T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İLAÇ NUMUNELERİNDE AMİLORİD HİDROKLORİD VE HİDROKLOROTİYAZİD KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNLERİ İkbal Demet ÜNLÜ Danışman: Doç. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI ISPARTA-2012 i

2 ii

3 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... iii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii SİMGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ Hidroklorotiyazidin Genel Özellikleri Amilorid Hidrokloridin Genel Özellikleri Kullanılan Yöntem Spektrofotometri UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi UV ve Görünür Bölge Absorpsiyon spektrofotometreleri UV ve Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon spektroskopisinin uygulamaları Kemometrik Yöntemler Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları Temel Bileşen Analizi Yöntemi (Principal Component Analysis (PCA) Method) Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (Principal Component Regression (PCR) Method) Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression Method) Kalibrasyon (Derişim) setinin tasarımı Çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) Varyans Analizi (ANOVA) Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları Çoklu bileşen analizi (Multicomponent analysis) KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL VE METOT i

4 3.1. Materyal Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Çözeltiler Yöntem UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi ARAŞTIRMA BULGULARI UV Spektroskopisi Saf halde HCT ve AMH ın spektrumları Kalibrasyon setinin hazırlanması Spektral Koşulların Optimizasyonu Temel Bileşen Analizi (PCA) Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (PCR) Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu PCR yöntemi için ANOVA testi PCR yönteminde istatistiksel analiz PCR Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS) Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu PLS yöntemi için ANOVA testi PLS yönteminde istatistiksel analiz PLS Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ ii

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi İLAÇ NUMUNELERİNDE AMİLORİD HİDROKLORİD VE HİDROKLOROTİYAZİD KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNLERİ İkbal Demet ÜNLÜ Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ Bu tez çalışmasında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri (temel bileşen analizi yöntemi (PCA), temel bileşen regresyonu yöntemi (PCR), kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS)), iki farklı farmasötik preparattaki amilorid hidroklorid (AMH) ve hidroklorotiyazid (HCT) nin aynı anda miktar tayinlerine hiç bir ayırma işlemi kullanmaksızın başarıyla uygulanmıştır ve burada UV/Görünür Bölge Spektroskopisi yöntemlerinde elde edilen veriler kemometrik olarak değerlendirilmiştir. Bu kemometrik yöntemlerin validasyonunda, AMH için 0,5-3,5 μg/ml konsantrasyon aralığında ve HCT için 5-35 μg/ml konsantrasyon aralığında bileşikleri içeren 28 adet karışımdan oluşan kalibrasyon (konsantrasyon) seti (MeOH-H 2 O 1:1,(v/v)) içerisinde hazırlanmıştır. Kalibrasyon setinin nm aralığında absorpsiyon spektrumu kaydedilmiştir. Kalibrasyon seti ve bu sete karşılık nm aralığında elde edilen absorpsiyon verileri arasındaki ilişkiden yararlanılarak üç kemometrik kalibrasyon oluşturulmuştur. PCA, PCR, PLS yöntemlerinin validasyonu, AMH ve HCT içeren sentetik karışımların analiziyle gerçekleştirilmiştir. PCR ve PLS yöntemlerinin AMH ve HCT karışımlarının analizine uygulanmasında, PCR ve PLS için % geri kazanım sonuçları ile karşılık gelen bağıl standart sapma değerleri sırasıyla AMH için % 99,61 / % 0,56 ve %100,82 / %2,20; HCT için %100,08 / % 1,72 ve %100,58 / % 6,99 olarak belirlenmiştir. Sonraki basamakta PCA, PCR ve PLS yöntemleri, iki farklı ticari farmasötik preparattaki AMH ve HCT nin aynı anda miktar tayinlerine uygulanmıştır. Anahtar Kelimeler: Amilorid hidroklorid, hidroklorotiyazid, PCA, PCR, PLS, UV, kemometri 2012, 53 sayfa iii

6 ABSTRACT M.Sc.Thesis SIMULTANEOUS DETERMINATION OF AMILORID HYDROCHLORIDE AND HYDROCHLOROTHİAZIDE IN PHARMACEUTICALS BY CHEMOMETRIC METHODS İkbal Demet ÜNLÜ Süleyman Demirel University Graduate Scholl of Applied and Natural Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr.Ahmet Hakan AKTAŞ In this thesis, three different chemometric calibration methods (principle component analysis (PCA), partial least square (PLS) and principal component regression (PCR)) were successfully applied to the simultaneous determination of amıloride hydrochloride (AMH) and hydrochlorothiazide (HCT) in two different pharmaceutical preparations without using any separation step. The data of UV- Visible Spectroscopy applied to the chemometric calculations. For the validation of this chemometric metot, a calibration set of 28 binary mixtures containing compounds in the working range of 0,5-3,5 μg/ml for AMH and 5-35 μg/ml for HCT was prepared in (MeOH-H 2 O 1:1,(v/v)). Calibration sets nm range absorption spectra were recorded. Three chemometric calibrations were constructed by using the relationship between the calibration set and its corresponding absorption data obtained in the range nm. The synthetic mixtures of two drugs were used for the validity of the calibrations. Means recoveries (percent) and relative standard deviation of PCR and PLS methods were found to be % 99,61 / % 0,56 and %100,82 / %2,20 for AMH; %100,08 / % 1,72 ve %100,58 / % 6,99 for HCT, respectively. In the next step, the PCA, PCR and PLS methods were applied to the simultaneous determination of AMH and HCT in two different commercial pharmaceutical preparations and successful results were obtained. Key words: Hydrochlorothiazide, Amıloridehydrochloride, PCA, PCR, PLS, UV, Chemometrics. 2012, 53 pages iv

7 TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca en sıkıntılı zamanlarımda bir kez bile olsun bıkmadan usanmadan yardımıma koşan, deneyimlerinden her alanda faydalandığım, deneylerimde gösterdiği ilgi alaka konusunda hakkını ödeyemeyeceğim yegane hocam; Sayın Doç. Dr. Hakan AKTAŞ a, Tez aşamasında beni destekleyip eğitimimden geri kalmamam için destek veren T. GARANTİ BANKASI Şube Müdürü; Sayın Barış TABAK a, Her an bana destek olan ve benim her an ailem kadar destekçim olan biricik NAKİT YETKİLİM; Sayın Veli TANEL e, En zorlu zamanlarda hayatımda varlığıyla beni gerçekten bütünleyen yaşam çınarım Sayın Tuğba ÇETİNKAYA ya, Kullandığım kimyasal maddeleri sağlayan Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma projeleri bölümü görevlilerine 2944-YL-11 nolu proje için, Eğitim öğretim hayatım boyunca beni maddi manevi her alanda destekleyen BİRTANECİK AİLEME teşekkürlerimi sunuyorum. İkbal Demet ÜNLÜ ISPARTA, 2012 v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1.1. Hidroklorotiazitin açık formülü... 3 Şekil 1.2. Kaptoprilden Hidroklorotiyazid sentezi... 4 Şekil 1.3. Amilorid Hidroklorid açık formülü... 4 Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar... 6 Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti (l = ışığın numune içinde aldığı yoldur)... 7 Şekil 1.6. Derişim etkisiyle Lambert Beer yasasından sapmalar... 8 Şekil 1.7. Bir spektrofotometrenin temel bileşenleri Şekil 1.8. UV-Görünür alan spektrofotometresi Şekil 1.9. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler Şekil X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni Şekil PLS2 kalibrasyonu Şekil 4.1. HCT maddesinin absorpsiyon spektrumu Şekil 4.2. AMH maddesinin absorpsiyon spektrumu Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği Şekil 4.4. HCT (5 μg/ml) ve AMH (2,5 μg/ml) ile iki bileşiğe karşılık gelen karışımın absorpsiyon spektrumları (Metanol su içerisinde) Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil PLS kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Varyans analizi çizelgesi (Anova testi çizelgesi: analysis of varation) Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri Çizelge 4.1. HCT ve AMH analizi için kalibrasyon seti Çizelge 4.2. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PCR kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Çizelge 4.3. MODURETİC Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar Çizelge 4.4. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Çizelge 4.5. MODURETİC Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar vii

10 SİMGELER DİZİNİ ANOVA Varyans analizi (Analysis of variance) BSS % Bağıl standart sapma AMH Amilorid hidroklorid HCT Hidroklorotiyazid GK % Geri Kazanım PCA Temel bileşen analizi yöntemi( Principal component analysis ) PCR Temel bileşen regresyon yöntemi (Principal component analysis) PLS Kısmi en küçük kareler yöntemi( Partial least squares regression) SS Standart sapma UV- Vis Ultra viyole görünür bölge spektroskopisi X Ortalama değer viii

11 1. GİRİŞ Hastalıkları tedavi etmek için kullanılan maddelere İlaç denir. İlaçlar elde edildikleri yere göre üçe ayrılırlar: 1- Madenlerden elde edilen ilaçlar 2-Bitkilerden elde edilen ilaçlar 3- Hayvanlardan elde edilen ilaçlar. Madensel menşeli ilaçlara kimyevi ilaçlar denir. Bunlar kimyevi maddelerden doğrudan doğruyla yapılırlar. Mesela; İngiliz tuzu, Aspirin, Sülfamitler vs. gibi. Bitkilerden elde edilen ilaçlar; bitkilerin köklerinden, çiçeklerinden yahut kabuklarından yapılırlar. Mesela; Hintyağı, Kinin, Dijital vs. gibi. Hayvansal menşeli ilaçlar ise; hayvanların veya insanların doku ve organlarından hazırlanırlar. Mesela: İnsülin, Karaciğer hülasası, Aşılar vs. gibi. İlaç Şekilleri Bütün ilaçlar genel olarak Katı veya Sıvı halde bulunurlar. Katı İlaç Şekilleri 1. Toz: Öğütülüp toz haline getirilerek kul anılan ilaçlardır. 2. Hap: Toz halindeki ilacın hamur haline getirilerek yuvarlak şekiller verilmesiyle yapılan ilaçlardır. 3. Kapsül: Jelatinden yapılmış bir muhafaza içinde bulunan ilaçlardır. 4. Tablet: Toz halindeki ilaçların küçük ve yassı yuvarlaklar şeklinde tazyik edilmesiyle yapılan ilaçlardır. 5. Draje: Tabletlerin üzerinin şeker ile kaplanmasıyla hazırlanan bir ilaç şeklidir. 1

12 6. Merhem: İlaçların domuz yağı, vazelin veya diğer bazı yağlar içersine katılması ile hazırlanan şeklidir. 7. Fitil: İlaçların kakao yağı veya gliserin ile karıştırılarak hamur haline getirildikten sonra koni şeklinde hazırlanan şeklidir. Sıvı İlaç Şekilleri 1. Tentür: Herhangi bir ilacın alkoldeki eriyiğidir. Yani ilacı alkol içinde eritmek suretiyle hazırlanan bir ilaç şeklidir. Mesela: Tentürdiyot, İyodun alkol içindeki eriyiğidir. 2. Sulu Mahsuller (Solüsyonlar): İlacın suda eritilmiş şeklidir. 3. Şurup: İlacın koyu şekerli suda eritilmiş şeklidir. 4. Ampul: Ampul adı verilen kapalı cam bir muhafaza içersinde saklanan steril ve sıvı halde olan bir ilaç şeklidir. İlaç analizlerinin yapılabilmesi için, önemli olan öncelikle analiz için kullanılacak aletler ve elde edilecek verilerin anlaşılabilir hale getirilebileceği matematiksel metotlardır. Analitik çalışmalarda tek başına, iki veya daha fazla aktif bileşiği içeren karışımların kantitatif analizi için spektrofotometri, spektroflorimetri, infrared spektrofotometrisi, voltametri (polorografi), kromatografi, kütle spektrometresi ve bu yöntemlerin kombine şekilleri kullanılmaktadır (Kaya, 2007). Günümüzde analiz için kullanılan UV/Görünür Bölge spektrofotometreler ucuz ve hassas olmakla birlikte karmaşık sonuçlar vermektedir. UV/Görünür aletlerinin kullanılması tek etken madde içeren ilaçların analizinde herhangi bir sorun oluşturmazken birbiri ile çakışan spektrum veren ilaç karışımları analizinde sorunlar oluşabilir. Analiz işlemlerinde daha kesin, daha doğru, daha hızlı, daha ekonomik ve daha güvenilir sonuçlara ulaşmak için yeni teknik ve yaklaşımlara ihtiyaç vardır (Çetin, 2008). Analitik kimyada hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın kombine ilaç numunelerinin aynı anda kantitatif analizi son derece önemlidir. Analitik yöntemler geliştirmek 2

13 amacıyla, klasik analitik yöntemler ile birlikte değişik matematiksel algoritmalara dayanan hesaplama teknikleri kombine olarak uygulanmaktadır. Klasik analitik yöntemler ile kemometrik kalibrasyonların karışım analizlerinde başarılı sonuçlar vermesi nedeniyle ilaç numunelerinin analizinde artan yoğunlukta kullanılmaktadır (Kaya, 2008). Bu çalışmada ilaç etken maddelerinden hidroklorotiyazid ve amilorid hidroklorid miktar tayinlerini UV spektroskopisi yöntemiyle tayin edip elde edilen verilerin kemometrik yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu bölümde analizi yapılacak bu etken maddeler ve uygulanan yöntemler hakkında bilgi verilecektir Hidroklorotiyazidin Genel Özellikleri Hidroklorotiyazit vücutta sıvı tutulumuna yol açan aşırı miktarda tuzun vücut tarafından emilimini engellemeye yardımcı olan bir idrar söktürücüdür. Hidroklorotiyazit, tiazit grubu idrar söktürücüler arasında yer alır. Hidroklorotiyazitin açık formülü Şekil 1.1 de gösterilmiştir. Şekil 1.1. Hidroklorotiazitin açık formülü Hidroklorotiyazit kapalı formülü C 7 H 8 C l N 3 O 4 S 2 olan beyaz renkli bir tozdur ve sistematik ismi 6- kloro- 3,4 dihidro-2h- 1,2,4-benzotiyadiazin-7- sülfonamid 1,1 dioksid tir. Molekül ağırlığı 297,74 g/mol olan maddenin erime noktası 274 o C ve suda az çözünürdür. 3

14 Hidrolorotiyazid birkaç yolla elde edilebildiği gibi kaptopril (1-[(2S)-3-merkapto-2- metilpropiyonil]-l-prolin ) den de elde edilebilmektedir.(şekil 1.2) Şekil 1.2. Kaptoprilden Hidroklorotiyazid sentezi İlaçların içeriğinde yaygın olarak kullanılan hidroklorotiyazid yüksek tansiyon düşürmek için kullanılan bir diğer adı hipertansif olan ilaçlarda çoğunlukla kullanılır. Hidroklorotiyazid vücutta sodyum, klor ve suyun hızlı bir şekilde atılmasını sağlayarak tansiyonun çabuk düşmesini ve dengelenmesini sağlar. Bunları yaparken kan basıncını düşürerek vücudu normale döndürmeye yardımcı olur Amilorid Hidrokloridin Genel Özellikleri Kapalı formülü C 6 H 8 ClN 7 O.HCl.2H 2 O olan Amilorid Hidrokloridin açık formülü Şekil 1.3 de gösterilmiştir. Şekil 1.3. Amilorid Hidroklorid açık formülü Kimyasal olarak bilinen diğer tür antikaliüretik veya diüretik ilaçlarla alakası olmayan bir pirazin-karbonil-guadin karışımı bir ajandır. Orta kuvvette bir baz tuzudur (pka: 8,7). Kimyasal formülü 3,5-diamino-6-kloro-N- diaminometilen 4

15 pirazinkarboksamid monohidroklorid dir. Erime noktası C O arasında değişmektedir. UV/görünür bölgede nm de absorbans verir (sulu asit çözeltisi). Amilorid hidroklorid etil asetat ve suda çözünür. Kloroform ve eterde pratik olarak çözünmez. Açık formülü Şekil 1.3 de gösterilen amilorid hidrokloridin molekül ağırlığı 302,1 g/mol dür. Bu formüle göre susuz ortamda hesaplanan her tablette 5 mg amilorid hidroklorid (AMH) vardır. Her bir tablet koloidal silikon dioksit, kroskarmelloz sodyum, D&C yellow, çift bazlı kalsiyum fosfat dihidrat, FD&C yellow, magnezyum sterat, mikrokristalin selüloz ve silikon dioksid vardır. Amilorid hidroklorid tıbbi olarak ilaç kullanımında zayıf natriüretik, diüretik ve antihipertansif etki gösteren sodyum koruyucu ( antikaliüretik) bir ilaçtır. Vücut için amilorid, tiyazid veya diüretik tek başlarına kullanıldığında idrardaki magnezyum atılımının azaldığı gösterilmiştir. Amilorid hidroklorid ilaç olarak oral yoldan alındıktan sonra 2 saat içinde vücutta etki göstermeye başlar. Elektrolit atılımı üzerindeki etkileşimi 6 ila 10 saat arasında zirveye ulaşılır ve emilim yaklaşık 24 saat sürer. Amilorid hidroklorid karaciğer tarafından emilmeden alınır ve böbrekler tarafından değişime uğramadan atılır Kullanılan Yöntem Spektrofotometri Işık ile madde arasındaki etkileşmeden yararlanarak gerçekleştirilen analiz yöntemleri, az sayıda analiz materyali gerektirmesi, seçiciliği, hassaslığı ve doğruluk derecesinin yüksek ve güvenilir oluşu nedenleriyle kimyacılar tarafından özellikle analitik amaçlar için sıklıkla kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden biri olan spektrofotometri, ışık enerjisinin absorpsiyonuna dayalı bir metottur. Işık ise elektromanyetik ışıma olup frekans ve dalga boyu ile karakterize edilmektedir. Enerji ise; 5

16 E = h. υ veya E = h. eşitlikleriyle ifade edilmektedir. Bu eşitliklere göre ışığın dalga boyu büyüdükçe enerjisinin azalmasına karşılık dalga boyu küçüldükçe enerjisi artar. Işık, atom ve moleküller tarafından absorbe edilebilir. UV ve görünür bölgedeki ışığın absorpsiyonu molekülü oluşturan atomların bağ elektronları ile ilgilidir. Kuantum kuramına göre atomlar, ancak elektron konfigürasyonuna ve dış elektronlarının belirli enerji düzeyleri arasındaki geçişlerine bağlı belirli potansiyel enerji düzeylerinde bulunabilirler. Elektronların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri ile ilgili atomik spektrumlar belirlenmiştir (Şekil 1.4). Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar Atomlar, elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçerler; bu geçişlerle ilgili olarak söz konusu atomun absorpsiyon spektrumları da belirlenmiştir. Elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçmiş olan atomlar, temel düzeye dönüş sırasında ultraviyole veya görünür bölge sınırları içinde ışıma enerjisi yayarlar (emisyon). Her atom için emisyon spektrumu da belirlenir. Elektronun bir orbitalden diğerine atlamasına elektronik geçiş denir. Elektronik geçişe dayalı absorpsiyona da elektronik absorpsiyon denir. UV/görünür bölge dış kabuktaki elektronların enerji düzeyini değiştirir. 6

17 UV ve görünür bölgedeki ışığın absorpsiyonu aynı zamanda bir molekülün titreşim ve dönme enerji seviyelerinde de değişikliğe neden olmaktadır. Çünkü bir molekülün toplam enerjisi; Bir molekülün toplam enerjisi=e elektronik +E titreşim +E dönme dir. (1.1) Işık absorpsiyonu spektrofotometrelerle ölçülür. Bu ölçüm atom, iyon veya molekül üzerine gönderilen ışığın şiddeti (Io) ile geçen ışığın şiddeti (I) arasındaki farkın ölçümü temelleri üzerine kurulmuştur (Şekil 1.5). Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti (l = ışığın numune içinde aldığı yoldur) Işığın absorpsiyonunun üzerine düştüğü atom, iyon veya molekülün derişimi ile orantılı olarak değiştiği Lambert - Beer tarafından ileri sürülmüştür. Lambert- Beer yasası olarak adlandırılan aşağıdaki eşitlikte aynı derinlikte bir çözeltiden geçen bir ışın demetinin şiddeti çözeltinin derişimiyle orantılı olarak azalır. I = Io. 10 -εlc Burada; I = Numuneyi terk eden ışığın şiddeti Io = Numune üzerine gönderilen ışığın şiddeti ε = Molar absorpsiyon katsayısı C = Absorpsiyon yapan türlerin derişimi 7

18 l = Işığın numune kabı içinde aldığı yoldur. Eğer eşitliğin eksi logaritması alınırsa, log = εlc elde edilir. Burada log absorbans dır ve A ile gösterilir. Bu durumda yukarıdaki eşitlik kısaca; A = εlc şeklinde gösterilir ve bu eşitlikten derişim kolaylıkla hesaplanabilir. Bu bağıntıda A değeri C ye karşı grafiğe geçirildiğinde eğimi εl olan bir doğru elde edilir. Ancak bu doğru her zaman muntazam bir şekilde elde edilemez. Bu olaya Lambert Beer yasasından sapma adı verilmektedir. Bu sapmanın en önemli nedenlerinden biri Şekil 1.6 da gösterilmektedir. Düşük derişim Yüksek derişim Şekil 1.6. Derişim etkisiyle Lambert Beer yasasından sapmalar Lambert - Beer yasası genellikle 0,01 M dan büyük derişimlerde doğrusallıktan sapar. Yüksek derişimlerde absorpsiyon yapan moleküller arası uzaklık azalır ve moleküllerin yük dağılımı bozulur. Bu da absorpsiyonu etkiler, çözeltilerin seyreltilmesi bunu giderir. Analitin ayrışması durumunda ise kimyasal sapma görülür. Bu genellikle asit/ baz indikatörlerinin sulu çözeltilerinde gözlenir. Ayrıca monokromatörün dalga boyununda az da olsa sapma görülür. Prizma, mercek ve filtrelerin yüzeyinde oluşan kaçak ışınlar da sapmalara neden olur. Aletsel sapmalarda daima düşük absorbans okuması gözlenir. 8

19 UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi Her madde üzerine düşürülen ışınlardan bazılarını absorplayabilir. Maddenin hangi dalga boylarındaki ışınları absorplayacağı kendine özgüdür. Bundan yararlanılarak nitel analiz yapılabilir. Bir maddenin absorplayacağı ışın şiddeti ise madde miktarı ile orantılıdır. Bundan yararlanılarak da nicel analiz yapılabilir. Bu amaçla madde üzerine çok çeşitli enerjilere sahip ışınlar gönderilebilir. Madde ile etkileşen ışının enerjisi değiştiğinde madde ile etkileşim mekanizması da değişir. Buna bağlı olarak ölçüm tekniğinin de değişmesi gerekir. Bu nedenle elektromanyetik spektrumun tümü için ölçüm yapılabilecek tek bir cihazın bulunması mümkün değildir. Elektromanyetik spektrumun farklı bölgeleri için farklı cihazlar kullanılır. Dalga boyu 110 nm 1000 nm arasındaki UV ve görünür bölge ışınları ile çalışılabilen cihazlara UV ve Görünür Bölge Spektrofotometreleri denir. Bu bölgedeki ışınların absorplanmalarının ölçümlerini temel alan analitik yönteme de UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi denir. UV ve görünür bölge ışınları molekülün en üst enerji seviyesindeki bir elektronun daha yüksek bir enerji düzeyine geçiş yapmasına sebep olur. UV ve görünür bölge ışınları, moleküllerde benzer etki yaptığı için birleştirilmişlerdir. Hem organik hem de anorganik moleküller UV ve görünür bölge ışınlarını absorplarlar. Her iki grup molekülde de ışın absorpsiyonu elektron geçişi ile gerçekleşmesine rağmen etkileşim mekanizmaları farklıdır. Organik moleküllerdeki absorpsiyon molekül orbital teorisine göre, anorganik moleküllerdeki absorpsiyon ise kristal alan teorisine göre açıklanır UV ve Görünür Bölge Absorpsiyon spektrofotometreleri Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre düzeneği Şekil 1.7 de görüldüğü gibi başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi ve dedektörden oluşur. Dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür. 9

20 IŞIK KAYNAĞI DALGABOYU ÖRNEK KABI DEDEKTÖR SEÇİCİ Şekil 1.7. Bir spektrofotometrenin temel bileşenleri Bu ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrelerde ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri ve giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek ise, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına konularak ışık yoluna yerleştirilir (Şener, 2006). Deneyler sırasında araştırma laboratuarımızda kullandığımız UV-Görünür bölge cihazımızın şekli aşağıda verilmiştir. Şekil 1.8. UV-Görünür alan spektrofotometresi UV ve Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon spektroskopisinin uygulamaları Bu yöntemin başlıca uygulama alanları şunlardır. 10

21 1. Nitel Analiz: Analizi yapılacak olan bilinmeyen madde saflaştırıldıktan sonra uygun bir çözücüde çözülerek spektrumu alınır. Bu spektrum bilinen bileşiklerin aynı koşullarda çekilmiş spektrumları ile karşılaştırılır. Bilinmeyen madde spektrumu kendisininkine tam olarak uygun maddedir. Bu yöntem nitel analiz için çok uygun bir yöntem değildir. Çünkü moleküllerin absorpsiyon bantları oldukça geniştir ve bazı kromoforların absorpsiyon bantları birbiri ile örtüşebilir. Ayrıca moleküllerin UV ve görünür bölge absorpsiyon spektrumlarında çok az sayıda bant bulunur. Bu az sayıda bandın birbiri ile karşılaştırılarak karar verilmesi bazen hatalı sonuçlara yol açabilir. 2. Nicel Analiz: Işının absorplamasına dayanan analiz yöntemleri nicel analiz için oldukça yararlı ve güçlü yöntemlerdir. Bu yöntemlerin klasik yöntemlere göre önemli avantajları vardır. a. Analiz süresi kısadır. Sonuç çabuk alınır. b. Doğruluk derecesi yüksektir. Çoğunlukla analizlerdeki hata binde bir veya iki civarındadır. c. Oldukça duyarlı bir yöntemdir M a kadar seyreltik çözeltilerin bile analizleri yapılabilir. d. Her maddenin kendine özgü bir absorpsiyon spektrumu olduğu için seçiciliği yüksektir. Çoğunlukla bir karışımdaki maddeler bir ön ayırma işlemine gerek kalmaksızın analizleri yapılabilir. e. Hem organik hem de anorganik pek çok molekül UV ve görünür bölge ışınları absorpladığından uygulama alanı geniştir (Şener,2006) Kemometrik Yöntemler Kimyada yada Analitik kimyada verilerin işlenmesi ve istatistiksel değerlendirilmesi ile bu verilerin sağlandığı deney faktörlerinin araştırılması, optimize edilmesi, zaman tasarrufunun sağlanması ve kantitatif ölçümler için kalibrasyonların gerçekleştirilmesi için gerekli olan deneysel tasarımların hazırlanması kimyanın belki de en çok hesaplama ve modelleme çalışmalarına ihtiyaç duyulduğu alanlarıdır. Temel kimya ve fizik bilgileri ile birlikte mühendislik ve hesaplama tekniklerine, matematik ve istatistik konularına dayanan kimyada verilerin işlendiği ve değerlendiği alan kemometri olarak bilinmektedir (Akpolat O, 2004). 11

22 Günümüzde bilgisayar, yazılım, istatistik ve uygulamalı matematik alanlarındaki gelişmeler, kimya alanında, özellikle de analitik kimyada karmaşık sistemlerin çözümü için kemometri adı verilen yeni bir disiplinin doğuşuna neden olmuştur. Bu gelişmeler, analitik kimya ve komşu dallardaki araştırmacılara, analitik problemlerin çözümünde yeni olanaklar sağlayan çok boyutlu ve çok değişkenli parametrelerin kullanıldığı kemometrik yöntemlerle yeni çalışma alanları doğurmuştur. Kemometri, istatistik ve matematik ile birlikte bilgisayar kullanarak kimyasal verilerin işlenmesini kapsayan bir kimya disiplindir. Kemometri, kimyasal analizlerde, kimyasal verilerden gerçek bilginin ektraksiyonunu veya saklı bilgilerin açığa çıkarılmasına olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Kemometrinin temel uygulama alanlarından biri de analitik kimyadır. Kemometri kavramı, 1972 yılında İsveçli Svante Wold ve Amerikalı Bruce R. Kowalski tarafından ileri sürülmüştür ve 1974 yılında uluslararası kemometri derneği tarafından bu disiplinin ilk resmi açıklaması yapılmıştır. Kemometri içerik olarak, tanımlayıcı ve açıklayıcı istatistik (descritive and inference statics), sinyal işleme (signal processing), deneysel tasarım (experimental design), modelleme (modeling), kalibrasyon (calibration), optimizasyon (optimization), yapı tanıma (pattern recognition), sınıflandırma (classification), yapay akıl yöntemleri (artificial intelligience methods), resim işleme (image processing), bilgi ve sistem kuramı (information and system theory) gibi kavram ve uygulamalarından oluşur. Günümüzde kemometrik yöntemlerin gelişmesiyle birden fazla etken madde içeren ürünlerin kantitatif analizi hiçbir kimyasal ön ayırma işlemi ve hiçbir grafik işlemi gerektirmeksizin hızlı, doğru ve hassas olarak gerçekleştirilmektedir. Bu durum kemometriye diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj kazandırmıştır ve kemometrinin kullanım alanının geniş bir alana yayılmasını sağlamıştır. Kemometri; analitik kimya, adli tıp, biyoloji, gıda kimyası, çevre kimyası, arkeoloji gibi alanlarda kullanılmaktadır. Fizikokimyacılar ve madde bilimciler, sinyal işleme ve çok değişkenli verilerin analizinde kemometrik yöntemleri uyguladıkları 12

23 görülmektedir. Organik kimyacılar ve farmasotik kimyacılar, reaksiyon koşullarının optimizasyonunda deneysel tasarım ve ilaç tasarımında yapı etki ilişkisi çalışmalarında kemometrinin araçlarını kullanmaktadırlar (Vandeginste ve ark., 1998). Organik Kimya Fizikokimya Sanayi Biyoloji Matematik İstatistik Bilgisayar Programlama KEMOMETRİ Analitik Kimya Tıp Uygulama alanları İlaç Mühendislik Gıda Şekil 1.9. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler Yukarıdaki şekilde de (Şekil 1.9) görüldüğü gibi kemometrik çalışmalarda, analitik kimyacıların ve diğer ilgili disiplinlerin ihtiyaçları ölçüsünde uygulamalı matematik ve istatistik bilgisine sahip olmaları gerektiği açıktır. Burada programlama ve hesaplama çok önemlidir. Kemometrik uygulamaların çoğu kompleks hesaplamalar içermektedir. Bu hesaplamaları elle veya basit hesap makineleriyle gerçekleştirmek mümkün olmadığı için bilgisayar programlarına ihtiyaç vardır. Kemometrik hesaplamalarda genellikle EXCEL, MATLAB, PANORAMA, MİNİTAB, XLSTAT, SOLO ve diğer paket programlar kullanılmaktadır (Dinç E., 2009). İki veya daha fazla aktif bileşiği içeren karışımlarda bu aktif bileşiklerin hiçbir ayırma işlemi kullanmaksızın analizi, analitik kimyanın ve diğer komşu dalların temel problemlerinden birisidir. Karışım halindeki numunelerin analizi için çeşitli kromatografik ve spektrofotometrik yöntemlerin yaygın olarak kullanıldığı çalışmalarda da görülmektedir. Bazı durumlarda bahsedilen bu yöntemlerin de iyi sonuçlar vermediği de bir gerçektir. Sayılan bu nedenlerden dolayı daha düşük miktarlarda numunelerin analizi için gelişmiş analitik cihazlar geliştirilmesine rağmen klasik analitik cihazlardan elde edilen verilerin çeşitli matematiksel algoritmalara tabi tutularak yöntemlerin hassasiyeti ve sonuçların doğruluğu artırılmaya çalışılmaktadır. 13

24 Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları Temel Bileşen Analizi Yöntemi (Principal Component Analysis (PCA) Method) Çok bileşenli verilerle ilgili en önemli sorunlardan biri, orijinal verilerin tamamının desen ve ilişkilerinin görülmesini engellemesidir. Çok değişkenli analiz yöntemlerinin birçoğunun temel hedefi verilerin boyutunu küçültmektir. Temel bileşen analizi daha çok bileşenler arasında korelâsyonun olmadığı durumlarda verilerin miktarını azaltmak için kullanılan bir tekniktir. Temel bileşen analizinin dayandığı ana fikir, her bir numuneyi tanımlayan orijinal değişkenlerin, X 1, X 2,, X n, doğrusal kombinasyonu olan PC1,PC2,,PCn şeklindeki temel bileşenleri bulmaktır. PC1 = a 11 X 1 + a 12 X 2 +.+a 1n X n (1.2) PC2 = a 21 X 1 + a 22 X 2 +.+a 2n X n vb. Esas bileşenler genellikle ortak varyans (kovaryans) matrisinden elde edilir. Ortak varyans, iki değişkenin birleşik varyansının bir ölçüsüdür. Matematiksel anlamda temel bileşenler (PC), ortak varyans matrisinin eigenvektör ( özvektör) leridir ve bu vektörlerin bulunmasında kullanılan tekniğe eigen analizi adı verilir. Her bir esas bileşene( yani, eigen vektörüne) karşılık gelen eigen değeri, o esas bileşenle tanımlanan veri takımının varyansının miktarını gösterir. Esas bileşenler birbirine dik açı oluşturur. Bu özellik diksellik olarak adlandırılır (Uyanık, 2008). 14

25 Şekil X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni gösteren diyagram (Uyanık, 2008) Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (Principal Component Regression (PCR) Method) Kemometrik kalibrasyon yöntemlerden birisi olan temel bileşen regresyon yöntemi, konsantrasyon seti için ölçülen absorbans verilerinin dekomposizyonu ile birbirine dik (ortogonal) doğrular elde edilmesi esasına dayanır. Bu elde edilen doğrular kurulacak kalibrasyonun koordinat sistemidir. Burada açıklanan PCR algoritması Martens ve Naes (1984) tarafından verilen şemaya göre açıklanmaktadır. PCR kalibrasyonu kurulmasındaki basamaklar aşağıdaki biçimdedir: Analiz edilecek maddenin konsantrasyon ve absorbans verilerinin varyanskovaryansı bulunur. Varyans-kovaryans saçılma matriksinin öz vektörleri ve öz değerleri hesaplanır. Seçilen öz değere (eigenvalue) karşılık gelen öz vektör (eigen vector) kalibrasyonun lineer bileşenidir. PCR algoritmasında genel lineer regresyon denklemi aşağıdaki biçimde yazılabilir: C = a + b. A (1.3) Burada C analiz edilecek maddenin konsantrasyonudur, a sabit sayı, b ise temel bileşenlerin ve C- loading matriksinin (q) çarpımından elde edilir: 15

26 b= P. q (1.4) Burada P öz vektörlerin matriksidir. Öz vektörler kolon matriksi en uygun öz değere (faktöre) ya da öz değerlere (faktörlere) karşılık gelmektedir. Burada q vektörü C- loading olarak adlandırılır ve T (sayı matriksi) üzerinden C nin regresyonu ile tayin edilir. q = D. T T. Y O (1.5) Burada D diagonal matriks olup her bir öz değerin tersine eşittir. t 1 sayı matriksi aşağıdaki eşitlikten elde edilebilir: t 1 = A o. P 1 (1.6) Ortalanmış absorbans ve konsantrasyon, AO ve CO ile gösterilebilir. Burada a sabiti genel lineer regresyon denklemi kullanılarak aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir: a = C o - A T O. b (1.7) Her bir aşamada elde edilen değerler denklemde yerine konarak numunede bilinmeyen konsantrasyonu hesaplanabilir. a. Yöntemin avantajları; i) dalga boyu seçimi gerektirmez, genellikle bütün spektral alan ya da bu spektral alanın deniş bir bölgesi kullanılabilir, ii) çok bileşen analiz için kullanılabilir, iii) PCR data işlemleri için ve kalibrasyondaki katsayılarının hesaplanmasında ILS regresyon işleminin kullanılmasına olanak tanır, iv) analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla çok kompleks karışımlar için kullanılabilir, v) bazen orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede bulunmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, vi) kalibrasyon için ölçülen absorbansların dekomposizyon işleminde sonra uygun öz vektörlere karşılık seçilen öz değerlerin deneysel ortamdan ve ölçüm aletlerinden gelen gürültünün eliminasyonuna olanak tanır. 16

27 b. Yöntemin dezavantajları; i) hesaplamalar klasik yöntemlere göre daha yavaştır, ii) yöntemin optimizasyonu temel kalibrasyon komponentlerinin bazılarının bilinmesini gerektirir (anlaşılması ve yorumlanması çok kompleks modeller için), iii) kalibrasyon için temel alınan vektörler analiz edilecek bileşenlere karşılık gelmeyebilir, iv) genellikle çok sayıda kalibrasyon numunesinin kullanılması doğru bir kalibrasyon için gereklidir, v) kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2007) Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression Method) Kemometrik kalibrasyonlardan en yaygın ve popüler olanı PLS yöntemidir. PLS yönteminde kalibrasyonun kurulması için kullanılan PLS algoritmalarına göre, ortogonalize edilmiş PLS algoritması (orthogonalized PLS algorithm) ve ortogonalize olmayan PLS algoritması (non-ortogonalized PLS algorithm) gibi ekilleri vardır. Ortogonalize PLS ve ortogonalize olmayan PLS kalibrasyonunun PLS 1 ve PLS 2 şeklinde iki tipi söz konusudur. PLS 1 de bir bileşik model içerisinde iken; PLS 2 de bütün bileşikler modele dahil edilmektedir. Wold ve Martens tarafından verilen PLS algoritması en genel olanlarıdır. PLS kalibrasyonu, sayı vektörleri vasıtasıyla X- ve Y- blokları arasındaki ilişkiye dayanır. PLS algoritmasına göre sıfır etrafında merkezileştirilmiş X- değişkeninin matrisi ve sıfır etrafında merkezileştirilmiş Y- değişkeninin parçalanması aşağıdaki biçimde verilir. Şekil PLS2 kalibrasyonu 17

28 X = T.P T + E (1.8) Y = U.Q T + F Y = X.B + F B = W (P T.W) -1. Q T Burada X= bağımlı değişken absorbans verileri), Y= bağımsız değişken (örneğin konsantrasyon), T= X için sayı matrisi, U= Y için sayı matrisi, P= X için yük matrisi, Q= Y için yük matrisi, E= X-kalıntı matrisi, F= Y-kalıntı matrisi, W=max (kovaryans (E,F) ) PCR algoritmasında olduğu gibi bu katsayılar (B) linear regresyon denkleminde yerine konursa analiz edilecek numunenin absorbans değerleri bu eşitlikte yerine yazılarak hesaplanabilir. a) Yöntemin avantajları; i) PLS kalibrasyon işlemi CLS ve ILS hesap tekniklerini kapsamaktadır, ii) tek aşamalı bir dekompozisyon ve regresyon işlemi gerektirir, kalibrasyonda kullanılan öz vektörler analiz edilen bileşenler ile en geniş ortak spektral değişimin olduğu bölgede doğrudan ilişkilidir, iii)kalibrasyonlar genellikle kalibrasyon setinin bilinmeyen numunelerden beklenen değişik konsantrasyonlarını yansıtması daha fazla güvenirlik sağlayacaktır, iv)yalnızca analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla kompleks karışımlar için kullanılabilir, v)bazı durumlarda orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede olmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, vi) bu tekniklerin hepsi spektral kantitatif analiz için uygulanırken literatürdeki sebepler genellikle PLS nin tahmin gücünün yüksek olduğunu göstermektedir. Birçok durumda PLS metodları PCR den daha iyi sonuçlar verir. b) Yöntemin dezavantajları; i) PLS hesaplamaları klasik metotlardan daha yavaştır, ii)pls modellerin anlaşılması ve yorumlanması zor olup son derece soyuttur, iii) genellikle çok sayıda numune için doğru bir kalibrasyon gereklidir, iv) kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2007). 18

29 Kalibrasyon (Derişim) setinin tasarımı Kemometrik (CLS, ILS, PCR, PLS) kalibrasyonlar için kalibrasyon seti ya rasgele (randomly) yada analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin konsantrasyonlarını içerecek şekilde kalibrasyon (derişim) setinin tasarımı yapılır. Simetrik kalibrasyon setinin planlanmasında analiz edilecek maddelerin konsantrasyonları, kalibrasyon setinin içinde ana kümenin permütasyonları şeklinde alt kümeler oluşturmalıdır. Kemometrik çalışmalarda rastgele kalibrasyon setinin hazırlanmasından ziyade, analiz edilecek maddelerin konsantrasyonlarına göre simetrik ve hataların minimize edilmesi açısından tercih edilecek bir durumdur. Çalışmalarda derişim seti hazırlanmasında, çeşitli tasarım şekilleri verilmekle birlikte rastgele hazırlanan derişim setleri de kullanılmaktadır Çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) Kemometrik kalibrasyonların validasyonu için kalibrasyonu ve tayin basamaklarında kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC) ve tayinin (tahminin) standart hatası (Standard error of prediction SEP) gibi parametreler kullanılmaktadır. SEC ve SEP değerlerini minimum yapan kalibrasyon koşulları ve F-istatistiği kullanılır. Kalibrasyon performanslarını değerlendirmek için, kemometrik kalibrasyonların SEC ve SEP değerleri yanında, bilinen ve tahmin edilen derişim değerlerinin lineer regresyon analizi yapılarak, korelasyon katsayısı, doğrunun eğim (m) ve kesim (n) değerleri kullanılır. PCR ve PLS kalibrasyonlarının kurulmasında faktör seçimi için çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) kullanılır. Bunun için karelerin tahmin (tayin) hatalarının toplamı (prediction error sum of squares PRESS) hesaplanır. Optimal faktör sayısını bulmak için önerilen kriterler minimum PRESS değeri ve F- istatistiğidir. 19

30 Varyans Analizi (ANOVA) Varyans analizi tekniği kullanılarak grup ortalamaları arasındaki farklılığın veya farklı analitik yöntemler ile elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları arasındaki farklılığın önemli olup olmadığına bakılabilir. Bir araştırmada k tane işlemin ( veya k tane yöntemin) n tekrarının sonunda elde edilen veriler bir tabloda özet haline getirilir. Sonra kontrol ve karşıt hipotezi aşağıdaki şekilde kurulur. H 0 : İşlemlerin temsil ettiği popülasyon ortalamaları arasındaki fark tesadüften ileri gelmektedir. İşlem ortalamaları arasındaki gözlenen fark sıfır kabul edilebilir: µ 1 = µ 2 = µ 3 = =µ k dır. H 1 : En az iki muamele grubunun ortalaması arasında gözlenen fark tesadüften ileri gelmektedir. En az iki işlem grubunun incelenen özellik üzerine olan etkileri birbirinden farklıdır, yani aralarındaki fark istatistiksel olarak önemlidir. Karşıt hipotez kurulurken en az iki işlem arasındaki fark önemlidir denilmektedir. Çünkü kontrol hipotezinin yapılan analiz sonucunda reddedilmesi için denemede dikkate alınan k tane işlemin birbirinden farklı olması gerekmez. En az iki işlem arasındaki farklılık kontrol hipotezinin reddedilmesine sebep olabilir. Yapılan hipotez kontrolü sonucunda karşıt hipotez kabul edilmiş ise bu en az iki grup ortalaması arasındaki farklılığın önemli olduğu çoklu karşılaştırma yöntemleri kullanılarak araştırılır. Gruplar arası, gruplar içi serbestlik dereceleri ve gruplar arası- gruplar içi kareler toplamı hesaplanır. Bu değerlerin oranlanmasıyla F değeri elde edilir. Elde edilen F değeri F değeri F tablosundan (α:0,05) okunan değerle kıyaslanır. 20

31 Çizelge 1.1. Varyans analizi çizelgesi (Anova testi çizelgesi: analysis of varation) (Dinç, 2009) Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları Analitik kimyadaki miktar tayini çalışmalarında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri ya da çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri IR spektrofotometre, UV- görünür alan spektrofotometre, spektroflorimetre, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiler elektroforez gibi analitik cihazlardan elde dilen analitik veriler uygulanmaktadır. Analitik kimyanın prensip ve yöntemleri çok değişik komşu disiplin tarafından kullanılmaktadır. Bu da analitik kimyanın biyoloji, tıp, ziraat, gıda ve eczacılık gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı olduğunu göstermektedir. Analitik çalışmalarda kemometrik yöntemlerin uygulamaları anorganik analiz, organik analiz, ilaç analizi, klinik ve biyolojik numunelerin analizi, gıda ve su analizleri, çevre analizleri ve stabilite tayinleri, çözünme hızı testleri şeklinde özetlenebilir Çoklu bileşen analizi (Multicomponent analysis) Son yıllarda, çoklu bileşen analizi, analitik kimyacılar için en önemli konulardan birisi oldu. Bu bağlamda, aynı anda miktar tayinlerinin klinik kimyası, ilaç analizi, kirlilik kontrolü vb. gibi değişik disiplinler ile ilgili aktif bileşikleri içeren karışımların kantitatif analizi için oldukça kullanışlı olduğu kanıtlanmıştır. Çok 21

32 değişkenli kalibrasyonların absorbans sinyallerine uygulanmasıyla çok bileşen analizlerinden elde edilen sonuçların doğruluğu, yöntem ve kullanılan analitik sinyallere bağlıdır. 22

33 2. KAYNAK ÖZETLERİ Erk ve Onur (1997) farmasötik preparatlardaki hidroklorotiazid ve amilorid hidrokloridi tayin etmek için üç spektrofotometrik yöntem kullanmıştır. Bu yöntemler sırasıyla Vierordt metodu, modifiye Vierordt yöntemi ve absorbans oranları yöntemleri olup farmasötik preparata uyguladıklarında hidroklorotiazid için 1,7; 1,6 ve 2,8 standart sapma ile, amilorid hidroklorür için 1,5; 1,8; 2,0 ve 1,6 standart sapma ile tablet analizlerini gerçekleştirmişlerdir. Ferraro, Castellano ve Kaufman (2002), bu çalışmada amilorid hidroklorid (AMH) ve hidroklorotiyazid (HCT) içeren ticari tablet preparatları ve sentetik örneklerin eşzamanlı analizleri için çok değişkenli spektrofotometrik kalibrasyon kullanıldığını bildirmişlerdir. Kısmi kareler yöntemi (PLS-1), hızlı ve doğru karışım çözünürlüğünde elektronik soğurma spektral verilerinin analizine önceki ayırma aşamasına gerek kalmadan ve diğer örnek bileşenlerin müdahalesi olmaksızın ki burada analit oranı yaklaşık 10:1 dir. Bu metotta, her iki ilacın sentetik karışımlarının analizi yapılarak onaylanmıştır, M.R. Khoshayand et al. (2008), bu çalışmada UV spektrofotometresi kullanarak ilaçlardaki kafein, parasetamol ve ibiprofen miktarının kemometrik yaklaşımlarla eş zamanlı tayinini diğer yöntemlere göre basit bir alternatif yöntem olarak bildirmişlerdir. İBU, CAF ve PAR ın doğrusal çalışma aralıkları içerisinde çeşitli konsantrasyondaki spektrumları kaydedildi ve nm arasında 1 nm aralıklarla metanol : 0,1 HCl (3:1) deki karışımlarının kalibrasyon hesaplanmasında kullanıldı. Verilerin kemometrik analizinde PLS, PLS(GA-PLS) ve PC-ANN yöntemleri kullanıldı ve kemometrik prosedürlerin parametreleri optimize edildi. Bu kemometrik yöntemlerin analitik performansları bağıl tahmin hataları ve geri kazanım(%) ile karakterize edilmiş ve birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Tahmin kapasite kaybı olmadan dalga boyu seçimi nedeniyle GA-PLS uygulanan diğer çok değişkenli yöntemlere göre üstünlük göstermektedir. Bileşenler önemli derecede spektral örtüşme göstermelerine rağmen hiçbir ayırma işlemi gerekmeden eş zamanlı ve hızlı bir şekilde tespit edilmiştir. Bu üç metot ilaç formülasyonlarına ve kapsüllere 23

34 yardımcı maddelerin girişimi olmadan başarıyla uygulanmıştır. Önerilen metotlar basit, hızlı ve ilaçların kalite kontrolünde alternatif araç olarak kolayca uygulanabilir. Dinç et al. (2008), Bu çalışmada paracetamol, propiphenazone, cafein ve thiamine içeren dörtlü ilaç karışımlarının kantitatif analizleri eş zamanlı olarak fonksiyonel dalga boyu dönüşümü (FWT) ile PCR, PLS, ANN metotları uygulanarak gerçekleştirildi. 22 çözelti karışımı içeren kalibrasyon seti ortogoal deneysel tasarım vasıtasıyla hazırlandı ve 210,0-312,3 nm spektral aralığındaki absorbsiyon spektrumları kaydedildi. Daha sonra fonksiyonel dalga boyuna aktarıldı ve FWT ile işlendi. FWT-PCR, FWT-PLS ve FWT-ANN kemometrik kalibrasyonları FTW metodu tarafından sağlanan katsayılar ve kalibrasyon setinin konsantrasyon verileri arasındaki ilişki kullanılarak hesaplandı. Doğrulama işlemi ilgili bileşiklerin sentetik karışımlarının analizi için geliştirilen yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiş ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Modeller son olarak ticari ilaç formülasyonlarına uygulanmıştır. Markopoulou et al. (2005), ticari tablet örneklerinde ve sentetik örneklerdeki üçlü karışımların ön ayırma işlemi gerekmeksizin eş zamanlı tayini için UV double divisor-ratio spektrum türev yöntemini kullanmışlardır. Metot klorofeniramin tuzu ve kafeinin parasetamol yada asetilsalisilik asit ile kombinasyonu ve asetilsalisilik asitin parasetamol ve kafein ile kombinasyonunu içeren üçlü karışımların ölçümüne uygun çözücüdeki absorbsiyon spektrumları kullanılarak başarıyla uygulanmıştır. Beer yasasına klorofeniramin için 0,84-4,21 μg/ml, kafein için 1,60-15,96 μg/ml, asetilsalisilik asit için 2,0-20,0 μg/ml ve parasetamol için 1,58-15,93 μg/ml konsantrasyon aralıklarında uyulmuştur. Tüm prosedür saf ilaçların sentetik karışımlarına ve ticari tabletlere içerik benzerliği ve çözünme testleri(usp 24) kullanılarak uygulanmıştır. metodun kesin ve tekrarlanabilir olduğu bulunmuştur. Çözünme profili testine göre parasetamol ve kafeinin %84 ünden fazlası 20 dakika içinde tamamen çözündü. Asetilsalisilik asidin çözünmesi daha yavaş olup dakika içinde tamamen çözündü. PLS ve HPLC metotları sonuçları değerlendirmek için aynı karışımlara uygulanmıştır. Önerilen metodun sonuçları ile PLS ve HPLC 24

35 metotlarından elde edilen sonuçlar uyum içinde olup çok bileşenli dozaj formlarının rutin analizinde kullanıma uygundur. De Luka et al. (2009), farklı kemometrik metorların tahmin yeteneklerini klasik UV spektrumlarına ve 1-4 dereceden türev spektrumlarına uygulayarak karşılaştırdılar. Parasetamol, propiphenazone ve kafein içeren ilaç tabletlerinin spektrum verilerine PCR, PLS-1 ve PLS-2 kemometrik yöntemleri uygulanmıştır. Çok bileşenli karışımların analizi için çok değişkenli yöntemler uygulanarak örtüşen spektrumların çözümünde türevlendirme yetenekleri değerlendirildi. Kemometrik modeller harici doğrulama veri setinde test edildi ve son olarak iki ya da üç ilaç içeren ticari tabletlerin analizine uygulandı. Yararlı bilgilerin edinilmesini ya da gereksiz ve gürültülü verilerin çıkartılmasını sağlayan yeni metodun kalibrasyonunda kullanılmak üzere seçilen dalga boyu aralığında model optimize edildi. Bu prosedür çok değişkenli regresyonlardan hesaplanan regresyon katsayıları kullanılarak dalga boylarının analitik verilerinin değerlendirilmesini sağladı. Üçüncü dereceden türev spektrumlarından oluşan kalibrasyon modellerinde önemli avantajlar bulundu. Bağıl standart hatalar %1,4 den az olup buna karşın diğer türev çeşitleri yüksek varyans sergiledi ve kullanımları yanlış sonuçlar verdi. Katalin et al. (2010), bu çalışmada ticari tabletlerdeki parasetamol, kafein, klorphenamin ve asprinin spektrofotometrik eş zamanlı analzini PCR ve PLS kemometrik metotlarıyla gerçekleştirmişlerdir. Özgün örneklerden elde edilen çeşitli derecede parametreler ve geri kazanım değerleri kuramsal modeller ile gerçek veriler arasında uyum, doğru ve hassas tahmin göstermiştir. Bahsedilen bu dört aktif bileşenden en az ikisini içeren sekiz ilaç formülasyonu başarıyla analiz edilmiştir. Elde edilen verilerin doğruluğu HPLC metoduyla kıyaslanmıştır. Ragno et al. (2004), bu çalışmada parasetamol, kafein, trifenilamin, salisilamid içeren çok bileşenli karışımların spektrofotometrik analizleri temel bileşen regresyon (PCR) ve kısmi en küçük kareler (PLS) yöntemleri kullanarak nitelendirmişlerdir. Kalibrasyon seti dörtlü, üçlü, ikili ve tek bileşenli karışımları içeren 47 referans örneğe dayandırılmıştır. Ve bu modelin amacı bir ya da dört komponentten oluşan 25

36 bileşimi bilinmeyen numunenin konsantrasyonunu önceden belirlemektir. PCR ve PLS modelleri karşılaştırılmıştır ve onların tahmin performansları sentetik karışımlar ve ilaç formulasyonlarının testlerinde başarılı uygulamalar gösterilmiştir. Yongnian ve Gong (1997), bu çalışmada tartrazine, sunset yellow, ponceau 4R, amaranth ve brilliant blue içeren karışımların kimyasal ön ayırması olmaksızın spektrofotometrik olarak eş zamanlı analizleri bu metotla yapılmışlardır. Deneylerden elde edilen veriler, CLS, PCR, PLS ve ITTFA gibi kemometrik yaklaşımlarla incelenmiştir. Bu işlem sırasında normal absorbans spektrumu ve 1. ve 2. türev spektrumları kullanılmıştır. Renklendiricilerin tamamından oluşan farklı derişimler içeren 16 sentetik karışımı incelenmiştir. Sonuçların farklı kemometrik yaklaşımlarla karşılaştırılarak uygulaması sağlanmıştır. ITTFA yönteminin PCR, PLS ve CLS den daha iyi sonuçlar verdiği gözlenmiştir. Kalibrasyonlar ilk türevlere dayandırılmıştır. Önerilen metotla, bazı ticari gıda ürünlerindeki renk maddelerinin belirlenmesi sağlanmıştır. Dinç ve Üstündağ (2003), bu çalışmada tabletlerde bulunan hidroklorothazin ve spironolaktonun spektrofotometrik eşzamanlı tayinini yaparak sonuçları, CLS, ILS, PCR ve PLS ile değerlendirmişlerdir. Kemometrik analiz metotları, ön ayırma gerektirmez. İlaçların ikisini de içeren 25 standart karışımın çalışma seti, karışım dizaynına göre 2-20 µg/ml derişim aralığında hazırlanmıştır. Çoklu kalibrasyonlar, çalışma seti kullanılarak 220 den 290 nm ye kadar 15 noktada zero-order ve ilk türev absorbansları ölçülmüştür. Çok bileşenli analiz metotlarının validasyonu, hidroklorothazin ve spironolaktonun sentetik karışımları analiz edilerek incelenmiştir. Sentetik karışımlar ve tabletlerden elde edile sonuçlar, tekyollu ANOVA testi ile istatistiksel olarak kıyaslanmıştır. Kemometrik analiz metotları, farmakolojik tablet formülasyonunda, hidroklorothazin ve spironolaktonun eş zamanlı tayini için uygun görülmüştür. Liao vd. (2007), bu çalışmada zayıf asit karışımlarının eş zamanlı tayini için kemometri ile birleştirilen yeni spektrofotometrik titrasyon metodu geliştirilmiştir. Bu metotta, titrant olarak sodyum hidroksit-asit/baz indikatörü karışımı 26

37 kullanılmıştır. İndikatör, titrasyon yöntemini denetlemek için kullanılmıştır. Titrasyon yönteminde, her bir titrasyon noktasında titrant ve çözünen sitin eklenen hacimleri, least square algoritmasıyla absorbans spektrumundan simultane olarak hesaplanmıştır. Sonra karışımdaki her bileşenin derişimleri, PCR ile titrasyon eğrisinden bulunmuştur. Metot, analitik sonuçların elde edilmesi için bilgi gerektirir ve hacim ölçümlerinden bağımsızdır. Analizler, titrasyonun son noktasından bağımsızdır. İndikatör ve asitlerin kararlılık sabitlerinin doğru değerlerini gerektirmektedir. Metot, mükemmel sonuçlarla benzoik asit, salisilik asit karışımlarının ve fenol, o-klorofenol ve p-klorofenol karışımlarının eş zamanlı analizi için uygulanmıştır. 27

38 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Bu çalışmada, UV/VIS spektrofotometrisi ile iki bileşenli bir ilaç numunesindeki aktif maddelerin nicel olarak tayini yapılmıştır. Elde edilen veriler, PCA, PCR ve PLS gibi kemometrik yöntemlerle değerlendirilmiştir. Spektrofotometrik ölçümlerle çözücü olarak metanol su karışımı kullanılarak hidroklorotiazid (HCT) ve amiloridhidroklorid (AMH) çözeltileri hazırlanıp spektrumları okunmuştur. Bu işlem için önce tek tek sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları alınmıştır. Son işlem olarak da ilaç örneğinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen veriler lisansı elimizde bulunan MİNİTAB 16 istatistik programıyla değerlendirilmiştir Kullanılan Cihazlar UV-Görünür Spektrofotometre Cihazı UV-VIS spektrumları, bilgisayar tarafından kontrol edilen 1cm uzunluğundaki hücre ile donatılan UV 1700 PHARMASPEC SHİMADZU spektrofotometresi kullanılarak not edilen spektrum değerleri ilaç tabletlerindeki HCT ve AMH miktarını belirlemek için kemometrik metotlara uygulanmıştır. 3.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler Deneylerde analitik saflıkta olan kimyasallar kullanılmıştır. Bu kimyasallar Çizelge 3.1 de verilmiştir. 28

39 Bileşiğin Adı Hidroklorotiazid Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar. Bileşiğin Formülü Amiloridhidroklorid Metanol MeOH Su, 0.05 S. cm -1 den düşük kondüktiviteye sahip, Milli Q su arıtma (Millipore Corp.) sisteminden sağlanmıştır Kullanılan Çözeltiler Çalışmada spektrofotometrik ölçümler için HCT ve AMH maddelerinin 500 ppm olacak şekilde stok çözeltileri hazırlanmıştır. Stok Hidroklorotiazid Çözeltisi : Hidroklorotiazid maddesinden 0,0631g tartılarak bir miktar metanol su karışımında çözüldükten sonra son hacim 250 ml ye tamamlanmıştır. Stok Amiloridhidroklorid Çözeltisi : Amiloridhidroklorid maddesinden 0,0624g tartılarak bir miktar metanol su karışımında çözüldükten sonra son hacim 250 ml ye tamamlandı. Analiz edilen bileşiklerin ticari preparatı : MODURETİC (Tablet) Hidroklorotiazid: 50 mg Amiloridhidroklorid :... 5 mg 29

40 Ticari numune Moduretic Ticari olarak satın alınan Modeuretic den 20 tablet havanda ezilip 1 tablet ağırlığına karşılık gelen 0,6571g tartılmıştır. Bir miktar metanol su karışımı ilave edilip yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 ml ye tamamlanmıştır. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 ml metanol - su ile yıkanmış ve hacim 100 ml ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltilmiştir Yöntem UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi Bu çalışmada, spektrofotometrik ölçümlerle ilaç aktif maddelerinin stok çözeltilerinin spektrumları okunmuştur. Bu işlem için önce tek tek sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları alınmıştır. Son işlem olarak da ilaç örneklerinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen veriler, farklı kemometrik yöntemlerle değerlendirilmiştir. İlk basamakta, UV spektrofotometre cihazının kalibrasyonu (sıfırlama işlemi) yapılmıştır. Kalibrasyon işlemi önce her iki hücre boş bırakılarak havaya karşı yapılmıştır. Sonra aynı işlem bu kez her iki ışık yoluna metanol su ile hazırlanan kör numunesi konularak yapılmıştır. Bütün okumalarda hep kör bu şekilde hazırlanmıştır. Kör olarak sadece metanol su kullanılmasının nedeni bu çalışmada genel olarak çözücümüz metanol- su karışımı olduğu içindir. Kör seçimi yapılırken girişim etkilerini yok etmek için, kör olarak çözücü tercih edilmiştir. İkinci basamakta, saf ilaç aktif maddelerinin tek tek spektrumları alınmıştır. Bu işlem esnasında stok ilaç aktif maddelerinden derişimleri 0,5-35 ppm arasında olacak şekilde 0,5-2,0 ml arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam hacim 25 ml ye tamamlanarak çözeltileri hazırlanmış ve UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapılmıştır. Üçüncü basamakta, her bir madde ayrı bir dalga boyunda maksimum verdiğinden saf ilaç maddelerinden oluşturulan sentetik karışımların UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapılmış ve birbiri yanında herhangi bir ön ayırma işlemine gerek olmaksızın ilaç aktif maddeleri incelenmiştir. Son basamakta ise, piyasada satılan ilaç numunesindeki ilaç aktif maddelerinin çözeltileri incelenmiştir. 30

41 4. ARAŞTIRMA BULGULARI Kemometrik kalibrasyonların HCT ve AMH bileşiklerinin analizine uygulamasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleridir. Kemometrik yöntemlerin uygulaması için spektral koşullar optimizasyonu ve optimal kalibrasyon setinin hazırlanması için ön çalışmalar yapılmıştır. Saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin nm dalga boyu aralığında absorbsiyon spektrumları alınmış ve kemometrik kalibrasyonlar nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerlerinin vektörel ölçümleri kullanılarak elde edilmiştir. Kemometrik algoritmalarla hesaplanan PCA, PCR ve PLS kalibrasyonları yapay ve farmosötik numunenin analizine uygulanmıştır UV Spektroskopisi Önce her bir renk maddesinin saf halde 500 ppm standart çözeltileri hazırlanmıştır. Daha sonra 0,05-3,5 ml arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam hacim 25 ml ye tamamlanmıştır. Bu işlem sonrası absorbanslar ölçülerek kaydedilmiştir. Her bir ilaç maddesinin derişimleri ppm olarak hesaplanmış ve absorbanslardan yaralanılarak molar absorpsiyon katsayıları belirlenmiştir. Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri İlaç Aktif Maddesi Hidroklorotia zid (HCT) Amiloridhidro klorid (AMH) Mak. Abs. Yaptığı Dalgaboyu Molar Absorpsiyon Katsayısı Kalibrasyon Denklemi 272 nm y = 0,0599x 0, nm y = 0,0597x 0,0457 Korelasyo n Katsayısı 0,9969 0,9988 Her bir ilaç aktif maddesinin önce tek tek spektrumları alınmıştır. Bu spektrumlar alınırken derişim aralıkları HCT için 5 35 ppm ve AMH için ise bu değerler 0,5-3,5 ppm arasındadır. Bu derişim aralıkları tayini yapılan her bir aktif madde için lineer doğrusallığın olduğu bölgelerdir. 31

42 Saf halde HCT ve AMH ın spektrumları HCT ve AMH maddeleri Çizelge 4.1 de de görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında maksimum absorbans vermektedirler. Bu özellikten yararlanılarak bir sonraki aşamada bu iki etken maddenin sentetik karışımları hazırlanmış ve bunlar birbiri yanında herhangi bir ön ayırma işlemi yapmaksızın tayin edilmişlerdir. HCT ve AMH ilaç aktif maddeleri sürekli spektrum göstermekte ve üst üste örtüşen spektrumlar gözlenmektedir. Şekil 4.1. HCT maddesinin absorpsiyon spektrumu Şekil 4.2. AMH maddesinin absorpsiyon spektrumu 32

43 Kemometrik kalibrasyonların HCT ve AMH bileşiklerinin analizine uygulamasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleridir. Kemometrik yöntemlerin uygulaması için spektral koşullar optimizasyonu ve optimal kalibrasyon setinin hazırlanması için ön çalışmalar yapılmıştır. Saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin nm dalga boyu aralığında absorbsiyon spektrumları alınmış ve kemometrik kalibrasyonlar nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerlerinin vektörel ölçümleri kullanılarak elde edildi. Kemometrik algoritmalarla hesaplanan PCA, PCR ve PLS kalibrasyonları yapay ve farmosötik numunenin analizine uygulanmıştır Kalibrasyon setinin hazırlanması Kemometrik kalibrasyonlar için metanol su içerisinde HCT için 5-35 μg/ml ve AMH için 0,5-3,5 μg/ml derişim aralığında her iki bileşiği içeren 28 değişik kompozisyonda simetrik bir kalibrasyon seti hazırlanmıştır. Çizelge 4.1. de hazırlanan kalibrasyon seti sunulmaktadır. Çizelge 4.1. HCT ve AMH analizi için kalibrasyon seti Kalibrasyon seti Derişim (µg/ml) Derişim (µg/ml) No HCT AMH No HCT AMH 1 5 0, , , , , , , , , , , , , , , ,5 33

44 Kalibrasyonlar için rastgele kalibrasyon seti yerine simetrik kalibrasyon seti tercih edilmiştir. Bunun sebebi analiz esnasında meydana gelebilecek kalibrasyon hatalarını minimize etmektir. Çizelge 4.1. deki simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki projeksiyon grafiği Şekil 4.3 de görülmektedir. Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği 4.3. Spektral Koşulların Optimizasyonu Spektrofotometrik çalışmalarda HCT ve AMH için metanol su karışımının uygun çözücü olduğu saptanmıştır. Metanol su karışımı içerisinde HCT ve AMH bileşikleri ile karşılık gelen karışımının nm dalga boyu aralığında spektrumları alındı (Şekil 4.4.). Şekil 4.4. den de görüldüğü gibi her iki bileşik aynı dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır. Bu nedenle klasik spektroskopik yaklaşımlarla her iki bileşiğin aynı anda miktar tayinleri mümkün değildir. 34

45 Şekil 4.4. HCT (5 μg/ml) ve AMH (2,5 μg/ml) ile iki bileşiğe karşılık gelen karışımın absorpsiyon spektrumları (Metanol su içerisinde) Temel Bileşen Analizi (PCA) Sentetik çözeltilerde hesap yaparken programın kendi içinde ilk yaptığı işlem temel bileşen analizi yapmaktır. Temel bileşen analizi uygulanmasının amaçları, bir orijinal değişkeni temsil eden n sayıda orijinal aksı (doğruyu) yeni akslar haline dönüştürmektir. Bu dönüşüm işleminde yeni akslar, verilerin maksimum varyans yönelimleri boyunca uzanır ve yeni aksların özelliği, ortogonal olmalarıdır ve bu yeni değişkenler arasında korelasyon yoktur. Numune verilerinin varyansının çoğunu açıklamak için ihtiyaç olan yeni değişkenlerin sayısı (p), n sayıdaki orijinal akslardan daha azdır. Temel bileşen analizi, çok değişkenli verilerin boyutunu indirgemek veya verileri azaltmak için bir yöntem olarak kabul edilir. Aynı zamanda değişkenlerin doğrusal bileşenlerini ortaya çıkarır. 35

46 Second Component 0,8 0,6 Loading Plot of C1;...; C2 C1 0,4 0,2 0,0-0,2-0,4-0,6 C2-0,8 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 First Component 0,6 0,7 0,8 Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri Şekil 4.5. e bakıldığında programa yüklediğimiz verilerden birinci temel aks ve ikinci temel aks üzerinden doğrusal bileşenler bulunmuştur. İşlemlerin doğruluğu ölçüsünde doğrusal bileşenler elde edilmiştir. Bu grafik varyans-kovaryans matrisinin elemanlarının orijinin merkezine olan büyük aks birinci temel bileşeni (C1) ve bu bileşene 45 ºC lik açı ile ikinci temel bileşen (C2) uzanmaktadır. Bir kare matris için, varyans-kovaryans matrisinin elemanları koordinat sisteminin orijini boyunca uzanır. Büyük aksın eğimi, birinci temel bileşen ile birleştirilmiş özvektör (eigenvector)dür. Bu özvektöre karşılık gelen özdeğer (eigenvalue) Şekil 4.5. deki büyük aksın uzunluğudur. Şekil 4.6. de özdeğerlerin grafiği görülmektedir. Özdeğerlerin simetrik bir veri matrisinden çıkarılması kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen analizi için önemlidir. Özdeğerler ve özvektörler elde edildikten sonra yapılacak işlem diğer kemometrik hesaplamalara geçiştir. Temel bileşen analizi ile elde edilen temel bileşenler yardımıyla oluşturulan korelasyon matrisi diğer kemometrik regresyonlara (PLS, PCR ) ışık tutmaktadır. 36

47 Eigenvalue Scree Plot of C3;...; C29 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Component Number Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği Şekil 4.6. de belirgin bir şekilde görüldüğü gibi özdeğerler 1. değerden 2. değere doğru düşmüştür. İlk iki faktör, toplam varyansın % 99 undan daha fazla güvenilirdir Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (PCR) PCR yöntemi kalibrasyon seti için ölçülen absorbans matrisinin parçalanmasıyla elde edilen temel bileşen regresyonuna dayalı bir yöntemdir. Yöntemin algoritması Bölüm de ayrıntılı olarak verilmiştir. PCR kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin nm dalga boyu aralığında Δλ= 0,1 nm aralıklarla absorbans değerleri okunmuştur. Bölüm de açıklanan PCR algoritmasına göre kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplanmıştır. Kalibrasyon seti için absorbansların varyans-kovaryans matriksinin dekompozisyon işlemine tabi 37

48 tutulmasından sonra derişimleri arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PCR kalibrasyonu kurulmuştur. İlaç aktif maddelerini içeren karışımların yukarıda belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak PCR kalibrasyonunda bu etken maddelerin miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir. PCR kalibrasyonu için Minitab 16 programında ilk olarak PCA değerleri hesaplanarak aşağıdaki çıktı elde edilmiştir. Eigenanalysis of the Covariance Matrix Eigenvalue 1,0025 0,0164 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Proportion 0,984 0,016 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Cumulative 0,984 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Variable PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 PC9 C3 0,163 0,017-0,193 0,153 0,327-0,216-0,297 0,227-0,312 C4 0,276-0,042-0,039 0,280 0,448-0,032 0,417 0,233 0,128 C5 0,418-0,115 0,094 0,288 0,076 0,089-0,120 0,090-0,030 C6 0,520-0,157 0,166 0,133 0,016 0,192 0,106-0,192 0,064 C7 0,501-0,095 0,123-0,107-0,289-0,217-0,163-0,125-0,108 C8 0,331 0,074 0,085-0,461-0,263 0,020 0,105-0,087 0,028 C9 0,164 0,220 0,034-0,390 0,198-0,240-0,279 0,361 0,155 C10 0,094 0,252 0,014-0,313 0,322-0,080-0,131-0,118 0,065 C11 0,073 0,167-0,161-0,244 0,253 0,303 0,137-0,027 0,085 C12 0,066 0,048-0,329-0,167 0,228 0,072 0,156-0,270-0,140 C13 0,070 0,000-0,397-0,051 0,139-0,003 0,101-0,311-0,025 C14 0,078-0,009-0,352 0,062-0,181 0,030-0,083-0,021-0,056 C15 0,085-0,003-0,319 0,057-0,138 0,050 0,137 0,113 0,011 C16 0,086 0,015-0,299 0,012-0,179-0,041-0,004 0,219 0,541 C17 0,080 0,044-0,272 0,033-0,207-0,023-0,106 0,047-0,191 C18 0,070 0,080-0,221 0,023-0,200 0,201 0,152 0,204-0,202 C19 0,053 0,130-0,183-0,009-0,164 0,138-0,008 0,127 0,162 C20 0,035 0,187-0,110-0,025-0,089 0,171-0,135 0,186-0,297 C21 0,026 0,244 0,001 0,208 0,086 0,415-0,460-0,296 0,078 C22 0,025 0,288 0,045 0,313-0,057-0,038-0,189 0,019 0,350 C23 0,028 0,327 0,098 0,067-0,073 0,289-0,017 0,247-0,167 C24 0,029 0,347 0,139 0,003-0,114 0,043 0,332 0,089 0,166 C25 0,029 0,347 0,146 0,070-0,009 0,061 0,104-0,320-0,021 C26 0,027 0,329 0,120 0,135-0,068-0,231 0,222 0,035-0,235 C27 0,024 0,287 0,039 0,059 0,062-0,160 0,049-0,010-0,141 C28 0,018 0,216-0,076 0,149-0,122-0,354 0,139-0,152-0,132 C29 0,010 0,126-0,228 0,171-0,046-0,370-0,095-0,269 0,220 Variable PC10 PC11 PC12 PC13 PC14 PC15 PC16 PC17 C3-0,279 0,225-0,078 0,043 0,123 0,152-0,331-0,063 C4 0,153-0,177 0,327 0,079-0,036-0,073-0,252-0,113 C5-0,314-0,301-0,209-0,003-0,326-0,086 0,473-0,113 C6 0,142 0,531-0,183 0,016 0,032 0,059 0,001 0,127 38

49 C7 0,103-0,183 0,179-0,141 0,401-0,023-0,034 0,305 C8-0,035-0,157 0,078 0,229-0,307-0,081-0,310-0,453 C9 0,219 0,150 0,006-0,143-0,125 0,047 0,206 0,068 C10-0,106-0,091 0,089-0,123 0,002 0,086 0,001 0,000 C11-0,037-0,035-0,326 0,208 0,095-0,266-0,179 0,370 C12-0,003-0,149 0,060-0,176 0,054 0,032 0,228 0,021 C13 0,156-0,120-0,096 0,059 0,106 0,098 0,270-0,056 C14-0,003 0,091 0,307 0,522 0,083 0,147 0,135-0,013 C15 0,118 0,038-0,067-0,582-0,094 0,117-0,062-0,222 C16-0,313-0,060 0,018 0,131 0,123 0,219-0,028 0,113 C17-0,216-0,210-0,338-0,094 0,132-0,042-0,235-0,086 C18 0,174 0,148 0,173-0,186-0,056-0,083-0,145 0,089 C19 0,085 0,172 0,123-0,038-0,077 0,114 0,243-0,007 C20 0,209 0,120-0,239 0,186-0,086-0,204 0,098-0,124 C21 0,135-0,120 0,153-0,036-0,102 0,043-0,234-0,005 C22 0,393-0,221-0,217 0,019 0,142 0,049-0,081-0,123 C23-0,239-0,092 0,374-0,072-0,016-0,169 0,130 0,255 C24-0,210 0,106-0,276-0,024 0,144-0,016 0,030 0,025 C25-0,346 0,199 0,119-0,156 0,058 0,285-0,032-0,170 C26 0,137-0,216-0,009 0,064 0,301-0,090 0,121-0,058 C27 0,083 0,216-0,006 0,219 0,065 0,134 0,155-0,249 C28 0,080-0,084-0,101 0,079-0,598 0,263-0,142 0,490 C29-0,133 0,267 0,135-0,084-0,101-0,712 0,011-0,049 Variable PC18 PC19 PC20 PC21 PC22 PC23 PC24 PC25 C3-0,339-0,208 0,144 0,083-0,161-0,074-0,004-0,091 C4 0,323-0,097-0,079 0,046 0,075 0,025 0,076-0,082 C5-0,130 0,132 0,105 0,104 0,144 0,143 0,031 0,011 C6-0,045 0,097-0,303-0,226-0,174-0,130-0,073 0,066 C7 0,187-0,119 0,310 0,081 0,060 0,097 0,070-0,066 C8-0,193-0,083 0,033 0,031-0,126-0,151-0,029 0,039 C9 0,085 0,008-0,272 0,294 0,209-0,109-0,197 0,145 C10-0,063 0,269-0,054-0,569 0,018 0,268 0,185-0,334 C11-0,118-0,079 0,231 0,053 0,206 0,136 0,089 0,355 C12 0,069-0,085-0,110 0,137-0,308 0,025-0,180 0,022 C13-0,108 0,017 0,058 0,062 0,063-0,444 0,104-0,154 C14-0,082-0,096-0,152-0,175 0,419 0,218-0,312-0,019 C15-0,039-0,148 0,237-0,292 0,085 0,174-0,304 0,265 C16 0,105 0,280 0,004 0,032-0,398 0,086 0,020 0,170 C17 0,362 0,102-0,412-0,037 0,167-0,247 0,093-0,035 C18-0,268 0,562 0,019 0,251 0,170 0,049 0,205-0,190 C19-0,078-0,402 0,031 0,126-0,181 0,026 0,464-0,196 C20 0,383-0,137-0,017-0,117-0,220 0,318 0,153-0,073 C21 0,096 0,098 0,026 0,264-0,165 0,077-0,300-0,093 C22-0,222-0,093-0,000-0,184 0,152-0,154 0,160 0,037 C23-0,019-0,114-0,008-0,322-0,076-0,468-0,064 0,142 C24 0,030-0,122 0,115 0,127 0,089-0,002-0,398-0,576 C25 0,102-0,118-0,142 0,205 0,288 0,151 0,301 0,268 39

50 C26-0,333 0,078-0,300 0,084-0,290 0,246-0,089 0,208 C27 0,299 0,359 0,503-0,036-0,039-0,203-0,027 0,185 C28 0,045-0,048 0,007-0,041-0,044 0,001-0,002-0,011 C29-0,000 0,000 0,000-0,000-0,000-0,000-0,000-0,000 Variable PC26 PC27 C3 0,005 0,090 C4-0,056-0,036 C5 0,038-0,017 C6 0,029-0,040 C7-0,026 0,052 C8 0,019 0,046 C9-0,064 0,009 C10-0,016-0,111 C11 0,034-0,160 C12 0,559 0,292 C13-0,548 0,058 C14 0,096-0,020 C15-0,150-0,113 C16-0,145 0,162 C17 0,158-0,303 C18 0,089 0,170 C19 0,176-0,473 C20-0,240 0,366 C21-0,129-0,221 C22 0,291 0,327 C23-0,055 0,099 C24-0,004 0,042 C25-0,124 0,231 C26-0,169-0,265 C27 0,227-0,221 C28-0,006 0,009 C29 0,000 0,000 Bu çizelge ilk üç esas bileşenin absorbansdaki değişmenin %99,99 kadarından sorumlu olduğunu göstermektedir. Bu nedenle regresyon işlemi bu üç bileşen esas alınarak yapılabilir. Ancak yaptığımız bu çalışmada diğer bileşenleri de işin içine katarak bir regresyon eşitliği türettik. Türetilen regresyon eşitlikleri aşağıda verilmiştir. C HCT = 3, ,7889 Z1-3,24774 Z2 + 25,5205 Z3-20,6816 Z ,421 Z5-342,915 Z ,964 Z7-162,13 Z8 + 99,4124 Z ,678 Z ,9 Z ,63 Z ,46 Z , Z14 + 1,66204e+006 Z15-40

51 1,32722e+006 Z16 + 1,35413e+006 Z17 + 2,00751e+006 Z Z Z Z21 + 1,34236e+006 Z22-1,85106e+006 Z Z27 C AMH = 1, , Z1 + 4,43811 Z2 + 3,56847 Z3-48,7075 Z4-43,332 Z5-18,775 Z6-60,843 Z7-102,368 Z8-44,3312 Z9-10,7868 Z10-58,3336 Z11-83,6196 Z12-185,796 Z , Z Z Z Z ,9 Z ,8 Z Z Z ,7 Z Z Z Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu PCR yöntemini valide etmek için HCT için 5-35 μg/ml ve AMH için 0,5-3,5 μg/ml çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 14 adet yapay karışım çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlanmıştır. Hazırlanan bu validasyon seti (çizelge 4.2.) kullanılarak kurulan PCR kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir. Geri kazanım (GK) değerleri; HCT için % 100,08 ve AMH için % 99,61 olarak bulunmuştur. Standart sapma değerleri HCT için % 1,72 AMH için ise % 0,56 olarak hesaplanmıştır. PCR kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2. de gösterilmiştir. Çizelge 4.2. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PCR kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Karışım (µg/ml) Bulunan (µg/ml) Geri kazanım (%) HCT AMH HCT AMH HCT AMH 5 3,2 4,94 3,19 98,80 99, ,2 10,01 3,19 100,10 99, ,2 15,06 3,20 100,40 100, ,2 20,15 3,18 100,75 99, ,2 24,98 3,20 99,92 100, ,2 30,02 3,20 100,07 100, ,2 34,99 3,19 99,97 99,69 8 0,5 8,05 0,49 99,80 98,00 8 1,0 7,78 0,99 97,25 99,00 8 1,5 8,01 1,49 100,13 99,33 8 2,0 8,15 2,00 101,88 100,00 8 2,5 8,22 2,50 102,75 100,00 8 3,0 8,21 3,00 102,63 100,00 8 3,5 7,74 3,49 96,75 99,71 X 100,08 99,61 SS 1,72 0,56 41

52 PCR yöntemi için ANOVA testi PCR kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1, grup içi serbestlik derecesi=27 % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,22 olmasına karşılık HCT için hesaplanan F-test değeri 3, ve p-değeri 0,99 ve AMH için hesaplanan F-test değeri 3, ve p-değeri 0,98 olarak bulunmuştur. ANOVA testinde F- hesaplanan < F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=27. F- hesaplanan < F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir olduğuna karar verilmiştir PCR yönteminde istatistiksel analiz HCT ve AMH içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PCR kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares PRESS) minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PCR kalibrasyonunda PRESS değeri HCT ve AMH için sırasıyla 0,2643 ve 0,0900 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri yeterince küçüktür. Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC), gerçek ve tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve HCT ve AMH için sırasıyla 0,01888 ve 0,08018 olarak bulunmuştur. Gerçek ve tahmin edilen derişim için lineer regresyon analiz sonuçları HCT için Şekil 4.7 de ve AMH için Şekil 4.8 de verilmiştir. 42

53 Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar PCR Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması PCR yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde tartılmıştır. Havanda iyice toz edildikten sonra Moduretic için 1 tablete karşılık gelen miktar olan 0,2480g tartılarak 100 ml lik balon jojede üzerine bir miktar metanol 43

54 su eklenerek yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 ml ye tamamlanmıştır. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 ml metanol su ile yıkandı ve hacim 100 ml ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltilmiştir. Bu analiz çözeltilerinin nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 1,0 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm de açıklanan PCR algoritması uygulanmış ve tablet içeriğindeki HCT ve AMH hesaplandı. Bu işlem 5 kez tekrarlanmıştır. Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi MODURETİC Tablet preparatı için ayrı ayrı tekrar edilmiştir. Sonuçlar Çizelge 4.3 de verilmiştir. Çizelge 4.3. MODURETİC Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar. MODURETİC Deney No HCT AMH 1 49,99 4, ,99 4, ,99 4, ,99 4, ,99 4, ,98 4,97 X = 49,99 4, Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS) Bölüm de ayrıntılı olarak algoritması verilen kısmi en küçük kareler yönteminde Çizelge 4.2 ye göre hazırlanan kalibrasyon seti kullanılmıştır. Ölçümler nm arasında yapılmıştır. Daha sonra aralık kalibrasyon seti için ve kullanılacak olan istatistik programı doğrultusunda dalga boyu aralığı nm olarak daraltılmıştır. 255; 260; 265; 270; 275; 280; 285; 290; 295; 300; 305; 310; 315; 320; 325; 330; 335; 340; 345; 350; 355; 360; 365; 370; 375; 380 ve 385 e karşılık gelen 27 noktada absorbans okunmuştur. PLS kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin nm dalga boyu aralığında Δλ= 0,1 nm aralıklarla absorbanslar okunmuştur. Kullanılan istatistik program ile kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplanmıştır. 44

55 Derişimler arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PLS kalibrasyonu kurulmuştur. İlaç aktif maddelerini içeren ticari farmasotik preparatda yukarıda belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak PLS kalibrasyonunda bu maddelerinin miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu PLS yöntemini valide etmek için HCT için 5-35 μg/ml ve AMH için 0,5-3,5 μg/ml çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 14 adet yapay karışım çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlanmıştır. Hazırlanan bu validasyon seti (Çizelge 4.2.) kullanılarak kurulan PLS kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir. Geri kazanım (GK) değerleri; HCT için % 100,58 AMH için % 100,82 olarak bulunmuştur. Standart sapma değerleri HCT için %6,99 AMH için % 2,20 olarak hesaplanmıştır. PLS kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.4. de verilmiştir. Çizelge 4.4. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Karışım (µg/ml) Bulunan (µg/ml) Geri kazanım (%) Karışım (µg/ml) Bulunan (µg/ml) Geri kazanım (%) HCT AMH HCT AMH HCT AMH 5 3,2 5,64 3,17 112,80 99, ,2 9,67 3,15 96,70 98, ,2 15,21 3,19 101,40 99, ,2 19,70 3,23 98,50 100, ,2 24,97 3,17 99,88 99, ,2 29,50 3,26 98,33 101, ,2 35,49 3,19 101,40 99,69 8 0,5 8,22 0,45 102,75 102,75 8 1,0 8,06 1,03 100,75 103,00 8 1,5 7,49 1,58 93,63 105,33 8 2,0 7,78 2,03 97,25 101,50 8 2,5 8,22 2,48 102,75 99,20 8 3,0 9,20 3,10 115,00 103,33 8 3,5 6,96 3,42 87,00 97,71 X 100,58 100,82 SS 6,99 2,20 45

56 PLS yöntemi için ANOVA testi PLS kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1, grup içi serbestlik derecesi=27 % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,22 olmasına karşılık HCT için hesaplanan F-test değeri 4, ve p-değeri 0,998 ve AMH için hesaplanan F-test değeri 9, ve p-değeri 0,992 olarak bulunmuştur. ANOVA testinde F- hesaplanan < F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=27. F- hesaplanan < F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir olduğuna karar verilmiştir PLS yönteminde istatistiksel analiz HCT ve AMH içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PLS kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares PRESS) minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PLS kalibrasyonunda PRESS değeri HCT ve AMH için sırasıyla 0,2910 ve 0,0026 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri yeterince küçüktür. Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC), gerçek ve tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplanmış ve HCT ve AMH için sırasıyla 0,5395 ve 0,0510 olarak bulunmuştur. Gerçek ve tahmin edilen derişim için lineer regresyon analiz sonuçları HCT için Şekil 4.9 da ve AMH için Şekil 4.10 da verilmiştir. 46

57 Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. Şekil PLS kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar PLS Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması PLS yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde tartıldı. Havanda iyice toz edildikten sonra Moduretic için 1 tablete karşılık gelen miktar olan 0,2480g tartılarak 100 ml lik balon jojede üzerine bir miktar metanol 47

58 su karışımı ile yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 ml ye tamamlanmıştır. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 ml metanol su ile yıkandı ve hacim 100 ml ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 0,1 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm de açıklanan PLS algoritması uygulandı ve tablet içeriğindeki HCT ve AMH hesaplandı. Bu işlem 5 kez tekrarlanmıştır. Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi MODURETİC Tablet preparatı için ayrı ayrı tekrar edildi. Sonuçlar Çizelge 4,5 de verilmiştir. Çizelge 4.5. MODURETİC Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar. MODURETİC Deney No HCT AMH 1 50,09 5, ,17 5, ,76 4, ,12 5, ,25 4, ,30 4,86 X = 49,95 4,96 48

59 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Günümüzde insanların hastalıklardan kurtulmak amacıyla sık olarak tükettikleri en etkili maddeler ilaçlardır. İlaçlar canlı bünyesinde içerdikleri etken maddeler sayesinde etki gösterebilmektedir. Bu etken maddeler ise giriş kısmında da belirtildiği üzere belirli miktarlarda alındıklarında canlı bünyesinde olumlu etki gösterirken aşırı alınması durumunda tehlikeli boyutlarda zararlar veren kimyasal maddelerdir. Bu nedenle ilaç analizlerinde etken madde analizi önemli yer tutmaktadır. Bu analizlerde genel olarak spektroskopik ve kromatografik yöntemler tercih edilmesine rağmen pahalı yöntemler olması ve çok uzun süren ön ayırma işlemleri bu yöntemlerin kullanımını sınırlamaktadır. Bu tez çalışmasında kemometrik kalibrasyonların ilaç etken maddelerinden HCT ve AMH bileşiklerinin hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın aynı anda analizine uygulanmasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleridir. Öncelikle ilaç etken maddelerinin saf haldeki spektrumları alınıp Çizelge 4.1. de görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında absorbans vermelerinden yararlanarak bu etken maddelerin sentetik karışımları hazırlanmıştır. Şekil 4.4. de görüldüğü gibi her iki bileşik aynı dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır bu durumda her iki bileşiğin klasik spektroskopik yaklaşımlarla aynı anda miktar tayinlerinin mümkün olmadığı görülmüştür. Geliştirilen PCR ve PLS kemometrik yöntemlerinin kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir. Kesinliğin sayısal ölçütü olan bağıl standart sapmanın düşük olması kesinliğin yüksek olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.3. ve Çizelge 4.5. de görüldüğü üzere bağıl standart sapmaların düşük olduğu görülmektedir. Doğruluğun sayısal ölçütü olan PRESS (Tahmin edilen hataların kareleri toplamı) değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesinin yüksek olduğunun göstergesidir. PCR yöntemi ile elde edilen PRESS değeri HCT için 0,2643 ve AMH için 0,0900 olarak hesaplanıp 49

60 PLS yöntemi ile elde edilen PRESS değeri HCT için 0,2910 ve AMH için 0,0026 olarak hesaplanmıştır ve bu değerlerin yeterince küçük olduğu görülmüştür. PCR ve PLS yöntemlerinin doğruluk ve kesinliğini valide etmek için elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanıp grup içi ve gruplar arası serbestlik derecesi ile tablodan okunan F değerine karşın hesaplanan F değerleri kıyaslanmıştır. Tablodan okunan F değeri 4,20 olup PCR yönteminde HCT için hesaplanan F değeri 3, ve AMH için 3, bulunmuş; PLS yönteminde HCT için 4, ve AMH için 9, olarak bulunmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar F hesaplanan <F tablo olduğu için bu kalibrasyon modellerinin ticari numunelerinin incelenmesinde kullanılabilir olduğu görülmüştür. PCR kalibrasyon basamağında Şekil 4.7 de HCT için ve Şekil 4.8 de AMH için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiklerinde görüldüğü üzere çalışılan aralıklarda doğrusal sonuçların elde edildiği görülmektedir. Aynı şekilde PLS yöntemi için de Şekil 4.9 da HCT için ve Şekil 4.10 da AMH için de aynı durum görülmektedir. PCR ve PLS yöntemlerinin uygulanmasıyla HCT ve AMH için elde edilen geri kazanım değerleri Çizelge 4.3. ve 4.5 de gösterilmiştir ve iki yöntem de elde edilen geri kazanımlar yüksek değerlerde bulunmuştur. Son olarak PCR ve PLS yöntemleri analiz edilen maddelerin ticari preparatlarına uygulanmış ve tabletlerde belirtilen HCT ve AMH miktarları ile Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.6 da bulunan bu aktif maddelerin miktarının birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak, geliştirilen kemometrik yöntemlerin birbiri ile uyumlu olduğu görülmüştür ve bu yöntemlerin tekrarlanabilirliğinin yüksek olup duyarlı ve doğru sonuçlar verdiği gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen bu kemometrik yöntemlerin HCT ve AMH içeren ilaç tabletlerinin analizinde kullanılabileceğini göstermektedir. 50

61 KAYNAKLAR Akpolat, O., F, Kartal., Kimyacılar İçin Bilişim Teknolojileri, 3-4. Çetin, A., Çoklu İlaç Karışımlarının Spektrofotometrik Olarak Kantitatif Analizi İçin Kemometrik ve Grafiksel Metot Geliştirme. Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 86s, Sakarya. De Luca, M., Oliverio, F., Ioele, G., Ragno,G., Multivariate calibration techniques applied to derivative spectroscopy data for the analysis of pharmaceutical mixtures. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 96, Dinç, E., Kemometri çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri, 27(1), Dinç, E., Kemometrik İşlem ve Yöntemlerin Analştik Kimyadaki Tipik Uygulamaları, Uygulamalı Kemometri Yaz okulu Notları, 1-5 Dinç, E., Üstündağ, Ö., Spectrophotometric quantitative resolution of hydrochlorothiazide and spirolactone in tablets by chemometric analysis methods. II Farmaco, 58, Dinç, E., Baleanu,D., Joele,G., De Luca, M., Ragno, G., Multivariate analysis of paracetamol, propiphenazone, caffeine and thiamine in quaternary mixtures by PCR, PLS and ANN calibrations applied on wavelet transform data. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48, Erk N.and Onur F Three new spectrophotometric methods for sımultaneous determination of hydrochlorothiazide ans amıloride hydrochlorıde ın sugarcoated tablets. Faculty of Pharmacy Unıversıty of Ankara. Analytical Letters, 30, Ferraro C.F. Monica, Castellano M.P., Kaufman S.T., Simultaneous determination of amiloride hydrochloride and hydrochlorothiazide in syntetic samples ans pharmaceutical formulations by multivarivate analysis of spectrophotometric data. Pharmaceutical And Biomedical Analysis, 30, Kaya, B., Kombine Farmasötik Preparatlardan Telmisartan ve Hidroklorotiyazid in kemometrik Kemometrik Kalibrasyon Yöntemleriyle Aynı Anda Miktar Tayinleri. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 104s, Ankara. Kartal M., and Erk N., Simultaneous of hydrochlorothiazide and amiloride hydrochloride by ratio spectra derivative spectrophotometry and highperformance liquid chromatography. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19, Khoshayand, M.R., Abdollahi, H., Shariatpanahi, M., Saadatfard, A., Mohammadi., A., Simultaneous spectrophotometric determination of paracetamol, ibuprofen and caffeine in pharmaceuticals by chemometric methods. Spectrochimica Acta Part A, 70,

62 Liao, L., Yang, J., Yuan, J., Process monitored spectrophotometric titration coupled with chemometrics for simultaneous determination of mixtures of weak acids. Analytica Chimica Acta, 591, Markopoulou, C.K., Malliou, E.T., Koundourellis, J.E., Content uniformity and dissolution tests of triplicate mixtures by a double divisor-ratio spectra derivative method. Il Farmaco, 60, Martin M.E., Hernandez O.M., Jimenez A.I- F., Arias J.J., Partial least-squares method in analysis by differential pulse polography. Simultaneous determination of amiloride and hydochlorothiazide in pharmaceutical preparations Analytica Chimica Acta, 381, Mot, A.C., S, Soponar, F., Medvedovici, A., Sarbu, C., Sımultaneous Spectrophotometrıc Determınatıon Of Aspırın, Paracetamol, Caffeıne, And Chlorphenamıne From Pharmaceutıcal Formulatıons Usıng Multıvarıate Regressıon Methods. Analytical Letters, 43, Ragno, G., Ioele, G., Risoli, A., Multivariate calibration techniques applied to the spectrophotometric analysis of one-to-four component systems. Analytica Chimica Acta, 512, Roggo, Y., Chalus, P., Maurer, L., Lema-Martinez, C., Edmond, A., Jend,N., A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, Skoog, D.A., Holler,F.J., Nieman, T.A., Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Özkan Matbaacılık, 849, Ankara. Şener, M., İçme Sularında Kalsiyum ve Magnezyumun Spektrofotometrik Metotla Simultane Tayini ve Yapay Sinir Ağları İle Kemometrik Analizi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 49s, Isparta. Uyanık, A., Analitik Kimyacılar için İstatistik ve Kemometri, Vandegınste B. M. G., Massart D. L., Buydens L. M. C., De Jong S., Lew_ P. J. And Smeyers-Verbeke. J. (1998). Handbook Of Chemometrics And Qualimetrics Part B, Elsevier, Amsterdam. 52

63 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : İkbal Demet ÜNLÜ Doğum Yeri ve Yılı: Isparta-1988 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu Lise : Isparta Gazi Lisesi Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü Yüksek Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı, Analitik Kimya devam ediyor. Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl: T. Garanti Bankası A.Ş Haziran devam ediyor. 53