (27) olmak üzere iki þekilde uygulanmýþtýr. Karbakol ile önkoþullamada daha önce sýçanlarda önkoþullama oluþturduðu bildirilen 4 µg/kg/dakika (28) karbakol dozu kullanýlmýþtýr. Deneysel protokol Bütün deneylerde cerrahi iþlemlerin bitiminin ardýndan deney protokollerine geçiþ öncesi 15 dk beklenilmiþtir (Þekil 1). Kontrol grubunda, kalpler 30 dk lýk stabilizasyon sonrasý 30 dk LAD koroner arter oklüzyonuna maruz býrakýlmýþtýr. Eritropoietinin akut uygulamasýnýn iskemi aritmileri üzerine etkilerinin araþtýrýldýðý deneylerde, oklüzyondan 20 dk önce 400 U/kg dozunda i.v. bolus þeklinde eritropoietin uygulanmýþ ve bunun iskemi aritmileri üzerindeki etkileri 30 dk boyunca incelenmiþtir. Ýskemik önkoþullama grubunda, 20 dk lýk stabilizasyon periyodundan sonra 5 dk iskemi ve ardýndan 5 dk reperfüzyon ile önkoþullama yapýlmýþ sonrasýnda 30 dk lýk iskemi uygulanmýþtýr. Eritropoietinin kronik uygulamasýnýn iskemi aritmileri üzerine etkilerinin araþtýrýldýðý deneylerde 100 U/kg, sc, her iki günde bir 15 gün süreyle eritropoietin uygulanmýþ, ertesi gün 30 dk süreyle uygulanan iskemi aritmileri üzerindeki etkileri incelenmiþtir. Kontrol grubunda sýçanlara her iki günde bir 15 gün süreyle eritropoietin dozu için hesaplanan hacimlerde serum fizyolojik uygulamasý yapýlmýþtýr. Ýskemik önkoþullama grubunda sýçanlara her iki günde bir 15 gün süreyle eritropoietin dozu için hesaplanan hacimlerde serum fizyolojik uygulamasý yapýlmýþ, ertesi gün 20 dk lýk stabilizasyon periyodundan sonra 5 dk iskemi ve ardýndan 5 dk reperfüzyon ile önkoþullama yapýlmýþ sonrasýnda 30 dk lýk iskemi uygulanmýþtýr. Kronik eritropoietin uygulamasýnýn önkoþullama üzerindeki etkilerinin araþtýrýldýðý deneylerde, her iki günde bir 15 gün süreyle eritropoietin uygulanmýþ ve ertesi gün iskemik önkoþullamanýn ardýndan oklüzyon yapýlarak 30 dk lýk iskemi döneminde aritmiler incelenmiþtir (eritropoietin + iskemik önkoþullama). L-NAME in kronik eritropoietin + iskemik önkoþullama üzerine olan etkilerinin incelenmesinde eritropoietin + iskemik önkoþullama grubundaki protokol uygulanmýþ ve 15 gün süreyle L-NAME 10 mg/kg/gün (30) dozunda i.p. þeklinde uygulanarak L-NAME in etkileri araþtýrýlmýþtýr (L-NAME + eritropoietin + iskemik önkoþullama). Farmakolojik önkoþullama deneylerinde sýçanlara her iki günde bir 15 gün süreyle eritropoietin dozu için hesaplanan hacimlerde serum fizyolojik uygulamasý yapýlmýþ, ertesi gün 20 dk lýk stabilizasyon periyodunun ardýndan karbakol 5 dk süreyle infüzyon tarzýnda 4 mg/kg/dk dozunda uygulanmýþ ve sonrasýnda 5 dk beklenilmiþ ve ardýndan 30 dk lýk oklüzyon yapýlmýþtýr (karbakol önkoþullamasý). Kronik eritropoietinin karbakol önkoþullamasý üzerindeki etkileri, eritropoietinin her iki günde bir 15 gün süreyle uygulanmasýndan sonra ertesi gün 5 dk karbakol infüzyonu ve sonrasýnda 5 dk bekleme periyodu ve ardýndan 30 dk lýk oklüzyon yapýlarak incelenmiþtir (eritropoietin + karbakol önkoþullamasý). Ölçülen parametreler Deney boyunca arteryel kan basýncý, rektal sýcaklýk, standart EKG verileri bilgisayar ortamýnda sürekli olarak kaydedilmiþtir. Bütün gruplarda kalp atým hýzý EKG den belirlenmiþ ve aritmiler Lambeth kurallarýna göre (31) ventriküler taþikardi (VT), ventriküler fibrilasyon (VF), ve ventriküler ektopik atým (VEA) þeklinde deðerlendirilmiþtir. 21

4 VEA, birbirinden ayrý ve belirlenebilir prematüre QRS kompleksi olarak tanýmlanmýþtýr. VT, dört veya daha fazla ardýþýk VEA olarak, VF ise normal EKG den daha küçük amplitüdlü, kaotik aktivite gösteren EKG þeklinde belirlenmiþtir. Bigemini gibi kompleks formlar ise VEA lar içerisinde deðerlendirilmiþtir. Sýçanlarda VF kalýcý olabilir veya spontan olarak normal sinüs ritmine dönebilir. Baþlangýcýndan itibaren 5 dk içerisinde normal sinüs ritmine dönmeyen irreversibýl VF olarak kabul edilmiþtir. Ýlk aritmi baþlama zamaný ve aritmilerin süresi de kaydedilmiþtir. Aritmi skoru daha önceden yayýnlanan skalaya göre hesaplanmýþtýr (32): 0-30 dakikalýk iskemi süresince VT veya VF nin olmamasý, 0-50 VEA olmasý, 1- Sadece VEA, den fazla VEA veya bir spontan olarak reversibl VT veya VF, arasýnda spontan olarak reversibl VT ve/veya VF görülmesi, 4-30 dan fazla sayýda spontan olarak reversibl VT ve/veya VF görülmesi, 5- Ýrreversibýl VF görülmesi. Biyokimyasal analizler Deneysel protokollerin bitiminin ardýndan sað ventrikülden kan örneði alýnmýþtýr. Alýnan kan örnekleri 5000 rpm de, 4 o C de 15 dakika süreyle santrifüj edilmiþ, plazmalarý ayrýlmýþ ve -40 o C de muhafaza edilmiþtir. Laktat ölçümü Laktat ölçümü için kan örnekleri sodyum florür/potasyum oksalat içeren tüplere alýnarak santrifüj edilmiþtir. Plazmadaki laktat konsantrasyonu ölçümü Vitros LAC Kiti (Ortho-Clinical Diagnostics, Rochester, ABD) kullanýlarak yapýlmýþtýr. Burada ölçülebilen en düþük plazma laktat düzeyi 0.5 mm dýr. Malondialdehid (MDA) ölçümü Plazma MDA düzeyi ölçümü daha önce belirtilen yöntemle ölçülmüþtür (33). MDA oluþumu, tiyobarbitürik asitle reaksiyona giren maddelerin (TBARS) ölçümü ile deðerlendirilmiþtir. Sodyum dodesil sülfat (% 8.1) 0.2 ml, % 20 lik asetik asit solüsyonundan 1.5 ml, % 0.8 TBA (ph 3.5) dan 1.5 ml, 90 mm butillenmiþ hidroksitoluenden 0.1 ml, (in vitro TBARS oluþumunu önlemek için) ve 0.6 ml distile su eklenmesiyle; n-butanol ve piridin içine ekstrakte edilen bir kromojenik ürün elde edildi. Sonuçlar spektrofotometrede 532 nm de okundu ve nmol/ml olarak gösterildi. TBARS ýn miktarý; tetramethoksipropan standartý kullanýlarak MDA eþdeðeri olarak hesaplandý. NO ölçümü Plazma örneklerini deproteinize etmek için, 1:2 v/v oranýnda soðutulmuþ (0 o C) absolu etanol eklendi ve vortekslendi. Örnekler 30 dk 0 o C de inkübe edildikten sonra g de 5 dk santrifüj edildi. Süpernatant, 95 o C deki vanadyum (III) HCl içine enjekte edilmiþ ve nitrat, nitrit ve S-nitroso bileþiklerinin NO ya indirgenmesi sonucu oluþan NO nun ölçümü için kullanýldý. NO ile ozon arasýndaki gaz fazý kemiluminesans reaksiyonu ile NOA 280i (Sievers Instruments, Boulder, CO, ABD) analizörü kullanýlarak NO ölçümü yapýldý. SOD düzeyleri Deney sonunda EDTA lý tüplere alýnan kandan eritrosit paketi hazýrlandý ve üretici firmanýn tarif ettiði þekilde SOD düzeyleri kit kullanýlarak belirlendi (RANSOD, Randox, Ýrlanda). Ýmmunohistokimyasal analiz Apoptozis Deney sonunda çýkarýlan kalpler %10 formalin solüsyonuna konularak patolojiye gönderildi ve üretici firmanýn tarif ettiði þekilde kit kullanýlarak belirlendi (DeadEnd, Colorimetric TUNEL System, Promega, Madison, WI, ABD). Ýstatistiksel analiz Sonuçlar ortalalama ortalamanýn standart hatasý olarak veya % insidans olarak verilmiþtir. Ýstatistiksel analizler GraphPad Instat (version 3.05, GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) kullanýlarak yapýlmýþtýr. Ýkiden fazla gruplar arasýndaki karþýlaþtýrmalarda tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanýlmýþ, anlamlýlýk tesbit edildiðinde analize Student-Newman-Keuls testi ile devam edilmiþtir. Ventriküler taþikardi ve ventriküler fibrilasyon insidanslarýndaki anlamlý farklýlýðý saptamada Fisher in kesin ki kare testi kullanýlmýþtýr. Aritmi skorlarýnýn istatistiksel deðerlendirilmesinde Mann- Whitney U testi kullanýlmýþtýr. Bütün testlerde 0.05 den küçük P deðeri istatistiksel olarak anlamlý kabul edilmiþtir. BULGULAR Hemodinamik parametreler Yapýlan deneylerde ölçülen hemodinamik parametrelerle ilgili elde edilen sonuçlar Tablo 1-4 de sunulmuþtur. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda ölçülen ortalama arteryel kan basýncý (mm Hg) ve kalp atým hýzý (atým/dk) deðerleri Tablo 1-2 de verilmektedir. Baþlangýç stabilizasyon dönemi ortalama kan basýncý deðerleri arasýnda istatistiksel analiz yapýldýðýnda kontrol grubuna göre anlamlý bir fark olmadýðý saptanmýþtýr. Yapýlan kontrol grubu deneylerinde ortalama arteryel kan basýncýnýn koroner arter oklüzyonundan sonra belirgin olarak düþmesi baþarýlý bir iskemi yapýldýðýný göstermektedir. Ýskemik önkoþullama grubunda hem 5 dakikalýk hem de 30 dakikalýk koroner arter oklüzyonu ile kan basýncý belirgin olarak düþmüþtür. L-NAME uygulamasý anlamlý olarak kan basýncý artýþýna yol açmýþtýr. Karbakol önkoþullamasýnda da 5 dakikalýk karbakol infüzyonu ve sonrasýndaki dönemlerde kan basýncý düþük olarak seyretmiþtir. Eritropoietin bu düþüþü etkilememiþtir (Tablo 1). Kalp atým hýzlarý deðerlendirildiðinde, stabilizasyon döneminde gruplar arasýnda belirgin bir farklýlýk bulunmamaktadýr. Karbakol uygulamasýnda kalp atým hýzýnda belirgin azalma oluþtuðu gözlenirken diðer gruplarda anlamlý bir deðiþiklik saptanmamýþtýr (Tablo 2). Kronik eritropoietin uygulmasý kan basýncýnda artýþlara yol açmýþtýr fakat gruplar arasýnda istatistiksel deðerlendirme yapýldýðýnda bu anlamlýlýk düzeylerine eriþmemiþtir. Anlamlý kan basýncý artýþý L-NAME uygulanan grupta saptanmýþtýr (Tablo 3). Kronik eritropoietin ile birlikte iskemik önkoþullama uygulanan gruplarda koroner oklüzyonla oluþan kan basýncýndaki anlamlý düþme ortadan kalkmýþtýr. 22

5 Tablo 1. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda ölçülen ortalama arteryel kan basýncý (mm Hg) deðerleri. Tablo 2. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda ölçülen kalp atým hýzý (atým/dk) deðerleri. Tablo 3. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda ölçülen ortalama arteryel kan basýncý (mm Hg) deðerleri. 23

6 Tablo 4. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda ölçülen kalp atým hýzý (atým/dk) deðerleri. Karbakol uygulamasý hem kan basýncýnda hem de kalp atým hýzýnda belirgin düþmeler oluþturmuþtur. Diðer gruplarda kalp atým hýzlarýnda belirgin bir deðiþiklik gözlenmemiþtir (Tablo 4). Aritmi parametreleri Yapýlan deneylerde oluþan aritmilerle ilgili elde edilen sonuçlar Tablo 5-8 de sunulmuþtur. Yapýlan deneylerde kontrol grubunda irreversibýl ventriküler fibrilasyon gözlenmezken tüm sýçanlar VT ye girmiþtir. Eritropoietinin akut uygulandýðý gruplarla önkoþullama gruplarýnda kontrol ile karþýlaþtýrýldýðýnda ventriküler ektopik atým sayýsý ve %VT anlamlý olarak azalmýþtýr. Karbakol önkoþullamasýnda %VT azalmasýna karþýn anlamlý düzeye eriþmemiþtir. VF sadece kontrol grubunda 3 sýçanda görülmüþtür (Tablo 5). Yapýlan deneylerde, aritmi baþlama zamaný da kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda gecikmiþ fakat sadece L-NAME + eritropoietin + iskemik önkoþullama grubunda anlamlý gecikme bulunmuþtur. VT sürelerinde belirgin bir deðiþiklik saptanmazken, kontrol grubu dýþýnda VF görülmediðinden gruplarda anlamlý azalma hesaplanmýþtýr. Aritmi skoru da anlamlý olarak azalmýþ, en belirgin azalma iskemik önkoþullama grubunda gözlenmiþtir (Tablo 6). Tablo 5. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda oluþan aritmiler. 24

7 Tablo 6. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda oluþan aritmi süreleri ve aritmi skoru. Tablo 7. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda oluþan aritmiler. Eritropoietinin kronik uygulandýðý gruplarda kontrol ile karþýlaþtýrýldýðýnda total ventriküler ektopik atým sayýsýnýn belirgin olarak azaldýðý görüþmüþtür. VT insidansý ise sadece iskemik önkoþullama uygulanan gruplarda belirgin olarak azalmýþtýr. VF ise sadece kontrolde gözlenmiþtir (Tablo 7). Aritmi baþlama zamaný ve VT süresi sadece iskemik önkoþullama uygulanan gruplarda anlamlý olarak deðiþmiþtir. VF süresi de kontrole göre anlamlýlýk göstermiþ ve aritmi skoru eritropoietin grubu dýþýndakilerde belirgin olarak azalmýþtýr. Aritmi skorunda en belirgin azalma, iskemik önkoþullama grubunda gözlenmiþtir (Tablo 8). Biyokimyasal analizler Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýndaki plazmada ölçülen biyokimyasal parametreler Þekil 2-5 de gösterilmiþtir. MDA düzeyleri kontrole göre tüm gruplarda anlamlý azalma göstermiþ, laktat düzeylerinde ise istatistiksel olarak anlamlý azalma sadece iskemik önkoþullama uygulanan gruplarda saptanmýþtýr. L- NAME uygulanan grupta plazma NO düzeyleri belirgin olarak azalmýþ, diðer gruplar arasýnda bir fark ortaya çýkmamýþtýr. Eritrosit SOD düzeylerinde ise belirgin bir deðiþiklik gözlenmemiþtir. Tablo 8. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýnda oluþan aritmi süreleri ve aritmi skoru. 25

8 Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deney gruplarýndaki plazmada ölçülen biyokimyasal parametreler Þekil 6-9 da gösterilmiþtir. MDA ve laktat düzeylerinde kontrole göre tüm gruplarda anlamlý azalma gözlenmiþtir. NO düzeylerinde ise eritropoietin uygulanan gruplarda belirgin artma saptanýrken, L-NAME uygulanan grupta anlamlý azalma gözlenmiþtir. Eritrosit SOD düzeylerinde ise belirgin bir deðiþiklik gözlenmemiþtir. Þekil 2. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma MDA düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda. Ýmmunohistokimyasal analiz Sol ventrikülden alýnan kesitlerde kit aracýlýðýyla yapýlan immunohistokimyasal boyamada kontrol grubu ve diðer gruplarda apoptozise rastlanmamýþtýr (Þekil 10). Þekil 3. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma laktat düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda. Þekil 6. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma MDA düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda. Þekil 4. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma NO düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 diðer gruplarla karþýlaþtýrýldýðýnda. Þekil 7. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma laktat düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda. Þekil 5. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin akut uygulamasý ile yapýlan deneylerde eritrosit SOD düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. Þekil 8. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deneylerde plazma NO düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. *P<0.05 kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda. +P<0.05 diðer gruplarla karþýlaþtýrýldýðýnda. 26

9 Þekil 9. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deneylerde eritrosit SOD düzeyleri. E, eritropoietin; ÝÖ, iskemik önkoþullama; KÖ, karbakol önkoþullamasý. Þekil 10. Anesteziye sýçanlarda eritropoietinin kronik uygulamasý ile yapýlan deneylerde immunohistokimyasal olarak boyamada apoptotik hücre görülmemektedir (x400 büyütme). TARTIÞMA Bu çalýþmada, akut ve kronik olarak uygulanan eritropoietinin iskemide, iskemik önkoþullamada ve karbakol ile oluþturulan farmakolojik önkoþullamadaki etkileri incelenmiþtir. Akut ve kronik uygulamada eritropoietin kardiyoprotektif etki oluþturmuþ, ventriküler aritmileri inhibe etmiþ, iskemik ve farmakolojik önkoþullamanýn etkilerini korumuþtur. Eritropoietin, lipid peroksidasyonunu ve laktat oluþumunu da azaltmýþtýr. Kronik eritropoietin uygulamasý, sýçanlarda hipertansiyon oluþturmuþtur. Bu sonuç, diðer deneysel çalýþmalarla uyumludur. 6 hafta boyunca haftada iki kez eritropoietin uygulamasýnýn sýçanlarda hipertansiyon oluþturmakta ve bu etki sirküle eden endotelin ve atriyal natriüretik peptid düzeyleri ile iliþkili bulunmamaktadýr (34). Eritropoietinin NO düzeylerine etkisi ilgili çalýþmalarýn sonuçlarý çeliþkilidir. 1 hafta süreyle tavþanlara eritropoietin uygulamasý, muhtemelen NO sentaz inhibisyonuyla endotelbaðýmlý vazodilatörlerin etkilerini azalttýðý bildirilmiþtir (35). Ayrýca, eritropoietin vasküler sistemde indüklenebilir NOS aktivitesini de inhibe edebilmektedir (36). Sýðýr endotel hücre kültürünün eritropoietin ile inkübe edildiðinde, NO ve ET-1 sentezinin modifiye edilmediðini gösteren çalýþma da mevcuttur (37). Endotel hücre kültürüne eritropoietin uygulamasýndan sonra NO düzeylerinin arttýðýný (38,39), deðiþiklik olmadýðýný (37) ve azaldýðýný (40) bildiren araþtýrmalar bulunmaktadýr. Del Castillo ve ark. (1995) eritropoietinin hipertansif etkisinin endojen NO sistemi aktivitesinde azalma sonucu olmadýðýný ortaya koydular (41). Bizim sonuçlarýmýz kronik eritropoietin uygulamasýnýn NO düzeylerini arttýrdýðýný gösteren çalýþmalarýn sonucunu desteklemektedir. Eritropoietin ile artan hematokrit, eritrosit kütlesi, kan hacmi, kan viskozitesi ve shear stres ile in vivo olarak NOS ekspresyonunun stimüle olmasý ve NO oluþumunun artmasý muhtemeldir. Normal sýçanlarda üriner NO atýlýmý da artmaktadýr (41, 27). Farelerde eritropoietinin kardiyoprotektif etkili olduðunu ve kardiyomiyosit enos protein ekspresyonu ile NO oluþumunu artýrdýðýný göstermiþtir (42). Kronik eritropoietin kullanýmý sitozolik Ca +2 konsantrasyonunu artýrmakta ve NO rezistansýna yol açtýðý ileri sürülmesine karþýn (43,44), sýçanlarda yapýlan çalýþmada eritropoietinin vasküler enos ekspresyonunu, plazma NO konsantrasyonunu ve NO baðýmlý vazodilatasyonu artýrdýðý gösterilmiþtir (45). Eritropoietinin ventriküler aritmilere karþý koruyucu etkisinin nöronal NOS aracýlýklý olduðu da gösterilmiþtir (46). Bu çalýþmada, L-NAME ile NO oluþumunun inhibe edilmesi, eritropoietinin koruyucu etkisini ortadan kaldýrmamýþtýr. Bu sonuç, izole infant tavþan kalbinde eritropoietinin kardiyoprotektif etkilerinin L-NAME veya L- NMA ile önlemediðinin gösterildiði çalýþmayý (47) desteklemektedir. L-NAME ile eritropoietin uygulanan sýçanlarda hipertansiyonun daha da artmýþ olmasý, eritropoietinin NO yu artýrmasýnýn bir göstergesi olabilir. Bizim bulgumuza benzer olarak eritropoietin uygulanan üremik sýçanlarda kontrol grubuna göre L-NAME kan basýncýnda daha fazla artýþ oluþturmuþtur (48). Yaptýðýmýz çalýþmada MDA düzeylerinde eritropoietin ile belirgin azalma gözlenmiþtir. Bu sonuç, Akisu ve ark. (2001) yaptýðý klinik araþtýrmadaki eritropoietin uygulanan preterm infantlarda serum MDA düzeylerinde bulunan düþme ile uyumludur (49). Hidroksil radikali ile oluþan eritrosit lipid peroksidasyonunun, eritropoietin tarafýndan önlendiði bilinmektedir (50). Bu bulgular, eritropoietinin lipid peroksidasyonunu inhibe edebildiðini göstermektedir. Sýçanlarda hem akut hem de kronik eritropoietin uygulamasý SOD düzeylerinde belirgin bir deðiþiklik yapmamýþtýr. Eritropoietin uygulanan preterm infantlarda eritrosit SOD aktivitesinde bir deðiþiklik olmadýðý saptanmýþtýr (49). Eksojen olarak uygulanan eritropoietin, vasküler endotel hücrelerini apoptozisden korur (51). H9c2 kardiyak miyoblast hücrelerinin 22 saat oksidatif strese veya 12 saat anoksiye maruz kaldýðýnda oluþan apoptotik ölümünü, eritropoietin azaltýr (23). Cai ve ark (2003) sýçanlara 5000 U/kg dozda eritropoietini i.p. olarak uygulamýþlar ve 24 saat sonra kalbi izole ederek 30 dk iskemi ve 45 dk reperfüzyon protokolü uygulamýþlar ve eritropoietinin apoptozisi azalttýðýný gösterdiler (15). Sýçanlarda eritropoietin 60 dakikalýk iskemiden sonra da apoptotik hücre sayýsýnda anlamlý azalma oluþturmaktadýr (16). Mudalagiri ve ark. (2008), insan atriyal trabekül kaslarý ile yaptýklarý çalýþmada, eritropoietinin önemli derecede apoptozisi azalttýðýný gösterdiler (52). 27

10 Bizim deneylerimizde apoptozis görülmemesinin nedeni deneysel protokolün apopotozis oluþturacak kadar uzun olmamasý ile ilgili olabilir. Tramontano ve ark. (2003) eritropoietinin iskemiden sonra uygulandýðýnda da koruyucu etki oluþturduðunu ortaya koydular (16). Sonuç olarak, bu projeden elde edilen veriler anesteziye sýçanda eritropoietinin antiaritmik etki gösterebileceðini, iskemik ve farmakolojik önkoþullamaya katkýsýnýn olabileceðini ortaya koymaktadýr. Bu sonuçlar, eritropoietinin farmakolojik önkoþullamada kullanýlabilecek bir ajan olabileceðini göstermekte ve miyokardiyal önkoþullamanýn hücresel mekanizmasýnýn aydýnlatýlmasýnda katkýda bulunmaktadýr. Teþekkür Bu çalýþma, Gaziantep Üniversitesi Bilimsel Araþtýrma Projeleri Komisyonu tarafýndan TF no lu proje ile desteklenmiþtir. REFERANSLAR 1. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 1986;74: Richard V, Kaeffer N, Tron C, Thuillez C. Ischemic preconditioning protects against coronary endothelial dysfunction induced by ischemia and reperfusion. Circulation. 1994;89: Piot CA, Padmanaban D, Ursell PC, Sievers RE, Wolfe CL. Ischemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo. Circulation. 1997;96: Altug S, Demiryurek AT, Kane KA, Kanzik I. Evidence for the involvement of peroxynitrite in ischaemic preconditioning in rat isolated hearts. Br J Pharmacol. 2000;130: Eisen A, Fisman EZ, Rubenfire M, Freimark D, McKechnie R, Tenenbaum A, Motro M, Adler Y. Ischemic preconditioning: nearly two decades of research. A comprehensive review. Atherosclerosis. 2004;172: Demiryürek S, Ceylan H, Demiryürek AT. Ýskemik önkoþullama ve etki mekanizmasý. Genel Týp Derg. 2003;13: Cohen MV, Yang XM, Liu GS, Heusch G, Downey JM. Acetylcholine, bradykinin, opioids, and phenylephrine, but not adenosine, trigger preconditioning by generating free radicals and opening mitochondrial K(ATP) channels. Circ Res. 2001;89: Demiryürek S, Ceylan H, Demiryürek AT. Ýskemik önkoþullamanýn klinik uygulamalarý. Genel Týp Derg. 2004;14: Kendall RG. Erythropoietin. Clin Lab Haematol. 2001;23: Marti HH, Bernaudin M, Petit E, Bauer C. Neuroprotection and Angiogenesis: Dual Role of Erythropoietin in Brain Ischemia. News Physiol Sci. 2000;15: Lin JS, Chen YS, Chiang HS, Ma MC. Hypoxic preconditioning protects rat hearts against ischaemia-reperfusion injury: role of erythropoietin on progenitor cell mobilization. J Physiol. 2008;586: Wasserfuhr D, Cetin SM, Yang J, Freitag P. Protection of the right ventricle from ischemia and reperfusion by preceding hypoxia. Naunyn-Schmiedeberg s Arch Pharmacol. 2008;378: Anagnostou A, Liu Z, Steiner M, Chin K, Lee ES, Kessimian N, Noguchi CT. Erythropoietin receptor mrna expression in human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91: Yamaji R, Okada T, Moriya M, Naito M, Tsuruo T, Miyatake K, Nakano Y. Brain capillary endothelial cells express two forms of erythropoietin receptor mrna. Eur J Biochem. 1996; 239: Cai Z, Manalo DJ, Wei G, Rodriguez ER, Fox-Talbot K, Lu H, Zweier JL, Semenza GL. Hearts from rodents exposed to intermittent hypoxia or erythropoietin are protected against ischemia reperfusion injury. Circulation. 2003;108: Tramontano AF, Muniyappa R, Black AD, Blendea MC, Cohen I, Deng L, Sowers JR, Cutaia MV, El-Sherif N. Erythropoietin protects cardiac myocytes from hypoxia-induced apoptosis through an Akt-dependent pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2003;112: Siren AL, Knerlich F, Poser W, Gleiter CH, Bruck W, Ehrenreich H. Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain. Acta Neuropathol (Berl). 2001;101: Sakanaka M, Wen TC, Matsuda S, Masuda S, Morishita E, Nagao M, Sasaki R. In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95: Digicaylioglu M, Lipton SA. Erythropoietin-mediated neuroprotection involves cross-talk between Jak2 and NFkappaB signalling cascades. Nature. 2001;412: Dawson TM. Preconditioning-mediated neuroprotection through erythropoietin? Lancet. 2002;359: Grimm C, Wenzel A, Groszer M, Mayser H, Seeliger M, Samardzija M, Bauer C, Gassmann M, Reme CE. HIF-1- induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nat Med. 2002;8: Ogilvie M, Yu X, Nicolas-Metral V, Pulido SM, Liu C, Ruegg UT, Noguchi CT. Erythropoietin stimulates proliferation and interferes with differentiation of myoblasts. J Biol Chem. 2000;275: Parsa CJ, Matsumoto A, Kim J, Riel RU, Pascal LS, Walton GB, Thompson RB, Petrofski JA, Annex BH, Stamler JS, Koch WJ. A novel protective effect of erythropoietin in the infarcted heart. J Clin Invest. 2003;112:

11 24. Parsa CJ, Kim J, Riel RU, Pascal LS, Thompson RB, Petrofski JA, Matsumoto A, Stamler JS, Koch WJ. Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart: a potential role for cardiac fibroblasts. J Biol Chem. 2004;279: Carbonin P, Di Gennaro M, Valle R, Beranbei R, Habed A. Intracellular calcium and electrogram in ischemic isolated rat heart. Am J Physiol. 1980;239: Vaziri ND, Zhou XJ, Smith J, Oveisi F, Baldwin K, Purdy RE. In vivo and in vitro pressor effects of erythropoietin in rats. Am J Physiol. 1995;269: Tsukahara H, Hiraoka M, Hori C, Hata I, Okada T, Gejyo F, Sudo M. Chronic erythropoietin treatment enhances endogenous nitric oxide production in rats. Scand J Clin Lab Invest. 1997;57: Yamaguchi F, Nasa Y, Yabe K, Ohba S, Hashizume Y, Ohaku H, Furuhama K, Takeo S. Activation of cardiac muscarinic receptor and ischemic preconditioning effects in in situ rat heart. Heart Vessels. 1997;12: Kawai Y, Hayashi Y, Ito I, Kamibayashi T, Takada K, Kagawa K, Yamatodani A, Mashimo T. Nicorandil prevents epinephrine-induced arrhythmias in halothane-anesthetized rats by nitric oxide-dependent mechanism. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2002;366, Yargicoglu P, Yaras N, Agar A, Gumuslu S, Abidin I, Bilmen S. Effects of N-nitro l-arginine methyl ester (L-NAME), a potent nitric oxide synthase inhibitor, on visual evoked potentials of rats exposed to different experimental stress models. Acta Physiol Scand. 2004;180: Walker MJA, Curtis MJ, Hearse DJ, Campbell RWF, Janse MJ, Yellon DM, Cobbe SM. The Lambeth Conventions: guidelines for the study of arrhythmias in ischaemia, infarction and reperfusion. Cardiovasc Res. 1988;22: Demiryürek AT, Yýldýz G, Eþiyok S, Altuð S. Protective effects of poly (ADP-ribose) synthase inhibitors on digoxininduced cardiotoxicity in guinea-pig isolated hearts. Pharmacol Res. 2002;45: Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979;95: Zhou XJ, Pandian D, Wang XQ, Vaziri ND. Erythropoietininduced hypertension in rat is not mediated by alterations of plasma endothelin, vasopressin, or atrial natriuretic peptide levels. J Am Soc Nephrol. 1997;8: Noguchi K, Yamashiro S, Matsuzaki T, Sakanashi M, Nakasone J, Miyagi K, Sakanashi M. Effect of 1-week treatment with erythropoietin on the vascular endothelial function in anaesthetized rabbits. Br J Pharmacol. 2001;133: Squadrito F, Altavilla D, Squadrito G, Campo GM, Arlotta M, Quartarone C, Saitta A, Caputi AP. Recombinant human erythropoietin inhibits inos activity and reverts vascular dysfunction in splanchnic artery occlusion shock. Br J Pharmacol. 1999;127: Lopez Ongil SL, Saura M, Lamas S, Rodriguez Puyol M, Rodriguez Puyol D. Recombinant human erythropoietin does not regulate the expression of endothelin-1 and constitutive nitric oxide synthase in vascular endothelial cells. Exp Nephrol. 1996;4: Wu XC, Johns EJ, Richards NT. Relationship between erythropoietin and nitric oxide in the contraction of rat renal arcuate arteries and human umbilical vein endothelial cells. Clin Sci. 1999;97: Banerjee D, Rodriguez M, Nag M, Adamson JW. Exposure of endothelial cells to recombinant human erythropoietin induces nitric oxide synthase activity. Kidney Int. 2000; 57: Wang XQ, Vaziri ND. Erythropoietin depresses nitric oxide synthase expression by human endothelial cells. Hypertension. 1999;33: del Castillo D, Raij L, Shultz PJ, Tolins JP. The pressor effect of recombinant human erythropoietin is not due to decreased activity of the endogenous nitric oxide system. Nephrol Dial Transplant. 1995;10: Rui T, Feng Q, Lei M, Peng T, Zhang J, Xu M, Dale Abel E, Xenocostas A, Kvietys PR. Erythropoietin prevents the acute myocardial inflammatory response induced by ischemia/reperfusion via induction of AP-1. Cardiovasc Res. 2005;65: Vaziri ND, Zhou XJ, Naqvi F, Smith J, Oveisi F, Wang ZQ, Purdy RE. Role of nitric oxide resistance in erythropoietininduced hypertension in rats with chronic renal failure. Am J Physiol. 1996;271: Ni Z, Wang XQ, Vaziri ND. Nitric oxide metabolism in erythropoietin-induced hypertension: effect of calcium channel blockade. Hypertension. 1998;32: Kanagy NL, Perrine MF, Cheung DK, Walker BR. Erythropoietin administration in vivo increases vascular nitric oxide synthase expression. J Cardiovasc Pharmacol. 2003;42: Burger DE, Xiang FL, Hammoud L, Jones DL, Feng Q. Erythropoietin protects the heart from ventricular arrhythmia during ischemia and reperfusion via neuronal nitric-oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther. 2009;329: Shi Y, Rafiee P, Su J, Pritchard KA Jr, Tweddell JS, Baker JE. Acute cardioprotective effects of erythropoietin in infant rabbits are mediated by activation of protein kinases and potassium channels. Basic Res Cardiol. 2004;99:

12 48. Moreau C, Lariviere R, Kingma I, Grose JH, Lebel M. Chronic nitric oxide inhibition aggravates hypertension in erythropoietin-treated renal failure rats. Clin Exp Hypertens. 2000;22: Akisu M, Tuzun S, Arslanoglu S, Yalaz M, Kultursay N. Effect of recombinant human erythropoietin administration on lipid peroxidation and antioxidant enzyme(s) activities in preterm infants. Acta Med Okayama. 2001;55: Chattopadhyay A, Choudhury TD, Bandyopadhyay D, Datta AG. Protective effect of erythropoietin on the oxidative damage of erythrocyte membrane by hydroxyl radical. Biochem Pharmacol. 2000;59: Chong ZZ, Kang JQ, Maiese K. Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Akt1 and mitochondrial modulation of cysteine proteases. Circulation. 2002;106: Mudalagiri NR, Mocanu MM, Di Salvo C, Kolvekar S, Hayward M, Yap J, Keogh B, Yellon DM, Br J Pharmacol. 2008;153: