İDYOPATİK JENERALİZE EPİLEPSİLERDE GENETİĞİN YERİ VE SCN1A GENİNDE D188V MUTASYONU

Transkript

1 T.C. Sağlık Bakanlığı Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Kliniği Klinik Şefi: Prof. Dr. Osman Tanık İDYOPATİK JENERALİZE EPİLEPSİLERDE GENETİĞİN YERİ VE SCN1A GENİNDE D188V MUTASYONU (Nöroloji Uzmanlık tezi) Dr.Hatice SEĞMEN İstanbul-2005 ÖNSÖZ

2 Nöroloji uzmanlık eğitimim sırasında bilgi ve deneyimlerini aktaran, bana her konuda destek veren hocam Prof. Dr. Osman Tanık a, Şef yardımcısı Dr. Parnoh Samurkaş a, İhtisasım sırasında başhekimlik görevinde bulunan Dr. Fehmi Baran a, Uzmanlarımız, başta Dr. Canan Bolcu Emir olmak üzere Dr. Jale Ağaoğlu, Dr. Serpil Moralı, Dr. Tülay Yetkin ve Dr. Fuldan Aktaş a eğitimimde yol gösterip, emek ve zamanlarını paylaştıkları için; Tezimle ilgili çalışmamın laboratuar aşamalarında özverili çalışması ve üniversite sıralarından beri her zaman yakın dostluk ve arkadaşlığı ile yanımda olduğu için İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü Araştırma Görevlisi Sema Sırma ya, Tezimle ilgili olarak bana büyük yardımı dokunan Dr. İsmet Kandemir e, İhtisasım sırasında hemşire olarak görev yapan ve tezimin belli aşamalarında katkısı olan Filiz Köksal, Aynur Danacı, Hülya Dal, Fatma İnam ve Gülten Belgin e, Tezimin başlangıcından son aşamasına kadar desteğini esirgemeyen ve stresimi paylaşan ablam Dr. Müberra Seğmen Yılmaz a, Tüm yaşamım ve tıp eğitimim boyunca benden sevgi ve desteklerini esirgememiş olan aileme, Bu günü görmüş olmasını çok istediğim fakat ihtisasım sırasında kaybettiğim sevgili babama teşekkür ederim. Dr.Hatice Seğmen

3 İÇİNDEKİLER Sayfa GİRİŞ 4 GENEL BİLGİLER.6 MATERYAL METOD 27 BULGULAR..33 TARTIŞMA 43 SONUÇLAR..48 RESİMLER 49 KAYNAKLAR...51 GİRİŞ Epilepsi, genel populasyonun yaklaşık %1 ini etkileyen, en sık rastlanan nörolojik hastalıklardan biridir. Toplumda bu kadar sık rastlanan bir hastalığın etyolojisinin aydınlatılması bilim çevrelerini uzun süre meşgul etmiş ve bu

4 konuda ilk karşılaşılan problem etyolojik heterojenite olmuştur. Epilepsinin pek çok nedeni olmasına rağmen vakaların çoğunda kesin etyoloji açıklanamaz. Etyolojinin açıklanamadığı bu vakalar günümüzde idyopatik başlığı altında incelenmekte olup etyolojiyi gösterme konusunda yeterli bilgi verici öykü, ailesel bulgu, klinik ve laboratuar bulgu mevcut değildir. Bütün epilepsilerin %40 ını oluşturan bu idyopatik epilepsilerde etyolojik olarak genetik faktörlerin rol oynadığı kabul edilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda Selim Ailesel Yenidoğan Konvülzüyonları (SAYK), Selim Ailesel İnfantil Konvülzüyon (SAİK), Otozomal Dominant Noktürnal Frontal Lob Epilepsisi (ODNFLE) ve Otozomal Dominant Lateral Temporal Epilepsi (ODLTE) gibi bir kaç epileptik sendromun patofizyolojisinin tespit edilmesi dikkatleri genetiğe çevirmiştir. Ancak kalıtsal kabul edilen epilepsilerin çok küçük bir kısmında şüpheli gen gösterilmiş olup bu genler iyon kanalları veya fonksiyonel proteinleri kodlayan genlerdir. Epilepsi sendromlarının çoğu basit kalıtımdan çok kompleks kalıtım gösterir. Bu nedenle genetik heterojenite ve uygun fenotipin tanımlanma zorluğu bu hastalıklarda şüpheli genlerin araştırılmasını zorlaştırmıştır. Epilepsilerin patolojisinin açıklanmasına önemli katkı sağlayabilecek bu genler doğru tanıya olanak sağlayabilir. Klinisyene hem nöbet tedavisi hem de epileptogenezin önlenmesi konusunda yardım edebilir. Bu çalışmaya Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Bölümünde yıllarında polikliniğe başvuran epilepsi hastaları arasından öykü, elektroensefalografi (EEG), görüntüleme özelliklerine bakılarak etyolojik bir nedenin bulunamadığı idyopatik jeneralize epilepsili hastalar dahil edilmiştir. Prospektif olarak yapılan bu çalışmada seçilen hastalarda İdyopatik jeneralize epilepsilerin patolojisinde önemli rolü olduğu düşünülen iyon kanallarını kodlayan gen mutasyonlarından en sık karşılaşılan sodyum kanalı alfa 1 alt tipinin (SCN1A) D188V mutasyonu araştırılmıştır.

5 GENEL BİLGİLER Tanım ve tarihçe: Epilepsi Merkezi Sinir Sisteminde belirli bir işlevi olan nöron topluluğunun ani, anormal ve hipersenkron deşarjı olarak tanımlanır. Bu tanımlama daha geniş anlamda nöronların somatik, psişik işlevi ile ilgili bilinç kaybını, paroksismal motor, duysal veya otonomik fenomenle birlikte olan, provake olmayan, beyin fonksiyonlarındaki geçici ve yineleyici bozuklukları kapsar (1,2). İlk kez J.H.Jackson, 19. yüzyılın sonlarında epilepsinin modern tanımını sinir dokusunun arasıra, aşırı, düzensiz deşarjı olarak yapmıştır.(3,4) Epilepsi kelimesi yunanca kavramak, yakalamak, ele geçirmek anlamına gelen Epi üstünden lipsis tutmak, tutup sarsmak kelimelerinden türemiş,

6 buna karşın nöbet kelimesinin karşılığı olarak kullanılan seizure kelimesi tutmak, yakalamak, ele geçirmek anlamındaki to seizure fiilinden gelişmiştir (5). Epilepsi ilk çağlardan beri bilinmektedir. M.Ö. 460 yılında doğan Hipokrat epilepsiyi bir beyin hastalığı olarak ilk kez tanımlamıştır. Epilepsi ile ilgili ilk monograf olan On the sacred disease (Kutsal hastalık hakkında) adlı kitabında hastalığın beyin yerleşimli olduğunu belirtmiş ve epilepsiye mal caduque adını vermiştir (5,6). Son yüzyılda epilepsi kavramı; pek çok klinisyenin gözlemlerinin birikimi ile ve nörofizyoloji, görüntüleme, genetik ilerlemelerin de katkısıyla oluşturulmuştur (7). Epilepsi tek bir antite değildir. Her birinin nedeni ve ortaya çıkış şekli farklı olan çeşitli hastalıklardan oluşmuş bir gruptur. Bunlara Epilepsiler demek daha doğru olacaktır. Epilepsilerin etyolojisinde genetik faktörlerin önemi kabul edilmiştir. Şüpheli genlerin bulunması epilepsinin patofizyolojisi hakkında bize bilgi sağlayabilir ve tedavi stratejilerimizi değiştirebilir. Günümüzde tedavi doğrudan nöbetlere yönelik olarak yapılmaktadır. Ancak nöbetler yalnızca altta yatan hastalığın bir sonucudur. Erken genetik inceleme ve tanımlama mümkün olabilirse bu durum klinisyene hem nöbet tedavisinde hem de epileptogenezin önlenmesinde yol gösterici olabilir (8). Epidemiyoloji: Epilepsi sık rastlanan bir nörolojik hastalıktır. Gelişmiş ülkelerdeki insidansı 40-70/ olup gelişmekte olan ülkelerde / oranındadır (2,7,9). Doğumdan 20 yaşına kadar olan zaman diliminde epilepsinin ortaya çıkma riski yaklaşık %1 civarında olup bu oran 75 yaşında %3 e kadar çıkar. Yani epilepsinin insidansı hayatın ilk yılı içinde ve 65 yaşından sonra iki kez pik yapar (4). Epilepsi çocuklarda erişkinlerden daha sıktır. Bütün nöbetlerin yaklaşık %75 i 20 yaş altında görülür. En yüksek insidans ise 10 yaş altındadır (10). Epilepsinin prevalansı yaklaşık %1 dir (2).

7 Aktif epilepsinin prevalansı, son beş yıl içinde nöbet geçiren veya antikonvülsan ilaç alan kişiler için kullanılır. Bu oran gelişmiş ülkelerde 4-10/ iken, gelişmekte olan ülkelerde 57/ ye ulaşır. Gelişmiş ülkelerde ortalama epilepsi prevalansı ise 6/1000 olup gelişmekte olan ülkelerde ortalama 18,5/1000 olarak bildirilmiştir (7,11). Gelişmekte olan ülkelerde epilepsinin insidansı ve prevalansı epilepsiye neden olan faktörlerden dolayı yüksektir. Doğum travması, kafa travması, enfeksiyon epilepsinin önlenebilecek nedenleri arasında başta gelir ve gelişmekte olan ülkelerde epilepsi insidansını artırırlar (11). Epilepsi tipleri içinde parsiyel nöbetler, sekonder jeneralizasyon olsun olmasın en sık nöbet tipidir. Parsiyel nöbetleri jeneralize tonik klonik nöbetler izler. Bunun dışındaki nöbet tipleri; absans, pür tonik, atonik ve miyoklonik nöbetler ise daha seyrek görülen nöbetlerdir (7). Epilepsiye erkeklerde kadınlardan kez daha sık rastlanır (7). Ailesinde epileptik üyeler bulunan kişilerde epilepsi gelişme olasılığı daha yüksektir. Eğer bir ebeveynde idyopatik epilepsi varsa çocuğun riski 1/25, semptomatik epilepsi varsa çocuktaki risk 1/67 dir. Her iki ebeveyn de etkilenmişse bu risk 1/25 den yüksektir (12). Sınıflama: Epilepsilerin sınıflandırılması iki eksen üzerine oturur (13). Birinci eksen temel ayrımı oluşturur; 1)Başlangıçtaki klinik ve EEG değişikliklerinin her iki beyin hemisferini birden tuttuğu jeneralize nöbetlerle seyreden epilepsilere jeneralize epilepsiler denir. 2)Nöbet semiyolojisinin veya inceleme bulgularının lokalize bir kaynağı gösterdiği parsiyel nöbetlerle seyreden epilepsilere lokalizasyonla ilişkili (lokal,parsiyel,fokal) epilepsiler denir. Bunlar beynin belli alanlarından çıkan lokalize deşarjlardır. 3)Hastanın bir arada veya ardı ardına hem fokal hem jeneralize nöbetlerinin izlendiği ve EEG bulgularının olduğu bir başka duruma da fokal mi jeneralize mi olduğu belirsiz epilepsiler denir.

8 İkinci eksen etyolojiyle ilşkilidir; 1)Herediter yatkınlık dışında bir sebebi olmayan epilepsilere idyopatik epilepsiler denir. 2)Sebebi bulunan epilepsilere semptomatik epilepsiler denir. 3)Semptomatik olduğu düşünüldüğü halde sebeb bulunamayan epilepsilere de kriptojenik epilepsiler denir. Nöbet tipleri ve başlangıç yaşları ile tedaviye yanıtı, klinik gidişleri ve ortak EEG bulguları mevcut, fakat etyolojileri farklı olabilen durumlar epilepsi sendromu adını alır (14). Jeneralize nöbetlerde bilinç bozukluğu, simetrik motor bulgular ve EEG de her iki hemisferde bilateral senkron deşarjlar vardır. Absans ve tonik-klonik nöbetler jeneralize nöbetlerin iki temel tipidir. Diğer nöbet tiplerini tonik, atonik, klonik ve miyoklonik nöbetler oluşturur (15, 16). İdyopatik jeneralize epilepsi (İGE) veya primer jeneralize epilepsi (PGE); Genetik temeli olan, iyi prognozlu, EEG de karakteristik 3 Hz diken dalga paterni görülen, yapısal bir beyin hastalığı ile ilişkisi olmayan sendromlardan oluşmuştur (17, 18). İnternational Leaguae Against Epilepsy (İLAE) sınıflamasında idyopatik jeneralize epilepsinin dokuzdan fazla tipi tanımlanmıştır (13). EPİLEPSİLERİN SINIFLANDIRILMASI VE EPİLEPTİK SENDROMLAR (13) 1.Lokalizasyonla ilişkili (fokal,lokal, parsiyel) epilepsiler ve sendromlar 1.1.İdyopatik (yaşla ilişkili başlangıç) -Sentrotemporal dikenli selim çocukluk çağı epilepsisi -Oksipital paroksizmli çocukluk çağı epilepsisi -Primer okuma epilepsisi 1.2.Semptomatik -Kronik progresif epilepsia partialis continua ( Kojewnikow sendromu)

9 -Özgül başlatılma tarzı olan nöbetlerle niteli sendromlar 1.3.Kriptojenik 2.Jeneralize epilepsiler ve sendromlar 2.1.İdyopatik (yaşla ilişkili başlangıç) -Selim ailesel yenidoğan konvülsiyonları -Selim yenidoğan konvülsiyonları -Çocukluk çağı selim miyoklonik epilepsi -Çocukluk çağı absans epilepsisi -Jüvenil absans epilepsisi -Jüvenil miyoklonik epilepsi -Uyanırken gelen grand mal nöbetler -Diğer jeneralize idyopatik epilepsiler -Özgül başlatılma tarzı olan nöbetlerle niteli epilepsi -Miyoklonik absans epilepsi 2.2.Kriptojenik veya semptomatik -West sendromu (infantil spazm) -Lennox-Gastaut sendromu -Miyoklonik-astatik nöbetli epilepsi -Miyoklonik absanslı epilepsi 2.3.Semptomatik Nonspesifik etyoloji -Erken miyoklonik ensefalopati -Suppression burst lü erken infantil epileptik ensefalopati -Diğer semptomatik jeneralize epilepsiler Spesifik sendromlar 3.Fokal mi jeneralize mi olduğu belirsiz sendromlar ve epilepsiler 3.1.Hem jeneralize hem fokal olan nöbetler -Yenidoğan nöbetleri -Sütçocukluğu çağı ciddi miyoklonik epilepsi -Yavaş dalga uykusunda sürekli diken dalgalı epilepsisi

10 -Edinilmiş epileptik afazi (Landau-Kleffner sendromu) -Tanımlanmamış başka epilepsiler 3.2.Kesin jeneralize veya fokal özellikleri olmayanlar 4.Özel sendromlar 4.1.Özel bir durumla ilişkili nöbetler 4.2.Febril nöbetler 4.3.İzole nöbetler veya izole status epileptikus 4.4Yalnız alkol, ilaçlar, eklampsi, nonketotik hiperglisemi gibi etmenlere bağlı akut metabolik veya toksik bir olay varken ortaya çıkan nöbetler EPİLEPSİDE GENETİK Genetik son yıllarda epilepsideki ilerlemelerin en heyacan verici alanlarından biri olmuştur. Pek çok epilepsi sendromunun temelinin heredite olduğundan uzun zaman şüphelenilmesine rağmen moleküler genetik defektlerin tespitindeki ilerlemeler yavaş olmuştur. Epilepsili hastaların yaklaşık %40 ının etyolojisinde genetik katkıdan sözedilir (19,20). Nöronlardaki genetik kontrol dolaylı veya dolaysız olabileceğinden sınıflandırmaya yönelik çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. Kalıtım mekanizmaları göz önüne alınarak gerçekleştirilen sınıflamada üç ana grup bulunmaktadır. Bunlar mendelyen hastalıklar, mendelyen olmayan-kompleks hastalıklar ve kromozomal hastalıklardır. Bir başka ayrım ise, tekrarlayan nöbetlerin çeşitli semptomları olan nörolojik hastalığın bir parçası olarak ortaya çıktığı epilepsiler ile tekrarlayan nöbetlerin nörolojik ve kognitif olarak tamamen normal kişilerde ortaya çıktığı epilepsileri belirtmeye yöneliktir (21). 1)Mendel tipi (basit) kalıtım: Bu kalıtım tipinde tek gen hastalıklarındaki kalıtımın karakteristik özellikleri vardır. Bunlar basit genetik özelliklerdir. Pek çok epilepsinin nedeni mendel tipi kalıtım olmamasına rağmen nadirde olsa bazı epilepsiler tek gen bozukluğunun olduğu mendel tipi kalıtım içerir. Tek gen kalıtım türleri; otozomal dominant, otozomal resesif, X geçişli

11 dominant, X geçişli resesif ve mitokondriyel geçişli türlerdir (22). Basit kalıtım gösteren nadir rastlanan epilepsiler epilepsinin genetik karmaşıklığı ve nedenleri hakkında daha çok bilgi edinmemizi sağladığından önemlidir. Epilepsinin fenotipin bir parçası olduğu mendelyen hastalıklar ve genetik özellikleri: Epilepsinin fenotipin yalnızca bir kısmını oluşturduğu 160 dan fazla tek gen hastalığı bulunmaktadır. Bu hastalıklar tüm epilepsilerin ancak %1 ini oluştururlar. Bu tek gen hastalıkları arasında nörokutanöz hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar, kalıtsal kortikal gelişim malformasyonları, kalıtsal metabolik hastalıklar sayılabilir. Bunlarda altta yatan nörolojik tutuluma bağlı semptomatik nöbetler, mental retardasyon ve gelişme geriliği görülmektedir (23). Tuberoz sklerozis kompleks: Otozomal dominant geçişlidir. Tuberoz sklerozis 1 (TSC1); 9q34 kromozomunda, tuberin geninde, GTPaz aktive edici proteinde mutasyon içerir. Tuberoz sklerozis 2 (TSC2); 16p13.3 kromozomunda, hamartin geninde mutasyon içerir (24, 25, 26). Frajil X sendromu: X geçişlidir. Xq27.3 kromozomunda mutasyon mevcuttur (27). Angelman sendromu: Maternal bilginin kaybı ile geçtiği bildirilmiştir. 15q11-13 delesyonu, UBE3A, GABRB3, GABRA5 ve GABRAG3 ü içeren delesyonlar bulunmuştur (28) (29). Rett sendromu: X e bağlı dominant geçtiği kabul edilir. Kesin olmamakla birlikte?xq28 kromozomunda mutasyon üzerinde durulmuştur (30). Nörofibromatozis: Otozomal dominant geçiş gösterir. NF1 de 17q11.2 kromozomunda, nörofibromin geninde ve NF2 de 22q12.2 kromozomunda mutasyon mevcuttur (31, 32). Huntington hastalığı: Otozomal dominant geçiş gösterir 4p16.3 kromozomunda, huntingtin geninde mutasyon mevcuttur (33, 34). Otozomal resesif kalıtımla geçtiği tanımlanan hastalıklar:

12 Bu hastalıkların en çok bilinenleri progresif miyoklonik epilepsiler başlığı altında incelenen Unverricht-Lundborg hastalığı ve Lafora cismi hastalığıdır. Unverricht-Lundborg hastalığı: Progresif miyoklonik epilepsilerin ilkidir (EPM1). 21q23 kromozomunda, sistatin B yi kodlayan gende mutasyon vardır (35). Lafora cismi hastalığı (EPM2): 6p24 kromozomunda, laforin geninde mutasyon vardır (36). Mitokondriyel hastalıklar: Mitokondriyel hastalıklardan en bilinen ikisi MERRF ve MELAS Sendromlarıdır. MERRF (Miyoklonik epilepsi ve ragged-red lifleri): Mitokondrial DNA da, 8344 nükleotid çiftinde A-G geçiş mutasyonu vardır (37). MELAS (mitokondriyel miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve strok benzeri epizod): Mitokondriyel geçişlidir, 3243 nükleotid çiftinde A-G geçiş mutasyonu mevcuttur (38). X geçişli hastalıklar: X geçişli hastalıklar, X geçişli dominant hastalıkların bir örneği olan X geçişli lissensefali, ailesel subkortikal band heterotopisi ve ailesel periventriküler heterotopidir (39,40,41) Primer mendel tipi epilepsiler: Tek gen hastalıklarının ancak çok küçük bir kısmını pür epilepsi sendromları oluşturmaktadır. Otozomal dominant mendelyen idyopatik epilepsiler hem jeneralize hem parsiyel epilepsileri içerir. Başlıca primer mendel tipi epilepsiler; Selim ailesel yenidoğan konvülzüyonu (SAYK) Selim ailesel infantil konvülzüyon (SAİK) Otozomal dominant noktürnal frontal lob epilepsisi (ODNFLE) Febril nöbet artı jeneralize epilepsi (FNJE) a) Selim ailesel yenidoğan konvülzüyonu (SAYK): Otozomal dominant kalıtımla geçen idyopatik jeneralize epilepsinin nadir görülen bir tipidir. Nöbetler genellikle yaşamın ilk birkaç gününde başlar ve sıklıkla 6 hafta civarında remisyon görülür. İLAE sınıflamasında jeneralize epilepsi olarak geçmesine rağmen, video EEG monitörizasyonunda parsiyel başlangıçlı nöbetler

13 görülür (13,42). Nöbet süresi genellikle kısadır ve jeneralize tonik-klonik faz özelliği gösterir. Nöbetlere motor otomatizmalar, oküler bulgular ve apne eşlik edebilir. Nörogelişim normaldir. %11 inde epilepsi erişkin dönemde de devam eder (43) yılında kromozom 20 nin uzun kolunda bağlantı analizi ile bir gen lokalize edilmiştir. Bu gen lokusu EBN1 olarak adlandırılmış olup bu sonuç daha sonra 6 Fransız ailede doğrulanmıştır (44,45) yılında 8. kromozomun uzun kolu üzerinde ikinci bir gen lokusu daha tespit edilip EBN2 olarak adlandırılmıştır (46) yılında genlerde her iki lokus da tanımlanmıştır (47, 48). SAYK voltaj kapılı potasyum kanalları KCNQ2 (kromozom 20 üzerinde) ve KCNQ3 (kromozom 8 üzerinde) mutasyonla ilişkili bulunmuş olup in vitro fonksiyonel çalışmalarda nöronun repolarizasyonunda önemli olan potasyum geçişinde fonksiyon kaybı olduğu tespit edilmiştir (47). b) Selim ailesel infantil konvülzüyon (SAİK): Başlangıçta Japonlarda tanımlanan bu sendrom otozomal dominant geçişli olarak İtalyanlarda tanımlanmıştır (49,50). Tipik olarak parsiyel nöbetlerin kümeleşmesi şeklindeki bu nöbetler 4-8. aylar arasında başlar. Psikomotor gelişim normal olup iyi prognozludur. İlki kromozom 19q üzerinde ve ikincisi paroksismal koreatetoz ile ilişkili kromozom 16 üzerinde olmak üzere iki lokus bildirilmiştir(51,52). Bazı çalışmalar seri ailelerde veya tek ailede epilepsinin klinik ortaya çıkışını tanımlamıştır fakat bu sendromların genetik bir temelinin olup olmadığı açık değildir. Paroksismal hareket hastalıkları ve epilepsi arasındaki bu önemli ilişki altta yatan patoloji olarak iyon kanalı bozukluklarına dikkati çekmiştir. c) Otozomal dominant noktürnal frontal lob epilepsisi (ODNFLE): 1994 yılında Avustralya, Kanada ve İngiltere deki ailelerde tanımlanmıştır (53) Uykudan kalkarken kümeler halinde görülen motor nöbetlerle karakterizedir. Etkilenen kişiler, tonik veya hiperkinetik özellikteki motor nöbetlerden önce

14 nonspesifik aura ile uyanabilir ve nöbet sırasında olanların farkında olabilirler. Bundan dolayı parasomnilerle, gece terörüyle ve histeriyle karıştırılabilir (54). Bu epilepsiler %70 penetranslı otozomal dominant kalıtımla geçer yılında Avustralyalı ailelerde kromozom 20q üzerinde haritalanmış ve daha sonra nöronal nikotinik asetilkolin reseptörünün alfa 4 alt tipini kodlayan CHRNa4 geninde mutasyonla ilişkili bulunmuştur (55). Aynı sendroma sahip diğer ailelerde yapılan çalışmalarda nikotinik asetilkolin reseptörünün diğer alt tiplerini kodlayan genlerin kümelendiği bölgelerde lokus heterojenitesini gösteren kanıtlar mevcuttur. Bir ailede nöronal nikotinik asetilkolin reseptörün beta 2 alt tipini kodlayan gende mutasyon (CHRNB2), diğer ailelerde de sendrom kromozom 15q24 le bağlantılı olduğu bulunmuştur (56). d) Febril nöbet artı jeneralize epilepsi (FNJE): Orta ve ciddi jeneralize epilepsileri içeren heterojen epilepsi fenotipleriyle karakterize bir genetik epilepsi sendromudur (57). En sık görülen fenotip Febril Nöbet(FN) ve ateşle birlikte olan nöbetlerin 6 yaşından sonra da ateşsiz tonik-klonik nöbetler şeklinde devam ettiği FN+ dır. Daha az rastlanan fenotipler; absans, miyoklonik veya atonik nöbetler şeklinde devam eden febril nöbetlerdir. En ciddi fenotipler; miyoklonik astatik epilepsi ve süt çocuğunun ciddi miyoklonik epilepsisidir. Parsiyel epilepsiler daha nadir görülür (58, 59). FNJE %60 penetranslı otozomal dominant kalıtım paterni gösteren nöbetleri olan ailelerde tanımlanmıştır. FNJE de kromozom 19q üzerinde FNJE1 ve kromozom 2q üzerinde FNJE2 olmak üzere iki lokus bulunmuştur(59,60) 1998 yılında FNJE1 de geniş bir Avustralya ailesinde voltaj kapılı sodyum kanalının beta 1 alt tipini kodlayan SCN1B geni bulunmuştur (54). Son zamanlarda ise alfa 1 sodyum kanal alt tipi SCN1A geni üzerinde 2 ailede mutasyon saptanmıştır (61). Aile öyküsünde ateşli nöbetler ve epilepsi varlığı olan, bir grup hastada bir sodyum kanal geni olan SCN1A da yeni bir mutasyon saptanmış ve FNJE,

15 Miyoklonik astatik Epilepsisi (MAE) ve Sütçocuğunun Ciddi Miyoklonik Epilepsisi (SCME) nin biyolojik moleküler verileri arasında ilişki kurulmuştur. Bu durum tablonun genetik doğasını desteklemektedir. 2)Mendel tipi olmayan (kompleks) kalıtım: Epilepside genetik faktörlerin katkısı çok çeşitli yollarla olur. Epilepside kalıtımın en sık formu mendel tipi olmayan (kompleks) kalıtımdır. Buna mutifaktöriyel kalıtım da denir. Yani genetik ve çevresel faktörler birlikte epilepsiye neden olurlar. İdyopatik epilepsilerin çoğu multifaktöriyeldir. Genel populasyona göre akraba olan kişilerde pek çok genin paylaşılması multifaktöriyel kalıtım nedeniyle daha fazladır. Ebeveynleri veya kardeşlerinde epilepsi olan kişilerde genel populasyona göre daha fazla epilepsi görülmesi genetik faktörlerin rolünü kanıtlar. Genel populasyonda insanların %1 inde epilepsi görülürken yakın akrabalarında epilepsi varsa, epilepsinin spesifik tipine göre bu oran %2-8 e çıkar. İdyopatik jeneralize epilepsi (İJE): İdyopatik adı altında pek çok epilepsi sınıflandırılmıştır. Bunlar bilinen bir nedeni olmayan nöbetleri anlatmada kullanılır. İJE sendromlarının çoğunda kompleks kalıtım paterni gösterilmiştir (19,20). Yeni genetik teknolojiler hızla idyopatik jeneralize epilepsiden sorumlu genleri tanımlamaktadır ve yavaş yavaş İJE den İ harfi çıkartılmaya başlanmıştır. İyon kanal mutasyonları; hem voltaj hem reseptör aracılar dahil olmak üzere idyopatik olduğu düşünülen pek çok epilepsi ile bağlantılıdır. İLAE sınıflamasına göre İJE ler başlığı altında incelenen sendromların başlıcaları şunlardır; 1) Selim ailesel yenidoğan konvülzüyonları (SAYK) 2) Selim yenidoğan konvülzüyonları (SYK) 3) Çocukluk çağı selim miyoklonik epilepsi(çsme) 4) Çocukluk çağı absans epilepsisi (ÇÇAE) 5) Juvenil absans epilepsisi (JAE) 6) Juvenil miyoklonik epilepsi (JME) 7) Uyanırken gelen JK nöbetleri (UGJK)

16 8) Miyoklonik absanslı epilepsi (MAE) 9) Febril nöbet artı jeneralize epilepsi (FNJE) ÇÇAE, JAE, JME en sık görülen İJE alt tipleridir(62, 63). Bu İJE sendromlarının nöbet tiplerinin özelliği ÇÇAE ve JAE de absans, JME de uyanırken bilateral miyoklonik nöbetleridir. İJE nöbetlerinin EEG bulguları jeneralize diken dalga deşarjları ile karakterizedir. Bunlar talamokortikotalamik döngülerin senkronize hipereksitabilitesini yansıtır (64,65). a-çocukluk çağı absans epilepsisi (ÇÇAE): En sık görülen tipik absanslı epilepsidir. Piknolepsi olarak da adlandırılmıştır (66). Çocukluk çağı epilepsilerinin %4 ünü, İJE lerin %5-15 ini oluşturur. Sıklıkla 5-7 olmak üzere 4-10 yaşları arasındaki sağlıklı çocuklarda başlar. Kız çocukları erkeklere göre daha fazla etkilenir. Basit ve kompleks absans nöbetleri görülür. Bu hastalarda absans nöbetleri genellikle ani başlangıçlı ve ani bitişli olup süreleri sıklıkla 8-10 saniye kadardır. Nöbet sırasında hastanın gözleri kapalıysa açılır, bakışta dalgınlaşma ve yapmakta olduğu eylemin durduğu gözlenir. Gözlerde yukarı kayma, baş ve gövdede retropulsiyon, küçük otomatizmalar eşlik edebilir. Bu nöbetler günde 1-2 kez görülebileceği gibi yüzlerce kez de olabilir. Olguların %30-40 ında jeneralize tonik klonik nöbetler gelişir. ÇÇAE li kişilerde %10-15 oranında daha sonra JME gelişebilir. EEG de temel aktivite normaldir, ritmik posterior delta aktivitesi sıktır. Nöbetler sırasında EEG de genellikle düzenli ve simetrik, bilateral 3 Hz diken dalga, bazen çoklu diken dalga paroksizmleri görülür. Genellikle zeka düzeyi normaldir ve tedaviye iyi yanıt elde edilir (67). ÇÇAE de kromozom 20q ve 8q24.3 üzerinde iki adet lokus haritalanmıştır(68, 69). JME ye dönüşen ÇÇAE de kromozom 1p üzerinde, grand mal nöbetlerle birlikte olan ÇÇAE de kromozom 8q24.3 üzerinde iki adet lokus olduğu görülmüştür (70). Wallace tarafından ÇÇAE ile birlikte febril konvülzüyonları olan bir ailede 5. kromozomda, GABRG2 geninde R43Q mutasyonu saptanmıştır (71). b-juvenil absans epilepsisi (JAE): Bir çok özelliği nedeniyle ÇÇAE ve

17 JME arasında bir ara form gibi kabul edilebilir. ÇÇAE den daha geç başlamaktadır. Bu hastalarda jeneralize tonik klonik nöbetler görülürken, bir kısmında da miyoklonik nöbetler izlenir. EEG özellikleri ve klinik prognozu ÇÇAE ile JME ye özgü bazı karakteristikler içermektedir. ÇÇAE den daha az sayıda retropulsif hareket içerir. Nöbet sıklığı ve şiddeti ÇÇAE den az, süresi ÇÇAE den uzundur.epilepsiler içinde ÇÇAE den daha seyrek görülür. Genellikle olmak üzere, 7-17 yaşları arasında başlar. Kızlar ve erkekler eşit etkilenir. EEG de temel aktivite normaldir. Diken dalga deşarj süreleri ÇÇAE de görülenlerden daha uzun ve daha kesintili olup, yavaş dalgalardan önce görülen dikenler 2 li, 3 lü gruplar halinde olabilir (72). Prognoz hala kesin olarak bilinmemekle birlikte ÇÇAE den daha kötü olduğu açıktır de glutamat reseptör polimorfizmi ile JAE arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışma yapılan bir ailede JAE ile ilişkili fenotiplerin patogenezinde GRIK 1 (kainat selektif glutamat reseptör genin) alelik varyantlarının majör genetik belirleyici olduğu görülmüştür (73). Genetik çalışmalar ÇÇAE ile birlikte planlanmaktadır ve şu an için aynı gen lokalizasyonun sorumlu olduğu varsayılmaktadır. c-juvenil miyoklonik epilepsi (JME): Tüm epilepsiler içindeki görülme oranı %10 lara varan JME, İJE ler arasında en sık rastlananıdır (74). Genellikle 8-26 yaşlarda görülür, en sık yaşlar arasında başlar. Kollarda belirgin, bilateral, tek ya da peşpeşe gelen, aritmik, düzensiz miyoklonik sıçramalardan oluşan nöbetlerle şekillenir. Bilinç kaybı görülmez. Cinsiyet dağılımı eşittir. Sıklıkla jeneralize tonik klonik nöbetler, daha sıklıkta, seyrek absanslar vardır. Nöbetler çoğunlukla uyanmayı takiben ortaya çıkar ve yorgunlukla, alkolle, menstürasyonla, televizyon izlemekle, uyku deprivasyonu ile tetiklenir. İnteriktal ve iktal EEG lerde hızlı, jeneralize, sıklıkla düzensiz diken dalga, multipl diken dalgalar görülür. Uygun ilaçlara yanıt iyidir. Hastaların neredeyse tümü ömür boyu ilaç kullanmak zorunda kalırlar. Hastalar sıklıkla fotosensitiftir (75). %90 ın üzerinde jeneralize tonik klonik %30 da absans nöbetler görülür. JME de genetik katkı olarak kalıtımın türü kesin olmamasına rağmen

18 uzun süre araştırılmıştır. Otozomal dominant, otozomal resesif ve multifaktöriyel kalıtım içerebileceği öne sürülmüştür (76,77,78). JME için HLA ile bağlantılı kromozom 6p21.3 üzerinde bir lokus bulunup EJM1 olarak adlandırılmıştır(79). Ayrıca nöronal nikotinik asetilkolin reseptörün alfa 7 alt tipinde CHRNA7 lokalizasyonunda ve 15q14 lokalizasyonunda JME ile bağlantı bulunmuştur. Araştırmalar bu gende mutasyonlar için devam etmektedir. Kromozom 6p12-p11 üzerindeki EFCHCI geninde mutasyonun neden olduğu farklı JME fenotiplerinden sözedilmektedir (80). 8q24 ve 1p üzerinde iki lokus rapor edilmiş ve bunların JME yi de içeren fakat JME ye sınırlı olmayan iki klinik İJE overlap sendromu için spesifik olabileceği düşünülmüştür. d- Uyanırken gelen JK (UGJK): Başlangıç yaşı diğer İJE lere göre daha geniş bir aralığa yayılmıştır. Fakat puberte civarında pik yaptığı açıktır. Nöbetlerin %90 ı sabahları uyanma döneminde görülmektedir. Jeneralize tonik klonik nöbetler öncesinde absans veya miyoklonik nöbetler görülebilir. Bazı hastalarda iki sendrom overlap sendromu gösterebilir. Bu klinik fenomen JME ile JK arasında olabilir. Nöbetler uyku deprivasyonu ve aşırı alkol alımı ile kolayca tetiklenebilir. Hastaların EEG sinde normal zeminde jeneralize epileptiform deşarjlar ve %13-17 hastada fotosensitivite mevcuttur. Uyanırken gelen JK nöbetleri JME deki gibi EJM1 lokusunda haritalanmıştır (81). e-spesifik olmayan İJE ler: Sık görülen İJE sendromlarında şüpheli genlerin pozisyonel klonlanmasında iki sorun karşımıza çıkmaktadır; Bunlar kompleks kalıtım ve genetik heterojenitedir. 3q26, 14q23, 2q36 lokalizasyonları bildirilenler arasındadır. Durner; kromozom 8 de JME hariç adolesan başlangıçlı İJE ile bağlantı bulmuştur (82). Sander; 8q24 bölgesinin replikasyon analizi ile bu bölgede İJE nin bağlantısı üzerine kanıt göstermiştir. Sander tarafından genom araştırma sonuçları 3q26 da sık görülen İJE sendromları için destekleyici kanıt sağlamıştır (83). Fakat bu lokus bağlantılı çalışmalarla daha fazla incelemeyi gerektirmektedir. Birkaç umut verici aday

19 genin 8q24 ve 6p11 üzerinde tespit edilmesine rağmen JME veya İJE nin hiç bir alt tipinde şüpheli gen saptanamamıştır (82). Ailesel erişkin miyoklonik epilepsi (AEME): Otozomal dominant kalıtımla geçmektedir Erişkin yaşta başlayan ekstremitelerde miyoklonus ve nadiren jeneralize tonik klonik nöbetlerle karakterizedir. Kromozom 8q24 ile bağlantısı gösterilmiştir (84). Göz kapağı miyoklonili absans epilepsisi (GKMA): İlk kez Jeavon tarafından 1977 de tanımlanmıştır. Göz kapama (GK) ile tetiklenen kısa süreli göz kapağı miyoklonisi, şuur kaybı ve göz kürelerinin yukarıya doğru kayması başlıca nöbet özellikleridir. İktal EEG de GK ile tetiklenen jeneralize 3-5 Hz çoklu diken dalga deşarjları görülmektedir. Tüm hastalar fotosensitiftir. Altı yaş civarında başlamaktadır. Genellikle remisyon beklenmez ve ailesel özellik belirgin olmakla birlikte genetik etyolojisi aydınlatılamamıştır (85)

20 Epileptik sendromların genetiği (1) İdyopatik jeneralize TİP SENDROM KALITI M SAYK(EBN1) OD SAYK(EBN2) OD Durumla ilişkili nöbet Progresif KROMOZOM GEN FONKSİYON 20q13 8q KCNQ2 KCNQ3 Voltaj kapılı K+ kanalı ÇÇAE 20q CHRNA4? ÇÇAE+JTK Kompleks 8q24.3 ÇÇAE+JME Kompleks 1p JAE Kompleks 21q22.1 GRİK 1 GluR5(Kainat reseptör) JME Kompleks 6p11-p12 JME Kompleks 15q14 CHRNA7 AEME OD 8q24 FEB1 OD 8q13-21 FEB2 OD 19p13.3 SCN1B Sodyum kanalb alt tipi FEB3 OD 2q23-24 SCN1A Sodyum kanal A alt tipi FNJE OD 2q21-33 FNJE OD 19q13.1 SAİK OD 9q11-13 Lokalizasyonilişkili(parsiyel) SAİK+koreatetoz OD 16q ODNFLE(ENFL1) OD 20q13.3 CHRNA4 ODNFLE(ENFL2) OD 15q24 ODTLE OD 10q22-24 APE OD 2? BRE Kompleks 15q14 CHRNA7? Unverricht- Resesif 21q22.3 CSTB Sistatin B Lundborg(EPM1) Lafora cismi Resesif 6q24 EPM2A Tirozin fosfataz hastalığı(epm2) Northern epilepsi Resesif 8pter-23 CLN8 Katepsin B (EPMR) KANALOPATİLER

21 Son yıllardaki genetik keşifler idyopatik epilepsilerin patofizyolojisinde iyon kanallarının rolünü göstermiştir. Monogenik kalıtımla geçen nadir epilepsi sendromları voltaj kapılı ve ligand kapılı iyon kanallarının alt tiplerini kodlayan genlerdeki mutasyonlarla ilişkilidir. Gen mutasyonları çeşitli yollarla uyarılabilirliği değiştirmektedir. Bu mutasyonların pek çoğu depolarizasyonu uzatır, tekrar ateşlenmeye yardım eder ve santral sinapslarda postsinaptik duyarlılığı veya nörotransmiter salınımını değiştirir. Voltaj kapılı iyon kanalları olan sodyum, potasyum, klor kanallarının mutasyonları jeneralize epilepsi formları ve infantil nöbetlerle ilişkili bulunmuştur. Ligant kapılı iyon kanalları olan nikotinik asetilkolin reseptörlerinin ve gama amino butirik asit (GABA) reseptörlerinin alt tipleri ise frontal ve jeneralize epilepsilerin spesifik sendromlarıyla bağlantılıdır yılında idyopatik epilepsiye neden olan ilk gen mutasyonunun bulunmasından bu yana bu durumla ilişkili 13 gen tanımlanmış olup çoğunun ya voltaj kapılı veya ligand kapılı iyon kanallarını kodladığı gösterilmiştir. Selim ailesel yenidoğan konvülzüyonlarında voltaj kapılı potasyum kanalları, otozomal dominant noktürnal frontal lob epilepsisinde nikotinik asetilkolin reseptörleri, febril nöbet artı jeneralize epilepside sodyum kanallarında mutasyon tespit edilmiştir (86,87). Son yıllarda periyodik paralizi, epizodik ataksi, migren, miyotoni ve diğer kalıtsal nörolojik hastalıklarda iyon kanallarında mutasyonlar tanımlanmıştır (88). Bu hastalıklardaki fenotipik karakteristik özellik; klinik bozukluğun paroksismal natürünün olmasıdır yani ani nörolojik disfonksiyon olması ve bu ataktan sonra hastanın normal durumuna geri dönmesidir. Kanal patolojileri; depolanma ve metabolik hastalıklardaki gibi statik veya progresif nörolojik bozukluğa yol açan hastalıkların tersine paroksismal hastalıklara neden olmaktadır. İdyopatik epilepsi genlerinin fonksiyonel sınıflaması (89)

22 Voltaj kapılı iyon kanalları KCNQ2, KCNQ3 SCN1B, SCN1A, SCN2A SCN2A CLCN2 Ligant kapılı iyon kanalları CHRNA4, CHRNB2 GABRG2 GABRA1 G protein aracılı reseptörler MASS1/ VLGR1 Fonksiyonu bilinmeyen proteinler LG11 Sendrom SAYK FNJE SAİK İJE Sendrom ODNFLE ÇÇAE/FN, FNJE AJME Sendrom FN Sendrom ODLTE SODYUM KANALI VE ALT TİPLERİ Uzun zamandır antiepileptik ilaçların hedefi olan sodyum kanallarının idyopatik epilepsilerin etyolojisindeki önemi ortaya çıkmıştır. Sodyum kanalları por şeklindeki alfa ve düzenleyici beta alt tiplerinden oluşmaktadır. Bilinen 11 alfa alt tipi ve 3 beta alt tipi mevcuttur (90). Epilepsi, periyodik paralizi, miyotoni, kardiak aritminin nedeni olarak 11 alfa alt tipin 4 ünde ve 3 beta alt tipin 1 inde mutasyon tespit edilmiştir. Sodyum kanalının spesifik mutasyonu, febril nöbetler gibi selim, kendini sınırlayan hastalıklardan dirençli nöbetlere ve entellektüel kayıp yapan ciddi epilepsilere kadar değişen epilepsi sendromlarıyla ilişkilidir. Sodyum kanal genleriyle ilişkili hastalıklar (91): Gen Kanal ismi Bulunduğu doku Hastalık SCN1A Na v 1.1, beyin 1 Beyin, periferik FNJE, sinir (somatik) SÇME SCN2A Na v 1.2, beyin 2 Beyin (aksonal) FNJE FNTLE,

23 SCN4A Na v 1.4, İK 1, M1 SCN5A Na v 1.5, İK 2, K1 SCN1B Na v B 1.1, B1 Beyin, periferik sinir, iskelet kası, kalp İskelet kası Hiperkalemik periyodik paralizi, paramiyotonia konjenita Kalp, iskelt kası Uzamış QT-3 sendromu FNJE SCN1A ve D188V mutasyonu: Epilepsiyle ilişkili gen mutasyonları arasında voltaj kapılı sodyum kanalının alfa 1 alt tipindeki mutasyon (SCN1A) en sık karşımıza çıkmaktadır. SCN1A doğumda yapılmaya başlanıp erişkinlikte yapımı devam etmektedir. Santral sinir sisteminde serebral korteks ve hipokampusu da içeren epileptogenezde önemi olduğu bilinen beyin alanlarında yaygın olarak mevcuttur. Üç farklı epileptik sendromun nedeni olarak SCN1A mutasyonu bulunmuştur. Bu sendromlar; febril nöbet artı jeneralize epilepsi (FNJE), febril nöbet artı temporal lob epilepsisi (FNTLE) ve sütçocuğu miyoklonik epilepsisi (SÇME) dir(92,93,94). SCN1A daki mutasyonların nöronal hücrelerin kendiliğinden ve kontrolsüz deşarjına neden olduğu düşünülmüştür. Bu mutasyonların fonksiyonel değerlendirilmesi için yapılan birkaç çalışmada, FNJE li ailelerde üç mutasyon üzerinde odaklanılmıştır. Bunlar T875M, W1204R ve R1648H dir (94). Bu fonksiyonel çalışmalar sodyum kanal mutasyonlarının sodyum geçişini değiştirerek nöronal hipereksitabiliteye neden olduğunu göstermiştir (95). FNJE li geniş bir ailede, kromozom 2q23-24 de haritalanan SCN1A da D188V mutasyonu tespit edilmiştir D188V mutasyonu, 1. alanın S3 transmembran parçasına çok yakın intraselüler halkada lokalizedir (96). Bu mutasyon yüksek frekanslı kanal aktivitesi süresince sodyum geçişinin kümülatif inaktivasyonunun azalmasına neden olmaktadır ve sonuç olarak membran hipereksitabilitesiyle uyumlu bir etki oluşturur. Bu mekanizma

24 sodyum kanallarında mutasyonun neden olduğu epilepsilerin patolojisinde temel teşkil eder. Genetik araştırmalarda en sık kullanılan yöntemlerden biri Polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) dır. Epilepsi genetiğinin araştırılmasında da PCR değerli bir yöntemdir. POLİMERAZ ZİNCİRLEME REAKSİYONU (PCR) Polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) 1980 yılında Kary Mullis tarafından tasarlanmış ve moleküler genetik araştırmalarında bir devrim yaratmıştır. Genetik çalışmalardaki en büyük sorun 3 milyon baz içeren genomda hedeflenen bölgenin hızla görüntülenmesidir. PCR yöntemi klonlamaya gerek duymaksızın istenilen DNA ya da RNA bölgesinin kısa süre içinde incelenmesini sağlayacak yaygın ve kolay bir tekniktir. PCR ın Kullanım alanları 1) Klonlama 2) Bağlantı analizi 3) Mutasyon analizi 4) Dizileme 5) cdna eldesi Ana prensipte PCR bir in vitro replikasyondur MATERYAL VE METOD yıllarında Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Bölümünde polikliniğe başvuran epilepsi hastaları arasından öykü, (EEG), görüntüleme özelliklerine bakılarak etyolojik bir nedenin bulunamadığı idyopatik jeneralize epilepsili toplam 65 hasta prospektif olarak incelenmiştir. Bu hastaların 31 i bayan, 34 ü erkek hasta olup 44 ünün ilk nöbet yaşı 16 nın altında, 21 inin ilk

25 nöbet yaşı 16 nın üzerindedir. Polikliniğe başvuran bu hastaların özgeçmişi, aile öyküsü, klinik seyri, nöbet özellikleri, ilaç ve tedavi öyküsü, nörolojik muayenesi, EEG bilgileri BT ve MRI gibi görüntüleme bulguları, hemogram, biyokimya ve antiepileptik ilaç kan düzeyleri gibi laboratuar bulguları teker teker incelenmiştir. Hastalar bir yıl boyunca izlenmiştir. Bütün hastaların aile ağacı çizilerek özellikle akraba evlilikleri ve ailede başka epilepsili hasta olup olmadığı araştırılmıştır. Hastaların tümünden kendisi veya birinci derece akrabasının rızasıyla 10 cc EDTA lı venöz kan alınmıştır. Alınan bu kanlar İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü (DETAE) nde genetik araştırma yapılmak üzere incelemeye alınmıştır. yapılmıştır. Genetik inceleme, polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) yöntemiyle UYGULAMA: I-DNA ELDESİ, KALİTE VE MİKTARININ BELİRLENMESİ: DNA miktarının ölçülmesi Spektrofotometrenin küvetleri önce alkol sonra distile su ile yıkanır. Yumuşak bir peçete ile kurutulur. Küvetlerden birine 100 l distile su konur ve bu küvet kontrol olarak, spektrofotometrenin 260 ve 280 nm lerde sıfırlanması için kullanılır. İkinci küvette, ölçülecek DNA 1:100 suyla seyreltilerek ölçüm yapılır. Spektrofotometre dalga boyu ayarı 260 nm ye getirilir. Önce kontrol içeren küvet ışığın giriş yönü dikkate alınarak yerleştirilir ve sıfırlama yapılır. Sonra, DNA yı içeren küvet aynı şekilde yerleştirilir ve ışığı soğurma (OD) değeri okunur.aynı işlemler 280 nm dalga boyu için yapılır. OD260/280 heasaplanarak temizlik derecesi saptanır. Ideal oran 1.8 dir. Spektrofotometrik yöntemden başka agaroz jelde yoğunluğunu bildiğimiz DNA fragmanlarıyla beraber yürütülerek de kantitasyon yapılabilir. DNA yoğunluğunun hesaplanması ve miktar belirtimi

26 260 nm deki O.D.değeri x seyreltme katsayısı x DNA sabiti (* g/ml) = g/ml cinsinden DNA yoğunluğu. *DNA sabitidir. Tek zincirli DNA için 40, çift zincirli DNA için 50 değerleri alınır. DNA ELDE ETME YÖNTEMİ: 10 ml EDTA lı venöz kan 50 ml lik tüpe alınır 3 katı LB eklenir İyice karıştırılır +4 o C dk bekletilir 4-10 o C ısıdaki santrifüjde 1500rpm de 10 dk, çevrilir Karıştırılır Üst sıvı atılır. Çökelti çözülür. Üzerine 10/20 mllb eklenir 4-10 o C ısıdaki santrifüjde 1500rpm de 10 dk, çevrilir Üst sıvı atılır. Çökelti çözülür. Çökeltiye 10 ml WBL +50 l proteinaz K l %10 SDS eklenir bekletilir İyice karıştırılır. 56 o C sıcak su banyosunda gece boyu 9M Ammonyum asetat her 1 ml ye 3.7ml oranında eklenir -20 o C derin dondurucuda 20 dk bekletilir 4-10 o C ısıdaki santrifüjde 3000rpm de 25 dk, çevrilir Çökelti atılır DNA içeren üst sıvı temiz tüplere alınır Üst sıvının 2X hacmi kadar %100 etil alkol eklenir DNA yüzeye çıkar

27 DNA pipet ucu ile yakalanır,üzeri yazılı 1.5 ml lik tüplere aktarılır %70 etil alkolde yıkanır DNA oda ısısnda kurutulur DNA TE tamponu içinde çözündürülür Ölçümler yapılır Materyal - 10 ml Na EDTA lı venöz kan kullanılmıştır. Kimyasallar - Distile su ( dh 2 O ), - Amonyum Klörür ( NH 4 Cl ), - Potasyum Bikarbonat ( KHCO 3 ), - Etilen diamin tetra asetik asit ( EDTA veya Na 2 EDTA ), - Trihidroksimetilaminometan ( Tris ), - Amonyum Asetat ( NH 4 Ac; NH 4 COO - ), - Sodyum dodesil sülfat ( SDS ), - Asetik Asit ( CH 3 COOH), - Etil Alkol (Eth.OH; CH 3 CH 2 COOH ) - Sodyum Hidroksit ( NaOH), - Hidroklorik asit ( HCl), - Hidrojen Peroksit ( H 2 O 2 ), Sodyum Hipoklorit ( Çamaşır suyu, NaClO kullanılmıştır Enzim - Proteinaz K kullanılmıştır. Çözeltiler Eritrosit parçalama çözeltisi ( Lysis Buffer; LB ) ( ph 7.4, 25 C ) Lökosit parçalama çözeltisi ( White Blood Cell Lysis Buffer; WBL ) Amonyum Asetat Çözeltisi ( NH 4 Ac )

28 % 10 SDS çözeltisi TE Çözeltisi ( ph 8.0, 25 C ) kullanılmıştır. II-POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU PCR bileşenleri: 1) Taq polimeraz: 50 μl lik bir reaksiyonda ortalama gerekli miktar U dir. 2) 10X enzime özgü reaksiyon tamponu 3) dntp 4) Primer 5) Kalıp DNA 6) MgCl 2 Primer olarak, D188V mutasyonunun primeri kullanılmıştır: caaaatattc tacaggtaaa gcaaacctat tcttaaaagc ata agcactg atggaaaacc aaactatgtt ctctcttaaa gtttcaaaaa aggcacttac gcaaatgtaa tgacagtgaa atcgagccag ttccatg // gat cc cgaaggaa agtaaaatct tctaaacaga atccccttgc aataattttt ataagtgatt caaaagtata tattcctgtg aaggtgtatc tgaaaacaag catccaaaaa atttgataaa gtaacagtgt tttttcatag cataccaatt tcttatcact ccatcagtgg aatagataaa tactaaaaaa gaaaactaag cagatggatt ttaattt cat acaaatgaaa cgtagcccta a atttaaatt cagcttccta acacaaagag ttgtttcgta aagtgtctta agagtagtgt gagaaataca aggtatatga aatctattta gccattgtct Enzim: BamHI kullanılmıştır. 243 BamHI 95 none 338 GATCCCGAAG GAAAGTAAAA TCTTCTAAAC AGAATCCCCT TGCAATAATT TTTATAAGTG ATTCAAAAGT ATATATTCCT GTGAAGGTGT ATCTGAAAAC

29 AAGCATCCAA AAAATTTGAT AAAGTAACAG TGTTTTTTCA TAGCATACCA ATTTCTTATC ACTCCATCAG TGGAATAGAT AAATACTAAA AAAGAAAACT AAGCAGATGG ATTTTAATTT CATACAAATG AAACGTAGCC CTAA 94 none 1 BamHI 94 AGCACTGATG GAAAACCAAA CTATGTTCTC TCTTAAAGTT TCAAAAAAGG CACTTACGCA AATGTAATGA CAGTGAAATC GAGCCAGTTC CATG III-JEL ELEKTROFOREZİ Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz jel elektroforezi sonuçlarının değerlendirilmesi IV-RNA İZOLASYONU

30 BULGULAR Çalışma tarihleri arasında Sağlık Bakanlığı Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji kliniğinde 31 i kadın (% 47.7), 34 ü erkek (% 52.3) olmak üzere toplam 65 olgu üzerinde yapılmıştır. Olgulara ilişkin özelliklerin yüzde dağılımları tablo 1 de görülmektedir. Tablo 1: Frekans tablosu Cinsiyet İlk nöbet yaşı Sendrom tipi Özgeçmiş Nöbet Tipi Klinik Fotosentivite Tedaviye Yanıt Akraba Evliliği Ailede başka Epilepsili üye n % Bayan 31 47,7 Erkek 34 52, ,7 > ,3 FNJE 7 46,7 JME 5 33,3 ÇÇAE 3 20,0 FK geçirenler 11 16,9 FK geçirmeyenler 54 83,1 Ato-Miyo 3 4,6 JK 43 66,2 JK-Abs 3 4,6 Miyo-JK 5 7,7 JK-KPN 1 1,5 Miyo 2 3,1 Abs 2 3,1 Tonik 3 4,6 Ato-JK 1 1,5 Tonik-Ato-JK 1 1,5 Ato 1 1,5 Var 5 7,7 Yok 60 92,3 Nöbetsiz 35 56,5 Dirençli 19 30,6 Azalma 8 12,9 Var 22 33,8 Yok 43 66,2 Var 39 60,0 Yok 26 40,0

31 Olguların % 47.7 si bayan, % 52.3 ü erkektir. Cinsiyet 52,3% 47,7% Kız Erkek Şekil 1: Cinsiyet dağılım grafiği Olguların % 67.7 sinin ilk nöbet yaşı 16 ve altında iken; % 32.3 ünde ilk nöbet yaşı 16 nın üzerindedir. İlk nöbet yaşı 32,3% 67,7% <= 16 > 16 Şekil 2: İlk nöbet yaşı dağılım grafiği

32 Toplam 15 olguda sendrom görülürken; bunların % 46.7 si FNJE, % 33.3 ü JME ve % 20 si ÇÇAE dir. Sendrom tipi 20,0% 46,7% 33,3% FNJE JME ÇÇAE Şekil 3: Sendrom tiplerine göre dağılım grafiği 11 olgu (% 16.9) FK geçirmiştir. Özgeçmiş 16,9% 83,1% FK geçirenler FK geçirmeyenler Şekil 4: Özgeçmiş varlığına göre dağılım grafiği

33 Olguların % 66.2 sinde JK görülmüştür. Nöbet Tipi 5% 3% 2% 3% 7% 5% 2% 2% 2%4% 66,2% Ato-Miyo JK JK-Abs Miyo-JK JK-KPN Miyo Abs Tonik Ato-JK Tonik-Ato-JK Ato Şekil 5: Nöbet tiplerinin dağılım grafiği Olguların % 7.7 sinde klinik fotosensitivite görülmüştür. Klinik Fotosentivite 7,7% 92,3% Var Yok Şekil 6: Klinik fotosensitivite dağılım grafiği Olguların % 56.5 inde tedaviye iyi yanıt (nöbetsiz) alınırken, % 30.6 sında

34 kötü yanıt (dirençli) alınmıştır. % 12.9 unda azalma görülmüştür. Tedaviye Yanıt 12,9% 30,6% 56,5% Nöbetsiz Dirençli Azalma Şekil 7: Tedaviye yanıta göre dağılım grafiği Olguların % 33.8 inde akraba evliliği vardır. Akraba Evliliği 33,8% 66,2% Var Yok Şekil 8: Akraba evliliğine göre dağılım grafiği Olguların % 60 ında aile öyküsü (başka epileptik) vardır.

35 Başka Epileptik 40,0% 60,0% Var Yok Şekil 9: Aile öyküsüne göre dağılım grafiği Tablo 2: Cinsiyete göre nöbet tipi dağılımı Kadın Erkek n % n % Ato-Miyo 3 9,7 - - JK 17 54, ,5 JK-Abs 2 6,5 1 2,9 Miyo-JK 3 9,7 2 5,9 JK-KPN ,9 Nöbet Tipi Miyo 2 6,5 - - Abs 1 3,2 1 2,9 Tonik 3 9,7 - - Ato-JK ,9 Tonik-Ato-JK ,9 Ato ,9 TOPLAM , ,0 Kadınlarda ve erkeklerde en sık görülen nöbet tipi JK dır. Kadınların % 54.8 inde, erkeklerin de % 76.5 inde JK görülmüştür. Tablo 3: Cinsiyete göre sendrom tipi dağılımı Kadın Erkek n % n %

36 FNJE 3 37,5 4 57,1 Sendrom Tipi JME 3 37,5 2 28,6 ÇÇAE 2 25,0 1 14,3 TOPLAM 8 100, ,0 Toplam 8 kadında sendrom görülürken, bunların 3 ü FNJE (% 37.5), 3 ü JME (% 37.5) ve 2 si ÇÇAE dir (% 25). Toplam 7 erkekte sendrom görülürken, bunların 4 ü FNJE (% 57.1), 2 si JME (% 28.6) ve 1 i ÇÇAE dir (% 14,3). Tablo 4: İlk nöbet yaşına göre nöbet tipi dağılımı İlk Nöbet Yaşı 16 > 16 n % n % Ato-Miyo 2 4,5 1 4,8 JK 27 61, ,2 JK-Abs 2 4,5 1 4,8 Miyo-JK 4 9,1 1 4,8 JK-KPN ,8 Nöbet Tipi Miyo 2 4,5 - - Abs 2 4,5 - - Tonik 3 6,8 - - Ato-JK 1 2,3 - - Tonik-Ato-JK 1 2,3 - - Ato ,8 TOPLAM , ,0 İlk nöbetini 16 yaş ve altında geçiren olguların % 61.4 ünde JK görülürken; ilk nöbet yaşı 16 nın üzerinde olan olgularda JK görülme oranı % 76.2 dir. Tablo 5: İlk nöbet yaşına göre karşılaştırmalar Özgeçmiş Tedaviye Yanıt Akraba Evliliği İlk Nöbet Yaşı 16 > 16 n % n % FK geçirenler 7 15,9 4 19,0 FK geçirmeyenler 37 84, ,0 Nöbetsiz 23 54, ,0 Dirençli 13 31,0 6 30,0 Azalma 6 14,3 2 10,0 Var 17 38,6 5 23,8 Yok 27 61, ,2 p 0,752 0,877 0,237

37 Başka Epileptik Var 25 56, ,7 Yok 19 43,2 7 33,3 0,448 İlk nöbet yaşı ile özgeçmiş arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). İlk nöbet yaşı ile tedaviye yanıt arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). İlk nöbet yaşı 16 nın altında olan olgular ile 16 nın üzerinde olan olgularda tedaviye yanıtın çoğunlukla nöbetsiz olduğu, bunu dirençli yanıtın izlediği görülmektedir. İlk nöbet yaşı ile akraba evliliği arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). İlk nöbet yaşı 16 nın altında olan olguların % 38.6 sında, 16 nın üzerinde olan olguların ise % 23.8 inde akraba evliliği görülmüştür. İlk nöbet yaşı ile başka epileptik varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). İlk nöbet yaşı 16 nın altında olan olguların % 56.8 inde aile öyküsü varlığı görülürken bu oran ilk nöbet yaşı 16 nın üzerinde olan olgularda % 66.7 dir. Tablo 6: Aile öyküsü varlığına göre karşılaştırmalar Özgeçmiş Tedaviye Yanıt Klinik Fotosentivite Başka Epileptik Var Yok n % n % FK geçirenler 8 20,5 3 11,5 FK geçirmeyenler 31 79, ,5 Nöbetsiz 19 52, ,5 Dirençli 13 36,1 6 23,1 Azalma 4 11,1 4 15,4 Var 3 7,7 2 7,7 Yok 36 92, ,3 p 0,344 0,534 1,000 Aile öyküsü varlığı ile özgeçmiş arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). Aile öyküsü varlığı ile tedaviye yanıt arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). Aile öyküsü var olan olgular ile aile öyküsü bulunmayan olgularda tedaviye yanıtın çoğunlukla nöbetsiz olduğu, bunu dirençli

38 yanıtın izlediği görülmektedir. Aile öyküsü varlığı ile klinik fotosensitivite varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamaktadır (p>0,05). İstatistiksel İncelemeler: Çalışmada elde edilen bulgular değerlendirilirken, istatistiksel analizler için SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows 10.0 programı kullanıldı. Çalışma verileri değerlendirilirken tanımlayıcı istatistiksel metodların (frekanslar) yanısıra niteliksel verilerin karşılaştırılmasında Ki-Kare testi ve Fisher Exact Ki- Kare testi kullanıldı. Sonuçlar % 95 lik güven aralığında, anlamlılık p<0.05 düzeyinde değerlendirildi. GENETİK İNCELEME BULGULARI 31 i kadın 34 ü erkek toplam 65 olgu üzerinde yapılan genetik incelemede sodyum kanal alfa 1alt tip (SCN1A) D188V mutasyonu araştırılmış olup bu mutasyonun bulunabileceği ailesel özellik gösteren ve bir sendrom tipine uyanlarda dahil olmak üzere hiçbir olguda SCN1A D188V mutasyonu gösterilememiştir.

39 TARTIŞMA Epilepsiler, en sık görülen nörolojik hastalıklardan biri olup genel populasyonun %1 ini etkilemektedir(2). Pek çok neden araştırılmış olmasına rağmen vakaların çoğunda etyolojinin açıklanamaması tanı ve tedavide zorluklar yaratmış bu nedenle birçok çalışma yapılmıştır. Yapılan bu çalışmalar içinde en ilgi çekeni genetik çalışmalardır. Son yıllardaki genetik keşifler idyopatik epilepsilerin patofizyolojisinde iyon kanallarının rolünü göstermiştir. Monogenik kalıtımla geçen nadir epilepsi sendromları voltaj kapılı(sodyum, potasyum,klor kanalları) ve ligand kapılı iyon kanallarının alt tiplerini kodlayan genlerdeki mutasyonlarla ilişkili bulunmuştur (86,87). Uzun zamandır antiepileptik ilaçların hedefi olan sodyum kanalları genetik araştırmaların bu yöne kaymasına neden olmuştur. Sodyum kanalları por şeklindeki alfa ve düzenleyici beta alt tiplerinden oluşmakta olup bu kanalların spesifik mutasyonu febril nöbetler gibi selim, kendini sınırlayan hastalıklardan dirençli nöbet ve entelektüel kayıp yapan ciddi epilepsilere kadar değişen epilepsi sendromlarına neden olmaktadır(90). Selim ailesel yenidoğan konvülzüyonlarında voltaj kapılı potasyum kanallarını

40 kodlayan genlerde mutasyon tespit edilmiştir(1,86,87). Biz çalışmamızda, epilepsi etyolojisindeki önemi gittikçe vurgulanan genetik geçiş gösteren sodyum kanal patolojilerden SCN1A geninde D188V mutasyonunu araştırmaya çalıştık. Çalışmamızı 31 i bayan 34 ü erkek toplam 65 İJE li olgu üzerinde yaptık. Bu olguların %67,7 si ilk nöbeti 16 yaş altında %32,3 ü 16 yaş üzerinde geçirmiş olup %16,9 u özgeçmişinde FK geçirmiştir(tablo1, Şekil 1,2,4). Olguların %56,5 i tedaviye nöbetsiz yanıt verirken % 12,9 unda nöbetlerde azalma, %30,6 sında tedaviye direnç görülmüştür. %33,8 inde akraba evliliği olan olguların %60 ında ailede başka epileptik birey mevcuttur(tablo 1,Şekil 7,8,9). 15 olguda sendrom tespit edilip bunların %46,7 sini FNJE, %33,3 ünü JME, %20 sini de ÇÇAE oluşturmaktadır(tablo1,şekil 3). Son zamanlarda epilepsi etyolojisinde kanal patolojileri üzerine bir takım genetik çalışmalar yapılmıştır. Yapılan bu çalışmalardan bazılarına bakılacak olursa; Patrick Cossette ve ark. yapmış oldukları çalışmada FNJE li geniş bir aile üzerinde SCN1A geninde D188V mutasyonu göstermişlerdir (98). Laura Saez-Hernandez ve ark. yaptıkları çalışmada İJE li bir ailede potasyum kanallarını kodlayan 6p21 geninde nokta kırık translokasyonu bulmuşlardır (99). İori Ohmori ve ark. çalışmalarında SÇME li 29 hastanın 24 ünde SCN1A mutasyonu göstermişlerdir (100). J. Spampanato ve ark. FNJE li hastalarda yapmış oldukları çalışmada SCN1A geninde W1204R mutasyonu bulmuşlardır (101). Ching Chou ve ark FN li aileleler üzerinde yaptıkları çalışmada SCN1A polimorfizmi ile FN arasında ilişki bulamamışlardır (102). N. Pineda-Trujillo ve ark. yapmış oldukları çalışmada FNJE li geniş bir Güney Amerikan ailesinde SCN1A geninde mutasyon tespit etmişlerdir (103). M. İto ve ark. yaptıkları çalışmada FNJE li 2 ailede SCN1A geninde missens mutasyon varlığı göstermişlerdir (104). İJE li geniş bir grupta yaptığımız bu çalışmada ülkemizde epilepsi