KARIŞIM DNA PROFİLLERİNİN İNCELENMESİ VE YORUMLANMASI

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KARIŞIM DNA PROFİLLERİNİN İNCELENMESİ VE YORUMLANMASI Emel YARDIMCI DİSİPLİNLER ARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Birsen KAPLAN ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KARIŞIM DNA PROFİLLERİNİN İNCELENMESİ VE YORUMLANMASI Emel YARDIMCI DİSİPLİNLER ARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Birsen KAPLAN ANKARA

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller vii Çizelgeler ix 1. GİRİŞ Karışım DNA Profili Karışımların Deşifre Edilmesinde Yüksek Derecede Polimorfik Markırların Değeri Floresan Ölçümlerinden Alınan Miktar Bilgisi Karışımların Yorumlanması Karışım Örnekleri Karışım DNA Profillerinin Yorumlanmasını Etkileyen Faktörler Stutterlar Null Alleller (Allel Drop-out) Pull-up Maskeleme Etkisi Genetik Anomaliler Karışım DNA Profillerinin Değerlendirilmesinde Y-STR Markırlarının Yeri Karışım Bileşenlerini Deşifre Etmek İçin Kullanılan Yazılımlar Amaç GEREÇ VE YÖNTEM Gereçler Analiz Örnekleri Kullanılan Araç ve Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Yöntem Örneklerin Alınması DNA İzolasyonu Örneklerin DNA Miktar Tayini Karışım Çeşitlerinin Planlanması Stok Örneklerin DNA Amplifikasyonu (PCR) ve Tiplendirmesi Karışım Çeşitlerinde Kullanılacak Donörlerin Belirlenmesi Karışım Örneklerinin Konsantrasyonlarının Belirlenmesi Karışım Oranlarının Belirlenmesi Karışım Konsantrasyonları ve Oranlarını Oluşturmak İçin Yapılan İşlemler 33

4 iv XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Konsantrasyon Gruplarının Hazırlanması XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Karışım Oranı Gruplarının Hazırlanması XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Tüm Karışım Örneklerinin Amplifikasyonu ve Tiplendirilmesi XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Konsantrasyon Gruplarının Hazırlanması XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Karışım Oranı Gruplarının Hazırlanması XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Tüm Karışım Örneklerinin Amplifikasyonu ve Tiplendirilmesi XY-XY Karışım Çeşidi Altındaki Örnekler İçin Yapılam İşlemler BULGULAR XX-XX Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi XX-XY Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi XY-XY Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi Stutter Piklerin Karışım DNA Profillerini Değerlendirme Üzerine Etkisi TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 76 ÖZET 81 SUMMARY 82 KAYNAKLAR 83 EKLER 87 ÖZGEÇMİŞ 89

5 v ÖNSÖZ Karışım DNA profillerinin incelenmesi ve yorumlanması, adli DNA analiz çalışmalarında önemli bir yere sahiptir. Tek kaynaklı DNA profillerinin incelenmesinden daha fazla deneyim gerektiren bir konu olduğu için üzerinde özellikle durulması gerekmektedir. Bu çalışma ile, söz konusu incelemelerin yapılması sırasında karşılaşılan güçlüklerin çözümü açısından konuya bilimsel yönden katkıda bulunulması amaçlanmıştır. Bu çalışmada, bana her konuda yardımcı olan Sayın Prof.Dr. Tülin SÖYLEMEZOĞLU na, bilgi ve deneyimleri ile bana yardımcı olan ve beni destekleyen tez danışmanım Sayın Doç.Dr. Birsen KAPLAN a, elde edilen verilerin istatistiksel analizlerini yapan Sayın Doç.Dr. Cemal ATAKAN a, yüksek lisansa başlamam için beni yüreklendiren kurum amirim Sayın M. Cem ÇUBUK a, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım çalışma arkadaşlarım Uzm. Bio. Fazilet BAYRAK ve Uzm.Bio. Seher ALTUNBAŞ a, her konuda bana destek olan eşim M. Mustafa YARDIMCI ve evde çalışmama mani olmayan kızım İrem YARDIMCI ile bu çalışma için gönüllü olarak biyolojik örneklerini veren donörlere teşekkür eder, saygılarımı sunarım.

6 vi SİMGELER VE KISALTMALAR ABD Amerika Birleşik Devletleri bp Baz çifti (Base pair) CODIS Birleştirilmiş DNA İndeks Sistemi (Combined DNA Index System) DNA Deoksiribonükleik asit FSS Adli Bilim Servisi (Forensic Science Service) LMA Linear Mixture Analysis LSD Least Squares Deconvolution M Kütle ml Mililitre µl Mikrolitre NEST NIJ Expert System Testbed ng Nanogram NIJ National Institute of Justice PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) pg Pikogram RFLP Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) RFU Bağıl Floresan Birimi (Relative Fluorescence Unit) rpm Dakikadaki Dönüş Sayısı (Rounds Per Minute) SDS Sequence Detection System STR Kısa Ardışık Tekrar (Short Tandem Repeat) V Hacim VNTR Değişken Sayıda Ardışık Tekrar (Variable Number Tandem Repeat) Y-STR Y-Kısa Ardışık Tekrar (Y-Short Tandem Repeat)

7 vii ŞEKİLLER Sayfa Şekil 1.1. Tipik tek kaynaklı (a) ve karışım (b) örneklerinde pik örneklerinin gösterilişi. 8 Şekil 1.2. Karışımların yorumlanmasındaki basamaklar. 10 Şekil 1.3. Bir adli olayda kadın ve erkeğe ait DNA ları birlikte içeren bir karışım örneğinin görüntüsü. 13 Şekil 1.4. Üç pik içeren 2:1 oranlı karışım kombinasyonları için beklenen pik profilleri. 17 Şekil 2.1. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0.02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:1 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. 36 Şekil 2.2. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0.02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:2 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. 37 Şekil 2.3. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0.02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:16 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. 37 Şekil 2.4. XX-XX karışım çeşidi altında 2 ng/µl konsantrasyondaki 1:32 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. 38 Şekil 2.5. XX-XX karışım çeşidi altında 0.06 ng/µl konsantrasyondaki 1:32 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. 39 Şekil 3.1. XX-XX karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki. 49 Şekil 3.2. XX-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki. 54 Şekil 3.3. XY-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki. 58

8 viii Şekil 3.4. Şekil 3.5. Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Şekil Şekil E/D, 1:8, 2 ng/µl örneğinin D21S11 bölgesi. D/E, 1:8, 2 ng/µl örneğinin D21S11 bölgesi. D/E, 1:8, 1 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. D/E, 1:8, 1 ng/µl örneğinin D18S51 bölgesi. E/D, 1:8, 0.5 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. E/D, 1:16, 0.5 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. E/D, 1:16, 0.5 ng/µl örneğinin D18S51 bölgesi. D/E, 1:32, 0,5 ng/µl örneğinin vwa bölgesi. Sayfa

9 ix ÇİZELGELER Sayfa Çizelge , 3 ve 4 allel pik durumları için kombinasyon çiftleri. 11 Çizelge 1.2. DNA nın çeşitli miktarları ile birlikte muhtemel Amelogenin X ve Y allel pik oranları. 12 Çizelge 1.3. Dört gen bölgesi için pik bilgileri ve bunlar kullanılarak elde edilen diğer bilgiler. 14 Çizelge 1.4. Bıçaklı saldırı olayında olay yeri ve referans örneklerinden elde edilen DNA profilleri. 18 Çizelge 2.1. Real-Time PCR tekniği ile çalışmada kullanılan izolatlardan ölçülen DNA miktarları. 29 Çizelge 2.2. Çalışmada numuneleri kullanılan donörlerin cinsiyetleri. 30 Çizelge 2.3. XX-XX, XX-XY ve XY-XY karışım çeşitlerinin oluşturulmasında kullanılan donörler, DNA ların karıştırılması ile ortaya çıkan bölge sayısı ve görüldüğü gen bölgeleri. 31 Çizelge 2.4. XX-XX, XX-XY ve XY-XY karışım çeşitleri için belirlenen karışım konsantrasyonları. 32 Çizelge 2.5. Karışım çeşitleri altındaki konsantrasyonların herbiri için uygulanacak karışım oranları. 32 Çizelge 2.6. XX-XX karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında D ve E donörlerine ait stok DNA örneklerine uygulanan dilüsyon işlemleri. 34 Çizelge 2.7. D ve E donörlerinin dilüye edilmiş DNA örnekleri ile planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. 35 Çizelge 2.8. XX-XY karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında A donörüne ait stok DNA örneğine uygulanan dilüsyon şekilleri. 40

10 x Sayfa Çizelge 2.9. A ve E donörlerinin DNA örnekleriyle planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. 40 Çizelge XY-XY karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında A ve B donörlerine ait stok DNA örneklerine uygulanan dilüsyon şekilleri. 41 Çizelge A ve B donörlerinin DNA örnekleri ile planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. 42 Çizelge 3.1. XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. 45 Çizelge 3.2. XX-XX karışım çeşidi altındaki örneklerde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. 48 Çizelge 3.3. XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. 50 Çizelge 3.4. XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 numunenin Amelogenin bölgelerinde beklenen ve gözlenen karışım oranları. 52 Çizelge 3.5. XX-XY karışım çeşidi altındaki örneklerde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. 54 Çizelge 3.6. XY-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. 55 Çizelge 3.7. XY-XY karışım çeşidi altındaki örneklerde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. 58

11 1 1. GİRİŞ Başlangıçta anne, baba ve çocuk arasındaki bağlantıyı ortaya çıkarmak için geliştirilen bir yöntem olan DNA (Deoksiribonükleik asit) analiz testlerinin adlî alanda kullanımı ilk kez 1986 yılında olmuştur ve 1986 yıllarında Lynda Mann ve Dawn Ashworth adlarındaki iki genç kız, tecavüze uğradıktan sonra acımasızca öldürülmüştür. Her iki cinayet İngiltere nin Leicestershire şehrinin Narborough köyü yakınlarında gerçekleşmiştir. Polis, her iki cinayetteki benzerliklerden dolayı olayın aynı kişi tarafından gerçekleştirildiğinden şüphelenmiştir. Bir şüpheli, kızlardan birini öldürdüğünü itiraf etmiş ve şüphelinin kanı olay yerinin etrafında bulunan semen ile mukayese edilmiştir. Bu kişinin her iki öldürme olayı ile ilişkili olmadığı bulunmuştur. Böylece DNA kullanımı ile bir kişinin mahkûm olması engellenip, o kişinin masum olduğu ilk kez gösterilmiştir. Bir başka olayda, cinayet soruşturması sırasında DNA testi için üç köyde bulunan bütün yetişkin erkeklerin kanları toplanmıştır den fazla erkeğin DNA testi sonucunda olay yeri ile benzerlik bulunmamıştır. Yaklaşık 1 yıl sonra bir kadın barda Colin Pitchfork adındaki bir adamın kan örneğini nasıl bir başka arkadaşına verdirdiğini övünerek anlattığını duymuştur. Polis, Pitchfork a ulaşmış ve kan örneği alınmıştır. Pitchfork un DNA profili her iki ölüm olayındaki semenden elde edilen DNA profili ile uyuşmuştur. Sonrasında Pitchfork suçlu bulunmuş ve ömür boyu hapse mahkûm edilmiştir. Alec Jeffrey, bu olayların çözümlenmesinde ilk kez 1985 yılında tanımladığı DNA tiplendirme metodlarını (çok-lokuslu RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysim-Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi) problarını) kullanmıştır. Bu metodların yaklaşık 25 yıl önce ilk kez kullanılmasından sonra, DNA testleri oldukça gelişmiş ve suçluyu adalete teslim etmek ve suçsuzu temize çıkarmak için etkili olmuştur.

12 2 Bilimsel delillerin hâkimler tarafından kabul edilebilir olması için genel olarak iki standart vardır: Bunlar; isimlerini Amerika da 1923 ve 1993 yıllarında meydana gelen Frye ve Daubert olaylarından alan Frye Standardı ve Daubert Standardı dır. Frye Standardına göre, adlî delillerin kabul edilebilmesi için adlî delillerin ait oldukları özel alanlarda genel kabul gördüğü yeterince kanıtlanmalıdır. Daubert Standardına göre ise, deliller yeterli bilimsel geçerliliğe sahip olmalı ve delillerin konu ile ilgili doğruluğu ve güvenilirliği bilimsel bilgi ile desteklenmelidir. New York un Castro bölgesindeki halk, bir öldürme olayında DNA delillerinin kabul edilebilirliğine ilk kez topluca karşı çıkmıştır. New York Yüksek Mahkemesinde yargılama öncesindeki duruşmada, davalının saati üzerindeki kan örneğinden şüphelenilmiştir. Mahkeme, DNA kimliklendirme teorisinin pratik olduğuna ve tekniklerin genel olarak bilimsel topluluklarca kabul edildiğine karar vermiştir. Mahkeme yargılama öncesindeki duruşmada laboratuvar yöntemlerinin bilimsel standartlarla bir düzen içinde olmasını ve jürinin kararı için güvenilir sonuçlar sunmasını istemiştir. Uzman tanıklığı laboratuvarın genel olarak kabul gören teknikleri yapamadıklarını göstermiş, bununla birlikte laboratuvar yöntemlerinden kuşkulanılmıştır. Güvenilir teknikler saat üzerindeki kanın, kurbana ait olduğunu kanıtlamıştır. Ancak, mahkeme DNA testlerini hariç tutmayı tercih etmiştir. New York Yüksek Mahkemesi kararına göre, gelecekte keşfedilecek ilerleme aşamalarının ihtiyaçları belirlenerek, savunma ve mahkeme için tüm laboratuvar sonuçlarının ve raporlarının kopyalarının tedarik edilmesini kapsayan, istatistiksel olasılık hesaplamalarını açıklayan, incelenen tüm hataları ya da laboratuvar yanlışlarını açıklayan, ayrıntılı analizler sonucunda DNA delil olarak kabul edilebilmiştir.

13 li yılların sonu 1990 lı yılların başında DNA delillerinin kabul edilebilirliğinde birçok hukuki değişiklikler gerçekleşmiştir. DNA delillerinin kabul edilebilirliğindeki en önemli husus toplama ve analiz etme aşamasında ortaya çıkmıştır. DNA delillerinin kabul edilemez olduğu durumda, DNA profillerinin yorumlanmasının geçerliliği (doğruluğu) ya da DNA profillerini elde ederken kullanılan tekniklerin geçerliliği ile laboratuvarın güvenilirliğinin ya da analiz yapan teknisyenin performansının güvenilirliği konuları yeniden gözden geçirilmiştir. Yaklaşık yirmi beş yıldır kriminal sistemlerin her alanında kullanılan DNA teknolojisi her geçen gün ilerleme göstermektedir. DNA kimliklendirmede kullanılan metodların (VNTR (Variable Number of Tandem Repeat-Değişken Sayıda Ardışık Tekrar) lokuslarında RFLP tekniğinin kullanılması ve STR (Short Tandem Repeat- Kısa Ardışık Tekrar) lerde PCR (Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve sekanslama tekniklerinin kullanılması) güvenilirliğinin sorgulanması, DNA delillerinin kabul edilebilirliğine karşı çıkmayı savunmak için avukatlara fırsat vermektedir li yıllarda, mahkemelerce DNA delillerinin güvenilir ve kabul edilebilir olduğu defalarca desteklenmiştir (Çelebioğlu, 2011). STR ler genomda ardarda tekrar eden nükleotid dizileridir. Bu dizilerin biyolojik fonksiyonu ve önemi halen bilinmemesine rağmen adli amaçlı olarak kişileri birbirinden ayırmaya yarayan son derece değerli bölgelerdir. Tüm insanlarda aynı tekrar dizileri bulunur ancak, bu dizilerin tekrar sayıları kişiden kişiye çeşitlilik gösterir (Filoğlu, 2008). Günümüzde, STR adı verilen genetik işaretleyiciler (markırlar), sonuçlarını yorumlaması kolay olduğu, az miktarda DNA ya ihtiyaç duyduğu, düşük kalitedeki DNA kalıpları ve yapısı bozulmuş (degrade) DNA örneklerinde başarılı olduğu, PCR temelli olduğu, ayrım güçleri yüksek olduğu ve çalışma süresini kısalttığı için, DNA tiplendirmede popüler hale gelmişlerdir (Krenke ve ark., 2002). STR tiplendirme metodları, bilim adamlarının verileri hızlı bir şekilde toplayabilmelerine olanak sağlayan tekniklerle çalışmaktadır ve otomasyona uygundur. Çok sayıda gen bölgesi

14 4 ile çalışıldığında, STR ler kişiye ait olan ve olmayan biyolojik örnekleri ayırmada kullanılır. Yukarıda da bahsedildiği gibi, genetik markırların kullanımı birçok suç çeşidi için, faillerin kimliklendirilmesinde veya yanlışlıkla suçlanan şüphelilerin beraat etmesinde son derece değerli kanıtlar sağlamaktadır. Fakat, biyolojik örneklerdeki genetik profillerin yorumlanması, materyal birden fazla kişiye ait örneği birlikte içeriyorsa komplike bir iş olabilmektedir (Weir ve ark., 1997; Andrade ve ark., 2006; Wickenheiser, 2006) Karışım DNA Profili Çalışılmakta olan bir biyolojik örnekte, eğer iki ya da daha fazla kişiye ait numune birarada bulunuyor ise karışım DNA profili ortaya çıkmaktadır (Clayton ve ark., 1998). Bu durum özellikle cinsel saldırı olaylarında yaygın olarak görülmektedir. Bu olaylarda örnek, mağdurdan gelen materyal ile birlikte failden gelen materyali de içeriyor olabilir (Weir ve ark., 1997). Karışımlara diğer birçok olayda da sıklıkla rastlanabilmektedir. DNA karışımı içindeki hacimce büyük olan bileşene majör bileşen, küçük olan bileşene ise minör bileşen denir (Buckleton ve ark., 2007). Karışım içindeki bileşenler eğer elde referans DNA profilleri var ise ve bu profil karışım içinde yer alıyorsa biliniyor demektir. Ancak elde referans profil yok ise bilinmeyen bir karışım söz konusudur (Lauritzen ve Mortera, 2002). En az iki bileşen içeren karışım DNA örneklerinin çoğunlukla olay yerinden elde edilmekle birlikte, gerekli tedbirler alınmadığı takdirde olay yeri incelemesi yapan personel ya da laboratuvar personeline ait biyolojik örneklerin incelenen biyolojik örnekler ile teması ile de oluşabileceği göz ardı edilmemelidir (Torres ve ark., 2003; Gill ve ark., 2006).

15 5 Günümüzde floresan ölçümlerine dayalı PCR teknolojisinin hassasiyeti ve DNA profil analizleri için kullanılan genetik analizör cihazlarının hassasiyetinin artması, karışım DNA profilleri ile daha fazla karşılaşılmasına yol açarken (Wickenheiser, 2006) karışım DNA profilleri içindeki minör bileşenin görülebilmesi kabiliyetini de arttırmaktadır (Torres ve ark., 2003; Butler, 2005; Andrade ve ark., 2006; Morling ve ark., 2007). Karışım DNA profillerinin tespit edilmesi ve yorumlanması, deneyim ve dikkatli bir eğitim olmadan zor olabilir (Ladd ve ark., 2001; Butler, 2005; Wickenheiser, 2006). Karışım DNA profilleri kavramı literatürde karışımlar (mixtures) olarak geçtiği için, bu dokümanın bundan sonraki bölümlerinde karışım DNA profili yerine karışım ifadesi de kullanılacaktır Karışımların Deşifre Edilmesinde Yüksek Derecede Polimorfik Markırların Değeri Bir karışımın tespit edilebilme olasılığı, daha çok lokusun ve heterozigotların daha yüksek etkisine sahip genetik markırların kullanımı ile artar. Tekli bir örnek içindeki çoklu bir DNA kaynağının tespiti, her bir kaynaktan gelen mevcut DNA nın oranına, genotiplerin spesifik kombinasyonlarına ve amplifiye olmuş toplam DNA miktarına bağlıdır. Başka bir ifade ile bazı karışımlar diğerleri kadar kolaylıkla tespit edilemeyebilir (Butler, 2005). Birçok olası allel içeren, yüksek derecede polimorfik STR markırlarının kullanımı, bir karışımın iki komponenti arasındaki farklılıkları görme şansını arttırır. Örneğin TPOX markırı sadece 15 bilinen allel içerirken, D18S51 markırı 51 olası allele sahiptir. Bu da D18S51 i karışımların tespiti için daha faydalı bir markır yapmaktadır. Aynı şekilde, multipleks (çoklu) STR amplifikasyonu kullanarak daha

16 6 fazla markırın incelenmesi, bir karışımdaki bileşenlerin gözlenme şansını arttırır (Butler, 2005). Karışım içindeki her bir bileşenin miktarı, karışım örneğinin tüm bileşenlerini tespit etme yeteneğinde bir fark oluşturur. Örneğin, eğer iki DNA kaynağı aynı miktarda ise bunun tespiti, bileşenlerden birinin çok, birinin az olduğu durumların tespitinden daha kolaydır. Karışımın minör bileşeni, karışım oranı %5-10 dan veya 1:20 oranından düşükse genellikle tespit edilemez (Cotton, 1995; Aşıcıoğlu, 2002; Buckleton ve ark., 2007). Güvenilir bir genotip sonucu elde edebilmek için AmpFlSTR kitleri, minör bileşen miktarının 35 pg ın üzerinde olmasını tavsiye etmektedir (Applied Biosystems, 1998) Floresan Ölçümlerinden Alınan Miktar Bilgisi DNA profillerini tespit etmek amacıyla kullanılan genetik analizör cihazlarında DNA profili içindeki alleller yazılım tarafından grafik şeklinde gösterilir. Grafiğin X ekseninde fragman uzunluğu pik şeklinde Y ekseninde ise floresan derecesi [RFU (Relative Fluorescent Unit-Bağıl Floresan Birimi)] yer alır. Bu grafiğe elektroferogram denmektedir (Clayton ve ark., 1998; Cowel ve ark., 2007). Genetik analizör cihazları kullanılarak elde edilen bir elektroferogramdan miktar bilgisi elde etme kabiliyeti, STR allellerinin bağıl pik yükseklikleri ve alanlarının ölçülebilmesine olanak sağlar. Bu pik bilgileri daha sonra, karışım bileşenlerinin olası genotiplerini deşifre etmek için kullanılabilir. Piklerdeki şekil varyasyonlarına bağlı olarak, allel pik bilgileri karşılaştırılırken hem pik alanları, hem pik yükseklikleri kullanılabilmektedir (Gill ve ark., 1998; Buckleton ve ark., 2007). Karışım yorumlanmasında birçok laboratuvarda pik yükseklikleri başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (Butler, 2005).

17 Karışımların Yorumlanması Karışım olmayan profillerin davranışları anlaşılmadan karışımların yorumlanmasında aşama kaydedilemez. Potansiyel bir karışımı yorumlamadan önce pik alanları ve onlara ait pozisyonları açısından heterozigotların ve stutterlerın (gölge bantların) niteliklerini bilmek önemlidir (Gill ve ark., 1998). Heterozigot bir gen bölgesinde 2 allel bulunmaktadır. Mükemmel bir heterozigot bölgede iki allel için allel pik alanlarının oranları aynı (1:1) olmalıdır. Fakat ölçüm hataları veya PCR reaksiyon verimindeki ufak farklılıklar, heterozigotlar için gözlenen pik alanları arasında tespit edilebilir bir fark yaratabilir (Gill ve ark., 1997). Bir gen bölgesinde heterozigot dengesi, küçük pik yüksekliğinin büyük pik yüksekliğine bölünmesiyle elde edilen değere göre belirlenir. Elde edilen değer 1 e ne kadar yakınsa pikler o kadar dengelidir (Bright ve ark., 2010). Stutter, ilgili olduğu allelden 1 tekrar ünitesi ya da 1 bp (base pair) daha kısa olan ve amplifikasyon işlemi sırasında Taq enziminin hatası sonucunda oluşan bir üründür. Ayrıca pik alanı açısından daima ilgili olduğu pikten daha küçüktür (Gill ve ark., 1997; Clayton ve ark., 1998). Şekil 1.1. de tipik tek kaynaklı örnekler ile karışım örneklerinin STR profilleri ile nasıl ayrılabildiği görülmektedir. Heterozigot örnekler için STR allel pik örnekleri, gerçek allel pik yükseklik veya alanının %15 inden daha küçükse genellikle stutter ürünlerdir (Clayton ve ark., 1998; Gill ve ark., 2006). Ayrıca tek kaynaklı bir örnekte, RFU değerince düşük pikin yüksekliğinin büyük olanınkine bölünmesiyle elde edilen pik yükseklik oranı, yaklaşık %70 den büyük olmalıdır (Gill ve ark., 1997; Gill ve ark., 2008a). Böylece, eğer pik, belirli bir STR lokusundaki (gen bölgesindeki) pik yüksekliklerinin %15-%70 bölgesinin arasında kalırsa, iki ya da daha fazla bileşenli bir karışım örneği varlığı muhtemeldir. Tek bir lokusta üç ya da daha fazla allel gözlenmesi, bir karışım varlığına dair güçlü bir göstergedir (Butler, 2005).

18 8 Heterozigot pik Karışım bölgesi Stutter bölgesi Tipik stutter ürününden yüksek (> %15) Heterozigot partner allelleri ile normalden daha küçük görünen pik alanı (< %70) Tipik stutter ürün oluşumu için hatalı allel bölgesi Şekil:1.1. Tipik tek kaynaklı (a) ve karışım (b) örneklerinde pik örneklerinin gösterilişi (Butler, 2005). Bir karışımın mevcudiyetine karar vermeye yardımcı olacak birçok ipucu bulunmaktadır. Aşağıdaki sorulara verilen cevaplar, karışım DNA profilinin kompozisyonunu oluşturan genotiplerin araştırılmasına yardımcı olabilir: Beklenen allel uzunluğu skalasında ikiden fazla pik gözlenen lokuslar var mı? Bir lokusta heterozigot alleller arasında pik yüksekliği bakımından dengesizlikler var mı? Stutter ürünler normal olmayan yüksekliklerde görülüyor mu? (örneğin %15-20 den daha büyük oranda) Eğer bu üç sorunun herbirine evet cevabı veriliyorsa o zaman bir karışım örneğinden kaynaklanan DNA profili söz konusu olabilir (Butler, 2005).

19 9 Genellikle bir karışım, öncelikle bir ya da daha fazla lokusta, üç ya da daha fazla pik varlığı ile tanımlanır (Gill ve ark., 2006). Tek bir lokusta, iki kaynaktan gelen DNA içeren bir örnek, aşağıda listelenen genotip kombinasyonları doğrultusunda bir, iki, üç ya da dört pik gösterebilir: Dört pik Heterozigot + Heterozigot, üst üste binen allel yok (genotipler ayrı) Üç pik Heterozigot + Heterozigot, bir üst üste binen allel Heterozigot + Homozigot, üst üste binen allel yok (genotipler ayrı) İki pik Heterozigot + Heterozigot, üst üste binen allel (genotipler aynı) Heterozigot + Homozigot, bir üst üste binen allel Homozigot + Homozigot, üst üste binen allel yok (genotipler ayrı) Bir pik Homozigot + Homozigot, üst üste binen allel (genotipler aynı) (Butler, 2005)

20 10 Şekil 1.2. de karışımların yorumlanması için kullanılan 6 temel basamak gösterilmektedir. Basamak-1 Karışım Varlığını Tanımlama Basamak-2 Allel Piklerinin Belirlenmesi Basamak-3 Potansiyel Bileşenlerin Sayısını Tanımlama Basamak-4 Karışım İçindeki Bileşenlerin Bağıl Oranını Tahmin Etme Basamak-5 Tüm Olası Genotip Kombinasyonlarını Düşünme Basamak-6 Referans Örneklerle Karşılaştırma Şekil:1.2. Karışımların yorumlanmasındaki basamaklar (Butler, 2005). Bir karışım tanımlandıktan ve tüm allelleri isinlendirildikten sonraki basamak (Basamak 3) potansiyel bileşenlerin sayısını tanımlamaktır. İki kişilik karışım için, eğer her iki birey de söz konusu lokus için heterozigotsa o bölgede 4 allel görülecek ve üstüste binen allel olmayacaktır. Bu nedenle bir lokusta dörtten fazla allel görülmesi halinde, ikiden fazla bireyin olduğu kompleks bir karışım varlığı muhtemeldir. Neyse ki adli vakalarda ikiden fazla bireye ait profilin birarada bulunduğu karışımlara daha az sıklıkla rastlanılmaktadır (Gill ve ark., 1998; Clayton ve ark., 1998; Butler, 2005). Karışımlarda her bir bileşenin oranı birbirine eşit olabilir ya da arasında büyük farklar da bulunabilir (Clayton ve ark., 1998). Karışımlardaki bu oran

21 11 çeşitliliği genellikle 1:1, 1:5 gibi bir oran formatında gösterilir. Karışımlardaki hedef DNA ların oranı PCR amplifikasyonu boyunca da korunur ve PCR sonrası da aynı oran ortaya çıkar (Gill ve ark., 1998; Clayton ve ark., 1998). Böylece bir elektroferogramda gözlenen pik alanları ve yükseklikleri, çoğu olayda, karışım içindeki bileşenlerin hedef DNA miktarları ile ilişkilidir (Butler, 2005). Karışım oranına en iyi şekilde, profile bir bütün olarak bakılarak ve her bir lokustan elde edilen bilgiler değerlendirilerek karar verilebilir. Karışım bileşenlerinin oranı en kolay, bir lokusta paylaşılan allel olmadığında tespit edilebilir. Bu nedenle, karışımın iki bileşeni olduğunda, bunların bağıl oranını tahmin etmek için, bir başlangıç noktası olarak dört allel içeren lokuslar öncelikli olarak incelenmelidir (Butler, 2005). Ancak bir gen bölgesi için tespit edilen karışım oranının diğer heterozigot bölgelerde de görülmesi gerektiği düşünülmemelidir. Yani lokus içinde gözlenen oran lokuslar arasında gözlenmeyebilir. Ardı ardına amplifikasyonlar arasında belirgin bir fark olabilir (Clayton ve ark., 1998). Paylaşılan alleller olduğunda, oranı belirlemek daha zor bir iştir. Çünkü gözlenen pik durumlarını açıklayan birden fazla olası allel kombinasyonu bulunabilir (Clayton ve ark., 1998; Butler, 2005). Çizelge 1.1. de 2, 3 ve 4 allel pik durumları için olası kombinasyonlar listelenmiştir. Bir lokusta dört allel için üç olası kombinasyon çifti, üç allel için altı olası kombinasyon çifti ve iki allel için dört olası kombinasyon çifti bulunmaktadır (Butler, 2005). Çizelge , 3 ve 4 allel pik durumları için kombinasyon çiftleri (Butler, 2005). Dört pik (A, B, C, D) Üç pik (A, B, C) İki pik (A, B) A,B C,D A,A B,C A,A A,B A,C B,D B,B A,C A,B A,B A,D B,C C,C A,B A,A B,B A,B A,C A,B B,B B,C A,C A,B B,C Cinsiyet belirleyici markır olan Amelogenin, genetik olarak normal kadın ve erkek birey bileşenlerini deşifre etmek için etkin bir markırdır. Çizelge 1.2. de bazı

22 12 kadın ve erkek karışım oranları için beklenen X ve Y allel pik oranları listelenmiştir. Amelogenin X ve Y pik alanları, karışımdaki majör bileşenin kadın ya da erkek olduğunu belirlemede özellikle faydalıdır (Butler, 2005). Çizelge 1.2. DNA nın çeşitli miktarları ile birlikte muhtemel Amelogenin X ve Y allel pik oranları (Butler, 2005). Karışım Oranı Allel Kombinasyonu X:Y Pik Alanlarının Oranı Dişi (X,X) Erkek (X,Y) X Y X:Y : : : : : : : ,7: ,5: ,4: ,2: ,1:1 Karışımın incelenmesinde bir sonraki adım, her lokustaki olası genotip kombinasyonlarını düşünmektir (Basamak 5). Bu aşamada eğer elde referans örneği var ise olay yeri profillerini referans örnekten yararlanarak çıkarıp karşılaştırmak nispeten kolaydır ancak bu yaklaşım tavsiye edilmemektedir. Karışımın yorumu referans profil bilgisi göz önüne alınmadan yapılmaya çalışılmalıdır (Gill ve ark., 1998; Clayton ve ark., 1998). Bunun için her bir lokustaki allel isimlerini temsil eden pikler A, B, C,... şeklinde işaretlenir. Çizelge 1.1. den olası kombinasyon çiftleri, her bir isimlendirilmiş pikin pik alanları kullanılarak düşünülür. İncelenen örnek için daha önceden hesaplanan karışım oranı bilgisi ışığı altında, farklı lokuslardaki allellerin her bir özel kombinasyonu düşünülür. Bu şekilde adım adım tüm lokuslar incelenerek majör ve minör bileşenlerin genotipleri deşifre edilmeye çalışılır. Şekil 1.3. te gösterilen örnekte ve Çizelge 1.3. te bu hesaplamalardan bazıları gösterilmiştir (Butler, 2005).

23 13 D3S1358 VWA FGA blue panel mavi panel Bağıl Floresans Üniteleri Amel D8S1179 D5S818 D21S11 D13S317 yeşil green panel panel D18S51 sarı panel yellow panel D7S820 Şekil 1.3. Bir adli olayda kadın ve erkeğe ait DNA ları birlikte içeren bir karışım örneğinin görüntüsü (Butler, 2005).

24 14 Çizelge 1.3. Dört gen bölgesi için pik bilgileri ve bunlar kullanılarak elde edilen diğer bilgiler (Butler, 2005). Lokus Bileşen Allel Adı Pik Alanı Muhtemel Kombinasyon Karışım Oranı A B+C/A+D= D21S11 B C D AD BC 29, , / = 2.3 ~ 2:1 A B D18S51 C D D8S1179 A B C AC BD 12,16 14,17 AA BC, BB AC, CC AB, AB AC, BC AC, AB BC B+D/A+C= / = 1.8 ~ 2:1 X X Amelogenin Y Y X:1Y X/Y=15957/751 2= 2.1 ~ 2:1 Bir karışımın yorumlanmasındaki son basamak, karışımın olası komponentleri için elde edilen genotipleri, referans örneklerin genotipleri ile karşılaştırmaktır (Basmak 6) (Clayton ve ark., 1998). Bir cinsel saldırı olayında söz konusu referans örneği şüpheli ya da mağdura ait olabilir. Eğer şüpheliye ait DNA profili karışımdaki majör ya da minör bileşenlerden biri ile eşleşiyorsa o zaman bu şahıs karışım içindeki olası bileşen olarak dışlanamaz (Butler, 2005) Karışım Örnekleri İncelenecek olan karışım örneği ile Şekil 1.2. de gösterilen basamakların bir karışımın yorumlanmasında nasıl kullanıldığı gösterilmektedir. Şekil 1.3. te tipik olarak bir cinsel saldırı olayında görülebilecek kadın ve erkek DNA kombinasyonu içeren karışım örneği gösterilmektedir. Karışım için STR markırları, her bir STR

25 15 markırının daha iyi görülebilmesi için işaretleme boyasının rengine göre üç panele ayrılmıştır (Butler, 2005). Bu örnekte yapılacak ilk şey, lokusların çoğunda ikiden fazla pik bulunup bulunmadığına bakmaktır. Örneğin D3S1358 lokusu dört, vwa lokusu üç pik içermektedir. Ayrıca Amelogenin lokusunda X ve Y allelleri arasında bir dengesizlik bulunmaktadır (Butler, 2005). Karışım varlığının belirlenmesinden sonra alleller tespit edilir. Her bir lokusta en fazla dört pik olduğu için bu örnek için ikiden fazla bileşen bulunma ihtimali yoktur. İsimlendirilmiş her bir allel, A, B, C ve D harfleri ile işaretlenir. Bu evrensel gösterim karışım hesaplamalarının geri kalanı boyunca olası allel kombinasyonlarını yazmak için kullanılır (Butler, 2005). Bu karışım örneğinin bileşenleri olan bireylerin bağıl oranları, dört pik içeren lokusların incelenmesi ile tahmin edilir. Şekil 1.3. te yeşil panelde bulunan STR verileri Çizelge 1.3. te pik alanları ile birlikte verilmiştir. D21S11 ve D18S51 lokuslarında dörder pik bulunmaktadır. D21S11 lokusunda A ve D allelerinin pik alanları birbiriyle, B ve C allellerinin de pik alanları birbiriyle benzer olduğu için, veriyi açıklayan en iyi olası allel kombinasyonunun AD ve BC olduğu farzedilebilir. Aynı şekilde D18S51 lokusunda A ve C allelleri benzer pik alanlarına sahiptir ve birlikte gruplandırılabilir. Bu lokus için en iyi olası allel kombinasyonu AC ve BD dir (Çizelge 1.3.) (Butler, 2005). D21S11 allelleri için karışım oranı 2,3, yaklaşık olarak 2:1 olarak hesaplanır. Hesaplamada büyük allelerin (B ve C) pik alanları toplamı, küçük allellerin (A ve D) pik alanları toplamına bölünür. Böylece bu karışımda majör bileşen miktarının minör bileşen miktarına göre 2 kat fazla olduğu anlaşılır. Aynı yaklaşım kullanılarak D18S51 lokusu için karışım oranı 1,8, yaklaşık olarak 2:1 olarak hesaplanır. (Çizelge 1.3.) Bu karışım oranları, stutter ürünlerin etkisi ve heterozigot pik alanlarının dengesizlikleri gibi faktörlere bağlı olarak her zaman doğru olmayabilir (Butler, 2005).

26 16 Dört allel gözlenen lokuslar için karışım oranlarını hesaplamak bir ya da daha fazla allelin paylaşıldığı lokuslardaki oranı hesaplamaktan daha kolaydır. Bu örnekte D8S1179 lokusu böyle bir durum sergiler. Söz konusu lokusta üç pik bulunmaktadır ve bu piklerden biri hem majör bileşen hem de minör bileşenden gelmiştir. Bu arada gözlenen veriye en iyi şekilde uyan her bir olası allel kombinasyonu dikkatli bir şekilde düşünülmelidir (Butler, 2005). 2:1 oranında karışım içeren ve üç pik gözlenen lokuslarda beklenen pik şekilleri Şekil 1.4. te gösterilmiştir. D8S1179 için gözlenen veri BC ve AC allel kombinasyonları senaryosuna uymaktadır. Burada BC majör bileşene aittir. Bu durumda C veya 14 alleli paylaşılmaktadır. D8S1179 lokusunda majör bileşenin genotipi 12,14 iken minör bileşeninki 10,14 olacaktır (Butler, 2005). Bu karışım örneğinde majör bileşen karışımdaki kadın DNA sından 2 kat daha fazla olan erkek DNA sıdır. Bu gerçek, X ve Y alleleri incelenerek ve Çizelge deki bilgilerle karşılaştırılarak da belirlenebilir. Bu nedenle bu örnekte, majör bileşenin erkek olduğu ve bunun D21S11 deki allelerinin 30,32.2, D18S51 deki allellerinin 14,17 ve D8S1179 daki allellerinin 12,14 olduğunu çözmek mümkündür. Yukarıda tanımlanan şekilde bütün lokuslar gözden geçirildiğinde majör ve minör bileşenlerin genotip profilleri ortaya koyulabilir (Butler, 2005). Karışım oranları her zaman, özellikle de bileşenler arasında paylaşılan alleller bulunduğunda, her lokusta tam ve güvenli bir şekilde hesaplanamayabilir (Butler, 2005).

27 17 1= majör bileşen 2= majör bileşen Şekil 1.4. Üç pik içeren 2:1 oranlı karışım kombinasyonları için beklenen pik profilleri (Butler, 2005). Evett ve arkadaşlarının (1998) yapmış oldukları bir vaka çalışmasında, Lisa ve Pauline isimli iki kız kardeşin bıçaklı saldırıya uğradığı olayda olay yeri kan lekelerinden ve kız kardeşlerden elde edilen DNA örneklerinin D18S51, D21S11, TH01, D8S1179, FGA, vwa ve Amelogenin gen bölgeleri çoğaltılarak tiplendirilmiştir. Tiplendirme sonucu Çizelge 1.4. te verilmiştir.

28 18 Çizelge 1.4. Bıçaklı saldırı olayında olay yeri ve referans örneklerinden elde edilen DNA profilleri (Evett ve ark., 1998). Numune D18 D21 TH01 D8 FGA vwa Lisa 12,15 59,61 9,9.3 13,13 22,24 15,17 Pauline 12,15 59,61 9,9.3 8,13 22,24 15,17 Leke-1 12,15-9,9.3 13,13 22,24 15,17 Leke-2 12,15-9,9.3 8,13 22,24 15,17 İlk bakışta Çizelge 1.4. ten 1 nolu leke örneğinin Lisa ya 2 nolu leke örneğinin ise Pauline e ait olduğu düşünülmektedir. Halbuki çalışmada D8S1179 gen bölgesindeki 8 ve 13 allellerinin pik alanları arasında önemli fark olduğu (313 RFU ve 1955 RFU) görülmüştür. Bu bölgeden yararlanarak 2 nolu leke örneğinin aslında Pauline e ait olmadığı Lisa ve Pauline e ait DNA ların karışımını içerdiği tespit edilmiştir (Evett ve ark., 1998). Bu örnekten anlaşılacak önemli noktalar bulunmaktadır: Birincisi, ne kadar çok gen bölgesi ile çalışılırsa karışımları tespit etmek o kadar kolaylaşır (örnekte Amelogeninle birlikte 7 gen bölgesi mevcut). Bu örnekte eğer D8S1179 bölgesi çalışılmamış olsaydı karışım farkedilemezdi. İkincisi, çalışılan gen bölgeleri ne kadar bilgi verici olursa (heterozigotluk oranları ne kadar yüksek olursa) karışım yine o kadar kolay tespit edilir. Üçüncüsü, aralarında yakın akrabalık ilişkisi bulunan bireylerde ortak allel bulunma olasılığı artacağı için böyle karışımların tespit edilmesinde çok sayıda ve bilgi verici gen bölgesi ile çalışmanın yanı sıra elde mutlaka referans örneğinin bulunmasının önemli olduğu da görülmektedir Karışım DNA Profillerinin Yorumlanmasını Etkileyen Faktörler Karışım DNA profillerinin yorumlanması, biyolojik ve teknolojik artefaktların da iyi bilinmesini gerektirmektedir. Bahsi geçen biyolojik artefaktlardan bazıları stutter ürünler ve null alleller (allel drop out)dir. Ayrıca üç allellilik durumu gibi trizomi ile sonuçlanan kromozomal anomaliler veya belli kromozomal bölgelerin dublikasyonu gibi durumlar meydana gelebilir. Aynı zamanda bazen spesifik olmayan amplifikasyon ürünleri meydana gelebilmektedir (Butler, 2005). Teknolojik

29 19 artefaktlar arasında da pull-up pikleri sayılabilir. Bu yüzden bir karışım profilini deşifre etmeye kalkarken aşağıdaki ihtimallerin de göz önüne alınması gerekir (Gill ve ark., 1998). Allelik artefaktlar (stutterlar gibi) içeren profiller, Spesifik olmayan artefaktlar, Yazılım (Pull-up pikleri gibi), Maskeleme etkisi (farklı bireylerden gelen allellerin baskılanması), Bir allelin amplifikasyonunun engellenmesi (primer bağlanma gölgesinin mutasyonu sebebiyle), Bir allelin amplifikasyonunun artması (yan bölgenin mutasyonu sebebiyle), Trizomi, translokasyon ve somatik mutasyon gibi genetik fenomenlerin bir sonucu olarak oluşan çok pikli ya da dengesiz profiller Stutterlar Normalde artefaktların büyük çoğunluğunun allel olmadığı mantıksal olarak bakıldığında anlaşılmaktadır. Ancak stutterlar bunun dışında kalmaktadır (Gill ve ark., 1998). Stutter ürünler, karışımların yorumlanmasında ve uygun allellerin dizaynında en büyük problemlerden biridir. Stutter pikleri, minör bileşenden gelen pikler ile karıştırılarak karışımların yanlış yorumlanmasına sebebiyet verebilir (Gill ve ark., 2006; Yamamoto ve ark., 2006). Bu nedenle iyi tanınmaları gerekmektedir. Stutterları dışlamak her zaman mümkün olmayabilir çünkü bunlar allelik ürünlerdir (Clayton ve ark., 1998; Butler, 2005). Tamamlanmamış tekrar üniteleri içeren gen bölgeleri için, stutter oluşum yüzdesi önemli ölçüde azalmaktadır. Dolayısıyla bu gen bölgeleri karışımların değerlendirilmesi için daha sağlıklı bilgiler verebilirler. Ayrıca pentanükleotid tekrarları içeren markırların tanıtılması ile stutter büyüklüklerinin ilgili olduğu allelin % 1-2 sine düşmesi, karışım yorumlanmasını oldukça basitleştirmiştir (Bacher ve ark., 1999; Krenke ve ark., 2002; Yamamoto ve ark., 2006).

30 Null Alleller (Allel Drop-out) Drop-out sonucu ortaya çıkan null alleller de stutterlar gibi önemli bir problemdir. Stutterlarda fazladan pik ortaya çıkarken drop-out durumunda beklenen allellerin eksik olarak gözlenmesi (null allel) söz konusudur. Örneğin bir a allelinin karışımda düşük bir yüksekliğe sahip olduğu düşünüldüğünde bunun minör bileşene ait olabileceği akla gelir. Ancak böyle bir durumda a nın kardeş allelinin de olduğu fakat drop-outa uğramış olduğu için gözlenmemiş olabileceği ihtimali de her zaman göz önünde bulundurulur (Gill ve ark., 2006). Yani minör bileşenin düşük hacimlerde olduğu karışım örneklerinde her zaman drop-outa rastlama ihtimali bulunmaktadır Pull-up Pull-up da yaygın bir problemdir. Bu, büyük bir allel pikinin altındaki farklı renkte küçük bir pik olarak tanımlanır. Tipik olarak, mavi bir pik yeşil bir piki doğrudan alt hizasına çekebilir (Gill ve ark., 1997; Gill ve ark., 1998). Pull-up piki karışım komponentlerine ait pikler ile çakıştığında sorun olur. Çünkü bu piklerin yüksekliğini arttırır ve yanlış yorumlamalara sebebiyet verebilir (Clayton ve ark., 1998) Maskeleme Etkisi Bir karışım lekenin bir ya da iki alleli paylaşan iki bileşeni bulunduğunda, alleller maskelenir ve genotip bileşenleri kolaylıkla deşifre edilemeyebilir. Örneğin, FGA lokusunda iki birey 23,24 ve 24,24 genotipine sahipse 1:1 olan karışım oranı 23 ve 24 allellerinin pik alanları için 1:3 oranını üretir. Bu özel durumda daha fazla bilgi olmadan karışım, büyük bir stutter ürününe sahip bir homozigot olarak yorumlanabilir. Fakat, paylaşılmayan allellere sahip diğer lokuslardaki STR profillerinin incelenmesiyle bu numune bileşenlerine düzgün bir şekilde ayrılabilir (Gill ve ark., 1998; Butler, 2005).

31 21 Bir multipleks içindeki her lokusta maskeleme olup olamayacağını görmek için FSS (Forensic Science Service-Adli Bilim Sevisi) tarafından yapılan bir çalışmada Kafkas veritabanındaki bireysel STR profili ile simulasyon karışımlar oluşturulmuş ve incelenmiştir (Gill ve ark., 1998). Bu çalışmada 6 STR markırından oluşan bir multiplekse karşı bu yapay karışımların çok büyük bir kısmının pik gösterdiği görülmüştür. 6 STR bölgesinde de üst üste binen alleli olmayan iki heterozigot bireyin karışımında maksimum 24 allel bulunacaktır. Böylece bu örnekte, birbiriyle ilişkisi olmayan bireyler ile oluşturulan basit karışımlarda bir çok lokusta üç ya da daha fazla allelin varlığıyla karışımlar tanımlanabilir. Yapılan eşleşme karşılaştırmasında yalnızca dört örnekte, 6 gen bölgesi içinde bir veya iki allel gözlenmiştir (Butler, 2005) Genetik Anomaliler Belirli bir STR lokusunda kromozomal anomaliler olabilir ve bunlar da ilave allel pikleri görülmesine neden olabilir. Kromozomal translokasyon, somatik mutasyonlar ve trizomiler adli bir lekenin donörünün hücrelerinde meydana gelebilir. Fakat, kromozomal anomalili bireyin STR profili, büyük olasılıkla yalnızca tek bir ilave pik gösterecektir ve hem lekede hem de şüpheliyle eşleşen referans örneğinde aynı pik paterni bulunacaktır (Clayton ve ark., 1998). Kromozomal anomalilerin en mükemmel örneği standart hücre hattı K562 de bulunmuştur. D21S11 lokusunda üç allel gözlenmiştir ve en azından diğer 5 STR bölgesinde de dengesiz heterozigot pik dağılımları görülmüştür. Böyle bir durumda ilk bakışta kromozom anomalileri içeren bir örnekten ziyade bunun bir karışım örneği olduğu izlenimi ortaya çıkabilir (Butler, 2005). Üç allellilik durumu bir çok STR lokusu için rapor edilmiştir. Aslında 13 CODIS (Combined DNA Index System-Birleştirilmiş DNA İndeks Sistemi) STR lokusu için 56 dan fazla farklı üç allellilik durumu rapor edilmiştir (Butler, 2005).

32 Karışım DNA Profillerinin Değerlendirilmesinde Y-STR Markırlarının Yeri Y-STR (Y-Short Tandem Repeat-Y-Kısa Ardışık Tekrar) ler erkek Y kromozomu üzerinde yer alan STR lerdir. Y kromozomu, cinsel suçların faillerinin belirlenmesinde, babalık davalarının sonuçlandırılmasında, evrim ve göç çalışmaları ile antropolojik çalışmalarda önemli bir rol oynamaktadır (Pestoni ve ark., 1998; Aşıcıoğlu, 2002; Demirçin, 2008). Cinsel suçlardaki kullanımı ise Y STR lerin en etkin olduğu alandır (Dekairelle ve Hoste, 2001). Y-kromozom analizleri cinsel saldırı olaylarında karşılaşılan kadın/erkek DNA karışımlarındaki erkek DNA sını tespit etmek için faydalıdır. Ayrıca azospermik ya da vazektomi uygulanmış erkeklerin semeninde spermatozoid bulunmaması nedeniyle yeterli DNA profili elde edebilmek son derece güç olmaktadır. Bu gibi vakalarda spermatozoid olmasa da Y-STR analizleri ile güvenilir ve şühelinin DNA profili ile karşılaştırılabilir nitelikte profil elde etmek mümkündür (Demirçin, 2008). Ancak karışımların tespitinde öncelikle otozomal STR ler kullanılmalıdır. Çünkü kullanımları nispeten daha kolaydır ve daha bilgi vericidirler. Ayrıca her ticari kitin bünyesinde cinsiyet belirleyici markır olan Amelogenin yer almaktadır. Bu da karışım bileşenlerinin cinsiyeti hakkında bilgi vermektedir. Dolayısıyla Y-STR analizlerine gerekli durumlarda geçilir. Y-STR lerin kullanımı, çok miktardaki kadın DNA sının erkek DNA sını baskıladığı durumlarda büyük avantaj sağlamaktadır. Otozomal STR ler ile tespit edilemeyen erkek profili Y- STR ler vasıtasıya elde edilebilir (Cerri ve ark., 2003; Demirçin, 2008). Bu kromozomun değeri; erkeğe özgü olmasının yanında üzerinde oluşan değişimlerin (mutasyon) kuşaklar boyunca korunması ve çeşitliliğinden ileri gelmektedir. Y kromozomu babadan kalıtılır. Babadan oğula değişmeden (mutasyon hariç) geçer (Pestoni ve ark., 1998; Aşıcıoğlu, 2002). Baba soyunun tüm erkek akrabaları da mutasyon hariç aynı allel kombinasyonlarına sahiptirler (Prinz ve Sansone, 2001). Bu nedenle babalık davalarında, özellikle baba adayının bulunamadığı durumlarda çocuk erkek ise baba soyundaki herhangi bir erkek

33 23 akrabanın Y-STR sonuçları olayın aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Aynı zamanda adli bir olayda şüpheliyle birlikte şüphelinin baba soyundan tüm erkek akrabalarının da dışlanmasını sağlar (Butler, 2005). Fakat dışlamanın yapılamadığı durumlarda Y-STR lerin bu özelliği dezavantaj haline dönüşmektedir. Çünkü bu durumda erkek ve o erkeğin baba soyunda gelen tüm erkek bireyler ile uyum söz konusu olur ve bu durumda mutlaka otozomal STR çalışması yapılması gerekir Karışım Bileşenlerini Deşifre Etmek İçin Kullanılan Yazılımlar Günümüzde karışım bileşenlerini deşifre etme ve karışım oranlarını bulmaya yardımcı olmak için bilgisayar programları kullanılabilmektedir. Bu programlardan bazıları LMA (Linear Mixture Analysis), LSD (Least Squares Deconvolution), PENDULUM ve istream dir ( Cowell ve ark., 2007) Amaç Her adli DNA laboratuvarının karışım DNA profillerinin yorumlanması için bir rehberinin bulunması gerekmektedir. Her ne kadar bazen karşılaşılan karışımlar eldeki rehberde geçen senaryolara uymasa da profillerin değerlendirilmesinde bir rehbere ihtiyaç duyulmaktadır (Tomsey ve ark., 2001). Laboratuvarların kullandıkları malzeme, kit ve teknik donanımlar farklı olduğundan, bir laboratuvarın hazırlamış olduğu rehber bir başka laboratuvarın işine yaramayabilir. Dolayısıyla her adli DNA laboratuvarının karışım DNA profillerinin yorumlanması konusunda kendi imkan ve kabiliyetleri doğrultusunda kendi rehberini hazırlaması gerekmektedir (Gill ve ark., 2008b). Adli DNA amplifikasyonu için üretilmiş olan bir kit olan PowerPlex 16 (Promega) kiti ilk piyasaya sürüldüğü dönemde ABD (Amerika Birleşik Devletleri) nin bir çok eyaletinde faaliyet gösteren adli DNA laboratuvarlarının ortak katılımıyla bir validasyon çalışması yürütülmüştür. Bu çalışmanın karışım DNA profilleri ile ilgili bölümünde oranları 1:19 dan 19:1 e değişen standart (tüm

34 24 laboratuvarlar için aynı) DNA karışımları kullanılmıştır. Toplam DNA 1 ng olarak ayarlanmıştır. Çalışmada laboratuvarların çoğu 1:2 ve 2:1 oranları arasındaki minör bileşen allellerini tanımlayabilmiştir. Majör-minör bileşen arasındaki hacim farkı arttıkça tespit edilen minör bileşen allellerinin oranı düşmüştür. 1:9 ve 9:1 yaklaşık %50, 1:19 ve 19:1 %17 oranında tespit edilebilmiştir. Laboratuvarların kullandıkları genetik analizör cihazlarının hassasiyeti, kullanılan DNA miktarı ve cihazların RFU limitlerinin büyük ölçüde değişkenlik gösterdiği anlaşılmıştır (Krenke ve ark., 2002). Bu da her laboratuvarın tespit limitlerinin kendine özgü olduğunu göstermektedir. Karışımlarla olan çalışmalar, STR bölgelerini içeren ticari kitlerin dahili validasyonlarının yani kullanıcı tarafından yapılması gereken validasyonun da önemli bir parçasıdır (Promega, 2008). Bir kit yeni kullanılmaya başlandığında karışım DNA profilerindeki minör bileşeni tespit başarısı kullanıcı tarafından test edilir. Bu çalışmanın amacı, bir adli DNA analiz laboratuvarında olay yeri numunelerinden karışım DNA profili elde edildiği zaman, bu profillerin incelenmesi, karışımı oluşturan bileşenlerin sayısının belirlenmesi, karışım oranının tespiti, bileşenlerin olası profillerinin tahmini konularında ve karışım içindeki minör bileşenlerin hangi orana kadar tespit edilebildiğini belirleme konusunda uzman ve uzman yardımcılarının yararlanabileceği bir rehber oluşturabilmektir. Aynı zamanda, karışım yorumlanmasını güçleştiren bazı durumların daha iyi tanınarak bunların yorumlamaya etkilerini incelemektir. Bu çalışmada aynı zamanda, karışım DNA profillerinin değerlendirilmesinde mevcut uygulaması, gözlenen karışım DNA profilindeki tespit edilmiş tüm allelleri kayıt altına almak ve bir referans örneği bulunduğunda bununla karşılaştırmak olan bir laboratuvar için, bir karışımın referans ile mukayeseye elverişli olup olmadığı da sorgulanmaya çalışılacaktır.

35 25 Yukarıda bu tür çalışmaların laboratuvara özgü olduğu belirtilmekle birlikte bu çalışmada, aynı amaçla faaliyet gösteren ve kendi rehberini oluşturmayı hedefleyen laboratuvarlara yardım için bir referans olma amacı da güdülmüştür.

36 26 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Gereçler Analiz Örnekleri Bu tez çalışması için, gönüllülük esasına göre biyolojik örnek vermeyi kabul eden şahıslardan ağız svabı numuneleri alınmıştır. Çünkü ağız svabı numunelerinden DNA izolasyonu için yapılan işlem, rutinde kullanılan diğer izolasyon yöntemlerinden daha pratiktir ve maliyeti daha düşüktür. Aynı zamanda daha az zaman almaktadır Kullanılan Araç ve Gereçler Steril pamuklu svap çubuğu M & S Bros 1,5 ml lik, 0,2 ml lik ve 50 ml lik plastik test tüpleri USA Scientific, Corning Tüp rack USA Scientific Buzlu rack USA Scientific Çeşitli hacimlerde cam mezür ve beher Duran, Marienfeld Otomatik pipetler Gilson Steril filtreli pipet uçları Gilson Dijital laboratuvar saati Roth Vorteks IKA Steril pens Aesculap Mikrosantrifüj Hermle Magnetik karıştırıcı Velp Scientifica Su banyosu Julabo Elektrikli ısıtıcı Teba Soğutucu dondurucu dolaplar Sanyo

37 27 Steril çalışma kabini Holten LaminAir 7500 Real-Time PCR System Cihazı Applied Biosystems Isı döngü cihazı (Thermal Cycler) Applied Biosystems 96 kuyucuklu optikal pleytler ve pleyt tutucu tablalar Applied Biosystems Yapışkan pleyt kaplayıcı bant Applied Biosystems 96 kuyucuklu PCR pleyti Applied Biosystems Pleyt septası Applied Biosystems Alüminyum folyo Silver Tek kullanımlık 5 ve 10 ml lik plastik pipetler Greiner Bio-One 16 kapillerli Genetik Analizör Cihazı Applied Biosystems Kullanılan Kimyasal Maddeler Steril deiyonize su Chelating resin (Chelex 100) Quantifiler Duo DNA Miktar Tayin Kiti Identifiler DNA Amplifikasyon Kiti LIZ-500 Size Standart Hi-Di Formamid 1X EDTA Buffer POP-7 Polimer %10 luk çamaşır suyu Sigma Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems ACE 2.2 Yöntem Ağız Svabı Örneklerinin Alınması Gönüllü 5 şahsın her birinden 2-3 er adet pamuklu çubuğa ağız svabı numuneleri alınmıştır. Numuneler alınırken şahıslara son 20 dakika içinde birşey yiyip içtiniz

38 28 mi? sorusu sorulmuştur. Hayır cevabı verenlerden hemen, Evet cevabı verenlerden ise ağızlarını çalkaladıktan sonra numuneler alınmıştır. Ağız svapları, sağ ve sol yanak içlerine svap çubuğu ile sürüntü yapmak suretiyle elde edilmiştir. Svap numuneleri alınır alınmaz 1,5 ml lik test tüplerine aktarılmıştır. Her bir gönüllü şahsa (donörlere) A, B, C, D ve E harfleri kullanılarak bir kod verilmiş ve bu kodlar test tüpleri üzerine de yazılmıştır. Çalışmanın ilerleyen safhalarında söz konusu kodlar kullanılmıştır DNA İzolasyonu Alınan numunelere Chelex 100 yöntemiyle (Walsh ve ark., 1991) DNA izolasyonu işlemi yapılmıştır. İşlemin basamakları aşağıdaki gibidir: -Ağız svaplarının bulunduğu tüplere 1 ml steril deiyonize su konup dakika boyunca bekletilmiş ve ara sıra titreşime tabi tutularak karıştırılmıştır. -Süre sonunda son kez karıştırılıp steril bir pens yardımıyla svaplar suyu sıkılarak tüp içinden çıkarılmış ve tüpler rpm (rounds per minute-dakikadaki dönüş sayısı) de 3 dakika santrifüj edilmiştir. -Tüpün dibinde yaklaşık 50 µl sıvı kalacak şekilde üstteki kısım pipet ucuyla çekilmiş ve kalan kısmın üzerine % 5 lik Chelex 100 solüsyonundan 150 µl eklenmiştir. -Tüpler 56 C deki su banyosunda 20 dakika bekletilmiş, süre sonunda titreşimle karıştırılarak kaynayan suda 8 dakika bekletilmiştir. -8 dakikanın sonunda tüpler tekrar karıştırılmış ve rpm de 3 dakika santrifüj edilmiştir. Üsttten 150 µl lik kısım pipet ucuyla çekilerek yeni ve temiz bir test tüpüne aktarılmıştır. DNA izolatları elde edildikten sonra aynı şahıstan alınan birden fazla numune, o şahsın kodu altında ve tek tüpte birleştirilmiştir.

39 Örneklerin DNA Miktar Tayini Karışım örneklerinin planlanmasında, elde edilen izolatlardaki DNA konsantrasyonunun bilinmesi çok önemli olduğundan, bir sonraki adımda Real-Time PCR tekniği ve Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, 2008) kullanılarak miktar tayini işlemi yapılmıştır. İşlemde 7500 Real-Time PCR System cihazı ve üzerindeki 7500 SDS (Sequence Detection System-Dizi Tespit Sistemi) software kullanılmıştır. A, B, C, D ve E ile kodlandırılan izolatlardan elde edilen DNA miktarları (konsantrasyonları) Çizelge 2.1. de verilmiştir. Çizelge 2.1. Real-Time PCR tekniği ile çalışmada kullanılan izolatlardan ölçülen DNA miktarları. Numune DNA Konsantrasyonu Kodu (ng/µl) A 2,97 B 3,06 C 2,61 D 2,87 E 5, Karışım Çeşitlerinin Planlanması Çalışma için alınan numunelerden izole edilen DNA lar kullanılarak 3 çeşit karışım hazırlanması planlanmıştır. Bunlar iki bileşen içeren karışımlardır. Adli olaylarda daha çok ikili karışımlara rastlandığı için çalışılacak numuneler aşağıdaki ikili setler şeklinde düşünülmüştür: XX-XX (Kadın-Kadın) karışımları, XX-XY (Kadın-Erkek) karışımları, XY-XY (Erkek-Erkek) karışımları. Çizelge 2.2. de ağız svapları alınan donörlerin cinsiyetleri verilmiştir.

40 30 Çizelge 2.2. Çalışmada numuneleri kullanılan donörlerin cinsiyetleri. Donör A B C D E Cinsiyeti ERKEK ERKEK KADIN KADIN KADIN Stok Örneklerin DNA Amplifikasyonu (PCR) ve Tiplendirmesi Bir sonraki basamak olarak, A, B, C, D ve E ile kodlu donörlerden elde edilen DNA lar Identifiler Amplification Kit (Applied Biosystems, 2001) ve GeneAmp PCR System 9700 (PE Biosystems) cihazı kullanılarak çoğaltılmıştır. Çoğaltılan DNA örnekleri, ABI PRISM TM 3130xl Genetik Analizörüne (Applied Biosystems) yüklenmiş ve GeneMapperID v.3.2 yazılımı kullanılarak tiplendirilmiştir Karışım Çeşitlerinde Kullanılacak Donörlerin Belirlenmesi Elde edilen DNA profilleri incelenmiş ve planlanan XX-XX, XX-XY ve XY-XY karışım çeşitlerinde hangi donör kombinasyonlarının kullanılacağına karar verilmiştir. Çalışmanın önemli bir aşaması olan karışım oranlarının hesaplanmasında, iki bileşenin de heterozigot olduğu gen bölgelerinden elde edilen bilgiler kullanıldığı için, incelemede eşleşmesinden her iki donör açısından da en fazla heterozigot bölge elde edilebilecek DNA ların hangileri olduğu dikkate alınmıştır. Çizelge 2.3. te söz konusu karışım çeşitlerinin oluşturulması için belirlenen donör çiftleri, bu donörlerin DNA larının karıştırılmasıyla gözlenecek heterozigot (4 allelli) bölgelerin sayısı ve bu durumdaki gen bölgeleri verilmektedir. Eşleşmede heterozigot allel içerecek

41 31 bölge sayısı ile birlikte çalışmanın ileri aşamalarında kullanmak üzere yeterli DNA miktarı bulunup bulunmadığı da göz önüne alınmıştır. Çizelge 2.3. XX-XX, XX-XY ve XY-XY karışım çeşitlerinin oluşturulmasında kullanılan donörler, DNA ların karıştırılması ile ortaya çıkan bölge sayısı ve görüldüğü gen bölgeleri. Karışım Çeşidi XX-XX XX-XY XY-XY Donör Çifti D-E A-E A-B Heterozigot Bölge Sayısı Heterozigot Gen Bölgeleri D16S539, D19S433, vwa, D18S51, D5S818 D8S1179, D7S820, D16S539, D2S1338, D19S433, D18S51, D5S818, FGA D21S11, D13S317, D5S818, FGA Yukarıdaki çizelgede görüldüğü gibi A ve B donörlerine ait DNA örneklerinin karıştırılmasından yalnızca 4 heterozigot bölge elde edilmektedir. Elde yalnızca 2 erkek donöre ait DNA örneği bulunduğu için ve 4 heterozigot bölge varlığının karışım oranı hesaplanmasında yeterli görülmesi nedeniyle, farklı bir erkek donör arayışına girilmemiştir. Ayrıca yine yukarıdaki çizelgede görüldüğü gibi, C donöründen elde edilen DNA örneğinin çalışmalarda kullanılmamasına karar verilmiştir. Söz konusu örneğin önceden XX-XY karışım çeşidinde kullanılması planlanmasına rağmen bu karışımdaki erkek donör ile 3 bölgede heterozigotluk göstereceğinden bu karara varılmıştır Karışım Örneklerinin Konsantrasyonlarının Belirlenmesi Karışım çeşitleri ve bunları oluşturacak donör çiftleri belirlendikten sonra, oluşturulacak karışımların konsantrasyonlarının nasıl olacağına karar verilmiştir. Çizelge 2.4. te karışım çeşitleri için planlanan karışım konsantrasyonları verilmiştir.

42 32 Çizelge 2.4. XX-XX, XX-XY ve XY-XY karışım çeşitleri için belirlenen karışım konsantrasyonları. Karışım Çeşidi Karışım Konsantrasyonları (ng/µl) XX-XX, XX-XY, XY-XY 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06; 0,02 Yukarıdaki çizelgede görüldüğü gibi karışım konsantrasyonları 6 farklı şekilde belirlenmiştir. Daha fazla sayıda planlanması, sonraki reaksiyonların sayısını arttıracağından yalnızca 6 konsantrasyon planlanmıştır Karışım Oranlarının Belirlenmesi Bir sonraki adım olarak da her bir karışım çeşidi ve bunların altındaki karışım konsantrasyonu için 6 farklı karışım oranı planlanmıştır. Çizelge 2.5. te karışım çeşitleri ve konsantrasyonları için planlanan oranlar verilmektedir. Çizelge 2.5. Karışım çeşitleri altındaki konsantrasyonların herbiri için uygulanacak karışım oranları. Karışım Çeşidi Karışım Konsantrasyonu (ng/µl) Karışım oranı XX-XX 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06; 0,02 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 XX-XY 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06; 0,02 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 XY-XY 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06; 0,02 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 Ayrıca her bir karışım çeşidi ve bunun altındaki karışım konsantrasyonları için belirlenen karışım oranları dahilinde, majör ve minör bileşenlerin yeri değiştirilerek bir grup daha karışım hazırlanmasına karar verilmiştir. Bunu açıklamak gerekirse; örneğin XX-XX karışımlarını oluşturmak için kullanılacak D ve E donörlerine ait 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06 ve 0,02 ng/µl konsantrasyonundaki DNA örnekleri 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ve 1:32 oranında öncelikle D donörü majör, E donörü minör bileşen olacak şekilde, alternatif olarak da E donörü majör, D donörü minör bileşen olacak şekilde karıştırılması planlanmıştır.

43 33 Bu şekilde aynı karışım için iki alternatif bulunduğundan her bir bölgedeki allellerin pik alan ve yükseklikleri değişeceği için, karışım DNA profillerinin incelenmesinden daha fazla bilgi elde edilebileceği umulmuştur Karışım Konsantrasyonları ve Oranlarını Oluşturmak İçin Yapılan İşlemler Bu aşamada öncelikle, A, B, D ve E donörlerine ait elde mevcut ve konsantrasyonu ölçülmüş DNA örneklerinin konsantrasyonlarını planlanan karışım konsantrasyonlarına getirmek için (karışım konsantrasyonları ile aynı olması gerektiğinden) yapılması gereken sulandırmalar (dilüsyonlar) planlanmış ve hesaplanmıştır. Çalışmada önce XX-XX karışım çeşidi için belirlenen konsantrasyon ve oranlar için hesaplamalar yapılmış ve karışımlar hazırlandıktan sonra amplifiye edilip tiplendirilmiştir. Diğer iki karışım çeşidi için planlamaların daha sonra yapılması uygun görülmüştür. Çünkü yapılacak planlamalarda ilk gruptan alınacak sonuçların yönlendirici olabileceği değerlendirilmiştir XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Konsantrasyon Gruplarının Hazırlanması Çizelge 2.6. da D ve E donörlerine ait DNA örneklerinin kullanıldığı XX-XX karışım çeşidi için stok DNA ların belirlenen konsantrasyonlara nasıl getirildiği verilmektedir. Hesaplamalarda kütle-hacim arasındaki ilişkiyi içeren M1xV1=M2xV2 formülü esas alınmıştır. Bu formül ile XX-XX karışımında kullanılan D ve E donörlerine ait stok DNA örneklerinden ne kadar alınıp üzerine su eklenerek istenen konsantrasyona getirileceği hesaplanmıştır. Yapılan hesaplardan bir örnek vermek gerekirse; D donörüne ait ve 2,87 ng/µl konsantrasyondaki stok DNA örneğini 2 ng/µl ye getirmek için: M1xV1=M2xV2, 2,87xV1=2x1 den

44 34 V1=2/2,87, V1=0,69 dur. Bulunan değer yaklaşık olarak 0,7 ye yuvarlanabilir. Yani stok DNA dan 0,7 µl alınıp üzerine de 0,3 µl su eklenip son hacim 1 µl ye tamamlanır. Çalışmalarda bu kadar küçük hacim kullanılamayacağı için, çalışmalara yetecek kadar dilüsyonlar olması gerektiği de düşünülerek alınacak DNA ve eklenecek su miktarı 150 kat arttırılmıştır. Çizelge 2.6. XX-XX karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında D ve E donörlerine ait stok DNA örneklerine uygulanan dilüsyon işlemleri. Stok DNA Donör Konsantrasyonu (ng/µl) D 2,87 E 5,32 Ayarlanacak Konsantrasyon (ng/µl) Stoktan alınacak DNA hacmi (µl) Eklenecek su hacmi (µl) ,5 97,5 0,5 25,5 124,5 0,25 13,5 136,5 0, , ,5 121,5 0,5 13,5 136,5 0,25 7,5 142,5 0,06 1,5 148,5 0,02 0,6 149, XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Karışım Oranı Gruplarının Hazırlanması Bu aşamada, D ve E donörlerinden elde edilen, belirlenmiş konsantrasyonlara getirilen DNA örnekleri kullanılarak planlanan oranlarda (majör ve minör bileşenlerin yerleri de değiştirilerek) karışım DNA örnekleri hazırlanmıştır. Çizelge 2.7. de XX-XX karışım çeşidi için kullanılan D ve E donörlerinin DNA örnekleri ile karışımların nasıl oluşturulduğu gösterilmektedir.

45 35 Çizelge 2.7. D ve E donörlerinin dilüye edilmiş DNA örnekleri ile planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. Minör Majör Karışım Minör bileşenden bileşenden Majör Bileşen Oranı Bileşen alınan DNA alınan DNA hacmi (µl) hacmi (µl) 1:1 D 10 E 10 1:2 D 7 E 14 1:4 D 4 E 16 1:8 D 2 E 16 1:16 D 1 E 16 1:32 D 0,5 E 16 1:1 E 10 D 10 1:2 E 7 D 14 1:4 E 4 D 16 1:8 E 2 D 16 1:16 E 1 D 16 1:32 E 0,5 D 16 Yukarıdaki planlama tüm konsantrasyon grupları (2; 1; 0,5; 0,25; 0,06; 0,02 ng/µl) için yapılmıştır. Birbiriyle birleştirilecek olan DNA hacimleri planlanırken kalan dilüsyon hacimlerinin sonraki çalışmalar için yeterli olmasına dikkat edilmiştir XX-XX Karışım Çeşidi Altındaki Tüm Karışım Örneklerinin Amplifikasyonu ve Tiplendirilmesi Hazırlanan 72 adet karışım örneği, Identifiler Amplification Kit (Applied Biosystems, 2001) ve GeneAmp PCR System 9700 (PE Biosystems) cihazı kullanılarak çoğaltılmıştır. Çoğaltılan DNA örnekleri, ABI PRISM TM 3130xl Genetik Analizörüne (Applied Biosystems) yüklenmiş ve GeneMapperID v.3.2 yazılımı kullanılarak tiplendirilmiştir. Elde edilen DNA profilleri, genel olarak incelenmiş ve Şekil 2.1., 2.2. ve 2.3. te görüldüğü gibi 0,02 ng/µl konsantrasyonundaki karışımlarda tüm karışım oranları için genel olarak sağlıklı sonuç alınamadığı, majör

46 36 bileşene ait piklerin dahi yazılım tarafından sağlıklı olarak isimlendirilemediği ve bu koşullarda örneklerde karışım tespitinin çok zor olacağı değerlendirilmiştir. Şekil 2.1. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0,02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:1 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram.

47 37 Şekil 2.2. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0,02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:2 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. Şekil 2.3. XX-XX karışım çeşidi altındaki 0,02 ng/µl konsantrasyonundaki 1:16 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram.

48 38 Diğer konsantrasyonlardaki (2; 1; 0,5; 0,25 ve 0,06 ng/µl) karışım örneklerinde ise Şekil 2.4. ve 2.5. te görüldüğü gibi genel olarak 1:32 karışım oranında minör bileşenin majör bileşen yanında tespit edilemeyecek kadar düşük kaldığı saptanmıştır. Şekil 2.4. XX-XX karışım çeşidi altında 2 ng/µl konsantrasyondaki 1:32 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram.

49 39 Şekil 2.5. XX-XX karışım çeşidi altında 0,06 ng/µl konsantrasyondaki 1:32 oranlı karışım örneğine ait elektroferogram. Yukarıda açıklanan sebeplerden, çalışmanın maliyetini düşürmek amacıyla bundan sonra çalışılacak XX-XY ve XY-XY karışım çeşitleri için 0,02 ng/µl konsantrasyon grubu ve tüm konsantrasyon grupları için 1:32 karışım oranından vazgeçilmiştir. Daha sonra diğer iki karışım çeşidinin planlanan konsantrasyon ve oranlarda hazırlanmasına geçilmiştir XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Konsantrasyon Gruplarının Hazırlanması XX-XY karışım çeşidinin hazırlanmasında A ve E donörlerinden elde edilen stok DNA lar kullanılmıştır. E donörüne ait dilüsyonlar bir önceki grupta hazırlandığı ve miktarı yeni çalışma için yeterli olduğundan tekrar hazırlanmamıştır. A donörüne ait DNA örneği Çizelge 2.8. de gösterildiği şekilde istenen konsantrasyonlara getirilmiştir.

50 40 Çizelge 2.8. XX-XY karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında A donörüne ait stok DNA örneğine uygulanan dilüsyon şekilleri. Stok DNA Donör Konsantrasyonu (ng/µl) A 2,97 Ayarlanacak Konsantrasyon (ng/µl) Stoktan alınacak DNA hacmi (µl) Eklenecek su hacmi (µl) 2 100,5 49, ,5 25,5 124,5 0, , XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Karışım Oranı Gruplarının Hazırlanması A ve E donörlerinden elde edilen dilüe DNA lar kullanılarak Çizelge 2.9. daki şekilde karışımlar hazırlanmıştır. Çizelge 2.9. A ve E donörlerinin DNA örnekleriyle planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. Minör bileşenden Majör bileşenden Karışım Minör Majör alınan DNA hacmi alınan DNA hacmi Oranı Bileşen Bileşen (µl) (µl) 1:1 E 10 A 10 1:2 E 7 A 14 1:4 E 4 A 16 1:8 E 2 A 16 1:16 E 1 A 16 1:1 A 10 E 10 1:2 A 7 E 14 1:4 A 4 E 16 1:8 A 2 E 16 1:16 A 1 E 16 Çizelge 2.9. daki planlama tüm konsantrasyon grupları için yapılmıştır.

51 XX-XY Karışım Çeşidi Altındaki Tüm Karışım Örneklerinin Amplifikasyonu ve Tiplendirilmesi Hazırlanan 50 adet karışım örneği daha önce bahsedildiği şekilde çoğaltılmış ve tiplendirilmiştir XY-XY Karışım Çeşidi Altındaki Örnekler İçin Yapılam İşlemler Son olarak XY-XY karışım çeşidinin hazırlanmasında A ve B donörlerinden elde edilen stok DNA lar kullanılmıştır. A donörüne ait dilüsyonlar daha önce hazırlanmış olmasına rağmen miktarı yetersiz olduğu için tekrar hazırlama ihtiyacı duyulmuştur. Bu DNA örnekleri Çizelge ve Çizelge deki şekilde dilüye edilmiş ve planlanan oranlarda birbiri ile karıştırılmıştır. Çizelge XY-XY karışım çeşidi altındaki konsantrasyonların oluşturulmasında A ve B donörlerine ait stok DNA örneklerine uygulanan dilüsyon şekilleri. Stok DNA Donör Konsantrasyonu (ng/µl) A 2,97 B 3,06 Ayarlanacak Konsantrasyon (ng/µl) Stoktan alınacak DNA hacmi (µl) Eklenecek su hacmi (µl) 2 100,5 49, ,5 25,5 124,5 0, , ,5 52,5 1 49,5 100,5 0, , ,

52 42 Çizelge A ve B donörlerinin DNA örnekleri ile planlanan oranlardaki karışımların hazırlanması. Minör Majör Karışım Minör bileşenden bileşenden Majör Bileşen Oranı Bileşen alınan DNA alınan DNA hacmi (µl) hacmi (µl) 1:1 A 10 B 10 1:2 A 7 B 14 1:4 A 4 B 16 1:8 A 2 B 16 1:16 A 1 B 16 1:1 B 10 A 10 1:2 B 7 A 14 1:4 B 4 A 16 1:8 B 2 A 16 1:16 B 1 A 16 Hazırlanan 50 adet karışım örneği çoğaltılmış ve tiplendirilmiştir. Her üç karışım çeşidi altındaki konsantrasyon grupları ve farklı karışım oranlarındaki DNA örneklerinden elde edilen karışım DNA profilleri üzerinde incelemeler yapılmıştır.

53 43 3. BULGULAR 3.1. XX-XX Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması XX-XX karışım çeşidi altındaki 2; 1; 0,5; 0,25; 0,06 ve 0,02 ng/µl konsantrasyonlu, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ve 1:32 oranlı ve majör-minör bileşenin yerleri de değiştirilerek hazırlanan 72 adet karışım örneğinden elde edilen DNA profillerinin incelenmesinde öncelikle her bir karışım profilinde planlanan karışım oranının gözlenip gözlenmediğini anlamak için karışım oranları hesaplanmıştır. Hatırlanacağı üzere XX-XX karışım çeşidini oluşturan donörler D ve E dir. 72 örneğin 36 sında D minör, E majör bileşen, diğer 36 sında ise E minör, D majör bileşen olarak belirlenmiştir. İlk oluşturulan karışım örneğinde D minör, E majör bileşen olarak kullanılmış, hedef DNA konsantrasyonu 2 ng/µl ye ayarlanmış ve karışım 1:1 oranında hazırlanmıştır. Bu örnek, çalışmada D/E, 1:1, 2 ng/µl olarak ifade edilmiştir. Oluşturulan tüm DNA karışım numuneleri aynı şekilde kısaltılarak gösterilmiştir. Burada D/E yerine E/D ifadesi kullanıldığında bu, minör bileşenin E, majörün D olduğunu anlatır. İlk numune olan D/E, 1:1, 2 ng/µl de, daha önce öngörülen 5 bölgede (Çizelge 2.3.) her iki bileşen için heterozigotluk durumu gözlenmiştir. Söz konusu 5 bölge bu numune için karışım oranının hesaplanmasında kullanılmıştır. Karışım oranının hesaplanmasında söz konusu 4 allelli bölgedeki piklerin alanları kullanılabileceği gibi, yüksekliklerinin de kullanılabileceği daha önce belirtilmiştir. Alan yerine yükseklik bilgisinin kullanımı, hesapların yapılmasını daha

54 44 pratik hale getirmektedir. Çünkü aynı pik için alan değeri, yükseklik değerinden daha büyüktür ve daha fazla rakam içermektedir. Bu nedenle tüm çalışmada pik yükseklikleri esas alınmıştır. Karışım oranının nasıl hesaplandığı daha önce anlatılmıştır. Hatırlamak gerekirse o bölgedeki en büyük alan ya da yüksekliğe sahip iki pike ait değerlerin toplamının, en küçük alan ya da yüksekliğe sahip diğer iki pike ait değerlerin toplamına bölümünden elde edilen sonuç, karışımdaki majör bileşen hacminin, minör bileşen hacminden kaç kat fazla olduğunu gösterir. Dolayısıyla karışımdaki minör bileşen bir hacim ise, yukarıdaki hesaptan elde edilen sonuç kadar hacim de majör bileşen bulunuyor demektir. Karışım oranlarını hesaplamadan önce, bu gruptaki 72 örneğe ait DNA profillerinin, hesaplamada kullanılacak heterozigot (4 allelli) bölgelerindeki pik yükseklikleri GeneMapperID v.3.2 yazılımı kullanılarak alınmıştır. D/E, 1:1, 2 ng/µl örneği için D16S539 gen bölgesindeki 9, 10, 12 ve 15 allelleri için pik yükseklikleri sırası ile 404, 315, 401 ve 302 dir. En yüksek iki değer olan 404 ve 401 in toplamının diğer iki değerin yani 315 ve 302 nin toplamına oranı 1,3 ve yaklaşık olarak 1 dir. Dolayısıyla bu bölgede karışım oranı 1:1 olarak bulunmuştur. Diğer 4 bölgedeki pik yükseklikleri kullanılarak yapılan hesaplar neticesinde de her birinde karışım oranı 1:1 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak bu numune için planlanan karışım oranının elde edilmiş olduğu anlaşılmaktadır. Çizelge 3.1. de XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin planlanan karışım oranını sağlayıp sağlamadığı gösterilmektedir.

55 45 Çizelge 3.1. XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 Bölge-5 D/E, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/D, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 D/E, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/D, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 D/E, 1:4, 2 ng/µl 1:5 1:3 1:3 1:3 1:4 E/D, 1:4, 2 ng/µl 1:3 1:4 1:4 1:4 1:4 D/E, 1:8, 2 ng/µl - 1:6 1:6 1:4 1:5 E/D, 1:8, 2 ng/µl 1:8 1:7 1:8 1:6 1:8 D/E, 1:16, 2 ng/µl :10 E/D, 1:16, 2 ng/µl :12 D/E, 1:32, 2 ng/µl E/D, 1:32, 2 ng/µl D/E, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/D, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 D/E, 1:2, 1 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/D, 1:2, 1 ng/µl 1:1 1:2 1:2 1:2 1:2 D/E, 1:4, 1 ng/µl 1:5 1:5 1:4 1:4 1:4 E/D, 1:4, 1 ng/µl 1:2 1:3 1:4 1:3 1:2 D/E, 1:8, 1 ng/µl - - 1:6-1:6 E/D, 1:8, 1 ng/µl - 1: :6 D/E, 1:16, 1 ng/µl E/D, 1:16, 1 ng/µl D/E, 1:32, 1 ng/µl E/D, 1:32, 1 ng/µl D/E, 1:1, 0,5 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/D, 1:1, 0,5 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 D/E, 1:2, 0,5 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/D, 1:2, 0,5 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 D/E, 1:4, 0,5 ng/µl 1:4 1:4 1:3 1:3 1:3 E/D, 1:4, 0,5 ng/µl 1:4 1:4 1:5 1:4 1:4 D/E, 1:8, 0,5 ng/µl 1:7 1:6 1:7 1:4 1:6 E/D, 1:8, 0,5 ng/µl 1:8 1:7 1:12 1:8 1:9 D/E, 1:16, 0,5ng/µl - - 1:8-1:9

56 46 Çizelge 3.1. Devam XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 Bölge-5 E/D, 1:16, 0,5 ng/µl 1: :13 D/E, 1:32, 0,5 ng/µl :10 E/D, 1:32, 0,5 ng/µl D/E, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/D, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 D/E, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/D, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 D/E, 1:4, 0,25 ng/µl 1:4 1:4 1:3 1:3 1:3 E/D, 1:4, 0,25 ng/µl 1:4 1:4 1:5 1:3 1:4 D/E, 1:8, 0,25 ng/µl 1:7 1:5 1:5 1:5 1:6 E/D, 1:8, 0,25 ng/µl - 1:7 1:9-1:8 D/E, 1:16, 0,25 ng/µl - 1:9 1:11-1:10 E/D, 1:16, 0,25ng/µl - - 1:16-1:14 D/E, 1:32, 0,25 ng/µl - - 1:18-1:12 E/D, 1:32, 0,25 ng/µl D/E, 1:1, 0,06 ng/µl - 1:1 1:1 1:1 1:1 E/D, 1:1, 0,06 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:2 D/E, 1:2, 0,06 ng/µl :2 E/D, 1:2, 0,06 ng/µl 1:1 1:1 1:2 1:1 1:2 D/E, 1:4, 0,06 ng/µl :4 E/D, 1:4, 0,06 ng/µl - 1:4 1:4-1:3 D/E, 1:8, 0,06 ng/µl :6 E/D, 1:8, 0,06 ng/µl :6 D/E, 1:16, 0,06 ng/µl E/D, 1:16, 0,06 ng/µl D/E, 1:32, 0,06 ng/µl E/D, 1:32, 0,06 ng/µl D/E, 1:1, 0,02 ng/µl E/D, 1:1, 0,02 ng/µl D/E, 1:2, 0,02 ng/µl E/D, 1:2, 0,02 ng/µl D/E, 1:4, 0,02 ng/µl E/D, 1:4, 0,02 ng/µl

57 47 Çizelge 3.1. Devam XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 Bölge-5 D/E, 1:8, 0,02 ng/µl E/D, 1:8, 0,02 ng/µl D/E, 1:16,0,02 ng/µl E/D, 1:16,0,02 ng/µl D/E, 1:32, 0,02 ng/µl E/D, 1:32, 0,02 ng/µl Çizelgede görüldüğü gibi, 0,02 ng/µl konsantrasyon grubundaki tüm oranlardaki karışım örneklerinde hiçbir bölgede karışım oranı bulunamamıştır. Bu nedenle daha önce bahsedildiği gibi, bu konsantrasyon grubu diğer iki karışım çeşidi içinden çıkarılmıştır. Yine çizelgede görüldüğü gibi, diğer konsantrasyon gruplarındaki (2; 1; 0,5; 0,25 ve 0,06 ng/µl) 1:32 olarak planlanan karışım örneklerinde karışım oranları bulunamamıştır. Bu nedenle 1:32 karışım oranı grubunun da diğer iki karışım çeşidi içinden çıkarıldığından bahsedilmiştir. Çizelgeden anlaşıldığı üzere, 0,02 ng/µl dışındaki tüm konsantrasyon grupları için 1:1 olarak planlanan karışımlardan ve 0,06 ve 0,02 ng/µl dışındaki tüm konsantrasyon grupları için 1:2 olarak planlanan karışımlardan planlanan ile uyumlu karışım oranları elde edilmiştir. Aynı konsantrasyon grubu içinde karışım oranı küçüldükçe planlanan ve hesaplanan karışım oranları arasında uyumsuzluklar ortaya çıktığı görülmektedir Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi Çizelge 3.2. de XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 karışım örneği için profilde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ile verilerin istatistiksel değerlendirmesi

58 48 verilmiştir. İstatistiksel analiz, SPSS 18.0 programı kullanılarak Ki-Kare Bağımsızlık Testi ile yapılmıştır. Çizelge 3.2. XX-XX karışım çeşidi altındaki örneklerde (n=72) beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. Karışım Oranı Konsantrasyon (ng/µl) Beklenen Allel Sayısı D/E, 1:1 D/E, 1:2 D/E, 1:4 D/E, 1:8 D/E,1:16 Gözlenen Allel Sayısı D/E,1:32 E/D, 1:1 E/D, 1:2 E/D, 1:4 E/D, 1:8 E/D,1:16 E/D,1:32 p* değeri , , ,638 0, , (*p<0,05). XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları ve bunların değerlendirilmesi çizelgesindeki (Çizelge 3.1.) veriler yazılırken heterozigot bölgelerdeki 4 allelin de yazılım tarafından isimlendirilmiş olmasına dikkat edilmiştir. Çünkü gözlenebildiği halde yazılım tarafından isimlendirilemeyen piklerin alan ve yükseklikleri yazılımdan elde edilememektedir. Dolayısıyla 4 allelin 1 tanesi bile isimlendirilememişse o bölgedeki piklerden karışım oranı hesaplanmasında yararlanılamamıştır. Ancak karışım DNA profilinin yazılmasında, yazılımın isimlendiremediği pikler uzman tarafından allelik ladder ile mukayese edilerek manuel olarak isimlendirilebileceği için, XX-XX karışım çeşidi altındaki tüm konsantrasyon gruplarındaki örneklerin, gen bölgelerine göre beklenen ve gözlenen allel sayıları çizelgesindeki (Çizelge 3.2) veriler yazılırken uzmanın sağlıklı olduğuna inanıp,

59 49 manuel olarak isimlendirebileceği pikler de dikkate alınmıştır. Değerlendirilemeyecek olanlar göz ardı edilmiştir. Şekil 3.1. de XX-XX karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki grafik şeklinde verilmiştir. Gözlenen Toplam Alllel Sayısı ng/µl 1 ng/µl 0,5 ng/µl 0,25 ng/µl 0,06 ng/µl 0,02 ng/µl D/E, 1:1 D/E, 1:2 D/E, 1:4 D/E, 1:8 D/E,1:16 D/E,1:32 E/D, 1:1 E/D, 1:2 E/D, 1:4 E/D, 1:8 E/D,1:16 E/D,1:32 Karışım Oranı ilişki. Şekil 3.1. XX-XX karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki 3.2. XX-XY Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması XX-XY karışım çeşidi altındaki 2; 1; 0,5; 0,25 ve 0,06 ng/µl konsantrasyonlu, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 ve 1:16 oranlı ve majör-minör bileşenin yerleri de değiştirilerek hazırlanan 50 adet karışım örneğinden elde edilen DNA profillerinin incelenmesinde yine öncelikle her bir karışım profilinde planlanan karışım oranının gözlenip gözlenmediğini anlamak için karışım oranları hesaplanmıştır.

60 50 XX-XY karışım çeşidini oluşturan donörler A ve E dir. 50 örneğin 25 inde A minör, E majör bileşen, diğer 25 inde ise E minör, A majör bileşendir. Karışım oranlarını hesaplamadan önce, bu gruptaki 50 örneğe ait DNA profillerinin, hesaplamada kullanılacak 8 adet heterozigot (4 allelli) gen bölgesindeki (Çizelge 2.3.) pik yükseklikleri GeneMapperID v.3.2 yazılımı kullanılarak alınmıştır. Çizelge 3.3. te XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin planlanan karışım oranını sağlayıp sağlamadığı gösterilmektedir. Çizelge 3.3. XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 Bölge-5 Bölge-6 Bölge-7 Bölge-8 E/A, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 A/E, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/A, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:1 1:2 1:2 1:2 - A/E, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/A, 1:4, 2 ng/µl 1:3 1:3 1:4 1:3 1:4 1:3 1:3 - A/E, 1:4, 2 ng/µl 1:4 1:4 1:4 1:5 1:4 1:4 1:3 1:3 E/A, 1:8, 2 ng/µl 1:5-1:5-1:10 1:5 1:6 - A/E, 1:8, 2 ng/µl 1:5 1:8 1:7 1:9 1:8 1:11 1:5 1:6 E/A, 1:16, 2ng/µl 1: A/E, 1:16, 2ng/µl 1: :10 1:13 1:12 - E/A, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 A/E, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 E/A, 1:2, 1 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:1 1:2 1:2 1:2 1:2 A/E, 1:2,1 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/A, 1:4, 1 ng/µl 1:4 1:3 1:4 1:3 1:3 1:4 1:3 - A/E, 1:4, 1 ng/µl 1:3 1:5 1: :5 1:3 - E/A, 1:8, 1 ng/µl 1: A/E, 1:8, 1 ng/µl 1:5 1: :6 - E/A, 1:16, 1ng/µl A/E, 1:16, 1ng/µl E/A, 1:1, 0,5ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 A/E, 1:1, 0,5ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1

61 51 Çizelge 3.3. Devam XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 Bölge-5 Bölge-6 Bölge-7 Bölge-8 E/A, 1:2, 0,5ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:1 1:2 1:2 1:2 1:3 A/E, 1:2, 0,5ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 E/A, 1:4, 0,5 ng/µl 1:3 1:4 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3 - A/E, 1:4, 0,5 ng/µl 1:4 1:4 1:4 1:5 1:4 1:4 1:4 1:3 E/A, 1:8, 0,5 ng/µl 1:6-1:5 1:5 1:7 1:8 1:6 - A/E, 1:8, 0,5 ng/µl 1:8 1:7 1:5-1:8 1:10 1:6 - E/A, 1:16, 0,5ng/µl 1: A/E, 1:16, 0,5 ng/µl 1: :11 - E/A, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 A/E, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:2 1:1 1:1 1:1 1:1 E/A, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:1 1:1 1:1 1:2 1:1 1:2 1:2 A/E, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:3 1:3 1:4 1:2 1:3 1:2 1:2 E/A, 1:4, 0,25 ng/µl 1:3 1:3 1:2 1:2 1:3 1:2 1:4 - A/E, 1:4, 0,25 ng/µl 1:5 1:5 1:5 1:6 1:6 1:6 1:4 1:5 E/A, 1:8, 0,25 ng/µl 1:5-1:4 1:5 1:5 1:6 1:6 - A/E, 1:8, 0,25 ng/µl 1:8-1:10 1:15 1:10 1:9 1:10 - E/A,1:16, 0,25ng/µl 1: A/E,1:16,0,25 ng/µl :14 - E/A, 1:1, 0,06 ng/µl 1:1 1:1 1:2 1:1 1:1 1:1 1:1 - A/E, 1:1, 0,06 ng/µl 1:1 1:1-1:1 1:1 1:1 1:1 - E/A, 1:2, 0,06 ng/µl 1:1 1:1-1:1 1:1 1:1 1:2 - A/E, 1:2, 0,06 ng/µl 1:2 1: :2 1:2 - E/A, 1:4, 0,06 ng/µl 1: : :2 - A/E, 1:4, 0,06 ng/µl E/A, 1:8, 0,06 ng/µl A/E, 1:8, 0,06 ng/µl E/A,1:16, 0,06ng/µl A/E,1:16,0,06 ng/µl Çizelgeden anlaşıldığı üzere, tüm konsantrasyon grupları için 1:1 olarak planlanan karışımlar ile 0,06 ng/µl dışındaki tüm konsantrasyon grupları için 1:2 olarak planlanan karışımlardan planlanan ile uyumlu karışım oranları elde edilmiştir.

62 52 Karışım oranı küçüldükçe planlanan ve hesaplanan karışım oranları arasında uyumsuzluklar ortaya çıktığı görülmüştür. Karışımların oranlarının hesaplanmasında ve yorumlanmasında Amelogenin bölgesindeki X ve Y piklerinin birbirine oranı da çok önemli olduğundan bu bölge için elde edilen karışım oranları ayrıca ele alınmıştır. Çizelge 3.4. te XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 numunenin Amelogenin gölgelerinde beklenen ve gözlenen karışım oranları verilmektedir. Amelogenin bölgesinde maksimum iki allel gözlenebildiği için bu bölgedeki beklenen karışım oranı aynı numunenin heterozigot bölgelerinde beklenen orandan farklı olmaktadır. Çizelge 3.4. XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 numunenin Amelogenin bölgelerinde beklenen ve gözlenen karışım oranları. Numune Karışım Bileşenleri Beklenen Oran Gözlenen Oran Minör Majör (Y/X) (Y/X) E/A,1:1,2 ng/µl XX XY 1:3 1:3 A/E,1:1,2 ng/µl XY XX 1:3 1:3 E/A,1:2, 2 ng/µl XX XY 1:2 1:2 A/E,1:2, 2 ng/µl XY XX 1:5 1:5 E/A,1:4, 2 ng/µl XX XY 1:1,5 1:1,4 A/E,1:4, 2 ng/µl XY XX 1:9 1:8,4 E/A,1:8, 2 ng/µl XX XY 1:1,25 1:1,28 A/E,1:8, 2 ng/µl XY XX 1:17 - E/A,1:16,2ng/µl XX XY 1:1,125 1:1,04 A/E,1:16,2ng/µl XY XX 1:33 - E/A,1:1,1 ng/µl XX XY 1:3 1:2,6 A/E,1:1,1 ng/µl XY XX 1:3 1:3 E/A,1:2, 1 ng/µl XX XY 1:2 1:2,38 A/E,1:2,1 ng/µl XY XX 1:5 1:5,76 E/A,1:4, 1 ng/µl XX XY 1:1,5 1:1,56 A/E,1:4, 1 ng/µl XY XX 1:9 - E/A,1:8, 1 ng/µl XX XY 1:1,25 1:1,12 A/E,1:8, 1 ng/µl XY XX 1:17 - E/A,1:16,1ng/µl XX XY 1:1,125 1:1,16 A/E,1:16,1ng/µl XY XX 1:33 - E/A,1:1,0,5ng/µl XX XY 1:3 1:3 A/E,1:1,0,5ng/µl XY XX 1:3 1:2,8

63 53 Çizelge 3.4. Devam XX-XY karışım çeşidi altındaki 50 numunenin Amelogenin bölgelerinde beklenen ve gözlenen karışım oranları. Numune Karışım Beklenen Gözlenen Bileşenleri Oran Oran Minör Majör (Y/X) (Y/X) E/A,1:2,0,5ng/µl XX XY 1:2 1:1,85 A/E,1:2,0,5ng/µl XY XX 1:5 1:6 E/A,1:4,0,5 ng/µl XX XY 1:1,5 1:1,39 A/E,1:4,0,5 ng/µl XY XX 1:9 1:12 E/A,1:8,0,5 ng/µl XX XY 1:1,25 1:1,2 A/E,1:8,0,5 ng/µl XY XX 1:17 1:21 E/A,1:16,0,5ng/µl XX XY 1:1,125 1:1,08 A/E,1:16,0,5 ng/µl XY XX 1:33 - E/A,1:1,0,25 ng/µl XX XY 1:3 1:3 A/E,1:1,0,25 ng/µl XY XX 1:3 1:3 E/A,1:2,0,25 ng/µl XX XY 1:2 1:2 A/E,1:2,0,25 ng/µl XY XX 1:5 1:5 E/A,1:4,0,25 ng/µl XX XY 1:1,5 1:1,7 A/E,1:4,0,25 ng/µl XY XX 1:9 1:13 E/A,1:8,0,25 ng/µl XX XY 1:1,25 1:1,3 A/E,1:8,0,25 ng/µl XY XX 1:17 - E/A,1:16,0,25ng/µl XX XY 1:1,125 1:1,03 A/E,1:16,0,25 ng/µl XY XX 1:33 - E/A,1:1,0,06 ng/µl XX XY 1:3 1:3 A/E,1:1,0,06 ng/µl XY XX 1:3 1:3 E/A,1:2,0,06 ng/µl XX XY 1:2 - A/E,1:2,0,06 ng/µl XY XX 1:5 - E/A,1:4,0,06 ng/µl XX XY 1:1,5 1:1,6 A/E,1:4,0,06 ng/µl XY XX 1:9 - E/A,1:8,0,06 ng/µl XX XY 1:1,25 1:1,48 A/E,1:8,0,06 ng/µl XY XX 1:17 - E/A,1:16,0,06ng/µl XX XY 1:1,125 - A/E,1:16,0,06ng/µl XY XX 1: Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi Çizelge 3.5 te XX-XY karışım çeşidi altındaki tüm konsantrasyon grubundaki 50 örneğin DNA profillerinde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ile verilerin

64 54 istatistiksel değerlendirmesi verilmiştir. İstatistiksel analiz, SPSS 18.0 programı kullanılarak Ki-Kare Bağımsızlık Testi ile yapılmıştır. Çizelge 3.5. XX-XY karışım çeşidi altındaki örneklerde (n=50) beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. Konsantrasyon (ng/µl) Beklenen Allel Sayısı E/A, 1:1 E/A, 1:2 E/A, 1:4 E/A, 1:8 Karışım Oranı Gözlenen Allel Sayısı , , , E/A,1:16 A/E, 1:1 A/E, 1:2 A/E, 1:4 A/E, 1:8 A/E,1:16 p* değeri 0,974 (*p<0,05). Şekil 3.2. de XX-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki grafik şeklinde verilmiştir E/A, 1:1 E/A, 1:2 E/A, 1:4 E/A, 1:8 E/A,1:16 A/E, 1:1 A/E, 1:2 A/E, 1:4 A/E, 1:8 A/E,1:16 Gözlenen Toplam Allel Sayısı 2 ng/µl 1 ng/µl 0,5 ng/µl 0,25 ng/µl 0,06 ng/µl Karışım Oranı ilişki. Şekil 3.2. XX-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki

65 XY-XY Karışım Çeşidinden Elde Edilen Bulgular Karışım Oranlarının Hesaplanması XY-XY karışım çeşidi altındaki 2; 1; 0,5; 0,25 ve 0,06 ng/µl konsantrasyonlu, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 ve 1:16 oranlı ve majör-minör bileşenin yerleri de değiştirilerek hazırlanan 50 adet karışım örneğinden elde edilen DNA profillerinin incelenmesinde diğer iki grupta olduğu gibi öncelikle her bir karışım profilinde planlanan karışım oranının gözlenip gözlenmediğini anlamak için karışım oranları hesaplanmıştır. XY-XY karışım çeşidini oluşturan donörler A ve B dir. 50 örneğin 25 inde A minör, B majör bileşen, diğer 25 inde ise B minör, A majör bileşendir. Karışım oranlarını hesaplamadan önce, bu gruptaki 50 örneğe ait DNA profillerinin, hesaplamada kullanılacak 4 adet heterozigot (4 allelli) gen bölgesindeki (Çizelge 2.4.) pik yükseklikleri GeneMapperID v.3.2 yazılımı kullanılarak alınmıştır. Çizelge 3.6. da XY-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin planlanan karışım oranını sağlayıp sağlamadığı gösterilmektedir. Çizelge 3.6. XY-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 A/B, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 B/A, 1:1, 2 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 A/B, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 B/A, 1:2, 2 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 A/B, 1:4, 2 ng/µl 1:3 1:4 1:3 1:4 B/A, 1:4, 2 ng/µl 1:4 1:3 1:5 1:4 A/B, 1:8, 2 ng/µl 1:6 1:7 1:6 - B/A, 1:8, 2 ng/µl 1:8 1:6 1:8 -

66 56 Çizelge 3.6. Devam XY-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 A/B, 1:16, 2 ng/µl - - 1:10 - B/A, 1:16, 2 ng/µl 1:10 1:10 1:16- - A/B, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 B/A, 1:1, 1 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 A/B, 1:2, 1 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 B/A, 1:2, 1 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 A/B, 1:4, 1 ng/µl 1:3 1:3 1:3 - B/A, 1:4, 1 ng/µl 1:3 1:3 1:4 - A/B, 1:8, 1 ng/µl 1:5 1:6 1:5 - B/A, 1:8, 1 ng/µl - - 1:8 - A/B, 1:16, 1 ng/µl - - 1:9 - B/A, 1:16, 1 ng/µl - - 1:11 - A/B, 1:1, 0,5 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 B/A, 1:1, 0,5 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 A/B, 1:2, 0,5 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 B/A, 1:2, 0,5 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 A/B, 1:4, 0,5 ng/µl 1:3 1:3 1:3 1:3 B/A, 1:4, 0,5 ng/µl 1:4 1:4 1:5 - A/B, 1:8, 0,5 ng/µl 1:6 1:7 1:5 - B/A, 1:8, 0,5 ng/µl 1:6 1:8 1:9 - A/B, 1:16, 0,5 ng/µl - - 1:9 - B/A, 1:16, 0,5 ng/µl - - 1:18 - A/B, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 B/A, 1:1, 0,25 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 A/B, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 B/A, 1:2, 0,25 ng/µl 1:2 1:2 1:3 1:2 A/B, 1:4, 0,25 ng/µl 1:4 1:4 1:6 1:4 B/A, 1:4, 0,25 ng/µl 1:4 1:4 1:4 1:5 A/B, 1:8, 0,25 ng/µl 1:6 1:7 1:5 - B/A, 1:8, 0,25 ng/µl 1:7 1:7 1:7 - A/B,1:16,0,25 ng/µl 1:10-1:10 - B/A,1:16,0,25 ng/µl - 1:8 1:13 - A/B, 1:1, 0,06 ng/µl 1:1 1:1 1:1 -

67 57 Çizelge 3.6. Devam XY-XY karışım çeşidi altındaki 50 örneğin heterozigot gen bölgelerinde hesaplanan karışım oranları. Heterozigot Gen Bölgeleri Numune Bölge-1 Bölge-2 Bölge-3 Bölge-4 B/A, 1:1, 0,06 ng/µl 1:1 1:1 1:1 1:1 A/B, 1:2, 0,06 ng/µl 1:2 1:2 1:2 1:2 B/A, 1:2, 0,06 ng/µl 1:2 1:2 1:2 - A/B, 1:4, 0,06 ng/µl - 1:3 1:2 - B/A, 1:4, 0,06 ng/µl - - 1:3 - A/B, 1:8, 0,06 ng/µl B/A, 1:8, 0,06 ng/µl A/B,1:16,0,06 ng/µl B/A,1:16,0,06 ng/µl Çizelgeden anlaşıldığı üzere, tüm konsantrasyon grupları için 1:1 ve 1:2 olarak planlanan karışımlardan planlanan ile uyumlu karışım oranları elde edilmiştir. Ancak bu çalışma grubunda 0,25 ng/µl konsantrasyon grubunda 1:4 karışım oranı için planlanan ile uyum sağladığı görülmüştür. Karışım oranı küçüldükçe planlanan ve hesaplanan karışım oranları arasında uyumsuzluklar ortaya çıktığı görülmüştür Karışım DNA Profili Elde Etme Başarısının Değerlendirilmesi Çizelge 3.7 de XY-XY karışım çeşidi altındaki tüm konsantrasyon grubundaki 50 örneğin DNA profillerinde beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ile verilerin istatistiksel değerlendirmesi verilmiştir. İstatistiksel analiz, SPSS 18.0 programı kullanılarak Ki-Kare Bağımsızlık Testi ile yapılmıştır.

68 58 Çizelge 3.7. XY-XY karışım çeşidi altındaki örneklerde (n=50) beklenen ve gözlenen toplam allel sayıları ve istatistiksel sonuç. Konsantrasyon (ng/µl) Beklenen Allel Sayısı A/B, 1:1 A/B, 1:2 A/B, 1:4 A/B, 1:8 Karışım Oranı Gözlenen Allel Sayısı , , , A/B,1:16 B/A, 1:1 B/A, 1:2 B/A, 1:4 B/A, 1:8 B/A,1:16 p* değeri 0,998 (*p<0,05). Şekil 3.3. te XY-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki ilişki grafik şeklinde verilmiştir A/B, 1:1 A/B, 1:2 A/B, 1:4 A/B, 1:8 A/B,1:16 B/A, 1:1 B/A, 1:2 B/A, 1:4 B/A, 1:8 B/A,1:16 Gözlenen Toplam Allel Sayısı 2 ng/µl 1 ng/µl 0,5 ng/µl 0,25 ng/µl 0,06 ng/µl Karışım Oranı ilişki. Şekil 3.3. XY-XY karışım çeşidinde konsantrasyon ve karışım oranı arasındaki

69 Stutter Piklerin Karışım DNA Profillerini Değerlendirme Üzerine Etkisi Bu çalışmada sağlıklı karışım DNA profili elde etmeyi engelleyen faktörlerden stutter ürünlere sıklıkla rastlanmıştır. Daha önce bahsedildiği üzere, stutter ürünlerin karışımların yorumlanmasına olumsuz yönde etkisi olduğundan yani bazen bu ürünlerin minör bileşene ait bir pik olduğu değerlendirilebildiğinden stutter ürünlerin iyi tanınıp gerçek piklerden ayırt edilebilmesi gereklidir. Bu çalışmada elde edilen 172 adet DNA profilinde stutter olabilecek piklerin varlığına ve yorumlamayı nasıl etkilediğine de bakılma ihtiyacı duyulmuştur. Ancak bu piklerin 172 örneğin hepsinde aranması gerekmemiştir. Çünkü bu çalışmada numuneler için bir bölgede beklenen ve gözlenen allel sayısı eşit olduğunda stutter ürünlerden bahsedilemez. Aşağıda stutterlar ile ilgili çalışmada rastlanan bazı örnekler verilmiştir (Şekil 3.4., 3.5., 3.6., 3.7., 3.8., 3.9., ve 3.11.). Şekil 3.4. E/D, 1:8, 2 ng/µl örneğinin D21S11 bölgesi.

70 Şekil 3.5. D/E, 1:8, 2 ng/µl örneğinin D21S11 bölgesi. 60

71 Şekil 3.6. D/E, 1:8, 1 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. 61

72 Şekil 3.7. D/E, 1:8, 1 ng/µl örneğinin D18S51 bölgesi. 62

73 Şekil 3.8. E/D, 1:8, 0,5 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. 63

74 Şekil 3.9. E/D, 1:16, 0,5 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesi. 64

75 Şekil E/D, 1:16, 0,5 ng/µl örneğinin D18S51 bölgesi. 65

76 66 Şekil D/E, 1:32, 0,5 ng/µl örneğinin vwa bölgesi. Her ne kadar stutterların etkisi ile ilgili örnekler XX-XX karışım çeşidi altındaki örneklerden verildiyse de diğer iki karışım çeşidi altındaki örneklerde de benzer sorunlar ile karşılaşılmıştır.

77 67 4. TARTIŞMA Bir DNA profilinin karışım içerip içermediğini anlamak için yapılacak ilk şey, daha önce bahsedildiği gibi, ikiden fazla allel içeren lokus olup olmadığını kontrol etmektir. Bu çalışmada, zaten önceden planlanan ve hazırlanan karışım örnekleri kullanıldığı için karışım varlığını tespit etmeye gerek duyulmamıştır. Ayrıca çalışma için ikili karışımlar hazırlandığından, bileşenlerin sayısı da belirlidir. Bu nedenle doğrudan karışım oranları ile çalışmaya başlanmıştır. Amplifiye edilen her bir karışım örneğinde her iki donörün de heterozigot olduğu bölgelerde karışım oranları hesaplanmış ve planlanan karışım oranları ile uyuşup uyuşmadığına bakılmıştır. Bu veriler Çizelge 3.1., 3.3., 3.4. ve 3.6 da her bir karışım çeşidi için verilmiştir. Çizelge 3.1. de XX-XX karışım çeşidi altındaki 72 adet örneğin heterozigot olan 5 bölgede hesaplanan karışım oranları verilmiştir. Burada görüldüğü gibi, majör ve minör bileşenlerin birbirine olan oranları küçüldükçe (1:1 den 1:32 ye doğru), planlanan ve gözlenen oranlar arasında farklar ortaya çıkmıştır. Anlaşıldığı üzere 1:1 ve 1:2 karışım oranlarında karışımlar hazırlanırken bir problem ortaya çıkmamıştır. Ancak 1:4 karışım oranından itibaren sapmalar gözlenmiştir. Bunun nedeni, daha fazla hacime sahip majör bileşen içinde minör bileşenin homojen bir karışım sağlayamaması olabilir. Aynı zamanda, büyük hacimdeki bir solüsyon içine daha küçük hacimde başka bir solüsyon eklerken pipetleme hatası nedeniyle karışım oranı değişebilmektedir. Bu, oranın daha da büyümesi veya küçülmesiyle sonuçlanabilir. Örneğin Çizelge 3.1. de D/E, 1:4, 2 ng/µl numunesinde 5 bölgede karışım oranları sırası ile 1:5, 1:3, 1:3, 1:3 ve 1:4 şeklinde bulunmuştur. E/D, 1:4, 1 ng/µl örneğinde ise 1:2, 1:3, 1:4, 1:3 ve 1:2 oranlarına rastlanmıştır. D/E, 1:8, 0,5 ng/µl örneğinde dördüncü bölgede planlanan oranın yarısına kadar düşen bir karışım oranına rastlanmıştır. E/D, 1:8, 0,5 ng/µl numunesinin üçüncü bölgesinde 1:12 gibi bir orana ulaşılmıştır. E/D, 1:32, 0,5 ng/µl örneğinde karışım oranı hesaplanabilen tek bölgede planlananın yarısından da büyük karışım oranı elde edilmiştir. Çizelge 3.1.

78 68 incelendiğinde bunun gibi pek çok uyumsuzluklar görülebilmektedir. Ayrıca bu durum diğer iki karışım çeşidi altındaki numuneler için de söz konusudur. Planlanan ve gözlenen oranların birbirine uyumsuz olduğu örneklere bakılırsa, heterozigot bölgelerin her birinde farklı farklı oranlar elde edilmiş olduğu görülmektedir. Zira lokus içinde gözlenen oranların lokuslar arasında gözlenemeyebileceğinden daha önce bahsedilmiştir (Clayton ve ark., 1998). Bu oranlar planlanandan çok farklı olmasalar dahi bölgeler arasındaki fark, örnekteki karışım oranına karar vermeyi güçleştirmektedir. Özellikle bu çalışmadaki XX-XY karışım çeşidi altındaki örneklerde olduğu gibi (Çizelge 3.3.) her iki donörün de heterozigot olduğu gen bölgelerinin sayısı fazla olduğunda ve bu bölgelerin her birinde farklı oranlar elde edildiğinde bu kararın verilmesi iyice zorlaşabilmektedir. Örneğin Çizelge 3.3 te A/E, 1:8, 2 ng/µl numunesinde 8 heterozigot gen bölgesinde gözlenen karışım oranları sırası ile 1:5, 1:8, 1:7, 1:9, 1:8, 1:11, 1:5 ve 1:6 dır. Bir karışım DNA profilinin farklı gen bölgelerindeki oran farklılıkları amplifikasyon koşullarından kaynaklanan dengesiz piklere bağlı olabilir. Daha önce bahsedildiği üzere, hedef karışım DNA nın karışım oranı ne ise amplifikasyon sırasında da bu oranın korunduğu bilinmektedir. Ancak majör ve minör bileşenlerin hacimleri arasındaki fark arttıkça minör bileşenin amplifikasyonu olumsuz etkilenerek dengesiz pikler ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu da gözlenen karışım oranlarının heterozigot bölgelerde farklı olarak görülmesine ve planlanandan da farklı olmasına neden olabilir. XX-XY karışım çeşidi altındaki örnekler için Amelogenin gen bölgesine bakılarak da karışım oranları hesaplanmış ve Çizelge 3.4. te verilmiştir. Bu çizelgeden anlaşıldığı üzere XX-XY karışım çeşidi altındaki numunelerde gözlenen 8 adet heterozigot gen bölgesine kıyasla Amelogenin gen bölgesinde gözlenen oranların planlananlar ile daha uyumlu olduğu farkedilmiştir. Ayrıca Amelogenin gen bölgesi ve bundaki orana bakılarak karışım majör ve minör bileşenlerinin cinsiyetleri belirlenebilmektedir.

79 69 Yine Çizelge 3.4. ten anlaşıldığı gibi, karışım oranı küçüldükçe (1:1 den 1:16 ya) minör bileşenin XX olduğu örneklerde Y nin X e oranı birbirine yaklaşmaya başlamaktadır. Bunun anlamı bu örneklerde XX varlığının tespit edilmesinin zorlaşmasıdır. Minör bileşenin XY olduğu örneklerde ise karışım oranı küçüldükçe Y nin X e oranı iyice düşmekte ve bu örneklerde de XY varlığının tespit edilmesi zorlaşmaktadır. Karışımların incelenmesinde bir sonraki adımın, olası genotip kombinasyonlarının belirlenmesi olduğundan daha önce bahsedilmiştir. Genotip kombinasyonlarını belirleyebilmek için sağlıklı bir karışım profili elde etmiş olmak gerekmektedir. Karışım DNA profilinin kalitesi, DNA konsantrasyonu ve karışım oranı ile ilişkilidir. Ancak verilere uygulanan istatistiksel analizler, bir numune için konsantrasyon ve karışım oranı değerlerinin birbirinden bağımsız olduğunu göstermiştir. Çizelge 3.2., 3.5. ve 3.7. deki verilerden elde edilen her üç p değeri 0.05 in üzerinde bulunmuştur. Bu da bir numune için konsantrasyon ve karışım oranı verilerinin ayrı ayrı değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir. Yani çalışılan bir karışım örneğinden elde edilen konsantrasyon ve karışım oranı değerlerine birlikte bakılarak bu karışımdan elde edilecek DNA profilinin verimliliği değerlendirilemez. Elde edilecek DNA profilinin kalitesine bu iki değişken ayrı ayrı etki etmektedir. Şekil 3.1., 3.2. ve 3.3. incelendiğinde de iki değişkenin birbirinden bağımsız olduğu anlaşılmaktadır. Çizelge 3.2 ye bakıldığında XX-XX karışım çeşidi altındaki 0,02 ng/µl karışım grubundaki örneklerde genel olarak amplifikasyon başarısızlığı olduğu görülmektedir. DNA konsantrasyonu düşük olduğundan karışımlardaki majör bileşenlerin belirlenmesinde bile başarısızlık olduğu görülmüştür. (Şekil 2.1, 2.2., 2.3.) Tek kaynaklı örneklerde bile bu kadar düşük konsantrasyonda tam profil elde etme olasılığı düşüktür. Dolayısıyla bu konsantrasyonda karışım varlığından bahsetmek bile çok güç olacağından XX-XY ve XY-XY karışım çeşitleri içinden bu konsantrasyon grubu çıkarılmıştır.

80 70 XX-XX karışım çeşidi altındaki 1:32 karışım oranlı örneklerde genel olarak minör bileşene rastlanmadığı için bu karışım grubu da diğer çalışma gruplarından çıkarılmıştır. (Şekil 2.4., 2.5.) Tüm veriler değerlendirildiğinde düşük konsantrasyon ve düşük karışım oranlarının ayrı ayrı karışım örneklerinden elde edilen profili etkilediği, düşen konsantrasyon ve azalan karışım oranı ile profilde beklenen toplam allel sayısında düşme olduğu görülmektedir. Bunun nedeni allellerde ya da lokusta meydana gelen drop-outtur. National Institute of Justice- (NIJ) Expert System Testbed (NEST) Projesi kapsamında Marshall Üniversitesinde Amy Christen, 280 karışım numunesi ile bir çalışma yapmıştır. Çalışmada yalnızca kadın-erkek karışımları kullanılmıştır. 1,5; 1; 0,5 ve 0,25 ng/µl olmak üzere 4 farklı konsantrasyon ve 1:1, 1:3, 1:10 ve 1:30 olmak üzere 4 farklı karışım oranı uygulanmıştır. Majör ve minör bileşenlerin yerleri de değiştirilerek karışım örnekleri çoğaltılmıştır. Ancak çalışmada karışım örneklerinin çoğaltılması için 5 farklı amplifikasyon kiti kullanılmıştır. Bu kitlerden biri de Identifiler dır ( Bu çalışmada 0,25 ng/µl konsantrasyonda ve 1:30 karışım oranında minör bileşen tespit edilememiştir. 1 ng/µl konsantrasyonda da 1:30 oranında minör bileşenin tespiti imkansız hale gelmiştir. Çizelge 3.2., 3.5. ve 3.7 incelendiğinde 0,06 ng/µl konsantrasyon grubu için 1:8 ve 1:16 karışım oranlı örneklerde minör bileşenin tespit edilemeyecek durumda olduğu ve 0,25 ng/µl konsantrasyon grubu için 1:16 karışım oranlı örneklerde minör bileşenin zor tespit edilebildiği görülmektedir. 0,5 ng/µl ve daha fazla olan konsantrasyon grupları için 1:16 da dahil olmak üzere diğer karışım oranlarında karışım varlığı tespit edilebilmektedir. Ancak beklenen allel sayıları eksik olabilmektedir. NEST Projesi kapsamında yapılan çalışmada 0,25 ng/µl konsantrasyonda 1:10 karışım oranındaki örneklerde minör bileşen tespit edilebilmiştir. (

81 71 Buna göre karışım konsantrasyonunu bilmek büyük önem arzetmektedir. Önceden bilinen konsantrasyon ve elde edilen profilin pik bilgilerinden yararlanılarak hesaplanan karışım oranına bakılarak o profilde olması muhtemel karışımın değerlendirilip değerlendirilmeyeceğine karar verilebilir. Çalışılan numunede düşük miktarda hedef DNA varlığında gözlenen pik yükseklikleri düşük olacağından piklerin gerçek pik olup olmadığı tereddütü yaşanabilir. Böyle bir durumda karışımların değerlendirilmesi de son derece güç olacaktır. Adli DNA laboratuvarları bu güçlüğün üstesinden gelmek ve daha az tereddüt yaşamak için analiz işlemlerinde pik yüksekliği eşik değerlerini RFU arasında bir değere ayarlarlar. Böylelikle belirlenen eşiğin altındaki pikler değerlendirilmez ve düşük yükseklikli piklerin gerçek pik olup olmadığı konusunda tereddüt yaşanmaz (Gilder ve ark., 2007). Bu çalışmada da analiz yaparken pik yüksekliği eşik değeri 50 RFU olarak ayarlanmıştır. Bu çalışmada, stutterlar ile ilgili problemlerin karışım oranlarıyla doğrudan bağlantılı olduğu da görülmektedir. Majör-minör bileşen arasındaki hacim farkı arttıça minör bileşenin pikleri iyice küçülmekte ve stutter pikleri ile karışma olasılığı artmaktadır. E/D, 1:8, 2 ng/µl örneğindeki D21S11 bölgesinde olduğu gibi (Şekil 3.4.) beklenen ve gözlenen allel sayıları aynı olmasına rağmen minör bileşene ait pikle eşit gibi görünen yükseklikte ve büyük allelin stutterı olan bir pik daha görülmüştür. Yazılım tarafından bu pike isim verilmemiştir. Ancak donörlerin profili bilinmeseydi ve de minör bileşenden gelen pike de isim verilmemiş olsaydı, stutter pikinin de minör bileşenden gelmiş bir pik olduğu düşünülebilirdi. Bu haliyle de eğer donörlerin profili bilinmiyor olsaydı, bu pik, diğer küçük pike bakılıp değerlendirilebilirdi. Şekil 3.4. deki üç pikin yükseklikleri sırası ile 84, 1442 ve 91 dir. 84, 1442 nin %15 inden küçük olduğu için yazılım tarafından stutter olarak değerlendirilmiş ve isimlendirilmemiştir.

82 72 Aynı konsantrasyon ve orandaki yukardaki karışım için majör ve minör bileşenin yeri değiştiği zaman elde edilen D/E,1:8, 2 ng/µl örneğinde aynı bölgede stutter problemi görülmemektedir. Çünkü gözlenen iki pikin yükseklikleri arasındaki fark azdır. (Şekil 3.5.) Şekil 3.5. de görüldüğü gibi, 29 allelinin önündeki pikin stutter olduğu gayet açıktır. Görüldüğü gibi aynı konsantrasyon ve karışım oranındaki iki örnekte majör ve minör bileşenlerin yeri değiştiğinde iki farklı durum ortaya çıkabilmektedir. D/E, 1:8, 1 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesinde 4 pik gözlenmesi gerekirken yazılım tarafından 3 pike isim verilmiştir. (Şekil 3.6.) Burada 12 ve 14 ün majör bileşenden geldiği açıktır. Ancak minör bileşenin 13 allelini taşıdığı bilinmeseydi cihazın isimlendirmesine rağmen bu pikin 14 allel pikinin stutteri olduğu düşünülebilirdi. Zira 13 pikinin yüksekliği 51, 14 ünkü ise 353 tür ve küçük pik büyüğün %15 inden küçüktür. Şekil 3.6. te 14 pikinin ilerisinde bir pik daha görülmektedir fakat yüksekliğinin 13 pikinden de daha düşük olduğu anlaşılmaktadır. Bu kadar düşük yükseklikte bir pikin değerlendirilmesi uygun olmayacaktır. Aynı şekilde 13 pikinin de değerlendirme dışı bırakılmasında fayda vardır. Yine aynı numunenin D18S51 bölgesi incelendiğinde, 4 pik gözlenmesi gerekirken yazılım tarafından isimlendirilmiş 3 pikin varlığıyla birlikte isimlendirilmemiş bir pik daha görülmektedir. (Şekil 3.7.) 13 pikinin yüksekliği 75, 14 ünki 424, isimlendirilmemiş pikin 57 ve 16 pikinin yüksekliği ise 386 dır. 13 ün yüksekliği 14 ünkinin %15 inin üzerinde olduğu için isimlendirilmiş, diğer küçük pik ise 16 nınkinin %15 inden küçük olduğundan stutter olarak değerlendirilmiştir. E/D, 1:8, 0,5 ng/µl örneğinin D19S433 bölgesinde beklenen 4 allel de isimlendirilmiştir ancak bir de yazılım tarafından isimlendirilmemiş bir pik gözlenmektedir. (Şekil 3.8.) 12 pikinin yüksekliği, 190, 13 ünki 1027, 14 ünki 102, isimlendirilmemiş pikinki 95 ve 15.2 ninki 1014 tür. Görüldüğü gibi, 14 ve yanındaki küçük pikin yükseklikleri birbirine çok yakındır. İsimlendirilememiş pik

83 73 allelik ladder ile karşılaştırıldığında 14.2 ye karşılık gelmektedir. Yükseklik olarak da 15.2 nin %15 inden küçüktür ve yazılım tarafından stutter olarak değerlendirilmiştir. Ancak 12 alleli gözlenmeseydi bu, minör bileşenden gelmiş bir pik de olabilirdi. E/D, 1:16, 0,5 ng/µl numunesinin D19S433 bölgesinde 4 pik beklenirken 3 ü isimlendirilmiş, 2 si isimlendirilmemiş 5 adet pik görülmektedir. (Şekil 3.9.) İlk isimlendirilmemiş pikin yüksekliği 116, 13 pikinin 966, 14 ün 54, ikinci isimlendirilmemiş pikinki 92 ve 15.2 pikinin yüksekliği 999 dur. 13 ün önündeki pik 13 pikinin yüksekliğinin %15 inin altında olduğu için yazılım tarafından stutter olarak değerlendirilmiştir. Halbuki bu pik minör bileşenden gelen 12 alleline aittir. İkinci isimlendirilmemiş pik 15.2 pikinin %15 inden küçüktür ve stutter olarak değerlendirilmiştir. Ancak yükseklik olarak hemen önündeki 14 pikinden daha yüksek olduğu görülmektedir. Dolayısıyla bu minör bileşenden gelmiş bir pik olabilirdi. Aynı numunenin D18S51 bölgesinde ise yine 4 allel beklenirken 3 ü isimlendirilmiş, 1 i isimlendirilmemiş 4 pik görülmüştür. (Şekil 3.10.) İsimlendirilememiş pikin yüksekliği 99, 15 allelininki 686 dır. 15 pikinin %15 inden küçük olduğu için isimlendirilmemiştir. Öte yandan bu pikten çok daha küçük olan 16 alleli isimlendirilmiştir. Burada da gerçek minör bileşen pikini belirlemede güçlük ortaya çıkmıştır. D/E, 1:32, 0,5 ng/µl numunesinin vwa bölgesinde 4 pik beklenirken 3 ü isimlendirilmiş, 3 ü isimlendirilmemiş 6 pik görülmektedir. (Şekil 3.11.) Birinci ve ikinci pikin yüksekliği 54 tür. Yükseklikleri aynı olmasına rağmen ilk pik isimlendirilememiş ikincisi ise 15 alleli olarak değerlendirilmiştir. Minör bileşenden gelen piklerin bu iki pik olduğu bilinmektedir. Majör bileşene ait 17 ve 19 piklerinin önlerindeki pikler de stutter olarak değerlendirilmiş ve isimlendirilmemiştir. Halbuki bu piklerin yükseklikleri minör bileşenden geldiği bilinen piklerinkinden daha yüksektir.

84 74 Şekil 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10 ve 3.11 de verilen örneklerde görüldüğü gibi stutterları tanıma konusunda yazılıma fazla güvenmemek gerekmektedir. Çünkü yazılım tarafından minör bileşen piki stutter, stutter piki gerçek pik olarak değerlendirilebilmektedir. Bu noktada uzmanın bilgi ve tecrübesi devreye girmelidir. Ancak en doğrusu minör bileşenin çok düşük olduğu karışım örneklerini mümkün mertebe değerlendirmemek olabilir. Degrade (yapısı bozulmuş) DNA varlığının da karışım yorumlanmasını etkilediği bilinmektedir. Degredasyon ile DNA molekülü ufak parçalara kırılmaktadır. Bu da PCR işleminde verim düşüklüğüne neden olur. Degredasyondan moleküler ağırlığı fazla olan lokuslar öncelikli olarak etkilenir. Bu durum numuneden elde edilen elektroferogramda büyük lokuslarda sinyal kaybı şeklinde görülür (drop-out). Sinyalin tamamen yokolduğu durumlarda kısmi profil elde edilir ve karışım yorumlanması güçleşir (Clayton ve ark., 1998; Ladd ve ark., 2001). Degrade DNA dan kaynaklanan kısmi profiller için, farklı bir ticari kit ile yapılan amplifikasyonda daha başarılı sonuçlar elde edilebileceği bilinmektedir. Çünkü kitler için kullanılan primerlerin bağlanma bölgeleri farklı olabilmektedir (Ladd ve ark., 2001). Nitekim Torres ve Sanz ın (2006) yaptığı çalışmada geçmiş yıllarda çalışılmış olan 55 adet karışım örneği aynı üretici firmanın 4 farklı kiti (AmpFlSTR Profiler Plus, Cofiler, Identifiler ve SGMPlus) kullanılarak tekrar tiplendirilmiştir. 11 örneğin ikiden fazla bileşenli karışım olduğu tespit edilmiştir. 1 örnekte DNA karışımın artık tespit edilmediği, 3 örnekte ise her 4 kit için de kısmi profil elde edildiği görülmüştür. 1 örneğin Identifiler kiti ile 1 örneğin de SGMPlus ile sonuç vermediği tespit edilmiştir. 55 örneğin sadece 5 tanesi geçmişteki ile aynı profili vermiştir. SGMPlus ve Profiler Plus, karışım tespitinde aynı başarı oranını göstermiş fakat SGMPlus da tam profil elde etme oranı daha yüksek, lokus drop-outu ise daha düşük olarak belirlenmiştir. Identifiler kitinde ise en kötü sonuçlar elde edilmiştir. SGMPlus kitinin bu başarısı, primer sekanslarının diğer üç kitten farklı olmasına bağlanmıştır. SGMPlus kitinde hassasiyeti arttırmak için bazı değişiklikler yapılmıştır (Torres ve Sanz, 2006). Ancak ülkemizde bu dört kitten Identifiler kullanılmaktadır. Çünkü diğer üç kitten daha fazla (16 adet) gen bölgesi içermektedir.

85 75 Degrade örneklerde allel pik yükseklikleri düştüğü ve allel drop-out da meydana gelebildiği için stutter piklerin profili yorumlamaya olumsuz etkisi de artmaktadır (Tomsey ve ark., 2001). Degredasyon DNA molekülüne etki eden yüksek sıcaklık, nem, radyasyon gibi fiziksel faktörler tarafından oluştuğundan olay yeri biyolojik bulguları üzerinde etkisi olabilir. Çalışmada şahıslardan alınan biyolojik örnekler kullanıldığından degradasyon etkisi gözlenmemiştir. Kısmi profil elde edilmesine neden olan bir diğer faktör de PCR inhibitörleridir. İnhibitörlerin etkisi ile düşen PCR kalitesiyle drop-out veya heterozigot allellerde dengesizlik gözlenebilir. İnhibitörlerin etkisi lokus büyüklüğünden bağımsızdır. Dolayısıyla tüm profili de etkileyebilir (Tomsey ve ark., 2001). İnhibitörler de daha ziyade olay yeri numunelerini etkilemektedir (toprakta bulunan bazı maddeler, kumaş boyaları gibi). Ancak kan içinde de inhibitör maddeler olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla referans kan örneklerini de etkileyebilecek bir faktördür. Fakat günümüzde kullanılan DNA izolasyon yöntemlerinde mümkün olduğunca saf ve inhibitörlerden de arınmış DNA elde edilebilmektedir. Ancak inhibitör miktarı fazla olduğunda kullanılan izolasyon kitlerinin saflaştırma kapasitesi yeterli olmayabilir. Çalışmada ağız svabı örnekleri kullanıldığından inhibitörlerden etkilenme olasılığı bulunmamaktadır.

86 76 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Karışımların yorumlanmasının kolay bir iş olmadığı açıktır. Karışım olduğu düşünülüp kayıt altına alınacak her allelin gerçekten o karışımı oluşturan donörlere ait olup olmadığının iyice kontrol edilmesi gerekmektedir. Bunun için de elde sağlıklı bir profil bulunması, bunun yorumlanmasındaki güçlüğü azaltacaktır. Bu çalışmadan elde edilen veriler değerlendirildiğinde, bir karışım DNA profili ile karşılaşıldığında uygulanması gereken kriterler ortaya çıkmaktadır. Bunlar: 1. Elde edilen DNA profilinde bazı lokuslarda ikiden fazla allel gözlendi ise bu profil karışım DNA profili olarak tespit edilir. 2. Karışım içinde kaç donöre ait DNA profilinin olduğunu tespit etmek için tüm lokuslar taranır. Herhangi bir lokusta 4 ten fazla pik bulunuyor ise karışım içinde ikiden fazla donör bulunuyor olabilir. 3. İkili karışımlarda donörlerin cinsiyetlerini belirlemek için Amelogenin lokusu incelenir. Yalnızca X alleli gözlendi ise her iki donör de kadın olabilir. X ve Y alleli birlikte gözlendi ise X ve Y piklerinin birbirlerine oranına bakılır. Oran 1 e çok yakın ise her iki donörün de erkek olduğu söylenebilir. Ancak aralarındaki oran 1 den farklı ise kadın-erkek profili karışımı söz konusudur. 4. Karışım oranını tespit etmek için her iki donörün de heterozigot olduğu bölgeler kullanılır. Eğer kadın-erkek karışımı söz konusu ise, Amelogenin lokusundan da yararlanılır. Hatta bu çalışmada Amelogenin lokusundan elde edilen karışım oranının daha güvenilir olduğu tespit edilmiştir. Lokus için gözlenen piklerin alanları ya da yükseklikleri kullanılarak karışım oranları hesaplanır. Amelogenin lokusu kullanılıyor ise elde edilen oran Çizelge 3.4. ten yararlanarak heterozigotlar için elde edilmesi beklenen

87 77 oranlarla karşılaştırılabilir. Yine bu çizelgeden yararlanarak majör ve minör bileşenlerin cinsiyetleri tespit edilebilir. 5. Tespit edilen DNA profilinde hedef DNA nın konsantrasyonu 0,06 ng/µl den düşük ise karışım olduğundan şüphe edilse bile bu profil karışım olarak değerlendirilmemelidir. 6. Elde edilen karışım oranının karışımın yorumlanmasında büyük önemi vardır. Çalışmada 1:32 olarak planlanan karışım oranlarındaki DNA profillerinde karışım varlığı tespit edilemeyecek durumda olduğundan majör-minör bileşenlerin hacimleri arasında bu kadar büyük bir fark olduğunda minör bileşenin tespit edilemeyeceği anlaşılmaktadır. 7. Çalışmada tüm karışım çeşitleri için 1:16 olarak planlanan karışımlardan hesap yapılabilen bölgelerde oranlar 1:8 ile 1:16 arasında değişen bir skalada tespit edilmiştir. (Çizelge 3.1., 3.3. ve 3.6.) Bu oranlarda planlanan örnekler için düşük konsantrasyonlarda (0,25; 0,06 ve 0,02 ng/µl) amplifikasyon başarısı düşük olmuş ve karışım tespiti güçleşmiştir. Dolayısıyla eğer hedef DNA konsantrasyonu 0,25 ng/µl ve bunun altında iken herhangi bir bölgede 1:8-1:16 arasında bir oran hesaplandıysa bu profilin karışım olarak değerlendirilmesi sağlıklı olmayabilir. 8. Çalışmada 1:8 olarak planlanan karışımlardan hesap yapılabilen bölgelerde oranlar 1:4 ile 1:10 arasında değişen bir skalada tespit edilmiştir. (Çizelge 3.1., 3.3. ve 3.6.) Bu oranlarda planlanan örnekler için özellikle 0,06 ve 0,02 ng/µl konsantrasyonlarda karışım tespiti güçleşmiştir. Dolayısıyla eğer hedef DNA konsantrasyonu 0,06 ng/µl ve bunun altında iken herhangi bir bölgede 1:4 ile 1:10 arasında bir oran hesaplandıysa bu profilin karışım olarak değerlendirilmesi sağlıklı olmayabilir.

88 78 9. Oranı 1:4, 1:2 ve 1:1 olarak planlanan karışım örneklerinden elde edilen DNA profillerinin 0,02 ng/µl dışındaki tüm konsantrasyonlarda rahatlıkla karışım DNA profili olarak değerlendirilebildiği tespit edilmiştir. Dolayısıyla miktarı çok düşük olmamak şartıyla söz konusu oranlar elde edilmiş DNA profilleri sağlıklı profiller olarak kabul edilip olası genotip kombinasyonlarının çıkarılması için üzerinde çalışma yapılabilir. Eğer elde referans örnek varsa bununla rahatlıkla mukayese edilebilir. Görüldüğü gibi, hedef DNA nın konsantrasyonu oldukça ayırıcı bir parametredir. Uzman elde ettiği profili incelerken öncelikle konsantrasyonu dikkate almalı, daha sonra elde ettiği karışım oranını değerlendirmelidir. Ayrıca stutterlar gibi faktörler devreye girdikçe olası genotip kombinasyonlarının belirlenmesinde hatalar ortaya çıkabilmektedir. Uzman emin olmadığı profilleri karışım olarak değerlendirmemelidir. Karışım olduğundan tam olarak emin olunamayan örnekler için aşağıdaki işlemlerden uygun olanları yapılarak ilave incelemeler gerçekleştirilebilir: 1. Konsantrasyon çok düşük ise, PCR işlemi öncesi çöktürme işlemi yapılarak reaksiyona eklenecek DNA, tüpün dibinden alınarak konabilir. Bu şekilde DNA örneği biraz yoğunlaştırılmış olur. 2. Yine konsantrasyon düşük ise, PCR işlemindeki döngü sayısı arttırılarak yeni bir PCR yapılabilir. 3. Karışımdaki majör- minör bileşen hacmi arasındaki fark çok fazla ise minör bileşenin tespiti için yukardaki işlemlerin yanı sıra delile geri dönülerek (eğer varsa) farklı bölgelerden ya da svap çubuklarından yeniden örnekler alınıp izolasyon ve amplifikasyon yapılabilir. Çünkü bu yeni örneklerde minör bileşenin daha yoğun olma olasılığı bulunabilir.

89 79 4. Eğer kadın-erkek karışımı söz konusu ise ve minör bileşenin erkek olduğu tespit edilmişse bunun varlığından emin olmak için Y kromozomu üzerindeki STR gen bölgelerini çoğaltmak için dizayn edilmiş kitler kullanılabilir. 5. Erkek-erkek karışımları için de Y-STR ler gerekli hallerde kullanılabilir. Ancak her iki erkek donörün aynı baba soyundan gelmesi halinde (Y-STR profili aynı baba soyundan gelen tüm erkek bireylerde mutasyonlar hariç aynı olduğundan) Y-STR lerin bir ayrım gücü olmayacaktır. Çünkü karışım örneği için tek Y-STR profili elde edilecektir. 6. Özellikle cinsel saldırı olaylarında kadına ait herhangi bir biyolojik örnek ile erkeğe ait sperm örneklerin birarada olduğu deliller üzerinden kadın ve erkek DNA profillerini karışım halinde değil ayrı ayrı elde etmek için diferansiyel (ayırıcı) ekstraksiyon yöntemleri kullanılabilir. Böylelikle karışım DNA profilleri ile karşılaşma olasılığı azalmış olur. Karışımlara kontaminasyon olayı haricinde yalnızca olay yeri örneklerinde rastlandığından, profiller değerlendirilirken DNA degredasyonu ve PCR inhibitörlerinin varlığı da her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Sonuç olarak, uzman ne kadar deneyimli olursa olsun, düşük konsantrasyonlarda, minör majör bileşen hacimleri arasında büyük farklar olduğunda, elinde referans örneklerine ait DNA profilleri bulunmuyorsa, elde ettiği profilin karışım olduğunu tespit etmekte güçlük çekecektir. Karışım DNA profili analizler sonucunda sahibi tespit edilemeyen olarak kalacaksa bunun karışım profil olarak DNA profil arşivine ve uzmanlık raporuna girmesi sakıncalar yaratabilir. Çünkü tespit edildiği düşünülen düşük pik yükseklikli alleller gerçekten minör bileşene ait olmayabilir. Bu profil ile mukayese için gelecekte referans örnekler gönderildiğinde boş yere mukayese yapma ihtimali bulunmaktadır.

90 80 Karışımların değerlendirilmesi üzerine daha fazla eğilme ihtiyacı bulunmaktadır. Bu konu ile ilgili yeterlilik testlerine katılmak bir adli DNA laboratuvarı için son derece faydalı olabilir. Ayrıca karışımların tespiti ve yorumlanması ile ilgili mevcut yazılımlardan uygun olan araştırılıp tedarik edilmeye çalışılabilir. Olası genotip kombinasyonlarının tespit edilebilmesi için geliştirilen istatistiksel yöntemlerin uygulanması konusunda uygulama yapan laboratuvarlardaki tecrübeli personelden eğitim alınabilir. Bir adli DNA laboratuvarında, DNA amplifikasyonunda kullanılan kit ve tiplendirmede kullanılan ekipman ile diğer malzemeler için validasyon (geçerli kılma) çalışması yapılarak söz konusu malzemelerle o laboratuvar koşullarında yapılan çalışmaların başarı sınırları belirlenmektedir. Farklı bir kit ya da genetik analizör cihazı kullanıldığında hem tek kaynaklı örnekler için hem de karışım örnekleri için bu tür bir çalışmanın yapılıp tespit limitlerinin belirlenmesi gerekmektedir. Çünkü her kitin ve cihazın hassasiyeti farklıdır. Bu da bir adli DNA laboratuvarı için validasyon çalışmalarının ne kadar önemli olduğunu göstermektedir.

91 81 ÖZET Karışım DNA Profillerinin İncelenmesi ve Yorumlanması Karışım DNA profillerine, başta cinsel saldırı olayları olmak üzere başka bir çok olayda rastlanmaktadır. Karışımların tespit edilmesi ve yorumlanması eğitim ile birlikte deneyim gerektirmektedir. Bu tez çalışmasındaki amaç, bir adli DNA laboratuvarın imkan ve kabiliyetleri ile, karışım DNA profillerinin incelenmesi ve yorumlanması için rutinde uygulanacak bir rehber oluşturmaktır. Çalışmada gönüllü şahıslardan ağız svapları alınmış ve bunlardan DNA izole edilmiştir. Elde edilen izolatların miktarları ölçülmüş ve eşleşmelerinden kaç bölgede heterozigot olacakları dikkate alınarak kadın-kadın, kadın-erkek ve erkek-erkek karışım çeşitleri oluşturulmuştur. Bu karışım çeşitleri için kullanılacak donörlerin stok DNA larını planlanan 6 çeşit konsantrasyona getirmek için dilüsyon işlemleri yapılmış daha sonra, planlanan 6 oranda karışımlar hazırlanmıştır. Toplam 172 adet karışım örneği hazırlanmış, amplifiye edilmiş ve tiplendirilmiştir. Sonuç olarak karışım konsantrasyonu ve karışım oranının profil elde etme başarısını birbirinden bağımsız olarak etkilediği ve bu iki değişkenin ayrı ayrı değerlendirilmesi gerektiği ortaya çıkmıştır. 0,25 ng/µl ve altındaki konsantrasyonlarda 1:8-1:16 arasında karışım oranına sahip örneklerin karışım DNA profili olarak değerlendirilmesinin sakıncalı olduğu, 1:1, 1:2 ve 1:4 oranlı karışımlarda ise 0.02 ng/µl haricindeki tüm konsantrasyonlarda başarılı bir şekilde karışım değerlendirmesi yapılabiceği tespit edilmiştir. Elde edilen bulgular yardımıyla karışım DNA profilleri ile karşılaşıldığında bunların incelenmesi ve yorumlanması sırasında uygulanması ve dikkat edilmesi gereken hususlar ortaya koyulmaya, adli DNA analiz uzman/uzman yardımcısı personel için uygulamada kullanılmak üzere tavsiyelerde bulunulmaya çalışılmıştır. Anahtar Kelimeler: DNA, Karışım DNA profili, Karışım oranı, Majör bileşen, Minör bileşen.

92 82 SUMMARY The Examination and Interpretation of Mixed DNA Profiles The mixed DNA profiles are encountered in most cases especially sexual assault cases. The detection and interpretation of mixtures require training and experience. The aim of this thesis is to establish a guidance to be applied for examination and interpretation of mixed DNA profiles with the capability of a forensic DNA laboratory. In the study, mouth swabs were taken from volunteer people and DNA were isolated from these were established by determining how many heterozygous are in coupled DNA. In order to balance stock DNA which is used for this mixture through the planned 6 concentrations. Afterwards, the mixtures were prepared on 6 planned ratios. Totally, 172 mixture samples were prepared, amplified and identified. As a result, profiling by mixture concentration and mixture proportion are independent, and it appears that these two variables are determined seperately. It is nonsense to evaulate the samples having mixture proportion between 1:8-1:16 as a mixture DNA profile on concentration 0,25 ng/µl and belows, it is determined that on 1:1, 1:2 and 1:4 mixture proportions, mixture evaulation can be pereformed succesfully on all concentrations except concentration 0.02 ng/µl. It is tried to identify what should be done and should be taken care with the help of findings reached in the course of examination and interpretation of mixed DNA profiles which are met and tried to advise to the forensic DNA expert/assistant for using on the examination. Key Words: DNA, Major component, Minor component, Mixed DNA profile, Mixture ratio

93 83 KAYNAKLAR ANDRADE, F.G., BOLEA, M., JARRETA, B.M., SANCHEZ, D. (2006). DNA mixtures in forensic casework resolved with ausomic STRs. International Congress Series. 1288: APPLIED BIOSYSTEMS. (1998). AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplication Kit User s Manual. Foster City, California. APPLIED BIOSYSTEMS. (2001). AmpFlSTR Identifiler System User s Manual. Foster City, California. APPLIED BIOSYSTEMS (2008). Quantifiler Duo DNA Quantification Kit User s Manual. Foster City, California. AŞICIOĞLU, F. (2002). Y-STR polimorfizminin adli genetikteki önemi ve uygulanması. Erişim:[ Erişim Tarihi: BACHER, J.W., HENNES, L.F., GU, T., TEREBA, A., MICKA, K.A., SPRECHER, C.J., LINS, A.M., AMIOT, E.A., RABBACH, D.R., TAYLOR, J.A., HELMS, C., DONIS- KELLER, H., SCHUMN, J.W. (1999). Proceedings of the Ninth International Symposium on Human Identification. p.: Madison, Wisconsin: Promega Corporation. BRIGHT, J.A., TURKINGTON, J., BUCKLETON, J. (2010). Examination of the variability in mixed DNA profile parametres for the Identifiler multiplex. Forensic Sci. Int.:Genetics. 4(2): BUCKLETON, J.S., CURRAN, J., GILL, P. (2007). Towards understanding the effect of uncertainty in the number of contributers to DNA stains. Forensic Sci. Int.:Genetics. 1: BUTLER, J.M. (2005). Forensic DNA Typing. 2 nd Ed. p.: Elsevier Academic Press. Oxford, UK. BUTLER, J.M. (2008). Strategies for mixture deconvolution. Erişim:[ AAFS2008_Mixture Workshop.htm] Erişim Tarihi: CERRI, N., RICCI, U., SANI, I., VERZELETTI, A., DE FERRARI, F. (2003). Mixed stains from sexual cases: Autosomal or Y-chromosome Short Tandem Repeats?. Croatian Medical Journal. 44(3):

94 84 CLAYTON, T.M., WHITTAKER, J.P., SPARKES, R., GILL, P. (1998). Analysis and interpretation of mixed forensic stains using DNA STR profiling. Forensic Sci. Int. 91: COTTON, R.W. (1995). Proceedings from the Sixth International Symposium on Human Identification. p.: Madison, Wisconsin: Promega Corporation. COWELL, R.G., LAURITZEN, S.L., MORTERA, J. (2007). Identification and separation of DNA mixtures using peak area information. Forensic Sci. Int. 166: ÇELEBİOĞLU, A. (2011). DNA nın Delil Olarak Kabul Edilmesi. Adli Bilimler II. CİHANGİROĞLU, B. s.: Jandarma Kriminal Daire Başkanlığı Yayınları. Ankara. DEKAIRELLE, A.F., HOSTE, B. (2001). Application of a Y-STR-pentaplex PCR (DYS19, DYS389 I and II, DYS390 and DYS393) to sexual assault cases. Forensic Sci.Int. 118: DEMİRÇİN S. (2008). Y-STR analizleri. Erişim: [ Erişim Tarihi: EVETT, I.W., FOREMAN, L.A., LAMBERT, J.A., EMES, A. (1998). Using a tree diagram to interpret a mixed DNA profile. J. Forensic Sci. 43(3): FİLOĞLU, G. (2008). DNA tipleme yöntemleri (somatik STR lokusları). Erişim: [ Erişim Tarihi: GILDER, J.R., DOOM, T.E., INMAN, K., KRANE, D.E. (2007). Run-spesific limits of detection and quantification for STR-based DNA testing. J. Forensic Sci. 52(1): GILL, P., SPARKES, R., KIMPTON, C. (1997). Develpment of guidlines to designate alleles using on STR multiplex system. Forensic Sci. Int. 89: GILL, P., SPARKES, B., CLAYTON, T.M., WHITTAKER, J., URQUHART, A., BUCKLETON, J. (1998). Interpretation of mixtures based on peak area-identification of genetic anomalies, stutters and other artefacts. 2nd European Symposium on Human Identification. Madison, Wisconsin: Promega Corporation. GILL, P., BRENNER C.H., BUCKLETON, J.S., CARRACEDO, Â., KRAWCZAK, M., MARY, W.R., MORLING, N., PRINZ, M., SCHNEIDER P.M., WEIR, B.S. (2006). DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics: Recommendations on the interpretation of mixtures. Forensic Sci. Int. 160: GILL, P., CURRAN, J., NEUMANN, C., KIRKHAM, A., CLAYTON, T., WHITAKER, J., LAMBERT J. (2008a). Interpretation of complex DNA profiles using empirical models and a method to measure their robustbes. Forensic Sci. Int.:Genetics. 2:

95 85 GILL, P., BROWN, R.M., FAIRLEY, M., LEE, L., SMYTH, M., SIMPSON, N., IRWIN, B., DUNLOP, J., GREENHALGH, M., WAY, K., WESTACOTT, E.J. (2008b). National recommendations of the Technical UK DNA working group on mixture interpretation for the NDNAD and for court going purposes. Forensic Sci. Int.:Genetics. 2: KRENKE, B.E., TEREBA, A., ANDERSON, S.J., BUEL, E., CULHANE, S., FINIS, C.J., TOMSEY, C.S., ZACHETTI, J.M., SPRECHER, C.J. (2002). Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J.Forensic Sci. 47(4): LADD, C., LEE, H.C., YANG, N., BIEBER, F.R. (2001). Interpretation of complex forensic DNA mixtures. Croatian Medical Journal. 42(3): LAURITZEN, S.L., MORTERA, J. (2002). Bounding the number of contributers to mixed DNA stains. Forensic Science International. 130: MORLING, N., BASTISCH, I., GILL, P., SCHNEIDER, P.M. (2007). Interpretation of DNA mixtures-european Consensus on principles. Forensic Sci. Int.:Genetics.1: PESTONI, C., CAL, M.L., LAREU, M.V., RODRIGUEZ-CALVO, M.S., CARRECEDO, A. (1998). Y-chromosome STR haplotypes: Genetic and sequencing data of the Galician population (NW Spain) Int.J.Legal Med. 112: PRINZ. M., SANSONE, M. (2001). Y Chromosome-spesific Short Tandem Repeats in forensic casework. Croation Medical Journal. 42(3): PROMEGA. (2008). Internal Validation of STR Systems. Reference Manual. USA. TOMSEY, C.S., KURTS, M., FLOWERS, B., FUMEA, J., GILES, B., KUCHERER, S. (2001). Case work guidelines and interpretation of Short Tandem Repeat complex mixture analysis. Croation Medical Journal. 42(3): TORRES, Y., FLORES, I., PRIETO, V., LOPEZ-SOTO, M., FARFAN, M.J., CARRACEDO, A., SANZ, P. (2003). DNA mixtures in forensic casework: a 4-year retrospective study. Forensic Sci Int. 134: WALSH, P.S., METZGER, D.A., HIGUCHI, R. (1991). Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic materials. BioTechnicques. 10(4): WEIR, B.S., TRIGGS, C.M., STARLING, L., STOWELL, L.I., WALSH, K.A.J., BUCKLETON, J. (1997). Interpreting DNA mixtures. J. Forensic Sci. 42(2):

96 86 WICKENHEISER, R.A. (2006). General guidelines for categorization and ınterpretation of mixed STR DNA profiles. Canadian Society of Forensic Science Journal., 39(4): YAMAMOTO, T., UCHIHI, R., ANDO, Y., SUZUKI, M., YOSHIMOTO, T., KATSUMATA, Y. (2006). Newly designed multiplex amplification and genotyping system at four pentanucleotide repeat STR loci useful for degraded mixed DNA specimens. International Congress Series. 1288:

97 EKLER 87

98 88