T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOLESTEROL TEDAVİSİNDE KULLANILAN BAZI İLAÇ ETKEN MADDELERİN KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNİ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOLESTEROL TEDAVİSİNDE KULLANILAN BAZI İLAÇ ETKEN MADDELERİN KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNİ Ümit UÇAR Danışman Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI ISPARTA 2018

2 2018 [Ümit UÇAR]

3

4

5 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... iii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ İlaç Sentetik (Yapay) İlaçlar Doğal Kaynaklı İlaçlar Kolesterol İyi Kolesterol (HDL) Kötü Kolesterol (LDL) Kullanılan Kimyasallar Ezetimib Rosuvastatin Kullanılan Yöntem Spektrofotometri Lambert-Beer Kanunu Ultraviyole Ve Görünür Alan Spektroskopisi Kemometri Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları (Multivariate Calibration Algorithms) Klasik En Küçük Kareler Yöntemi (Classical Least Squares (K-matris) Method) Temel bileşen analizi yöntemi (Principal Component Analysis (PCA) Method) Temel Bileşen Regresyon Röntemi (Principal Component Regression (PCR) Method) Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression Method) Kalibrasyon (Derişim) Setinin Tasarımı Çapraz Validasyon İşlemi (Cross-Validation Procedure) Varyans Analizi (ANOVA) Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları Çoklu Bileşen Analizi (Multicomponent Analysis) KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Kullanılan Cihazlar UV/VIS Spektrofotometre Kullanılan Kimyasallar Kullanılan Çözeltiler Yöntem i

6 UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi ARAŞTIRMA BULGULARI UV Spektroskopisi Saf Halde Ezetimib ve Rosuvastatin Aktif Bileşenlerinin Spektrumları Ezetimib ve Rosuvastatin İlaç Etken Maddelerinin PCR ile Tablet Formunun Miktar Tayini Temel Bileşen Analizi (PCA) Orijinal Absorpsiyon Spektrumu - Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (OAS - PCR) Yöntemin Validasyonu Yöntemin ANOVA Testi Yöntemde İstatistiksel Analiz Kalibrasyonun Standart Hatası Yöntemin Ticari Numunelere Uygulanması Orijinal Absorpsiyon Spektrumu - Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (OAS - PLS)) Yöntemin Validasyonu Yöntemin ANOVA Testi Yöntemde İstatistiksel Analiz Kalibrasyonun Standart Hatası Yöntemin Ticari Numunelere Uygulanması TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ ii

7 ÖZET Yüksek Lisans Tezi KOLESTEROL TEDAVİSİNDE KULLANILAN BAZI İLAÇ ETKEN MADDELERİN KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNİ ÜMİT UÇAR Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ Bu tez çalışmasında, UV Görünür Alan Spektroskopisi yöntemlerinden elde edilen veriler alındı ve kemometrik kalibrasyon yöntemlerinden temel bileşen analizi (PCA), temel bileşen regresyonu yöntemi (PCR), kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS), farmasötik ezetimib ve rosuvastatin in aynı anda miktar tayinlerine hiç bir ayırma işlemi kullanmaksızın başarıyla uygulanmıştır ve bu yöntemlerden elde edilen veriler kemometrik olarak değerlendirildi. Bu çalışmada UV Spektroskopisi yöntemi ile bir ilaç numunelerinin etken maddeleri olan ezetimib ve rosuvastatin tayini amaçlanmıştır. Metot, basit, hızlı ve ucuzdur. Bu maddelerin tayini üzerine olan çalışmalar literatürde bulunmaktadır. Elde edilen veriler, lineer cebir matematiğine dayalı olarak bilgisayar destekli kalibrasyonlar kurularak kantitatif analizlerin yapılmasına olanak tanıyan Analitik Kimyanın bir kolu olan kemometri ile değerlendirildi. Hesaplanan sonuçlar, klasik spektrofotometrik metotla ile belirlenen sonuçlarla kıyaslandı. Anahtar Kelimeler: Kalp hastalıkları tedavisi, kolesterol, ilaç, kemometri, ezetimib, rosuvastatin, PCA, PCR, PLS, UV spektrofotometri 2018, 68 sayfa iii

8 ABSTRACT M.Sc. Thesis DETERMINATION OF SOME PHARMACEUTICAL SUBSTANCES USED IN THE TREATMENT OF CHOLESTEROL OF CHEMOMETRIC METHODS ÜMİT UÇAR Süleyman Demirel University Graduate School Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ In this thesis study, the data obtained from the methods of UV-Visible Spectroscopy were taken and the results of chemometric calibrations were compared with the principal component method (PCA), principal component regression method (PCR), partial least squares method (PLS), pharmaceutical ezetimibe and rosuvastatin were successfully applied without using any sorting procedure and the data obtained from these methods were evaluated chemometrically. In this study, ezetimibe and rosuvastatin which are the active ingredients of drug samples were aimed with UV Spectroscopy. The method is simple, fast and cheap. Studies on the identification of these substances are in the literature. The obtained data were evaluated by chemometry, which is a branch of Analytical Chemistry, which enables the quantitative analysis by establishing computerbased calibrations based on linear algebra mathematics. The calculated results were compared with the results determined by the classical spectrophotometric method. Keywords: Heart disease treatment, cholesterol, medicine, chemometrics, Ezetimibe, Rosuvastatin, PCA, PCR, PLS, UV spectrophotometry 2018, 68 pages iv

9 TEŞEKKÜR Öncelikle tez konumun seçiminde isteklerimi göz önünde bulundurup bana yardımcı olan, desteğini her zaman hissettiğim, engin bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım çok değerli tez danışmanım ve sayın hocam Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ a, Tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Tüm eğitim hayatım boyunca bıkmadan, usanmadan benden maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen her zaman yanımda olan sevgili aileme teşekkürlerimi bir borç bilirim. Ümit UÇAR ISPARTA, 2018 v

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1.1. Ezetimibin molekül yapısı... 4 Şekil 1.2. Rosuvastatinin molekül yapısı... 5 Şekil 1.3. Işığın dalga boyları... 7 Şekil 1.4. Beer kanunun şematik olarak gösterilmesi I0 ışın şiddetinin üstel olarak azalması... 9 Şekil 1.5. Lambert yasasının şematik olarak açıklanması. Işın demeti şiddetinin logaritmik olarak azalması Şekil 1.6. UV-Görünür alan spektrofotometresi Şekil 1.7. UV-Görünür alan spektrofotometresinin şematik gösterimi Şekil 1.8. Kemometrinin ilişkili olduğu alanlar Şekil 1.9. Temel bileşenin ilk ikisi koyu renkle çizili olan iki boyutlu sistemde verilerin bir dizi noktaları Şekil PLS2 kalibrasyonu Şekil 3.1. Ezetrol tablet Şekil 3.2. Crestor tablet Şekil 4.1. Metanol içerisindeki 1,92 ppm Ezetimib ve 1,92 ppm Rosuvastatin aktif bileşenlerinin UV absorpsiyon spektrumları Şekil 4.2. Ezetimib ilaç etken maddesinin absorpsiyon spektrumu Şekil 4.3. Rosuvastatin ilaç etken maddesinin absorpsiyon spektrumu Şekil 4.4. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için iki boyutlu düzlemdeki kalibrasyon grafiği Şekil 4.5. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği Şekil 4.6. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için iki boyutlu düzlemdeki validasyon grafiği Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında Ezetimib için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında Rosuvastatin için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında Ezetimib için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar Şekil PLS kalibrasyon basamağında Rosuvastatin için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar vi

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Spektroskopi tipleri ve kuantum geçişleri... 8 Çizelge 1.2. Varyans analizi çizelgesi (ANOVA testi çizelgesi = Analysis Of Varation) Çizelge 3.1. Kullanılan malzemeler Çizelge 4.1. İlaç etken maddelerinin spektroskopik özellikleri Çizelge 4.2. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için kalibrasyon seti Çizelge 4.3. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için validasyon seti Çizelge 4.4. Ezetimib ve Rosuvastatin sentetik karışımlarına PCR validasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri 48 Çizelge 4.5. PCR validasyon yönteminin Ezetimib ve Rosuvastatin analizi için kesinlik ve doğruluk test sonuçları Çizelge 4.6. PCR kalibrasyonunda Ezetimib aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları Çizelge 4.7. PCR kalibrasyonunda Rosuvastatin aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları Çizelge 4.8. Ticari ilaç numunesine PCR kalibrasyon yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar Çizelge 4.9. Ezetimib ve Rosuvastatin sentetik karışımlarına PLS validasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri 56 Çizelge PCR validasyon yönteminin Ezetimib ve Rosuvastatin analizi için kesinlik ve doğruluk test sonuçları Çizelge PLS kalibrasyonunda Ezetimib aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları Çizelge PLS kalibrasyonunda Rosuvastatin aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları Çizelge Ticari ilaç numunesine PCR kalibrasyon yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar vii

12 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ANOVA Varyans analizi (Analysis of variance) BSS Bağıl standart sapma BH Bağıl hata CLS Classical Least Squares GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry GK Geri Kazanım HDL high-density lipoprotein HMG-CoA 3-hidroksi-3-metil-glutaril-Koenzim A HPLC High-performance liquid chromatography ILS Inverse Least Squares IR infrared LC-MS Liquid chromatography mass spectrometry LDL low-density lipoprotein LOD Dedeksiyon limiti NMR nükleer magnetik rezonans NPC1L1 Niemann-Pick C1-Like 1 PC Matematiksel anlamda temel bileşenler PCA Temel bileşen analizi yöntemi(principal component analysis method) PCR Temel bileşen regresyon yöntemi (Principal component regression) PRESS Prediction error sum of squares PLS Kısmi en küçük kareler yöntemi( Partial least squares regression) SEC Standard error of calibration SEP Standard error of prediction SS Standart sapma VLDL Very Low Density Lipoprotein UV Ultraviyole görünür bölge spektroskopisi UV-Visible Ultraviyole-görünür x Ortalama viii

13 1. GİRİŞ Geçmişten günümüze insanlar çeşitli hastalıklarla savaş halindedirler. Bu nedenle de çeşitli bitki ve hayvanlardan elde edilen materyallerle hastalıkları önlemeye çalıştılar. Tabi geçmiş denilince akıllara hekimliğin öncü isimleri olan Lokman Hekim ve İbn-i Sina gelmektedir. Özellikle de bu hekimler birçok bitkisel ve hayvansal kaynaklı ilaçlar üretmiş ve kullanmışlardır. Zamanla modern tıp ve kimya alanının da gelişmesiyle birlikte kullanılan bu ilaçlar da gelişmiştir İlaç İlaç: Canlı organizmanın hücrelerinde meydana getirdiği etki ile herhangi bir hastalıktan koruyan veya bu hastalıkların teşhis ve tedavisini mümkün kılan kimyasal preparatlara ilaç adı verilir. İlaçlar bir hastalığın önlenmesi, teşhis edilmesi, tedavi edilmesi veya daha farklı amaçlarla (Örneğin, kontresepsiyon; gebeliği önlemek amaçlı) kullanılır. İlaçlarda etki selektivite (seçicilik) veya doza bağlıdır ve bunların etkileri geçicidir. İlaçlar, belirtilen doz aşamasında vücuda alındıklarında canlı bünyesinde olumlu etki gösterirken aşırı dozda alınması durumunda tehlikeli boyutlarda zararlar veren kimyasal maddelerdir. İlaçlar; a) Farmakolojik özellikleri b) Kimyasal yapıları c) Hedef sistemleri d) Etki ettiği bölgeye, göre 4 sınıfta incelenebilinir. Bunlarla beraber daha da genellemek gerekir ise ilaçlar doğal veya yapay (sentetik) olarak ikiye ayrılır. 1

14 Sentetik (Yapay) İlaçlar Eskiden ilaçlar genellikle bitkisel veya hayvansal yani doğal yollarla elde edilebilinirken, şimdilerde kimya biliminin de gelişmesiyle birlikte laboratuar ortamında yapay (sentetik) olarak ta üretilmektedir. Günümüzde doğal yollarla üretilebilecek ilaçların büyük çoğunluğu laboratuar ortamında üretile bilmektedir. Laboratuar ortamında yapılan üretim daha maliyetsiz olduğu taktirde o ilacın üretimi tamamen laboratuar ortamında yapılmaktadır. Sentetik ilaçların ilk kullanımı ise tıpta basit bileşikler şeklinde olmuştur. Bunların en önemlisi anestezide kullanılan dietil eterdir (1846) lerde ise halen daha kullandığımız, ağrı kesici ve ateş düşürücü özelliği olan aspirin sentezlenmiştir Doğal Kaynaklı İlaçlar a) Bitkisel kaynaklı olanlara örnek olarak mantarlardan üretilen antibiyotikler verilebilir. b) Hayvansal kaynaklı olanlara örnek olarak insülin ile anemide kullanılan karaciğer ekstresi verilebilir. c) Mikroorganizmalara ise antibiyotikler ve penisilin örnek olarak verilebilir. d) Minerallere de iyot ve demir başta olmak üzere müshilde kullanılan magnezyum sülfat ve radyoaktif ışınlar yayan elementler örnek verilebilir. Hazırlamış olduğum bu tezde kolesterol tedavisinde kullanılan Ezetimib ve Rosuvastatin kombinasyonunu içeren ilaçların kemometrik metotla miktar tayinlerini yapılacaktır. 2

15 1.2. Kolesterol Kolesterol, hayvansal dokulardaki hücre zarlarında bulunan ve kan plazması vasıtasıyla taşınan bir sterol, yani bir tür steroid ve alkol birleşimidir. Kanda bulunan yağ benzeri bir maddedir, yani lipit de denebilir. Kanda bulunan bu lipit miktarının artması yine bu lipidin yavaş yavaş damar çeperlerinde birikmesine neden olur. Bundan dolayı damar tıkanıklığı ve buna bağlı olarak kalp krizi, felç ve böbrek yetmezliği gibi durumlar açığa çıkar. Kolesterol, mumsu bir yapıdadır, hücrelerde ve hayvansal kaynaklı besinlerin tamamında bulunur. Kolesterol, vücudumuzun olmazsa olmazlarındandır ve vücutta ihtiyaca göre üretilir. Kolesterolün %75 i karaciğerde üretilirken %25 i tüketilen besinlerden gelir. Kolesterol, D vitamininin sindirilmesinde yer alan safra asitlerinin sentezlenmesinde ve vücutta bazı hormonların üretiminde de yer alır. İki çeşit kolesterol vardır. Bunlar; İyi Kolesterol (HDL) Küçük molekül yapılı ve yoğun moleküllerdir. Yüksek yoğunluklu lipoprotein olarak ta bilinir. Dokularda birikmiş kolesterolün karaciğere taşınarak vücuttan atılımın da görev alır. Böylece kan damarlarında kolesterol birikimini önleyerek kan damarlarında plak oluşumunun da önüne geçer. Besinlerde bulunmaz ve vücutta üretilir. HDL değerinin aşırı yüksek olmamak kaydıyla, yüksek olması iyiye işarettir Kötü Kolesterol (LDL) Düşük yoğunluklu lipoprotein olarak ta bilinir. Kolesterolün dokulara taşınmasında görev alır. Bu nedenle ihtiyaç fazlası LDL üretimi veya HDL nin yetersiz üretilmesi kolesterolün arter ve diğer kan damarlarının çeperlerinde birikmesine neden olur. LDL bu nedenle kötü kolesterol olarak ta bilinir. LDL kolesterolün en zararlı alt sınıfı VLDL dir ve kandaki yağların bağırsaklar tarafından emilerek yağ depolarına nakledilmesini sağlar. 3

16 1.3. Kullanılan Kimyasallar Ezetimib Kimyasal adı 1 - (4-florofenil) - 3(R) - [3 - (4-florofenil) - 3 (S ) - hidroksipropil] - 4 ( S ) - (4-hidroksifenil) - 2 azetidinon dur ve CAS kayıt numarası 'dir. Ampirik formülü C24H21F2NO3. Molekül ağırlığı 409,4'dür Kolesterol ve bununla ilgili bitki sterollerinin bağırsak emilimini inhibe eden, lipit modifiye edici bir bileşik sınıfındandır. Şekil 1.1. Ezetimibin molekül yapısı Ezetimibin moleküler hedefi ise hepatik kolesterol taşınmasında görev alan, sterol taşıyıcı bağırsak proteini Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) dir. Ezetimib böylelikle bağırsak kolesterolünün karaciğere taşınmasında azalmaya neden olur. Böylece kandaki kolesterolün temizlenmesini sağlar. Ezetimib safra asidi atılımını arttırmaz ve de karaciğerdeki kolesterol sentezini inhibe etmez. 4

17 Rosuvastatin Kimyasal adı bis [(E) -7- [4- (4-florofenil) -6-izopropil-2- [metil (metilsülfonil) amino] pirimidin-5-il] (3 R, 5 S) -3, 5-dihidroksihept-6-enoik asit] kalsiyum tuzu dur ve CAS Numarası 'dir. Ampirik formülü (C22H27FN3O6S)2Ca. Molekül ağırlığı 1001,14 olup, kimyasal yapısı; Şekil 1.2. Rosuvastatinin molekül yapısı Rosuvastatin 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A yı kolesterolün öncüsü ve hız sınırlayıcı olan mevalonat a dönüştüren sentetik bir HMG-CoA inhibitörüdür. Rosuvastatin; 1) Hücre yüzeyindeki karaciğer LDL reseptörlerinin sayısını arttırıp LDL nin alınımını ve katabolizmasını arttırır. 2) VLDL nin hepatik sentezini engeller, böylece VLDL ve LDL parçacıklarının toplam sayısını azaltır. 5

18 1.4. Kullanılan Yöntem Spektrofotometri Spektroskopik yöntemler; inorganik ve organik bileşiklerin kalitatif, kantitatif analizlerinde asit-baz denge sabitlerinin ve molekül yapılarının aydınlatılmasında oldukça yaygın bir şekilde kullanılan, atomik ve moleküler spektroskopiye dayanan bir analitik yöntemler grubudur. Spektroskopi kavramı ilk zamanlar ışığın (görünür ışık) dalga boylarına ayrılıp spektrumlarının elde edilmesi ile uğraşan bilim dalı olarak tanımlanırken, günümüzde ise elektromanyetik ışımanın, madde ile etkileşmesini inceleyen bilim dalı olarak tanımlanmaktadır (Pekin, 2013). Bu yöntemlerde maddeye farklı dalga boylarında ışın gönderilir bir enerji düzeyindeki atom, molekül veya iyon gönderilen ışını absoplayarak başka bir enerji düzeyine geçer, maddenin absopladığı bu ışın miktarını sayısal değer olarak okumamızı sağlayan cihazlara da spektrofotometre adı verilir. Işın veya elektromanyetik dalga uzayda çok büyük hızlarla hareket eden ve parçacık yapısında bulunan bir enerji şeklidir. Işık, ısı, radyo dalgaları ve X-ışınları gibi çeşitleri vardır. Bu enerji çeşitlerinden sadece ışık gözle görülmektedir. Işımanın atom yada moleküller tarafından soğurulması veya yayılması incelendiğinde, soğurma (absorpsiyon) veya yayılma (emisyon) spektroskopileri olarak adlandırılır. Işın uzayda dalgalar halinde yayılır. Işık enerjisinin absorpsiyonuna (soğurulmasına) dayalı bir yöntemdir. Işık elektromanyetik bir radyasyondur, frekansı (v) veya dalga boyu (λ) ile karakterize edilir. Belli bir dalga boyundaki ışık absorpsiyonu hangi spektrum bölgesinde olursa olsun enerjiyi absorbe etmek için yeterli kapasiteye sahip bir yapının varlığını gösterir. Elde edilen absorbsiyon miktarı, dalga boyunun bir fonksiyonu olarak kaydedilirse sonuç olarak absorbsiyon spektrumu meydana gelir. 6

19 Şekil 1.3 Işığın dalga boyları Elektro magnetik ışımanın moleküller tarafından soğurulması; moleküldeki atomların türüne, düzenine, moleküllerin şekline, büyüklüğüne v.b gibi özelliklerine göre değişiklik gösterir. Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdır. Maddelerin tanınması, yapılarının ve stereo kimyasal özelliklerinin bulunması için maddeye 110 nm den 3000 nm ye kadar ışınlar düşürülür. Bu aralıklardaki ışını verecek ve hangi dalga boylarının absorplandığını tespit edecek tek bir yapmak mümkün olmadığından, belirli dalga boyları arasında çalışan cihazlar geliştirilmiştir nm dalga boyları arasında çalışan cihazlar ultraviyole ve görünür (UV-Visible) alan, nm dalga boyları arasında çalışan cihazlar infrared (IR titreşim), Daha yüksek dalga boylarında çalışan cihazlara da nükleer magnetik rezonans (NMR) cihazlarıdır ve bunların spektroskopileri de aynı isimler ile adlandırılır (Pekin, 2013). 7

20 Çizelge 1.1 Spektroskopi tipleri ve kuantum geçişleri Spektroskopi tipi Dalga boyu Dalga sayısı Kuantum geçişinin aralığı aralığı (cm 1 ) tipi γ- ışını emisyonu 0,005-1,4 Å.. Nükleer X-ışını absorbsiyonu, emisyonu, floresansı, difraksiyonu 0,1-100 Å.. İç enerji seviyesindeki elektronlar Vakum ultraviyole nm 1x10 6-5x10 4 Bağ elektronları absorbsiyonu Ultraviyole görünür nm 5x10 4-1,3x10 4 Bağ elektronları bölge absorbsiyonu, emisyonu ve floresansı İnfrared absorbsiyonu ve raman saçılması 0,78-300µm 1,3x10 6-3,3x10 1 Moleküllerin titreşim ve dönmeleri Mikrodalga absorbsiyonu 0,75-3,75mm Moleküllerin dönmeleri Elektron spin rezonans 3cm 0,33 Magnetik alanda elektron spini Nükleer magnetik rezonans 0,6-10m 1,7x10 2-5x10 3 Magnetik alanda çekirdeklerin spini Saydam veya şeffaf bir ortamdan farklı dalga boylarında ışın demeti geçirildiğine bu dalga boylarının bir kısmının azaldığı görülür ve bu olaya ışının absorplanması denir. Moleküller, UV, görünür veya IR ışınlar ile uyarıldıkları zaman kuantlaşmış 3 tip geçiş görünür. Bunlar; elektronik geçişler ile ışın ile oluşabilen titreşim ve dönme geçişleridir. Bir moleküldeki toplam enerji; E T = E elektronik + E titre şim + E dönme (1.4.1) 8

21 Lambert-Beer Kanunu Beer yasası: Beer e göre (1852) aynı derinlikte bir çözeltiden geçen ve çözelti tarafından absorblanan monokromatik bir ışın demetinin şiddeti çözeltinin konsantrasyonuyla logaritmik, üstel veya geometrik olarak azalır. I = I 0 /2 I = I 0 /4 I = I 0 /8 Şekil 1.4. Beer kanunun şematik olarak gösterilmesi I 0 ışın şiddetinin üstel olarak azalması Bu gerçek logaritmik olarak, I = I 0. e bc (1.4.2) veya I = I ac (a=b/2,303 (1.4.3) şeklinde verilir. Ancak analitik hesaplamalarda ikinci eşitlik kullanılır (Gündüz, 1999). Lambert yasası: Lambert e göre (1760), çözeltiden geçen monokromatik bir ışın demetinin şiddeti, çözeltinin derinliği yani ışının çözelti içinde aldığı yolla logaritmik, üstel veya geometrik olarak azalır. I = I 0. e bl (1.4.4) veya 9

22 I = I al (a=b/2,303 (1.4.5) Ancak analitik işlemlerde ikinci eşitlik kullanılır. Şekil 1.5. Lambert yasasının şematik olarak açıklanması. Işın demeti şiddetinin logaritmik olarak azalması. Bu iki yasa birleştirildiğinde I = I ɛlc (1.4.6) Şeklinde bir yasa elde edilir ve buna Lambert-Beer yasası denir. Eşitlikte I 0 gelen ışın demetinin şiddeti, I çözeltiden çıkan ışın demetinin şiddeti, ɛ çözeltinin absorplama katsayısı, l ışın demetinin içinden geçtiği çözeltinin kalınlığı ve C ise çözeltinin konsantrasyonudur. Eşitliğin eksi logaritması alınırsa; log I/I 0 = ɛlc (1.4.7) olur. log I/I 0 değerine absorbans denir ve A ile gösterilir. log I/I 0 = A = ɛlc (1.4.8) yani A = ɛlc (1.4.9) olur (Gündüz, 1999). 10

23 Aynı bir ışın demetinin çözeltiden geçen kısmının çözücüden geçen kısmına oranına geçirgenlik denir ve T ile gösterilir. T= I I 0 (1.4.10) Buradan da, A = -log T (1.4.11) Elde edilir. Geçirgenlik genelde yüzde olarak verilir. %T= I I 0 x100 (1.4.12) Elde edilir. Lambert-Beer yasasından sapmalar; Bu kanun sadece çok seyreltik olan çözeltilerde uygulanıla bilinmektedir. Çünkü yüklü tanecikler birbirlerinin yük dağılımlarını etkiler veya değiştirir. Böyle bir taneciğin absorplama kabiliyeti çok fazla değişeceğinden derişim ile absorbans arasındaki lineer bağıntı bozulur. Başlıca sapmalar: 1) Cihazdan gelen sapmalar 2) Kimyasal maddeden gelen sapmalar 3) Analizci hatasından gelen sapmalar Ultraviyole Ve Görünür Alan Spektroskopisi Bir madde üzerine düşen dalga boylarından bazılarını absorplar. Maddenin bu özelliklerinden yaralanılarak yapı, konsantrasyon v.b tayin edilebilir. 11

24 UV ışınlar kendi aralarında 3 e ayrılır; UV-A(en uzun dalga boyu); Derideki melanini koyulaştırarak kısa sürede geçici bronzluk sağlar. UV-B; Geç ve uzun süreli bronzluk verir. Maruz kalındıktan yaklaşık bir gün sonra güneş yanıkları, deride su toplama, kızarıklık ve ağrılara neden olur. UV-C; Ozon tabakasından dolayı yeryüzüne ulaşamaz ama canlı yaşamını yok edici bir sterilizasyon etkisi bulunur. Burada maddenin absorpladığı enerji yapısında bulunan bir elektronu, bir üst enerji seviyesine çıkarmak için kullandığı kabul edilir. Bu nedenle bu metoda orbitaller arasındaki elektron geçişlerini ölçen spektroskopi dalı da denir. Bu işlemlerde lamberbeer eşitliğinden yararlanılır (Pekin, 2013). Çalışma aralıkları 110 ile 1000 nm arasındadır. 110 ile 190 nm aralığındaki cihazlar vakum tertibatlı olduğu için pahalıdır ve bu nedenle de laboratuarlarda genellikle 190 ile 800 nm aralığındaki cihazlarla çalışılır. UV spektrofotometreler; tek ışınlı ve çift ışınlı olarak ikiye ayrılır. UV-Görünür bölge spektrofotometreleri; ışın kaynağı, dalga boyu seçici, numune kabı, ışın transduserleri/dedektörleri ve okuyucudan oluşur. UV bölgesi için ışıma aralığı nm aralığında hidrojen ve döteryum lambaları, görünür bölge için nm aralığında olan tungsten lambası kullanılır (Pekin, 2013). Kullanılacak olan ışın kaynağının; 1) Enerjisi büyük olmalı (ışın yoğun olmalı). 2) Sürekli bir spektrum vermeli (ard arda gelen pek çok sayıda ışın vermeli). 3) Enerjisi sabit olmalı (Çift yollu cihazlarda enerjinin sabit olması çok önemli değildir.) (Gündüz, 1999). 12

25 Işın kaynağından gelen ışın demetini dalga boylarına göre ayıran cihazlara monokromatörler denir ve üç kısımdan meydana gelirler; 1) Işın demetinin giriş ve çıkış aralıkları (A ve D), 2) Mercek sistemi (BB ), 3) Gelen ışını tek dalga boylu demetlere ayırmaya yarayan prizma veya optik ağ (C). Giriş aralığından (A) monokromatora giren ışın B paralel hale getirilerek prizmaya gönderilir. Prizmada dalga boylarına ayrılan ışınlar ikinci bir mercek (B ) yardımıyla toplanarak konkav bir ayna üzerinde bulunan küçük aralığa, oradan da çözelti üzerine düşürülür. Prizmanın hafif döndürülmesi sonucu tek dalga boylu ışın demetleri sırasıyla D çıkış aralığına (silitine) rastlatılır. A ve D aralıkları B ve B merceklerinin odak noktalarıdır. (Gündüz, 1999) Şekil 1.6. UV-Görünür alan spektrofotometresi 13

26 Şekil 1.7. UV-Görünür alan spektrofotometresinin şematik gösterimi Numune kapları yani küvetler çalışılan spektrum bölgesindeki ışını absorplamayan maddelerden yapılmalıdır. Burada genellikle UV bölgede kuvars (350 nm altı) veya silikat cam küvetler ( nm aralığı), görünür bölgede ise plastik küvetler kullanılır. Foton ve ısı olmak üzere iki genel tip dedektör vardır. Bu cihazlar kalitatif analiz, kantitatif analiz ve molekül yapısını aydınlatma amaçlarıyla kullanılır. Çözücünün cinsi, ph, sıcaklık, bozucu maddelerin varlığı ve elektrolit derişimi okunan spektrumu etkileyen başlıca değişkenlerdir. 14

27 Kemometri Kemometri, kelime olarak ilk kez 1970 li yıllarım ortalarında İsveçli Svante Wold ve Amerikalı Bruce R. Kowalski tarafından ortaya atılmıştır yılında da uluslar arası kemometri derneği (Research Group for Chemometrics, Umea Universty ) tarafından bu alanın ilk resmi açıklanası yapılmıştır. Kemometri, istatistik ve matematik ile birlikte bilgisayar kullanarak kimyasal verilerin işlenmesini kapsayan bir kimya disiplini (alanı) dir. Kemometri, kimyasal analizlerde, kimyasal verilerden gerçek bilginin ekraksiyonunu veya saklı bilgilerin açığa çıkarılmasına olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Kemometrinin temel uygulama alanlarından biri analitik kimyadır (Dinç, 2007). Kemometri içerik olarak, tanımlayıcı ve açıklayıcı istatistik (descriptive and inference statistics), sinyal işleme (signal processing), deneysel tasarım (experimental design), modelleme (modeling), kalibrasyon (calibration), optimizasyon (optimization), yapı tanıma (pattern recognition), sınıflandırma (classification), yapay akıl yöntemleri (Artificial intelligence methods), resim işleme (image processing), bilgi ve sistem kuramı (information and system theory) gibi kavram ve uygulamaları kemometrinin konularını oluşturmaktadır (Dinç, 2007). Bu yöntemin başta gelen kullanıcıları analitik kimyacılar olduğu gibi, laboratuar ve analiz çalışmaları yapan komşu alanlarda da kullanıldığı gözlemlenmektedir. Şekilde kemometrinin farklı disiplinlerle ilişkileri sunulmuştur. Şekil 1.8. Kemometrinin ilişkili olduğu alanlar. 15

28 Kemometri uygulamalarının çoğu karmaşık hesaplamalar içerdiğinden gerekli hesaplamalar için bilgisayar programları kullanılır. Bu hesaplamalar için genellikle Excel, Minitab veya Matlab gibi programlar kullanılır Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları (Multivariate Calibration Algorithms) Klasik En Küçük Kareler Yöntemi (Classical Least Squares (K-martris) Method) Bu kalibrasyon yönteminde spektrofotometri gibi çeşitli analitik cihazlardan elde edilen verilerden oluşan denklemlerin Lambert-Beer yasasına uygulanmasıdır. A = K x C (Lambert-Beer yasasına göre) A 1 = K 11 C 11 + K 12 C K 1C C C A 2 = K 21 C 1 + K 22 C K 2C C C A 3 = K 31 C 1 + K 32 C K 3C C C (1.4.13) A 1 = K 11 C 11 + K 12 C K 1C C C Burada A; ölçülen sinyal, K; ölçüm için seçilen noktalardaki katsayılar, C; analiz edilen bileşiğin konsantrasyonudur. Yöntemin basit algoritması şu şekildedir; A pqx = K pxj. C jxq K = (A pjx C qxj x (C pxj C T qxj ) 1 (1.4.14) K T = K jxp K pxj ) 1 T K jxp C jxp = K. A sample 16

29 Yöntemin avantajları; a) Hesaplamalar hızlıdır. b) Kalibrasyonlarda dalga boyu seçmeye gerek kalmaz. c) Dalga boylarının sayıları bileşenlerinden fazla olsa da kullanılabilir. d) Geniş spektral alanlarda çok sayıda dalga boylarının absorbans ölçümlerinin kalibrasyonlarında kullanılabilir. e) PCR ve PLS ye göre daha basit bir matematiğe sahiptir. Yöntemin dezavantajları; a) Bu kalibrasyonda kalibrasyon karışımlarının her bileşen için tam olarak komposizyonunun bilinmesi gerekmektedir, b) Spektrofotometride grafik yöntemlerin uygulanmasında birbiriyle etkileşen bileşenlerin bulunduğu karışımların analizinde olduğu gibi CLS kalibrasyon yöntemi için de bu tarz karışımların analizi için uygun değildir Temel bileşen analizi yöntemi (Principal component analysis (PCA) method) Matriksin boşluk dizilerinin sınanması yöntemi, örnekler arası ilişkiyi incelemek için oldukça etkili bir yoldur. Fakat, bu durum yalnızca değişkenlerin ölçüm sayısı üçten az olduğunda mümkündür. Temel bileşen analizi, küçük sayılı faktör leri kullanarak birçok değişken içerisinde ki amacın, varyasyon yüzdesini sunmak olduğunda, veri matriksinin matematiksel işletimini esas alır. Bu yeni boşluk dizisi, orijinal ölçüm değişkenlerinden daha fazla faktör kullanılarak, tekrar tarif edilmesiyle örneklerin gösterildiği çizim biçimidir. İşte bu yeni giriş, faktör ya da temel bileşen olarak yol gösteren, birçok değişkenle analizcilere matriks araştırmasına ve göreceli küçük sayılı boyutlarda verilerin doğru değişken doğasının çizilmesine izin verir. Bu yeni bakışla, insan örnek tanımlamaları, verilerdeki yapıların tanınmasına izin verir. 17

30 Temel bileşen analizleri, en net şekilde iki değişkenli örnek kullanılarak anlaşılabilir. Sadece iki değişkenle, değişkenlerin sayısının azaltılmasına ihtiyaç duyulmaksızın, boşluk dizilerinin çizimi mümkün olmaktadır. Bu tamamen PCA nın avantajları arasında arasında olmamasına rağmen, sistemin nasıl işlediğini iyi anlatır. Ayarlı örnek verilerinin dizi boşlukların iki boyutlu noktaları Şekil 1.9 da gösterilmiştir. Veri matriksi iki kolondan meydana gelir, iki ölçüm, 40 dizi ve örnekleri sunar. Matrikslerin her bir grafikte (0) noktası olarak gösterilir. Şekil 1.9. Temel bileşenin ilk ikisi koyu renkle çizili olan iki boyutlu sistemde verilerin bir dizi noktaları Boşluk dizilerinde, örnekler arasındaki ilişkiyi çalışmak ilginçtir; örnekler arası uzaklık benzerlik ve farklılıkları belirlemede kullanılır. Matematiksel terimlerde, PCA nın amacı, mümkün olduğu kadar boyutları kullanarak iç noktaların uzaklığını anlatmaktır Temel Bileşen Regresyon Röntemi (Principal Component Regression (PCR) Method) Kemometrik ölçümleme yöntemlerden birisi olan temel bileşen regresyon yöntemi, konsantrasyon seti için ölçülen absorbans verilerinin dekomposizyonu ile birbirine dik (ortogonal) doğrular elde edilmesi esasına dayanır. Bu elde edilen doğrular kurulacak kalibrasyonun koordinat sistemidir. 18

31 Burada açıklanan PCR algoritması Martens ve Naes (1984) tarafından verilen şemaya göre açıklanmaktadır. PCR kalibrasyonun kurulmasında kullanılan basamaklar aşağıdaki biçimdedir: Analiz edilecek maddenin konsantrasyon ile absorbans verilerinin, varyans-kovaryans değerleri bulunur. Varyans-kovaryans saçılma matriksinin öz vektörleri ve öz değerleri hesaplanır. Seçilen öz değere (eigenvalue) karşılık gelen öz vektör (eigen vector) kalibrasyonun lineer bileşenidir. PCR algoritmasında genel lineer regresyon denklemi aşağıdaki biçimde yazılabilir: C= a + b. A (1.4.18) Burada C analiz edilecek maddenin konsantrasyonu, a sabit sayıdır, b sayısını ise temel bileşenlerin ve C loading matriksinin (q) çarpımı verir: b = P. q (1.4.19) Burada P öz vektörlerin matriksidir. Öz vektörler kolon matriksi en uygun öz değere (faktöre) ya da öz değerlere (faktörlere) karşılık gelmektedir. q vektörü C loadings olarak adlandırılır ve T (sayı matriksi) üzerinden C nin regresyonu ile tayin edilir: q = D.T T.Yo (1.4.20) Burada D diagonal matriks olup her bir öz değerin tersine eşittir. t 1 sayı matriksi aşağıdaki eşitlikten elde edilebilir: t 1 = Ao.P 1 (1.4.21) Ortalanmış absorbans ve konsantrasyon, A 0 ve C 0 ile gösterilebilir. Burada a sabiti genel lineer regresyon denklemi kullanılarak aşağıdaki eşitlikten hesaplanılabilir: a = C 0 A 0 T. b (1.4.22) Her bir aşamada elde edilen değerler nolu denklemde yerine konarak numunede bilinmeyen konsantrasyonu hesaplamamızı sağlar. 19

32 Yöntemin avantajları; a) Dalga boyu seçimi gerektirmez, genellikle bütün spektral alan veya bu spektral alanın geniş bir bölgesi kullanılabilir, b) Çok bileşenli analiz için kullanılabilir, c) Temel bileşen regresyon yöntemi veri işlemleri için ve kalibrasyondaki katsayılarının hesaplanmasında Ters En Küçük Kareler regresyon işleminin kullanılmasına olanak tanır. d) Analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi koşuluyla oldukça kompleks karışımlar için de kullanılabilir, e) Bazen, orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan ancak numunede bulunmayan bileşen içeren numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, f) Kalibrasyon için ölçülen absorbansların dekomposizyon işlemi yapıldıktan sonra uygun öz vektörlere karşılık seçilen öz değerlerin deneysel ortamdan ve ölçüm aletlerinden gelen gürültünün elenmesine olanak tanır. Yöntemin dezavantajları; a) Hesaplama işlemi klasik yöntemlere göre daha yavaştır, b) Yöntemin optimizasyonu temel kalibrasyon komponentlerinden bazılarının bilinmesini gerektirir (anlaşılması ve yorumlanması oldukça kompleks olan modeller için), c) Kalibrasyon için temel alınan vektörler analiz edilecek bileşenlere karşılık gelmeyebilir, d) Doğru bir kalibrasyon için, genellikle çok sayıda kalibrasyon numunesinin kullanılması gerekmektedir, e) Bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle, kalibrasyon numunelerinin hazırlanması zordur. 20

33 Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression Method) Kemometrik kalibrasyonlardan en yaygın ve popüler olanı PLS yöntemidir. PLS yönteminde kalibrasyonun kurulması için kullanılan PLS algoritmalarına göre, ortogonalize edilmiş PLS algoritması (orthogonalized PLS algorithm) ve ortogonalize olmayan PLS algoritması (non-orthogonalized PLS algorithm) gibi şekilleri vardır. Ortogonalize PLS ve ortogonalize olmayan PLS algoritması arasındaki temel fark X den faktörlerin çıkarılmasındadır. PLS kalibrasyonunun PLS1 ve PLS2 şeklinde iki tipi söz konusudur. PLS1 de bir bileşik model içerisinde iken; PLS2 de bütün bileşikler modele dahil edilmektedir. Wold ve Martens tarafından verilen PLS algoritması en genel olanlardandır. PLS kalibrasyonu, sayı vektörleri vasıtasıyla X- ve Y-blokları arasındaki ilişkiye dayanır. PLS algoritmasına göre sıfır etrafında merkezileştirilmiş X-değişkeninin matrisi ve sıfır etrafında merkezileştirilmiş Y-değişkeninin parçalanması şekil 1.9 daki biçimde verilir. Şekil PLS2 kalibrasyonu X = T P T + E Y = U Q T + F (1.4.23) Y = X B + F B = W (P T W) -1 Q T 21

34 Burada X= bağımlı değişken absorbans verileri, Y= bağımsız değişken (örneğin derişim), T= X için sayı matrisi, U= Y için sayı matrisi, P= X için yük matrisi, Q= Y için yük matrisi, E= X-kalıntı matrisi, F= Y-kalıntı matrisi, W=max (kovaryans (E,F) ). PCR algoritmasında olduğu gibi bu katsayılar (B) lineer regresyon denkleminde yerine konursa analiz edilecek numunenin absorbans değerleri bu eşitlikte yerine yazılarak hesaplanabilir. Yöntemin avantajları; a) PLS kalibrasyon işlemi CLS ve ILS hesap tekniklerini kapsamaktadır. b) Tek aşamalı bir dekompozisyon ve regresyon işlemi gerektirir, kalibrasyonda kullanılan öz vektörler analiz edilen bileşenler ile en geniş ortak spektral değişimin olduğu bölge ile doğrudan ilişkilidir. c) Kalibrasyonlar genellikle kalibrasyon setinin bilinmeyen numunelerden beklenen değişik derişimler yansıtması daha fazla güvenilirlik sağlayacaktır. d) Yalnızca analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi durumunda kompleks karışımlar için kullanılabilir. e) Bazı durumlarda orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede olmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde de kullanılabilir. f) Bu tekniklerin hepsi spektral kantitatif analiz için uygulanırken literatürdeki sebepler genellikle PLS nin tahmin gücünün yüksek olduğunu göstermektedir. Birçok durumda PLS metotları PCR den daha iyi sonuçlar verir. Yöntemin dezavantajları; a) PLS hesaplamaları klasik metotlardan daha yavaştır. b) PLS modellerin anlaşılması ve yorumlanması zor ve oldukça soyuttur. c) Genellikle çok sayıda numune için doğru bir kalibrasyon gereklidir. d) Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin derişimleri ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur. (Dinç, 2007). 22

35 Kalibrasyon (Derişim) Setinin Tasarımı Kemometrik (CLS, ILS, PCR, PLS) kalibrasyonlar için kalibrasyon setinin tasarımı ya rastgele yada analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin derişimlerini içerecek şekilde yapılır. Simetrik kalibrasyon setinin planlanmasında analiz edilecek maddelerin derişimleri, kalibrasyon seti içerisindeki ana kümenin permütasyonları şeklinde alt kümeler oluşturmalıdır. Kemometrik çalışmalarda rastgele kalibrasyon seti hazırlamaktan ziyade, analiz edilecek maddelerin derişimlerine göre simetrik kalibrasyon sisteminin hazırlanması hataları minimize etmek amacıyla tercih edilen bir durumdur. Çalışmalarda derişim setinin hazırlanmasında, çeşitli tasarım şekilleri verilebilmekle beraber rastgele hazırlanan derişim setleri de kullanılmaktadır Çapraz Validasyon İşlemi (Cross-Validation Procedure) Kemometrik kalibrasyonların validasyonu için kalibrasyonu ve tayin basamaklarında kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC) ve tayinin (tahminin) standart hatası (Standard error of prediction SEP) gibi parametreler kullanılmaktadır. Bunun için SEC ve SEP değerlerini minimum yapan kalibrasyon koşulları ve F-istatistiği kullanılır. Kalibrasyonun performanslarını değerlendirebilmek için kemometrik kalibrasyonların SEC ve SEP değerlerinin yanında, bilinen ve tahmin edilen derişim değerlerinin lineer regresyon analizi yapılarak, korelasyon katsayısı, doğrunun eğim (m) ve kesim (n) değerleri kullanılır. PCR ve PLS kalibrasyonlarının kurulmasında faktör seçimi yapabilmek için çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) kullanılır. Bunun için karelerin tahmini (tayin) hatalarının toplamı (prediction error sum of squares PRESS) hesaplanır. Optimal faktör sayısını bulmak için önerilen kriterler minimum PRESS değeri ve F- istatistiğidir. 23

36 Varyans Analizi (ANOVA) Varyans analizi kullanılarak grup ortalamaları arasındaki farklılığın veya farklı analitik yöntemler ile elde edilen analiz sonuçlarının ortalamalarının arasındaki farklılığın önemli olup olmadığına bakılabilir. Bir araştırmada k tane işlemin (veya k tane yöntemin) n tekrarının sonunda elde edilen veriler bir tabloda özet haline getirilir. Sonra kontrol ve karşıt hipotezi aşağıdaki şekilde kurulur. H0: İşlemlerin temsil ettiği popülasyon ortalamaları arasındaki fark tesadüften ileri gelmektedir. İşlem ortalamaları arasındaki gözlenen fark sıfır kabul edilebilir: µ1 = µ2 = µ3 = =µk dır. H1: En az iki muamele grubunun ortalaması arasında gözlenen fark tesadüften ileri gelmektedir. En az iki işlem grubunun incelenen özellik üzerine olan etkileri birbirinden farklıdır, bu durumda da aralarındaki fark istatistiksel olarak önemli olmaktadır. Karşıt hipotez kurulurken en az iki işlem arasındaki farkın önemli olduğu söylenilmektedir. Çünkü kontrol hipotezi yapılan analiz sonucuna göre reddedilmesi için denemede dikkate alınan k tane işlemin birbirinden farklı olması gerekmez. En az iki işlem arasındaki farklılık kontrol hipotezinin reddedilmesine sebep olabilir. Yapılan hipotez kontrolü sonucunda karşıt hipotez kabul edilmiş ise bu en az iki grup ortalaması arasındaki farklılığın önemli olduğu çoklu karşılaştırma yöntemleri kullanılarak araştırılır. Gruplar arası, gruplar içi serbestlik dereceleri ve gruplar arası- gruplar içi kareler toplamı hesaplanır. Bu değerlerin oranlanmasıyla F değeri elde edilir. Elde edilen F değeri F değeri F tablosundan (α:0,05) okunan değerle kıyaslanır (Dinç, 2009). 24

37 Çizelge 1.2. Varyans analizi çizelgesi (ANOVA testi çizelgesi = Analysis Of Varation) Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi Kareler toplamı Kareler ortalaması F-değeri Yöntemler arası (Gruplar arası) k 1 Yöntemler içi (Gruplar içi) k(n 1) Genel varyasyon nk Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları Analitik kimyadaki miktar tayini amaçlanan çalışmalarda, kemometrik kalibrasyon yöntemleri ya da çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri IR spektrofotometre, UVgörünür alan spektrofotometre, spektroflorimetre, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiler elektroforez gibi analitik cihazlardan elde dilen analitik veriler üzerinde uygulanmaktadır. Analitik kimyanın prensip ve yöntemleri çok değişik komşu disiplinler tarafından da kullanılmaktadır. Bu da analitik kimyanın biyoloji, tıp, ziraat, gıda ve eczacılık gibi alanlarda oldukça geniş bir çalışma alanı bulduğunu göstermektedir. Analitik çalışmalarda kemometrik yöntemlerin uygulama alanları anorganik analiz organik analiz, ilaç analizi, klinik ve biyolojik numunelerin analizi, gıda ve su analizleri, çevre analizleri ve stabilite tayinleri, çözünme hızı testleri biçiminde özetlenebilir. 25

38 Çoklu Bileşen Analizi (Multicomponent Analysis) Son yıllar içerisinde çoklu bileşen analizi, analitik kimyacılar için en önemli konulardan birisi olmuştur. Bu bağlamda, aynı anda miktar tayinlerinin klinik kimyası, ilaç analizi kirlilik kontrolü vb. gibi değişik alanlar ile ilgili aktif bileşikleri içeren karışımların kantitatif analizi için oldukça kullanışlı olduğu anlaşılmıştır. Çoklu bileşen analizi için kombine farmasötik preparatlardaki ilaç etken maddelerin miktar tayinlerine kemometrik kalibrasyon yöntemlerinin uygulaması, bu alanda uğraşan araştırmacılar için ilgi odağı olmuştur. İki veya daha fazla ilaç etken maddeyi içeren karışımlarda, çoklu bileşen analizinde kemometrik kalibrasyon ya da çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri, doğrudan absorbans sinyallerine uygulanır ve bu yöntemler aynı şekilde türev absorbans sinyallerine de uygulanabilmektedir. Çok değişkenli kalibrasyonların absorbans sinyallerine uygulanmasıyla çok bileşenli analizlerden elde edilen sonuçların doğruluğu, yöntem ve kullanılan analitik sinyallere bağlıdır. 26

39 2. KAYNAK ÖZETLERİ Literatür araştırması yapıldığında ezetimibin farklı maddelerle olan karışımı için, ister bir arada isterse ayrı ayrı analizlerinin yapıldığı birçok çalışmaya rastlanmıştır. Bu çalışmalar RP-HPLC, UPLC, LC-MS/MS, elektro analitik yöntemler ve UV spektroskopik yöntemlerdir. Jain ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptıkları çalışmada simvastatin ve ezetimibin bir arada bulunduğu ilaç formundan tayinleri için çalışmacılar ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HP-HPLC) metodunu uygulamışlardır. Kromatografik ayırma için 25 C de Luna C 18 kolon ve metanol: su: asetonitril karışımı mobil faz olarak kullanılmış ve akış hızı 1,8mL/dakika olarak uygulanmıştır. Çalışmada 231nm de UV-PDA dedektör kullanılarak dedeksiyon sağlanmıştır. Simvastatin ve ezetimibin alıkonma zamanları 13,5 ve 4,20 dakika olarak bulunmuştur. Uygulanan metotta lineer bölge 1-50 µg/ml ve simvastatin için %99,21 ezetimib için %99,50 geri kazanım bulunmuştur. Geliştirilen metot doğruluk ve kesinlik verileri ve diğer istatistiksel analizlerle doğrulanmış ve tahmin edilen veriler arasında iyi bir kolerasyon olduğu bulunmuştur. Rahman ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptıkları çalışmada simvastatin ve ezetimibin bir arada bulunduğu ilaç formundan tayinleri için çalışmacılar ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HP-HPLC) metodunu uygulamışlardır. Kromatografik ayırma izokratik olarak C 18 kolonda, asetonitril: metanol: ortofosforik asit bileşimindeki mobil faz ile ve 1 ml/dakika akış hızıyla gerçekleştirilmiştir. Dedeksiyon 238nm de UV-Vis dedektörle başarılmıştır. Simvastatin ve ezetimibin alıkonma zamanları sırasıyla 3,701 ve 5,975 dakika olarak bulunmuştur. Yöntemde simvastatin için %99,78 ve ezetimib için %98,81 geri kazanım µg/ml lineer bölgesinde elde edilmiştir. Önerilen metodun simvastatin ezetimibin bir arada tayinleri için rutin analizlerde başarılı bir şekilde uygulanılabileceği ifade edilmiştir. Kancherla ve arkadaşlarının 2015 yılında yaptıkları çalışmada ezetimibin bozulmasıyla oluşan dört ürünün karakterize edilmesi sıvı kromatografi- kütle/kütlespektrometri (LC-MS/MS) ile gerçekleştirilmiş ve ezetimibin ilaç safsızlıklarındaki tayini ultra performans sıvı kromatografi (UPLC) metoduyla doğrulanarak geliştirilmiştir. Ezetimibin bozunması asidik ve bazik şartlarda gerçekleştirilmiş ve dört bozunma 27

40 ürünü gözlemlenmiştir. Analit PDA dedektör ile 230nm de tayin edilmiştir. Metodun doğruluğu %RSD ile belirlenmiş ve dört safsızlık için 0,2 ile 1 arasında bulunmuştur. Cistla ve arkadaşlarının 2005 yılında yaptıkları çalışmada ezetimibin farmosatik formlardaki tayini için hızlı ve özel ters faz sıvı kromatografi metodu geliştirmişlerdir. Bunun için çalışmacılar kromasil 100 C 18 kolon ve su: asetonitril mobil fazı kullanarak izopratik bir ayrışma gerçekleştirmişler, akış hızı olarak 0,5 ml/dakika kullanmışlar ve analiti 232nm de tayin etmişlerdir. Uygulanan yöntem 0,5-50 µg/ml doğrusal aralığında geçerlidir. Chitravathi ve arkadaşlarını 2016 yılında yaptıkları çalışmada ezetimibin elektrokimyasal tayini gerçekleştirilmiştir. Bunun için Magnezyum oksit nanofleks (MgONF) CTAB kullanılarak beraber çöktürme metoduyla hazırlanmış. Hazırlanan bu çökelek karbon pasta elektroda modifiye edilmiş ve ezetimibin fosfat tampon çözeltisi içindeki elektrokimyasal davranışı siklik voltametrik tekniği ile tayin edilmiştir. Uygulanan metodun ticari tablet örneklerindeki ezetimibin tayini için başarıyla uygulanabildiği belirtilmiştir. Kumar ve arkadaşlarının 2016 yılında yaptıkları çalışmada ilaç örneklerinde atorvastatin kalsiyum, ezetimib ve fenofibratın bir arada tayinleri için yeni bir ters faz sıvı kromatografi yöntemi geliştirmişlerdir. Uygulanan yöntemde Agilent C 18 kolon, metanol: su mobil fazı, 1 ml/dakika akış hızı ve 250nm de UV dedektör kullanılmıştır. Çalışmacılar bu yöntemde her üç maddenin bir arada tayini için geliştirilen yöntemin basitliği, hızlılığı ve doğruluğu nedeniyle, birçok çalışmacı tarafından uygulanabilir olduğunu söylemişlerdir. Jain ve arkadaşlarının 2009 yılında yaptıkları çalışmada simvastatin ve ezetimibin bir arada tayini için basit hızlı doğru ve hassas bir spektrofotometrik metot geliştirmişlerdir. Çalışmada simvastatin tayini 223 ve 254,5nm dalga boylarında ve ezetimib ise 258,5 nm dalga boyunda tayin edilmiştir. Metoda doğrusal bölge 1-25 µg/ml doğrusal alanında ve geri kazanım ortalaması ise simvastatin için %99 ezetimib için %99,65 olarak bulunmuştur. Geliştirilen metot rutin analiz çalışmalarında uygulanabilirdir. 28

41 Hafez ve arkadaşlarının 2016 yılında yaptıkları çalışmada ezetimibin saf ve ilaç formlarındaki tayini için iki hassas ve doğru spektrofotometrik yöntem geliştirmişlerdir. Önerilen yöntemler çeşitli analitik belirteçlerin asidik ortamda ezetimib ile yükseltgenme reaksiyonlarına dayanmaktadır. Yükseltgenen ürünler çeşitli dalga boylarında ölçülmüştür. Tepkimeyi etkileyen deneysel şartlar incelenerek optimize edilmiştir. Uygulanan yöntemler ezetimibin tablet içerisindeki tayinine başarı ile uygulanmış ve sonuçlar t-testi ve F-testleri uygulanarak istatistiksel olarak birbirleri ile mukayese edilmiştir. Kumar ve arkadaşlarının 2009 yılında yaptıkları çalışmada tablet yapısı içerisindeki simvastatin ve ezetimibin bir arda tayinleri için ters faz yüksek performans sıvı kromotografi metodu geliştirilmiştir. Ayırma işlemi C 18 kolonda amonyum astat tamponu ve asetonitril sıvı fazı kullanılmış ve akış hızı 1 ml/dakika olarak gerçekleştirilmiştir. Alıkonma zamanları ezetimib için 5,9 ve simvastatin için 8,5 dakika olarak belirlenmiş ve dedeksiyon 240nm de gerçekleştirilmiştir. Özaltın ve arkadaşlarının 2007 yılında yaptıkları alışmada ezetimib ve simvastatinin bir arada tayinleri için sıvı kromatografik yöntem geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Optimum ayırma C 8 kolon kullanılarak 10 dakikadan daha az sürede gerçekleştirilmiştir. Dedeksiyon 240nm de diyot-array dedektör, kullanılarak ve carenone iç standardı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ezetimib ve simvastatin için dedeksiyon limitleri sırasıyla 0,05 ve 0,5 mg/ml olarak bulunmuştur. Geliştirilen metot farmosatik bileşiklerdeki ezetimib ve simvastatinin bir arda tayini için başarıyla uygulanmıştır. Ashfaq ve arkadaşlarının 2007 yılında yaptıkları alışmada ezetimib ve simvastatinin bir arada tayinleri için ters faz sıvı kromatografik yöntem geliştirilmiş ve valide etmişlerdir. Kromotografik ayırma merck C 18 kolonda 240nm dalga boyunda ve asetonitril amonyum asetat mobil fazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yöntem sonuçları iki analit arasında iyi bir çözünürlük ve mükemmel bir ayrılma olduğunu göstermiştir. Geri kazanım %99,12 den daha büyük RSD değerleri ise %1,38 den daha küçüktür. Sonuçlar, yöntemin amaçlanan kullanımı için uygun olduğunu göstermiştir. 29

42 Seshachalam ve arkadaşının 2008 yılında yaptığı çalışmada atorvastatin ve ezetimibin bir arada tayinleri için basit, izokratik ve hassas ters faz sıvı kromatografi yöntemi geliştirilmiştir. Ayırmada amonyum asetat: asetonitril mobil fazı kullanılmış dedeksiyon 254nm de gerçekleştirilmiş, ezetimib ve atorvastatin için alıkonma zamanları sırasıyla 15,50 ve 19,30 olarak bulunmuştur. Çalışmada dedeksiyon limiti atorvastatin için 1,25µg/mL ezetimib için 1,48µg/mL olarak bulunmuştur. Önerilen yöntem atorvastatin ve ezetimibin ticari örneklerinde kantitatif tayin için başarıyla uygulanmıştır. Balaji ve Sunitha nın 2010 yılında yaptığı çalışmada simvastatin ve ezetimibin bir arada tayinleri için doğru hassas ve ekonomik bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmiştir. 236 ve 234nm nin üzerindeki absorbans değerleri herhangi bir etkileşim olmadan tayinde kullanılmıştır. Uygulanan yöntem simvastatin için 4-16 µg/ml ezetimib için 4-16 µg/ml konsantrasyon aralığında beer yasasına uymaktadır. Uygulanan analiz sonuçları doğruluk ve kesinlik açısından istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Jahangiri ve arkadaşları tarafından 2016 yılında yapılan çalışmada atorvastatin ve ezetimibin ikili karışımları ve ticari tabletleri için en küçük kareler (PLS) temel bileşen regrasyonu (PCR) çoklu kalibrasyon yöntemleri uygulanmıştır. Bahsedilen analitlerin üst üste gelen spektrumlarından dolayı, bunların bir arada tayinleri bilinen spektrofotometrik yöntemlerle her hangi bir ayırma olmadan mümkün değildir. Önerilen metotlarda (PLS ve PCL) analitlerin tayini için bütün spektrum değerleri kullanılmıştır. Rajput ve Raj ın 2007 yılında yaptıkları çalışmada ezetimib ve simvastatinin tabletler içerisindeki bir arada tayini için birinci derece türev yöntemi kullanılarak basit doğru ve hassas bir spektroskopik metot geliştirilmiştir. Çalışmada ezetimib 245,4nm simvastatin ise 265,2nm de sıfır geçiş noktası göstermiştir. Ezetimib için 5-40µg/mL aralığında lineer korelasyon 0,9994, simvastatin için ise 245,4nm de 5-80µg/mL aralığında 0,9935 olarak bulunmuştur. Tayin limiti ezetimib için 0,39 ve simvastatin için 0,12mg/mL olarak tayin edilmiştir. Yöntem ezetimib ve simvastatinin ikili karışımlardaki bir aradaki tayinlerinde başarı ile uygulanmıştır. 30

43 Erdal Dinç 2007 yılında yapmış olduğu çalışmada şunlara değinmiştir; Analitik kimyada kemometri, çok değişkenli analitik verilerden maksimum kimyasal bilgi elde edebilmek için istatistik ve uygulamalı matematik ile birlikte bilgisayarın kullanıldığı bir disiplindir. Kemometrinin özel alanlarından bazıları; deneysel tasarım, yapı tanıma, çok değişkenli kalibrasyon, istatistiksel yöntemler ve sinyal işleme yöntemleri. Bu çalışma temel olarak, kemometrik kalibrasyonların ya da çok değişkenli kalibrasyonların genel prensipleri ve analitik kimyadaki özgün uygulamaları üzerine odaklanmıştır. Çok değişkenli kalibrasyonlar, kemometrik algoritmaların derişim seti ve karşılık gelen çok değişkenli ölçüm verilerine uygulanmasıyla elde edilirler. Kemometride, çok değişkenli kalibrasyonlar için çeşitli matematiksel algoritmalar kullanılmaktadır ya da önerilmektedir. Bu bağlamda, bunlardan yaygın olarak kullanılan klasik en küçük kareler (classical least-squares CLS), ters en küçük kareler (inverse least-squares ILS), temel bileşen regresyon (principal component regression PCR) ve kısmi en küçük kareler (partial least-squares PLS) bu çalışmanın içinde kısaca açıklanmıştır. İzleyen basamaklarda, bu kalibrasyon yöntemlerinin analitik kimyadaki uygulamalarının yakın geçmişteki literatür taraması yapılarak sunulmuştur. 31

44 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Bu tez çalışmasında, ezetimib ve rosuvastatin ilaç etken maddelerini kombine olarak içeren ROSALIN, EZEROS ve NOVİROS isimli ilaçları bulundu. Ancak ilaçlardan 2 si henüz üretime girmediği ve diğerinin ise artık üretilmediğini öğrenildi bundan dolayı piyasada bulunan CRESTOR ve EZETROL isimli ilaçlar temin edilerek bu ilaçları laboratuar ortamında karıştırılarak gerekli ölçümler yapıldı. UV/VIS spektrofotometrisi ile Ezetimib ve Rosuvastatin aktif bileşenlerini içeren ve kolesterol tedavisinde kullanılan Ezetrol (ezetimib) ve Crestor (rosuvastatin) ticari isimli ilaç numuneleri karıştırılarak, ezetimib ve rosuvastatinin nicel olarak tayini yapıldı. UV/VIS Spektroskopi cihazından elde edilen verilere PCA, PCR ve PLS gibi kemometrik yöntemler uygulandı. Spektrofotometrik ölçüm çalışmalarında ezetimib ve rosuvastatin aktif bileşenleri metanol kullanılarak çözüldü ve hazırlanan bu çözeltilerin spektrumları alınarak kaydedildi. Bu işlemde birinci basamakta piyasadan elde edilen saf ezetimib ve rosuvastatinin önce tek tek, ikinci basamakta ise farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların UV spektrumları kaydedildi. Çalışmada son olarak ise ticari ilaç örneğinde ölçümler yapıldı. lisansı elimizde bulunan MİNİTAB 16 istatistik programıyla değerlendirildi. Elde edilen veriler 3.2. Kullanılan Cihazlar UV/VIS Spektrofotometre UV-VIS spektrumları, bilgisayar tarafından kontrol edilen 1 cm uzunluğundaki hücre ile donatılan ve şeffaf kuartz küvetler vasıtasıyla ölçüm yaptığımız UV 1700 PHARMASPEC SHIMADZU spektrofotometresi kullanılarak alındı. 32

45 3.3. Kullanılan Kimyasallar Deneyde laboratuar çalışmalarına uygun, analitik saflıktaki malzemeler kullanıldı. Bu maddeler ve yapıları Çizelge 3.1 de verildi. Çizelge 3.1. Kullanılan malzemeler Bileşiğin Adı Bileşiğin Yapısı Ezetimib Rosuvastatin Metanol CH3OH 33

46 Kullanılan Çözeltiler Yapılan tez çalışmasında UV-VIS ölçümleri için ezetimib ve rosuvastatin aktif bileşenlerinin stok çözeltileri hazırlandı. Stok Ezetimib Çözeltisi Piyasadan elde ettiğimiz aktif ezetimib bileşiğinden alınan 10 mg hassas bir şekilde tartılarak bir miktar metanol de çözüldü ve daha sonra da son hacim 250 ml ye tamamlandı. Stok Rosuvastatin Çözeltisi Piyasadan ede ettiğimiz aktif rosuvastatin bileşiğinden 10 mg hassas bir şekilde tartılarak bir miktar metanol de çözüldü ve daha sonra da son hacim 250 ml ye tamamlandı. Analiz edilen bileşiklerin ticari numuneleri EZETROL (Tablet) Ezetimib : 10 mg Şekil 3.1. Ezetrol tablet 34

47 CRESTOR (Tablet) Rosuvastatin : mg Şekil 3.2. Crestor tablet Ticari olarak satın alınan Ezetrol ve Crestor ilaçlarından 20 şer tablet havanda ezilip Ezetrol ve Crestor ilaçlarının birer tabletinin toplam ağırlığına karşılık gelen miktarlar tartıldı. Tartılan kısımlara metanol ilave edilip birer saat manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve son hacimleri 100 ml ye tamamlandı. Çözeltide süzüldü ve çözünmeden kalan kısımlar en az 3 kez 10 ml metanol ile yıkandı ve hacimler 100 ml ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi Yöntem UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi Bu çalışmada, spektrofotometrik ölçümlerle ilaç etken maddelerin stok çözeltileri hazırlandı ve bu stoklardan hazırlanan karışımların UV Spektrofotometre ile spektrumları okundu. Bu işlem için ilk olarak tek tek daha sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların ölçümleri alındı. Son işlem olarak da ilaç örneklerindeki etken maddelerin ölçümleri gerçekleştirildi. Elde edilen veriler, çeşitli kemometrik yöntemler kullanılarak değerlendirildi. İlk olarak, UV spektrofotometre cihazının kalibrasyonu yapıldı. 35

48 Kalibrasyon işlemi, kullanılan kuartz küvet ve çözücünün elde edilen piklere etki etmemesi için yapılan bir sıfırlama işlemidir. Bunun için önce her iki küvet boş bırakılarak havaya karşı bir sıfırlama işlemi gerçekleştirildi. Sonra aynı işlem her iki ışık yoluna metanol ile hazırlanan kör numunesi konularak yapıldı. Bu işlemin amacı cihazdan ve çözeltilerden gelecek hataların önüne geçmektir. Bütün okumalarda kör numunesi spektrofotometrenin 2 numaralı gözünde kalır. Kör olarak metanol kullanmamızın nedeni yapılan çalışmada çözücümüzün metanol olmasıdır. Kör seçimi yapılırken girişim etkilerini yok etmek temel amaçtır. Çalışmanın ikinci basamağında, çözülen saf ilaç aktif bileşenlerin tek tek spektrumları alınır. Bu işlem esnasında hazırlanan stok ilaç etken maddelerden, derişimleri 1-10 ppm arasında saf maddeler alınarak toplam hacim 25 ml ye tamamlanıp çözeltileri hazırlandı ve UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapıldı. Üçüncü basamakta, her bir aktif bileşen farklı dalga boyunda maksimum absorbans verdiğinden saf ilaç aktif bileşenlerinden oluşturulan sentetik karışımların UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapıldı ve birbiri yanında herhangi bir ön ayırma işlemine gerek olmadan ilaç etken bileşenleri incelendi. Son basamakta ise, piyasadaki ilaç numunelerinde bulunan ilaç aktif bileşenlerinin çözeltileri incelendi. 36

49 4. ARAŞTIRMA BULGULARI Hazırlanan kombine ilaç numunesindeki ezetimib ve rosuvastatin etken bileşenlerinin kantitatif analizine, çok değişkenli kalibrasyona ve sinyal işlemeye dayalı kemometrik yöntemler uygulandı. Ezetimib ve rosuvastatin kombinasyonunun çok değişkenli kalibrasyon yöntemleriyle analizi için iki farklı çok değişkenli kalibrasyon yöntemi, orijinal absorpsiyon spektrumlarına uygulanarak 3 farklı kemometrik yöntem geliştirildi. Bu yöntemler, orijinal absorpsiyon spektrumu-temel bileşen analizi (OAS-PCA), orijinal absorpsiyon spektrumu - temel bileşen regresyonu (OAS-PCR) ve orijinal absorpsiyon spektrumu-kısmi en küçük kareler (OAS-PLS) yöntemleri olarak adlandırıldı. Yöntemlerin geliştirilmesi esnasında en uygun koşullar, en yüksek geri kazanım sonuçlarına göre saptandı ve saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin nm dalga boyu aralığında absorpsiyon spektrumları alındı. Kemometrik kalibrasyonlar nm dalga boyu aralığındaki bütün absorbans değerlerinin vektörel ölçümleri kullanılarak elde edildi. Geliştirilen yöntemler ezetimib ve rosuvastatin içeren yapay karışımlar ile ticari preparatların kantitatif analizine uygulandı UV Spektroskopisi Önce her bir ilaç hammaddesinden saf halde 40 ppm standart çözeltileri hazırlandı. Daha sonra 0,48-3,20 ppm arasında stoklardan saf maddeler alınıp toplam hacim 25 ml ye tamamlandı. Bu işlem sonrası absorpsiyon değerleri ölçülerek kaydedildi. Her bir ilaç maddesinin derişimleri ppm olarak hesaplandı ve absorbanslardan yararlanılarak molar absorpsiyon katsayıları belirlendi. 37

50 Çizelge 4.1. İlaç etken maddelerinin spektroskopik özellikleri İlaç madde etken Max. Dalga boyu Kalibrasyon denklemi Korelasyon kat sayısı Ezetimib 231,6 nm y = 0,4072x + 0,0360 R² = 0,99994 Rosuvastatin 244,0 nm y = 0,3602x - 0,0137 R² = 0,99993 Çalışmanın bu aşamasında ilaç etken maddelerin tek tek spektrumları alınmış ve bu spektrum değerleri alınırken derişim aralıkları ezetimib için 0,64-3,20 ppm ve rosuvastatin için ise bu değerler 0,48-2,40 ppm arasındadır. Bulunan bu derişim aralıkları tayini yapılan her bir ilaç aktif maddesi için lineerliğin olduğu bölgeler olarak saptanmıştır Saf Halde Ezetimib ve Rosuvastatin Aktif Bileşenlerinin Spektrumları Ezetimib ve Rosuvastatin in metanol içindeki çözeltilerinin nm arasındaki UV spektrumları (Şekil 4.1) çizildiğinde nm ler arasında Ezetimib ve Rosuvastatin in spektrumlar görülmektedir. Bundan dolayı karışımlarında her iki etken maddenin aynı anda herhangi bir ayırma işlemi olmadan miktar tayinlerinin bu spektrum aralığında absorbans değerlerinin ölçümü ile yapılması mümkün olmayacaktır. Şekil 4.1 de görüldüğü gibi nm arasındaki bölgede Ezetimibin sanki Rosuvastatinin girişimi olmaksızın direk absorbans değerlerinin ölçümü ile tayini yapılabilecek gibi gözükmesine rağmen, çok düşük değerlerde de olsa Rosuvastatinin bu bölgede absorpsiyon yaptığı ve bu yüzden bu işlemin gerçekleştirilemeyeceği anlaşılmıştır. Bu nedenle karışımlarında ezetimib ve rosuvastatinin miktar tayini için bu iki maddenin kalibrasyon ve validasyon çözeltilerinde nm ler arasında okunan absorbans değerlerinin kemometrik yöntemler kullanılarak yapılması ile mümkün olabileceği düşünülmüştür. 38

51 Absorbans (nm) Bu amaçla PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleri uygulanmıştır. Burada PCR yöntemi kullanılarak elde edilen verilerin, PLS yöntemi kullanılarak elde edilen verilerden daha iyi olduğu gözlenmiştir. Ezetimib ve rosuvastatin ilaç etken maddeleri Çizelge 4.1 de de görüldüğü gibi iki farklı dalga boyunda maksimum absorbans vermektedirler. Bu özellikten yola çıkılarak deneysel çalışmanın bir sonraki basamağında iki ilaç etken maddesinin sentetik karışımları hazırlanmış ve bunlar maddeler birlikte herhangi bir ön ayırma işlemi yapılmaksızın tayin edilmişlerdir. Ezetimib ve rosuvastatin ilaç etken maddeleri sürekli spektrum göstererek üst üste çakışan spektrumlar vermektedir. Bu spektrumları grafikleri Şekil 4.2 ve 4.3 de gösterilmiştir. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 1,92ppm Ezetimib 1,92ppm Rosuvastatin Dalga Boyu (λ) Şekil 4.1. Metanol içerisindeki 1,92 ppm Ezetimib ve 1,92 ppm Rosuvastatin aktif bileşenlerinin UV absorpsiyon spektrumları 39

52 Absorbans (nm) Absorbans (nm) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0,64ppm 1,28ppm 1,92ppm 2,56ppm 3,2ppm Dalga Boyu (λ) Şekil 4.2. Ezetimib ilaç etken maddesinin absorpsiyon spektrumu 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,48ppm 0,96ppm 1,44ppm 1,92ppm 2,4ppm Dalga Boyu (λ) Şekil 4.3. Rosuvastatin ilaç etken maddesinin absorpsiyon spektrumu 40

53 Çalışmanın bu aşamasında belirlenen spektral şartlarda kalibrasyon setinin ve numunelerin nm dalga boyu aralığında absorpsiyon spektrumları okundu ve kemometrik kalibrasyonlar nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerleri kullanılarak hesaplandı. Kemometrik algoritmalar vasıtasıyla hesaplanan, PLS, PCR ve PCA kalibrasyonları piyasadaki etken maddeler ile ticari ilaç numunelerinin analizine başarılı bir şekilde uygulandı Ezetimib ve Rosuvastatin İlaç Etken Maddelerinin PCR ile Tablet Formunun Miktar Tayini Yapılan deneysel çalışmalarda, yöntemden en iyi sonuçların alınabilmesi için metanol eşliğindeki aktif bileşen çözeltilerinin orijinal UV absorpsiyon spektrumları çeşitli dalga boyları ile aralıkları arasında denendi ve nm aralığında λ = 5 nm olarak 15 dalga boyunda absorbans değerlerinin ölçülmesinin yeterli olacağı anlaşıldı. Bu karışımda her iki aktif bileşenin miktar tayinleri için ezetimib ve rosuvastatinin farklı derişimlerini içeren metanol eşliğindeki karışımlarının çözeltileri kalibrasyon setine (Çizelge 4.2) temel bilen regresyonu (PCR) yöntemi paket programlar kullanılarak uygulandı. Kalibrasyon setinin hazırlanmasında kullanılan karışım derişimleri Çizelge 4.2 de görülmektedir. Yapılan çalışmalarda 15 karışım numunesinde en iyi sonuçların elde edilebilmesi için ezetimib ve rosuvastatin için 5 temel bileşenin yeterli olduğu saptandı. Bu yöntemde lineer kalibrasyon aralığının ezetimib için 0,32-1,60 μg/ml, rosuvastatin için ise 0,24-1,20 μg/ml olduğu bulundu. Bu paket programlar vasıtasıyla en iyi sonucu alabilmek için herhangi bir ön işlem yapılmaksızın, ortalama merkezli (mean center) ve standartlaştırılmış veriler denendi. Bunların içerisinde en uygun analiz sonuçlarının aşağıda gösterilen formüle göre ortalama merkezli verilerle ulaşıldığı gözlemlendi. Z = x x 41

54 Burada Z ortalama merkezli değer, x veri, x ortalamadır. Kullandığımız paket programlar ile birlikte kalibrasyon setindeki derişimlere (Çizelge 4.2) karşılık gelen score matrisleri ve spektrofotometrede okunan absorbanslara karşılık gelen loading (yükleme) matrisleri kuruldu, daha sonra aynı işlem tekrardan bilinmeyen derişimlerde bu iki ilaç etken maddeyi içeren karışımlara uygulanarak elde edilen veriler kalibrasyon regresyonu yardımıyla hesaplandı. Çizelge 4.2. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için kalibrasyon seti Kalibrasyon Seti Karışım Ezetimib (µg/ml) Rosuvastatin (µg/ml) Mix 1 0,32 0,24 Mix 2 0,64 0,48 Mix 3 0,96 0,72 Mix 4 1,28 0,96 Mix 5 1,60 1,20 Mix 6 0,80 0,24 Mix 7 0,80 0,48 Mix 8 0,80 0,72 Mix 9 0,80 0,96 Mix 10 0,80 1,20 Mix 11 0,32 0,64 Mix 12 0,64 0,64 Mix 13 0,96 0,64 Mix 14 1,28 0,64 Mix 15 1,60 0,64 Çizelge 4.2 deki kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki projeksiyon grafiği Şekil 4.4 de görülmektedir. 42

55 Rosuvastatin derişimi 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 Ezetimib derişimi Şekil 4.4. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için iki boyutlu düzlemdeki kalibrasyon grafiği Temel Bileşen Analizi (PCA) Temel bileşen analizi (PCA) yani matrisin boşluk dizilerinin sınanması yöntemi, örnekler arasındaki ilişkiyi incelemek için oldukça etkili bir yoldur. Temel bileşen analizi, küçük sayılı faktör leri kullanarak birçok değişkende varyasyon yüzdesinin sunulması amaçlandığında, veri matrisinin matematiksel işletimidir. Ancak, bu durum değişkenlerin ölçüm sayısı üçten az olduğunda yapılabilmektedir. Yeni boşluk dizisi, orijinal ölçüm verilerinden daha fazla faktör kullanılarak, yeniden tarif edilmesiyle örneklerin gösterildiği çizimdir. Bu yeni giriş, faktör veya temel bileşen olarak, temel olan birçok değişkenle analizcilere matris araştırmasına ve göreceli küçük sayılı boyutlarda verilerin doğru değişken doğasının çizilmesine izin verir. Özdeğerlerin simetrik bir veri matrisinden çıkarılması kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen analizi için oldukça önemlidir. Özdeğerler ve özvektörler elde edildikten sonra diğer kemometrik hesaplamalara geçilir. Temel bileşen analizi ile elde edilen temel bileşenler yardımıyla oluşturulan korelasyon matrisi diğer kemometrik regresyonlara (PLS, PCR ) yol göstermektedir. 43

56 Öz d eğ erler Bileşen sayısı Şekil 4.5. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği Şekil 4.5. de görüldüğü gibi özdeğerler 1. değerden 3. değere doğru düştüğü görülmektedir. İlk üç faktör, toplam varyansın yaklaşık % 100 ü kadar güvenilir olduğu grafikten net bir şekilde anlaşılmaktadır Orijinal Absorpsiyon Spektrumu - Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (OAS - PCR) PCR yöntemi kalibrasyon seti için ölçülen absorbans matrisinin parçalanmasıyla elde edilen temel bileşen regresyonuna dayalı bir yöntemdir. Yöntemin algoritması Bölüm de ayrıntılı olarak verilmiştir. PCR kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin nm dalga boyu aralığında Δλ= 0,1 nm aralıklarla 1001 noktada absorbans değerleri okunarak, bölüm de açıklanan PCR algoritmasına göre kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplandı. Derişim seti için ölçülen 15x13 boyutundaki veriler matrisinin parçalanma işlemine tabi tutulmasından sonra elde edilen temel bileşenlerin, derişim seti ile arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı OAS-PCR kalibrasyonu kuruldu. Ezetimib ve rosuvastatin içeren numunelerin nm dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak OAS-PCR kalibrasyonunda yerine konuldu 44

57 ve ezetimib ve rosuvastatinin derişimleri hesaplandı. PCR kalibrasyonu için Minitab 16 programında ilk olarak PCA değerleri hesaplandı ve aşağıda gösterilen çıktı elde edildi. Korelasyon Matrisinin Özdeğerleri Özdeğerler 10,284 2,655 0,060 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Oran 0,791 0,204 0,005 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Toplam 0,791 0,995 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Özdeğerler 0,000 0,000 Oran 0,000 0,000 Toplam 1,000 1,000 Değişken PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 PC9 PC10 C3 0,223 0,429-0,153 0,178-0,477 0,481-0,138-0,284-0,021 0,143 C4 0,256 0,346-0,399-0,126-0,156-0,180-0,238 0,648-0,184-0,084 C5 0,296 0,179-0,519-0,125 0,228-0,087 0,329-0,364 0,094-0,267 C6 0,300-0,163-0,272 0,318 0,100-0,396 0,016-0,128 0,173 0,657 C7 0,272-0,300 0,066 0,334-0,367-0,363 0,102-0,138-0,336-0,506 C8 0,265-0,323 0,132 0,141-0,368 0,108-0,061 0,169 0,155 0,135 C9 0,270-0,307-0,011 0,050 0,004 0,428 0,009 0,151 0,240-0,062 C10 0,280-0,271-0,115-0,121 0,288 0,447 0,211-0,015-0,471 0,053 C11 0,294-0,204-0,045-0,222 0,179-0,006-0,270 0,116 0,525-0,290 C12 0,310-0,054 0,229-0,406 0,108-0,143-0,556-0,277-0,370 0,167 C13 0,302 0,146 0,357-0,340-0,123-0,116 0,607 0,266-0,029 0,225 C14 0,264 0,321 0,380-0,125-0,079-0,085 0,025-0,291 0,301-0,130 C15 0,262 0,328 0,335 0,584 0,518 0,062-0,079 0,184-0,081-0,095 Değişken PC11 PC12 PC13 C3 0,319 0,079 0,153 C4-0,115-0,005-0,229 C5-0,327-0,119 0,307 C6 0,121 0,108-0,192 C7 0,164 0,165-0,041 C8-0,361-0,620 0,230 C9-0,387 0,638-0,082 C10 0,212-0,280-0,379 C11 0,566-0,095 0,116 C12-0,164 0,134 0,235 C13 0,176 0,156 0,266 C14-0,183-0,135-0,640 C15-0,023-0,048 0,196 45

58 Bu çizelge ilk üç temel bileşenin spektrumdaki absorbans değişmesinin %100 ü kadarından sorumlu olduğunu bize göstermektedir. Bu nedenle regresyon işlemi ilk üç bileşen esas alınarak yapılabilir. Yinede yapılan tez çalışmasında diğer veriler de kullanılarak regresyon eşitliği türetilmiş ve türetilen regresyon eşitlikleri aşağıda verildi. CEzetimib = 2, ,181 C3-0,744 C4-13,11 C5 + 15,58 C6 + 0,3105 C7-23,93 C8+ 28,47 C9-5,897 C10 + 7,403 C11-21,37 C12-0,1922 C13 CRosuvastatin = 1, ,264 C3-0,467 C4-13,15 C5 + 11,36 C6-12,23 C7 + 9,72 C8+ 10,25 C9-6,622 C10 + 0,7373 C11-20,68 C12+ 13,37 C Yöntemin Validasyonu PCR yöntemini validasyonu için Ezetimib 0,64-1,60 μg/ml aralığında, Rosuvastatin de 0,48-1,20 μg/ml çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde olmak şartıyla 12 adet yapay karışım çözeltisinden oluşan bir set hazırlandı. Bu validasyon seti üzerinden hazırlanan PCR kalibrasyonunun kesinlik ve doğruluğu verileri test edildi. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için hazırlanan bu validasyon seti Çizelge 4.13 de, iki boyutlu düzlemdeki validasyon grafiği ise Şekil 4.6 da verildi. Geri kazanım (GK) değerleri; Ezetimib için % 99,99 ve Rosuvastatin için % 100,05 olarak bulundu. Standart sapma değerleri Ezetimib için % 0,0052, Rosuvastatin için ise % 0,0264 olarak hesaplandı. PCR kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.4 de gösterildi. 46

59 Rosuvastatin Çizelge 4.3. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için validasyon seti Validasyon Seti Karışım Ezetimib(µg/mL) Rosuvastatin(µg/mL) Mix 1 0,64 0,72 Mix 2 0,64 0,96 Mix 3 0,64 1,20 Mix 4 0,96 0,48 Mix 5 0,96 0,96 Mix 6 0,96 1,20 Mix 7 1,28 0,48 Mix 8 1,28 0,72 Mix 9 1,28 1,20 Mix 10 1,60 0,48 Mix 11 1,60 0,72 Mix 12 1,60 0,96 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 Ezetimib Şekil 4.6. Ezetimib ve rosuvastatin analizi için iki boyutlu düzlemdeki validasyon grafiği 47

60 Çizelge 4.4. Ezetimib ve Rosuvastatin sentetik karışımlarına PCR validasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Karışım (µg/ml) Bulunan (µg/ml) Geri kazanım (%) Ezetimib Rosuvastatin Ezetimib Rosuvastatin Ezetimib Rosuvastatin 0,64 0,72 0,7204 0, , ,0514 0,64 0,96 0,9603 0, , ,0342 0,64 1,20 1,2003 0, , ,0217 0,96 0,48 0,4804 0, , ,0893 0,96 0,96 0,9603 0, , ,0289 0,96 1,20 1,2002 0, , ,0190 1,28 0,48 0,4804 1, , ,0894 1,28 0,72 0,7203 1, , ,0440 1,28 1,20 1,2002 1, , ,0164 1,60 0,48 0,4804 1, , ,0736 1,60 0,72 0,7203 1, , ,0423 1,60 0,96 0, , , ,0238 x = 99, ,0445 SS = 0,0052 0,0264 PCR yönteminin doğruluk ve kesinliğinin validasyonunu sağlamak için gün içi ve günler arası kesinlik ve doğruluk çalışmaları kalibrasyon setinin içinde olacak şekilde üç farklı konsantrasyonda (Ezetimib için 0.64, 0.96 ve 1.28 μg/ml ve Rosuvastatin için 0.48, 0.72 ve 0.96 μg/ml ) ve her derişim için altı farklı çözelti kullanılarak aynı gün içinde ve günler arasında hazırlanan çözeltiler kullanılarak yapıldı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5 de verildi. 48

61 Çizelge 4.5. PCR validasyon yönteminin Ezetimib ve Rosuvastatin analizi için kesinlik ve doğruluk test sonuçları Gün İçi (n=6) Konulan (μg/ml) Ezetimibe Ezetimib Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,64 0,48 0,6402 2,94E-03 2,94E-05 0, ,036 0,96 0,72 0,9603 2,99E-04 2,99E-06 0, ,027 1,28 0,96 1,2803 5,81E-04 5,81E-06 0, ,022 x 100,028 SS 0,0071 BSS 7,06E-05 LOD 0,0233 LOQ 0,0706 Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,4813 3,98E-02 3,97E-04 0, ,264 0,7213 4,54E-02 4,53E-04 0, ,182 0,9613 3,16E-02 3,16E-04 0, ,140 x 100,196 SS 0,0631 BSS 6,30E-04 LOD 0,2083 LOQ 0,

62 Günler Arası (n=6) Konulan (μg/ml) Ezetimib Ezetimib Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,64 0,48 0,6399 3,23E-05 3,23E-07-0,019 99,9808 0,96 0,72 0,9599 5,58E-05 5,58E-07-0,015 99,9855 1,28 0,96 1,2798 6,46E-05 6,46E-07-0,012 99,9878 x 99,9847 SS 0,0035 BSS 3,54E-05 LOD 0,0117 LOQ 0,0354 Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,4804 4,39E-05 4,38E-07 0, ,084 0,7203 3,50E-05 3,50E-07 0, ,046 0,9603 5,00E-05 5,00E-07 0, ,029 x 100,053 SS 0,0282 BSS 2,80E-04 LOD 0,0932 LOQ 0,2824 GK: Geri kazanım BSS: Bağıl standart sapma SS: Standart sapma BH: Bağıl hata x = Ortalama 50

63 Yöntemin ANOVA Testi PCR kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek için üç farklı konsantrasyonda, (Ezetimib için 0,64; 0,96 ve 1,28 μg/ml ve Rosuvastatin için 0,48; 0,72 ve 0,96 μg/ml ) her derişim için altı farklı numuneden elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulandı ve sonuçlar Çizelge 4.6 ve 4.7 de verildi. Çizelge 4.6. PCR kalibrasyonunda Ezetimib aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları ANOVA Varyans Kaynağı SS df MS F P-değeri F ölçütü Gruplar Arasında 1,37E ,37E-07 9,82E-07 0,9993 4,3010 Gruplar İçinde 3, ,1396 Toplam 3, Çizelge 4.7. PCR kalibrasyonunda Rosuvastatin aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları ANOVA Varyans Kaynağı SS df MS F P-değeri F ölçütü Gruplar Arasında 5,77E ,77E-07 7,35E-06 0,9979 4,3010 Gruplar İçinde 1, ,0785 Toplam 1,

64 ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulundu. Varyans analizinde iki adet serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=22. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğundan dolayı kullanılan kalibrasyon modelinin ticari numunelerin incelenmesinde kullanılabilir olduğu anlaşıldı Yöntemde İstatistiksel Analiz Kalibrasyonun Standart Hatası Ezetimib ve Rosuvastatin etken bileşenlerini sentetik karışımlarda bu ilaç etken maddelerin miktar tayini için PCR kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares PRESS) minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PCR kalibrasyonunda PRESS değeri Ezetimib ve Rosuvastatin için sırasıyla 3, ve 1, olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırır ve elde edilen PRESS değerleri yeterince küçüktür. Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC), gerçek ve tahmini derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve bu değerler Ezetimib ile Rosuvastatin için sırasıyla 1, ve 3, olarak bulundu. Gerçek ve tahmini derişim için lineer regresyon analiz sonuçları Ezetimib için Şekil 4.7 de ve Rosuvastatin için ise Şekil 4.8 de verilmiştir. 52

65 Tahmini Rosuvastatin Derişimi (ppm) Tahmini Ezetimib derişimi (ppm) 1,8 1,6 1,4 y = 1x + 3E-05 R² = 1 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ,5 1 1,5 2 Gerçek Ezetimib Derişimi (ppm) Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında Ezetimib için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar 1,4 1,2 y = 0,9999x + 3E-05 R² = 0, ,8 0,6 0,4 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Gerçek Rosuvastatin Derişimi (ppm) Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında Rosuvastatin için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar 53

66 Yöntemin Ticari Numunelere Uygulanması PCR yönteminin ticari ilaç numunelerine uygulanmasında 20 şer tablet ilaç alınarak doğru bir şekilde tartılmıştır. Elimizdeki ilaç etken maddelerin her ikisini kombine biçimde içeren ilaçlar eczanelerin sisteminde görülmesine rağmen piyasada bulunmadığından dolayı elimizdeki etken maddeleri ayrı ayrı içeren ticari numuneler alınıp laboratuar ortamında karıştırılarak deneyin ilaç kısmına devam edilmiştir. Elimizdeki ticari tabletlerde bulunan etken madde değerleri EZETROL için 10 mg Ezetimib ve CRESTOR için 10 mg Rosuvastatindir. Elimizdeki ticari numuneler havanda iyice toz edilip karıştırıldı. Ezetimib (99,1 mg) ve Rosuvastatinin (153,3 mg) her birinin 1 er tabletinin ağırlığına karşılık gelen miktarlar alındı ve 200 ml lik balon joje içinde üzerine bir miktar metanol eklenerek yaklaşık 55 dakika manyetik karıştırıcıda ayrı ayrı karıştırıldı. Son hacimler 250 ml ye tamamlandı. Çözelti daha sonra süzüldü ve süzgeç kâğıdında kalan kısım 4 kez 15 ml metanol ile yıkanarak hacim 100 ml ye tamamlandı ve daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 5,0 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm de açıklanan PCR algoritması uygulanmış ve ticari ilaç numunesindeki içeriğindeki Ezetimib ve Rosuvastatin miktarları hesaplandı. Bu işlem 6 kez tekrarlandı ve sonuçlar Çizelge 4.8 de gösterilmiştir. 54

67 Çizelge 4.8. Ticari ilaç numunesine PCR kalibrasyon yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar. Deney No Ezetimib Rosuvastatin 1 9,94 10,01 2 9,95 10,02 3 9,94 10,04 4 9,95 10,00 5 9,92 10,02 6 9,91 10,03 7 9,88 9,99 x = 9,93 10,02 SS= 0,026 0,017 BSS = 0,003 0,002 % BH = -0,72 0,17 GA( P= 0,05)= x ±0,02(9,90-9,95) x ±0,02(10,00-10,03) Orijinal Absorpsiyon Spektrumu - Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (OAS - PLS) Bölüm de ayrıntılı olarak algoritması verilen kısmi en küçük kareler yönteminde Çizelge 4.2 de hazırlanan kalibrasyon seti kullanıldı. Ölçümler nm arasında yapıldı ve daha sonra bu aralık kalibrasyon seti için, kullanılacak olan istatistik programı doğrultusunda dalga boyu aralığı nm olarak daraltıldı. PLS kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin nm dalga boyu aralığında Δλ= 0,1 nm de bir olmak üzere bu noktalara karşılık gelen 1001 noktada absorbans okunmuştur. Kullanılan istatistik program ile kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin Varyans - kovaryans matriksleri hesaplanmıştır. Derişimler arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PLS kalibrasyonu kurulmuştur. 55

68 Ticari ilaç aktif bileşenlerini içeren ticari ilaç numunesinde de yukarıda belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak PLS kalibrasyonunda bu maddelerinin miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir Yöntemin Validasyonu PLS yöntemini valide etmek için Ezetimib için 0,64-1,60 μg/ml ve Rosuvastatin için 0,48-1,20 μg/ml çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 12 adet yapay karışım çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlanmıştır. Çizelge 4.9. Ezetimib ve Rosuvastatin sentetik karışımlarına PLS validasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri Karışım (µg/ml) Bulunan (µg/ml) Geri kazanım (%) Ezetimib Rosuvastatin Ezetimib Rosuvastatin Ezetimib Rosuvastatin 0,64 0,72 0,6396 0, , ,0311 0,64 0,96 0,6405 0, , ,9583 0,64 1,20 0,6401 1, , ,9613 0,96 0,48 0,9597 0, , ,0434 0,96 0,96 0,9600 0, , ,1245 0,96 1,20 0,9601 1, , ,0778 1,28 0,48 1,2797 0, , ,8016 1,28 0,72 1,2808 0, , ,9385 1,28 1,20 1,2794 1, , ,8891 1,60 0,48 1,6001 0, , ,0858 1,60 0,72 1,6002 0, , ,0183 1,60 0,96 1,5998 0, , ,0506 x = 100, ,9984 SS = 0,0424 0,

69 Hazırlanan validasyon seti (Çizelge 4.3.) kullanılarak kurulan PLS kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir. Geri kazanım (GK) değerleri; Ezetimib için % 100,0005 ve Rosuvastatin için % 99,9984 olarak bulundu. Standart sapma değerleri Ezetimib için % 0,0424 Rosuvastatin için ise % 0,0921 olarak hesaplandı. PLS kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.10 da gösterilmiştir. Çizelge PCR validasyon yönteminin Ezetimib ve Rosuvastatin analizi için kesinlik ve doğruluk test sonuçları Gün içi (n=6) Konulan (μg/ml) Ezetimibe Ezetimib Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,64 0,48 0,6401 1,00E-03 1,00E-05 0, ,0190 0,96 0,72 0,9598 7,00E-04 7,00E-06-0,016 99,9837 1,28 0,96 1,2800 7,72E-04 7,72E-06-0,003 99,9970 x 99,9998 SS 0,0177 BSS 1,80E-04 LOD 0,0583 LOQ 0,1767 Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0, ,0873 8,72E-04-0, ,0730 0, , ,31E-04-0,004 99,9328 0, , ,47E-04 0, ,9918 x 99,9761 SS 0,0704 BSS 7,00E-04 LOD 0,2322 LOQ 0,

70 Günler arası (n=6) Konulan (μg/ml) Ezetimibe Ezetimib Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,64 0,48 0,6401 0,0729 7,29 E-04 0, ,0080 0,96 0,72 0,9600 0,0002 2,03E-06-0, ,9952 1,28 0,96 1,2800 0,0612 6,12 E-04-0, ,9961 x 99,9998 SS 0,0071 BSS 7,13E-05 LOD 0,0235 LOQ 0,0713 Rosuvastatin Bulunan SS %BSS %BH %GK 0,4799 0,1533 0,0015-0, ,9770 0,7200 0,0501 0,0005-0, ,9960 0,9604 0,0833 0,0008 0, ,0445 x 99,9761 SS 0,0348 BSS 0,0004 LOD 0,1149 LOQ 0,3481 GK: Geri kazanım SS: Standart sapma x = Ortalama BSS: Bağıl standart sapma BH: Bağıl hata 58

71 Yöntemin ANOVA Testi PLS kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulandı. Sonuçlar Çizelge 4.11 ve Çizelge 4.12 de gösterildi. Çizelge PLS kalibrasyonunda Ezetimib aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları ANOVA Varyans Kaynağı SS df MS F P-değeri F ölçütü Gruplar Arasında 8,88E ,88E-16 6,36E-15 0,9999 4,3010 Gruplar İçinde 3, ,1396 Toplam 3, Çizelge PLS kalibrasyonunda Rosuvastatin aktif maddesi için ANOVA testi sonuçları ANOVA Varyans Kaynağı SS df MS F P-değeri F ölçütü Gruplar Arasında -4,44E ,44E-16-5,65E-15 0,9999 4,3010 Gruplar İçinde 1, ,0785 Toplam 1,

72 ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=28. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir olduğuna karar verilmiştir Yöntemin İstatistiksel Analizi Kalibrasyonun Standart Hatası Ezetimib ve Rosuvastatin içeren karışımlarda bu ilaç aktif maddelerin miktar tayini için PLS kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares PRESS) minimal değerleri elde edildi. Kurulan PLS kalibrasyonunda PRESS değeri Ezetimib ve Rosuvastatin için sırasıyla 3, ve 4, olarak hesaplandı. İstatistikte PRESS değerinin sıfıra yakın olması durumu doğruluk derecesini arttıran bir sonuç olduğu için elde edilen PRESS değerleri yeterince küçük olduğu sonucuna ulaşıldı. Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration SEC), gerçek ve tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve Ezetimib ve Rosuvastatin için sırasıyla 1, ve 5, olarak bulundu. Gerçek ve tahmin edilen derişim için lineer regresyon analiz sonuçları Ezetimib için Şekil 4.9 da ve Rosuvastatin için Şekil 4.10 da verildi. 60

73 Tahmini Rosuvastatin Derişimi (ppm) Tahmini Ezetimib Derişimi (ppm) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,99998x + 0,00002 R² = 0, ,5 1 1,5 2 Gerçek Ezetimib Derişimi (ppm) Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında Ezetimib için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,9996x + 0,0003 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Gerçek Rosuvastatin Derişimi (ppm) Şekil PLS kalibrasyon basamağında Rosuvastatin için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar 61

74 Yöntemin Ticari Numunelere Uygulanması PLS yönteminin ticari ilaç numunelerine uygulanmasında 20 şer tablet ilaç alınarak doğru bir şekilde tartılmıştır. Elimizdeki ilaç etken maddelerin her ikisini kombine biçimde içeren ilaçlar eczanelerin sisteminde görülmesine rağmen piyasada bulunmadığından dolayı elimizdeki etken maddeleri ayrı ayrı içeren ticari numuneler alınıp laboratuar ortamında karıştırılarak deneyin ilaç kısmına devam edilmiştir. Elimizdeki ticari tabletlerde bulunan etken madde değerleri EZETROL için 10 mg Ezetimib ve CRESTOR için 10 mg Rosuvastatindir. Elimizdeki ticari numuneler havanda iyice toz edilip karıştırıldı. Ezetimib (99,1 mg) ve Rosuvastatinin (153,3 mg) her birinin 1 er tabletinin ağırlığına karşılık gelen miktarlar alındı ve 200 ml lik balon jojede üzerine bir miktar metanol eklenerek yaklaşık 55 dakika manyetik karıştırıcıda ayrı ayrı karıştırıldı. Son hacimler 250 ml ye tamamlandı. Çözelti daha sonra süzüldü ve süzgeç kâğıdında kalan kısım 4 kez 15 ml metanol ile yıkanarak hacim 100 ml ye tamamlandı ve daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 5,0 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm de açıklanan PLS algoritması uygulanmış ve ticari ilaç numunesi içeriğindeki Ezetimib ve DOM' un derişim değerleri hesaplanmıştır. Bu işlem 6 kez tekrarlanmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.13 de verilmiştir. 62

75 Çizelge Ticari ilaç numunesine PCR kalibrasyon yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar. Deney No Ezetimib Rosuvastatin 1 10,00 9,84 2 9,75 10, ,16 10, ,66 9, ,20 9,98 6 9,43 10,78 7 9,81 9,88 x = 10,00 10,06 SS = 0,393 0,588 BSS = 0,039 0,058 % BH = 0,015 0,639 GA( P= 0,05)= x ±0,36(9,64-10,37) x ±0,54(9,52-10,61) 63

76 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Geçmişten günümüze canlılar çeşitli hastalıklarla mücadele etmişlerdir. Bu mücadelenin en büyük yardımcısı ilaçlar olmuştur. Bu ilaçlar ilk olarak bitkisel kaymaklı olsa da daha sonraları bu ilaçların yerini laboratuar koşullarında üretilen sentetik materyaller almıştır. İlaçlar genel olarak canlı organizmasında ihtiva ettikleri etken kimyasallar sayesinde hastalıklarla savaşabilmektedir. Bu etken maddeler tezin giriş kısmında da belirtildiği gibi belirtilen doz aşamasında vücuda alındıklarında canlı bünyesinde olumlu etki gösterirken aşırı dozda alınması durumunda tehlikeli boyutlarda zararlar veren kimyasal maddelerdir. Bu sebepten ötürü bilimde ilaç analizlerinde daha çok etken madde analizi çok önemli bir yer tutmaktadır. Bu gibi analizlerde genel olarak spektroskopik ve kromatografik yöntemler tercih edilmesine rağmen pahalı yöntemler olması ve çok uzun süren ön ayırma işlemleri bu yöntemlerin kullanımını sınırlamaktadır. Saf maddeler ile yapılan deneyler sonucunda optimum şartlar belirlenmiş ve daha sonra numune çalışmalarına geçilmiştir. İlaç ham maddelerinin bir arada tayini için PCR ve PLS kemometrik yöntemleri geliştirilmiştir. PCR ve PLS için geri kazanım miktarları bulunmuştur. Bu tez kapsamında geliştirilen çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri daha kolay uygulanabilirlikleri, hızlı ve ekonomik olmalarıyla birlikte tekrar edilebilir, kesin, doğru ve güvenilir sonuçları vermeleri nedeniyle ezetimib ve rosuvastatinin ticari ilaç örneklerinden analizi için bu tez çalışmasını orijinal kılmaktadır. Tez kapsamında geliştirilen ve başarılı bir şekilde ezetimib ve rosuvastatin içeren ticari ilaç analizine uygulanan çok değişkenli kalibrasyonların kemometrik yöntemleriyle son derece başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Geliştirilen bu kalibrasyon yöntemleri analiz işlemlerinde son derece hızlı, kolay uygulanabilir ve ekonomiktir. Kemometrik yöntemler, kromatografik yöntemlerle karşılaştırıldığında yukarıda sayılan avantajları yanında herhangi bir ön ayırma işlemi kullanmaksızın kombine ticari ilaç örneklerinin analizinde karşılaştırılabilir sonuçlar bulunması yönünden de avantajlıdır. 64

77 6. KAYNAKLAR Jain, N., Jain, R., Swami, H. and Jain, D. K., RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Simvastatin and Ezetimibe in Bulk Drug and its Combined Dosage Form, Asian J. Research Chem. 1(1): July-Sept. 2008; s Rahman, M., Parveen, G., Nyola, N.K., Khan, S., Talegaonkar, S., Shahar yar, M. and Khar, R.K., Simultaneus Estimation of Simvastatin and Ezetimibe in Pharmaceutical Tablet Dosage Forms by RP-HPLC: A Reviev, International Journal of Pharma Research and Development 2010 s Kancherla, P., Velpuri, V., Alegete, P., Albaseer, S.S., Khagga, M., Das, P., LC MS/MS characterization of the forced degradation products ofezetemibe: Development and validation of a stability-indicating UPLC method, Journal of Taibah University for Science 10 (2016) s Sistla, R., Tata, V.S.S.K., Kashyap, Y.V., Chandrasekar, D., Diwan, P.V., Development and validation of a reversed-phase HPLC method for the determination of ezetimibe in pharmaceutical dosage forms, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39 (2005) s Chitravathi, S., Reddy, S. Swamy, B.E.K. Electrochemical determination of ezetimibe by MgO nanoflakes-modified carbon paste electrode, Journal of Electroanalytical Chemistry 764 (2016) 1 6 Kumar, B. P., Vidyadhara, S., Murthy, T.E.G.K., Rao, B. V. and Nikhila, V., A Novel Reverse Phase Liquid Chromatographic Method Development and Vlidation for the Simultaneous Estimation of Atorvastatin, Ezetimibe and Fenofibrate in Bulk and Tablet Dosage Form, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2016; Vol. 7(10): Jain, N., Jain, R., Swami, H., Padey S., and Jain, D. K., International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol. 1, Issue 1, July-Sep. 2009, s

78 Hafez, E.M., El Shiekh, R., Alaa Amin, S., and Gouda, A. A., Validated Spektrophotometric Metods for Estimation Ezetimibe in Pure and Dosage Forms, Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2016, s Kumar, D. A., Sujan, D. P., Vijayasree, V., and Seshagiri, R. J. V. L. N., Simultaneous Determination of Simvastatin and Ezetimibe in Tablets by HPLC, E-Journal of Chemistry 2009, 6(2), Özaltın, N., Uçaktürk, E., Simultaneous Determination of Ezetimibe and Simvastatin in Pharmaceutical Formulations by Dual-Mode Gradient LC, Chromatographia Supplement Vol. 66, 2007 s Ashfaq, M., Khan, I.U., S. Qutab, S., Razzaq, S. N., HPLC Determination of Ezetimibe and Simvastatin in Pharmaceutical Formulations, J. Chil. Chem. Soc., 52, Nº 3 (2007) s Seshachalam U., & Kothapally C.,B. HPLC Analysis for Simultaneous Determination of Atorvastatin and Ezetimibe in Pharmaceutical Formulations, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 31:5, (2008) , Balaji, S., and Sunitha, A., Development and Validation of Spektrophotometeric Method for Simultaneus Determination of Simvastatin and Ezetimibe in Tablet Formulations, Pak. J. Pharm. Sci., Vol.23, No.4, October 2010, pp Jahangiri, A., Adibkia, K., Asadpour-Zeynali, K., Javadzadeh, Y., Hamishehkar, H., Barzegar-Jalali, M., Application of Multivariate Calibration Methods, in Dissolution Testing and Simultaneous Determination of Atorvastatin and Ezetimibe in Their Combined Solid Dosage Form, Pharmaceutical Sciences, June 2016, 22, Rajput, S.J, and Raj, H.A, Simultaneous Spectroscopic Estimation of Ezetemibe and Simvastatin in Tablet Dosage forms, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 2007 page MEREY, G., İlaç Kimyası ve Endüstriyel Uygulamaları Ders Notları 66

79 Yang, Y.J., Lee, S.H., Kim, B.S., Cho, Y.K., Cho, H.J., Cho, K.I., Kim, S.Y., Ryu, J.K., Cho, J.M., Park, J.I., Park, J.S., Park, C.G., Chun, W.J., Kim, M.A., Jin, D.K., Lee, N., Kim, B.J., Koh, K.K., Suh, J., Lee, S.H., Lee, B.K., Oh, S.J., Jin, H.Y., Ahn, Y., Lee, S.G., Bae, J.H., Park, W.J., Lee, S.C., Lee, H.C., Lee, J., Park, C., Lee, B., and Jang, Y., Combination Therapy of Rosuvastatin and Ezetimibe in Patients with High Cardiovascular Risk, Clinical Therapeutics/Volume 39, Number 1, 2017, page Mukthinuthalapati, M.A., Bukkapatnam, V., Bandaru, S.P.K., Stability Indicating Liquid Chromatographic Method for the Simultaneous Determination of Rosuvastatin and Ezetimibe in Pharmaceutical Formulations, Advanced Pharm Bull, 2014, 4(4), Gündüz, T., İnstrümental Analiz, Gazi Kitabevi 5. Baskı, Ankara 1999, sayfa Pekin, E., Enstrümental (Aletli) Analiz, Paradigma Akademi Yayınları 1. Baskı, Şubat 2013, sayfa 51-70, Dinç, E., Kemometri Çok Değişkenli Kalibrasyon Yöntemleri, Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi, Cilt 27 / Sayı 1 / Ocak 2007 / ss Dinç, E., 2009, Kemometrik İşlem ve Yöntemlerin Analitik Kimyadaki Tipik Uygulamaları, Uygulamalı Kemometri Yaz Okulu Notları,

80 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Ümit UÇAR Doğum Yeri ve Yılı : Bursa-1992 Medeni Hali Yabancı Dili E-posta : Bekar : İngilizce : ucarumit92@gmail.com Eğitim Durumu Lise Lisans : Dörtçelik ATL-2010 : SDÜ, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü Yayınları AKTAŞ, A. H., UÇAR, Ü., Spectrometric Determination of Rosuvastatin and Ezetimibe in Tablets by Multivariate Calibration Approach, JOURNAL OF SCIENTIFIC PERSPECTIVES, April 2018, UÇAR, Ü, AKTAŞ, A, H, Kolesterol Tedavisinde Kullanılan Bazı İlaç Etken Maddelerin Kemometrik Yöntemlerle Tayini (sözlü sunum), 1st INTERNATIONAL HEALTH SCIENCE AND LIFE CONGRESS (IHSLC 2018) May 2018, AKTAŞ, A, H, UÇAR, Ü, Bazı Benzoik Asit Türevlerinin UV-Spektroskopisi Yöntemiyle Kemometrik Analizleri (poster sunumu), 1st INTERNATIONAL HEALTH SCIENCE AND LIFE CONGRESS (IHSLC 2018) May