Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:27-3

Transkript

1 ALFA LİPOİK ASİTİN FARKLI BALIK TÜRLERİNİN PROTEİN KALİTESİNE OLAN ETKİSİNİN İN VİTRO KOŞULLARDA İNCELENMESİ The In Vitro Investigation of Alpha Lipoic Acid Supplementation on Protein Quality of Different Species Gamze ÖZKALAY Su Ürünleri Anabilim Dalı Doç.Dr. Bahar KARAKAYA Su Ürünleri Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmada, çipura, hamsi ve palamut türlerine Fe +2 katalizli oksitlendirme sistemi kullanılarak bir antioksidan olan alfa lipoik asitin protein kalitesine etkisi araştırılmıştır. Protein oksidasyonunu belirlemek için protein karbonil (nmol karbonil/mg protein) ve protein denatürasyonunu belirlemek için sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılmıştır. Genel lineer model (GLM) kullanılarak yapılan istatistiksel analiz sonucunda, karbonil düzeyini önemli oranda azaltan alfa lipoik asit miktarı çipura için %1 ve palamut için %0.5 olarak tespit edilmiştir. Hamsi için ise %0.5 ve %0.1 düzeylerinde alfa lipoik asit eklemesinin protein karbonil düzeyini önemli oranda azalttığı, fakat %1 düzeyinde alfa lipoik asit eklemesinin protein karbonil düzeyi üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Protein bantlarının elektroforetik analizi sonucunda, alfa lipoik asitin bir antioksidan olarak protein bantlarının yoğunluğunun muhafazasında önemli bir etkiye sahip olmadığı hatta hamsi ve palamut gibi koyu renkli kasa sahip balıklarda %1 gibi yüksek düzeylerde kullanıldığında prooksidan olarak görev yaptığı saptanmıştır. Anahtar kelimeler: Alfa lipoik asit; Protein oksidasyonu; Protein denatürasyonu; Fe katalizör ABSTRACT In this study, the effect of alpha lipoic acid as an antioxsidant on protein quality of sea bream, anchovy and Atlantic bonita oxidized with Fe +2 catalyzed oxidation system were investigated. Protein carbonyl (nmol carbonyl/ mg protein) and sodium dodecyl sulfade polyacrylamide gel elctrophoresis (SDS-PAGE) were used to determine protein oxidation and denaturation, respectively. As a result of this study, a significantly decrease in the amount of protein carbonyl was obtained with 1% alpha lipoic acid supplementation for seabream and 0.5% alpha lipoic acid supplementation for Atlantic bonita. In anchovy, the amount of protein carbonyl decreased with 0.1% and 0.5% alpha lipoic acid supplementation. However, 1% alpha lipoic acid supplementation did not effect on the amount of protein carbonyl. Results from electrophoresis anaylses indicated that the alpha lipoic acid did not Yüksek Lisans Tezi- Msc_Thesis

2 show a good antioxidant property for these species and also it showed prooxidant activity in the dark muscle of fish when it was used of the ratio of 1%. Key words: Alpha lipoic acid; Protein oxidation; protein denaturation; Fecatalyzed oxidation Giriş Balıklar da, yaşayan diğer organizmalar öldükten sonra, reaktif oksijen türlerinin (ROS) meydana getirdiği oksidatif hasarı engelleyemeyecek hale gelir. Balıkların kas dokusunda oluşan ROS un yaptığı hasarlardan şimdiye kadar en çok lipitlerin oksidasyonu ile ilgili çalışmalara ağırlık verilmiştir. Halbuki oluşan ROS sadece lipitlerin oksitlenmesine değil aynı zamanda proteinlerinde oksitlenmesine neden olmaktadır (Berlett ve Stadtman, 1997; Griffiths, 2000). Protein oksidasyonu özellikle etlerde jelleşme, emülsifikasyon, vizkosite, çözünürlük ve su tutma kapasitesi gibi kas proteinlerinin fonksiyonlarını değiştirdiği belirtilmektedir ( Liu ve Xiong, 2000). Balıkların işlenmesi ve depolaması sırasında lipit oksidasyonunun kaliteye olan etkisi ile ilgili birçok çalışma olmasına rağmen balık kaslarında protein oksidasyonu ile ilgili çalışmalar oldukça kısıtlıdır. Biyolojik örneklerdeki oksidatif stresin etkisini tespit etmek amacıyla kullanılan en yaygın yöntem in vitro koşullarda metalle katalizlenen oksidasyon (MKO) sistemleridir (Madurawe ve Lumpkin, 1997; Kato ve ark., 2001). Yapılan çalışmalar, özellikle metalle katalizlenen oksidasyon sistemlerinin spesifik proteinleri okside ederek proteinlerin fonksiyonlarının kaybolmasına, yapısal değişikliklere ve protein yapılarını daha hassas hale getirerek indirgenmesine sebep olduğunu göstermektedir (Stadtman ve Oliver, 1991; Requena ve ark., 2003; Biridgewater ve ark., 2006). Antioksidan bileşiklerin etki şekli ve etkinlik düzeyi oldukça farklıdır. Genelde antioksidanlar; reaktif oksijen ve nitrojen türevlerinin temizlenmesi, oksidatif stresten zarar gören dokuların tamiri, endojen antioksidanların yenilenmesi ve metal şelasyonu gibi oldukça farklı etki şekillerinden birini veya birkaçını ortaya koyarlar. İdeal bir antioksidanın, bilinen bu etki şekillerinden birçoğunu yerine getirebilme özelliğine sahip olması gerekir. Antioksidanlar içinde ideale yakın olan bileşik alfa lipoik asit (ALA) ve dihidrolipoik asit (DHLA) redoks çiftidir (Biewenga ve ark., 1994; Packer ve ark., 1995; Chen ve ark., 2003). Balık kasında, metal katalaz oksidasyon sistemleri tarafından gerçekleştirilen proteinlerin oksidatif hasarları ve ALA ile ilgili çalışmalar oldukça sınırlıdır. Bu sebeple bu çalışmada, çipura, palamut ve hamsinin kas homejenatlarına farklı konsantrasyonlarda ALA eklemesinin balıklarının in vitro koşullarda kas proteinlerinde meydana gelen değişimlere olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Materyal

3 Bu çalışmada materyal olarak çipura (Sparus aurata), hamsi (Engrailus engrasichalus) ve palamut (Sarda sarda) kullanılmıştır. Araştırmada, antioksidan olarak alfa lipoik asit (Sigma T5625) kullanılmıştır. Metot Çipura (Sparus auratus), palamut (Sarda sarda) ve hamsi (Engrailus engrasichalus) avlandıktan hemen sonra yerel bir balıkçıdan satın alınıp, buz içinde Ç.Ü. Su Ürünleri Fakültesi İşleme Teknolojisi Bölümü Protein Araştırma Laboratuarına getirilmiştir. İç organlarından temizlenen balıklar yıkandıktan sonra filetoları çıkartılmıştır. Waring Blenderda homojenize edilen filetolardan 0.5 g et örneği tartılmış ve test tüplerine aktarılıp farklı oranlarda ALA uygulanmıştır. Oksitlendirme reaksiyonu, Mercier ve ark. (2004) nın önerileri doğrultusunda yapılmıştır. Homojenatlar 37 ºC ye ayarlı su banyosunda 0, 3 ve 5 saat süresince inkübe edilmiştir. Homojenatlardaki oksidasyon reaksiyonu, bütillenmiş hidroksitoluen (BHT, %0.02 oranında) eklenerek durdurulmuştur. Protein Karbonil Değeri Protein karbonil içeriği Levine ve ark. (1994) na göre 2,4 dinitrofenilhidrazin (DNPH) ile protein karbonillerinin reaksiyonu ile belirlenmiştir. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) Balıkların proteinlerinde meydana gelen denatürasyonu incelemek için, BioRad marka mini vertikal sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi %10 luk poliakrilamit jel ile Laemmli (1970) metoduna göre yapılmıştır. Proteinlerin moleküler kütlesini belirlemek için, triofosfat izomeraz (26,600 kda), laktik dehidrogenaz (36,500 kda), ovalalbumin (45,000 kda), püruvat kinaz (58,000 kda), insan sütünden laktoferrin (90,000 kda) ve β-galaktosidaz (116,000 kda) içeren sigma standardı (sigma P- 8748) kullanılmıştır. İstatistiksel Analiz Farklı konsantrasyonlardaki alfa lipoik asitin etkisi %5 önem düzeyinde varyans analizi (Tek-yönlü ANOVA) kullanılarak Duncan karşılaştırma testi ile değerlendirilmiştir. Aynı zamanda, tüm saatler göz önüne alındığında alfa lipoik asitin protein karbonil düzeyine etkisi genel lineer model (GLM) kullanılarak tespit edilmiştir. Araştırma Bulguları ve tartışma Protein Karbonil Değerleri Araştırmada, farklı konsantrasyonlarda ALA içeren 100 mg/ml çipura, hamsi ve palamut içeren homojenatların, 37 ºC de 0, 3 ve 5. saatlerde Fe +2 -katalizli

4 oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein karbonil (nmol/nmol karbonil/mg protein) düzeyleri Çizelge 1., 2. ve 3. de verilmiştir. Çizelge 1. Farklı konsantrasyonlarda ALA içeren Çipura (100 mg/ml) nın Fe +2 - katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg protein) 37 ºC de ki Alfa Lipoik Asit Oranları inkübasyon süresi (saat) Kontrol % 0.1 %0.5 %1 0 3,05±0,25 a 1,71±0,19 b 1,49±0,23 b 1,74±0,22 b 3 3,80±0,55 bc 4,24±0,27 c 3,50±0,10 b 2,85±0,07 a 5 4,89±0,22 c 2,44±0,13 b 4,54±0,26 c 1,28±0,50 a Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, ALA eklenen tüm örneklerde protein karbonil miktarının önemli bir biçimde azaldığı bulunmuştur (p<0.05). Bununla birlikte, Çizelge 4.1 de de görüldüğü gibi farklı oranlardaki ALA miktarlarının protein karbonil düzeyleri üzerine önemli bir etkiye sahip olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Oksitlendirmenin 3. saatinde ise, kontrol grubu, %0.1 ve %0.5 düzeyinde ALA eklenen örnekler arasında önemli bir faklılığın bulunmadığı tespit edilmiştir. Buna rağmen, %1 düzeyinde eklenen ALA kontrol grubuna göre protein karbonil miktarını önemli oranda azalttığı bulunmuştur (p<0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde ise kontrol grubuna göre çipuraların karbonil düzeyleri üzerine %0.5 düzeyindeki ALA eklemesinin önemli bir etkisi bulunmazken, %0.1 ve %1 lik düzeylerin protein karbonil düzeyini önemli oranda azalttığı bulunmuştur. Genel lineer model uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne alındığında çipura protein karbonil düzeyini önemli oranda azaltan ALA miktarı %1 olarak tespit edilmiştir (p<0.05). Çizelge 2. Farklı konsantrasyonlarda ALA içeren Palamut (100 mg/ml) un Fe +2 - katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg protein) 37 ºC de ki inkübasyon süresi (saat) Alfa Lipoik Asit Oranları Kontrol %0.1 %0.5 %1-16 -

5 0 2,06±0,11 a 1,81±0,15 a 2,06±0,15 a 2,94±0,34 b 3 3,68±0,27 bc 3,30±0,10 b 2,61±0,21 a 3,88±0,50 c 5 2,49±0,13 c 2,28±0,10 bc 1,89±0,17 a 2,06±0,22 ab Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, kontrol, %0.1 ve %0.5 düzeylerinde ALA eklenen palamut örneklerinin protein karbonil miktarları arasında önemli bir faklılık bulunmazken (p>0.05), %1 oranında ALA eklenen grupta protein karbonil miktarı önemli düzeyde yüksek bulunmuştur (p>0.05). Oksitlendirmenin 3. saatinde ise, %0.5 ALA eklenen grup ile en düşük karbonil değeri elde edilmiştir (p<0.05). %0.1 ve %1 düzeyinde ALA eklenen grup ile kontrol grubu arasında ise önemli bir farklılık bulunmamıştır (p<0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde ise, en düşük karbonil miktarı %0.5 ALA eklenen örnekler ile sağlanmıştır (p<0.05). Genel lineer model uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne alındığında palamut un protein karbonil düzeyini önemli oranda azaltan ALA miktarı %0.5 olarak tespit edilmiştir (p<0.05). Çizelge 3. Farklı konsantrasyonlarda ALA içeren Hamsi (100 mg/ml) nin Fe +2 - katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein karbonil düzeyleri (nmol karbonil/mg protein) 37 ºC de ki inkübasyon süresi (saat) Alfa Lipoik Asit Oranları Kontrol % 0.1 %0.5 %1 0 3,09±0,28 a 2,07±0,27 b 1,67±0,23 b 1,95±0,24 b 3 3,75±0,40 b 3,79±0,16 b 3,05±0,23 a 3,46±0,48 b 5 2,50±0,10 ab 2,44±0,06 a 2,57±0,22 b 5,23±0,20 c Aynı satırdaki farklı harfler p<0.05 önem düzeyindeki farkı göstermektedir Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, ALA eklenen tüm örneklerde protein karbonil miktarının önemli bir biçimde azaldığı bulunmuştur (p<0.05). Bununla birlikte, farklı ALA miktarlarının protein karbonil düzeyleri üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Oksitlendirmenin 3. saatinde, %0.5 oranında eklenen ALA miktarının protein karbonil miktarını önemli oranda azalttığı (p<0.05) fakat diğer oranları ise önemli düzeyde etkilemediği tespit edilmiştir (p>0.05). Oksitlendirmenin 5. saatinde ise, kontrol grubu ile %0.1 ve %

6 düzeyinde ALA eklemesinin önemli bir etkisi bulunmazken (p>0.05), %1 düzeyinde ALA eklemesinin protein karbonil düzeyini önemli oranda yükseltmiştir (p>0.05). Genel lineer model uygulanarak yapılan tek yönlü varyans analizi sonucunda, tüm saatler göz önüne alındığında %0.5 ve %0.1 ALA eklemesinin protein karbonil düzeyini önemli düzeyde azalttığı, fakat %1 düzeyinde ALA eklemesinin ise protein karbonil düzeyi üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir (p<0.05). Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) Araştırmada ml de 100 mg çipura, palamut ve hamsi eti bulunan homojenatların 37 o C deki 0, 3 ve 5 saatlik Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı Şekil 1., 2. ve 3. de gösterilmiştir. Şekil 1. Çipura, palamut ve hamsinin 37 o C de oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında, Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilmesi sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin elektroforezi β-mercaptoetanol ün yokluğunda (A) ve varlığında (B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2: %0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW: moleküler ağırlık). Oksitlendirme reaksiyonunun başlangıcında Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilen ve farklı düzeylerde ALA eklenen çipura, palamut ve hamsi türlerinin protein bant yoğunlukları üzerine etkisi Şekil 4.1 de görülmektedir. Bu analiz sonucuna göre, farklı düzeylerde ALA eklemesinin çipura ve palamut türlerinin protein bant yoğunlukları üzerine önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Buna rağmen, hamsi balığının kontrol grubundaki (K) bant yoğunluğunun ALA eklemesi yapılan örneklere göre daha farklı olduğu, diğer örneklerde ise

7 kda a yakın moleküler ağırlığa sahip bantların yoğunluğunun özellikle %1 düzeyinde ALA eklenen örneklerde daha az olduğu dikkat çekmektedir. Elektroforez bantlarındaki yoğunluğun azalması proteinlerin denatüre olarak daha yüksek moleküler ağırlıklı polimerler oluşturduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, %1 gibi yüksek oranda yapılan ALA eklemesinin oksitlendirme sonucu oluşan polimerleşmeyi engellemediği, aksine artırdığı saptanmıştır. Başka bir ifadeyle, yüksek oranda kullanılan ALA eklemesinin hamsi balığı için bir bakıma prooksidan olarak rol oynadığı görülmüştür. ALA nın kuvvetli bir antioksidan olmasının yanı sıra bir prooksidan olarak rol oynadığı ile ilgili bilimsel çalışmalar mevcuttur (Moini ve ark., 2002, Biewenga ve ark., 1997). İndirgen madde içeren elektroforez örneklerinde ise, hamsi dışında yine çipura ve palamut un bant yoğunlukları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, ALA eklemesinin önemli bir etkisi görülmezken, hamside %1 düzeyinde ALA eklenen örneğin hemen hemen tüm bant yoğunluklarında bir azalma görülmüştür. Bu azalmanın β-merkaptoetanol ün varlığında ve yokluğunda görülmesi polimerleşmenin disülfit olmayan kovalent bağlarla gerçekleştiğini göstermektedir (Decker ve ark., 1993; Saeed ve Howell, 2002). Şekil 2. Çipura, palamut ve hamsinin 37 o C de 3 saatlik Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin elektroforezi β-merkaptoetanol ün yokluğunda (A) ve varlığında (B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2: %0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit, MW: moleküler ağırlık). Oksitlendirmenin 3. saati için yapılan elektroforez analizinde, indirgen maddenin yokluğunda, kontrol ve ALA eklenen çipura örneklerindeki protein bant

8 yoğunluğunda herhangi bir değişiklik görülmemiştir. Aynı şekilde, kontrol grubu ve %0.1 oranında ALA eklenen palamut örnekleri arasında önemli bir farklılık görülmemiştir. Ancak, %0.5 oranında ALA eklenen örneğin 116 kda molekül ağırlığına yakın protein bantlarının yoğunluğunda bir azalma olduğu görülmüştür. 26,60 kda ın altındaki iki bantta ise tamamen kaybolduğu görülmüştür. %1 oranında ALA eklenen örneklerde ise, 116 kda nın üstündeki molekül ağırlığına yakın protein bantlarının yoğunluğundaki azalmanın, %0.5 düzeyinde ALA eklenen örneğe göre daha fazla olduğu ve 26,60 kda ın altında iki bandında %0.5 ALA eklenen örnekte olduğu gibi tamamen kaybolduğu tespit edilmiştir. Hamside ise, 3 saatlik oksitlendirme sonucunda özellikle ALA içeren örneklere göre kontrol grubunun 116 kda molekül ağırlığına sahip protein bandının daha yoğun olduğu görülmektedir. İndirgen maddenin varlığında yapılan analiz sonucuna göre ise, indirgen maddenin yokluğunda olmayan düşük moleküler ağırlıklı yeni bantların oluştuğu görülmektedir. Bu da oksitlendirmenin 3. saatinde disülfit köprüleriyle kovalent polimerleşmenin olduğunu göstermektedir. Burada elde edilen verilere benzer şekilde, yapılan birçok çalışma MKO sistemi ile oksitlendirilen proteinlerin disülfit çapraz bağları ile polimerleştiğini ve/ veya bölündüğünü göstermiştir (Liu ve Xiong, 2000; Ooizumi ve Xiong, 2004; Thanonkaew ve ark., 2006). Şekil 3. Çipura, palamut ve hamsinin 37 o C de 5 saatlik Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilme sonucu elde edilen protein profillerinin molekül ağırlığına göre dağılımı. Örneklerin elektroforezi β-merkaptoetanol ün yokluğunda (A) ve varlığında (B) gerçekleştirilmiştir (K: Kontrol, 1: %0.1 alfa lipoik asit, 2: %0.5 alfa lipoik asit, 3: %1 alfa lipoik asit) Oksitlendirmenin 5. saati için yapılan elektroforez analizinde, kontrol grubu ile ALA eklenen örnekler karşılaştırıldığında ise, ALA nın bir antioksidan olarak önemli bir etkisinin olmadığı görülmektedir. İndirgen maddenin varlığında ise, özellikle 26,60 kda ın altındaki protein bantlarının yok olduğu fakat bazı bantların yoğunluğunda ise artış olduğu görülmektedir. Palamutta ise, diğer saatlerle

9 karşılaştırıldığında, özellikle indirgen maddenin yokluğunda, kontrol grubu ve %0.1 düzeyinde ALA içeren örneklerin protein yoğunluğunda bir azalma olduğu görülmüştür. Fakat bu azalma, %0.5 ve %1 ALA eklenen örneklerde görülen azalmadan çok daha az olduğu tespit edilmiştir. %0.5 ALA içeren örneklerde bantların çoğunun yok olduğu ve bantların yoğunluğunun azaldığı görülmüştür. %1 düzeyinde ALA eklenen örneklerde de bant yoğunluğunda bir azalmanın olduğu fakat %0.5 düzeyinde eklenen örneklere göre daha az olduğu tespit edilmiştir. İndirgen maddenin varlığında ise, özellikle 26,60 kda ın moleküler ağırlığın üzerinde yeni bantların ortaya çıktığı görülmektedir. Hamsi balığında ise, indirgen maddenin yokluğunda 90 kda ın üzerindeki ve 26,60 kda ın altındaki tüm bantların hem kontrol grubundaki örneklerde hem de ALA eklenen örneklerde tamamen ortadan kalktığı görülmüştür (Şekil 3-A). Bununla birlikte kontrol grubu ile %0.1 düzeyinde ALA içeren örneklerde 90 kda moleküler ağırlığına sahip proteinlerle 26,60 kda lık moleküler ağırlığına sahip protein bantlarının arasındaki proteinlerin yoğunluğunun %0.5 ile %1 düzeyinde ALA içeren örneklere göre daha yoğun olduğu tespit edilmiştir. İndirgen maddenin varlığında ise, kaybolan bu bantların 26,60 kda ın üzerinde moleküler ağırlığa sahip proteinlerde olduğu görülmüştür. Tokur ve Korkmaz (2007a), Fe +2 -katalizli oksidasyon sisteminde 3 saatlik inkübasyon sonucunda hamsi nin 50 kda dan daha büyük moleküler ağırlığa sahip protein bantlarının tamamen yok olduğunu bulmuştur. Bu sonuç, bu çalışmada hamsi ile yapılan örneklerdeki sonuçlarla benzerlik göstermektedir. Sonuç ve Öneriler In vitro koşullarda Fe +2 -katalizli oksitlendirme sistemi ile oksitlendirilerek farklı düzeylerdeki ALA nın çipura, palamut ve hamsinin protein oksidasyonuna ve denatürasyonuna olan etkisinin incelendiği bu çalışmada, protein karbonil düzeyini önemli oranda azaltan ALA miktarı çipura için %1 olarak, palamut için %0.5 hamsi için %0.5 ve %0.1 olarak tespit edilmiştir (p<0.05). Protein bantlarının elektroforetik analiz sonucunda, ALA nın bir antioksidan olarak protein bantlarının yoğunluğunun muhafazasında önemli bir etkiye sahip olmadığı hatta hamsi ve palamut gibi koyu renkli kasa sahip balıklarda %1 gibi yüksek düzeylerde kullanıldığında prooksidan olarak görev yaptığı saptanmıştır. Her ne kadar ALA eklemesi protein karbonil düzeyini azaltsa da elektroforez örnekleri göz önüne alındığında çipura, palamut ve hamsi gibi türler için gıda katkı maddesi olarak iyi bir antioksidan olmadığı düşünülmektedir. Bu çalışmadan elde edilen verilere göre, ALA nın in vivo olarak çalışılması ve diğer çalışmalarda belirtildiği üzere Na-ALA haline getirilerek uygulanması bir antioksidan olarak kullanılabileceğini veya kullanılamayacağını daha net ortaya çıkaracaktır. Kaynaklar

10 BERLETT, B.S., STADTMAN, E.R Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stres. J. Biol. Chem. 272: BIEWENGA, G., DE JONG, J., BAST, A Lipoic acid favors thiolsulfinate formation after hypochlorous acid scavenging: a study with lipoic acid derivatives. Arch. Biochem. Biophys. 312: BIEWENGA, GP., HAENEN, GR., BAST, A The pharmacology of the antioxidant lipoic acid. Gen. Pharmacol. 29 (3): BIRIDGEWATER, J. D., LIM, J., VACHET, R. W Transition metal peptide binding studied by metal-catalyzed oxidation reactions and mass spectrometry. Anly. Chem. 78: CHEN, H.J., WU, S.B., CHANG, C.M Biological and dietary antioxidants protect against DNA nitration induced by reaction of hypochlorous acid with nitrite. Arch. Biochem. Biophys. 415: DECKER, E.A., XIONG, Y. L., CALVERT, J.T., CRUM, A.D., & BLANCHARD, S.P Chemical, physical, and functional properties of oxidized turkey white muscle myofibrillar proteins. J. Agric. Food Chem. 41: GRIFFITHS, H.R Antioxidant and protein oxidation. Free Rad. Res. 33: KATO, Y., KITAMOTO, N., KAWAI, Y., OSSAWA, T The hydrogen peroxide/copper ion system, but not other metal-catalyzed oxidation systems, produces protein-bound dityrosine. Free Radical Biol. Med. 31: LAEMMLI, U.K Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 277: LEVINE, R.L., WILLIAMS, J.A., STADTMAN, E.R., SHACTER, E Carbonyls assays for determination of oxidatively modified proteins. Meth. Enzymol. 23: LIU, G., XIONG, Y.L Electrophoretic pattern, thermal denaturation, and in vitro digestibility of oxidized myosin. J. Agric. Food Chem. 48: MADURAWE, R. D., LUMPKIN, J. A Quantitation of protein damage in metal ion-catalyzed oxidation systems. Chem. Eng. Commun. 162: MERCIER, Y., GATELLER, P., Renerre, M Lipid and protein oxidation in vitro, and antioxidant potential in meat from Charolais cows finished on pasture or mixed diet. Meat Sci. 66(2): MOINI, H., PACKER, L., SARIS, NILS-ERIK, L Antioxidant and Prooxidant Activities of α-lipoic Acid and Dihydrolipoic Acid. Toxicol. App. Pharmacol. 182: OOIZUMI, T., XIONG, Y.L Biochemical susceptibility of myosin in chicken myofibrils subjected to hydroxyl radical oxidizing systems. J. Agric. Food Chem. 52: PACKER, L., WITT, E.H., TRITSCHLER, H.J Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic Biol. Med. 19:

11 REQUENA, J.R., LEVINE, R.L., STADTMAN, E.R Recent advances in the analysis of oxidized proteins. Amino Acids 25: SAEED, S., HOWELL, N. K Effect of lipid oxidation and frozen storage on muscle proteins of Atlantic mackerel (Scomber scombrus). J. Sci. Food Agric STADTMAN, E.R., OLIVER, C.N Metal-catalyzed oxidation of proteins. J. Biol. Chem. 266: THANONKAEW, A., BENJAKUL, S., VISESSANGUAN, W., DECKER, E. A The effect of metal ions on lipid oxidation, color and physicochemical properties of cuttlefish (Sepia pharaonis) subjected to multiple freezethaw cycles. Food Chem. 95: TOKUR, B., KORKMAZ, K. 2007a. The effects of an iron-catalyzed oxidation system on lipids and proteins of dark muscle fish. Food Chem. 104: