ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yöneticisi : Bağımsız Proje (B) : 15B : Prof. Dr. Nevin Erk Proje Başlığı : Bazı farmasötik formülasyonlardaki ilaç etken maddelerin miktar tayinlerine yönelik yüksek kaliteye sahip yeni nesil grafen temelli elektrokimyasal nanosensörlerin geliştirilmesi Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM GEREKÇESİ: Prof. Dr. Nevin Erk

2 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU Proje Başlığı: Bazı farmasötik formülasyonlardaki ilaç etken maddelerin miktar tayinlerine yönelik yüksek kaliteye sahip yeni nesil grafen temelli elektrokimyasal nanosensörlerin geliştirilmesi Proje Yürütücüsünün İsmi: Prof. Dr. Nevin Erk Yardımcı Araştırmacıların İsmi: Arş. Gör. Engin Er Proje Numarası: 15B Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Proje Adı: Bazı farmasötik formülasyonlardaki ilaç etken maddelerin miktar tayinlerine yönelik yüksek kaliteye sahip yeni nesil grafen temelli elektrokimyasal nanosensörlerin geliştirilmesi Proje Özeti: Farmasötik preparatların içerisinde bulunan ilaç etken maddelerin miktarları oldukça önem teşkil etmektedir. Bilindiği üzere ilaçlar, canlılarda belirli doz miktarlarına bağlı olarak alındıklarında istenilen etkiyi göstermekte ancak belirli dozun altında/üzerinde alımında ise beklenmedik hayati önem arz eden riskler meydana gelebilmektedir. Bu sebeple, farmasötik preperatlardaki ilaç etken maddelerin miktar tayini ve tayin yöntemi oldukça önemlidir. Bu noktada, proje kapsamında elektroaktif olan ilaç etken maddelerin miktar tayinine yönelik yüksek hassasiyete ve seçiciliğe sahip hızlı, pratik, ekonomik ve rutin kullanıma uygun elektrokimyasal nanosensörlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle, proje çalışanımız tarafından literatürde etki faktörü yüksek olan bir dergide yayınlanmış olan etkili bir indirgeme yöntemi ile grafen sentezi gerçekleştirilecektir. Elde edilecek grafen ile modifiye elektrotlar oluşturarak, proje kapsamında seçilen silodosin ve nebivolol adlı etken maddelerin elektrokimyasal davranışları incelenecek ve farmasötik preparatlarda miktar tayini uygulamaları yapılacaktır. Bu sayede, elektroaktif olan etken maddeler için rol model oluşturulmuş olunacaktır. Geliştirilecek olan grafen temelli nanosensörler, farmasötik preperatlar içerisinde yer alan etken madde miktarı tayini için basit, hassas, seçici ve pratik olması gibi avantajları göz önüne alındığında ilaç sanayindeki rutin analizler için tercih nedeni olacaktır. Grafen, çok geniş yüzey alanı, yüksek elektron aktarım kabiliyeti ve mükemmel iletkenliği nedeniyle son dönemlerde sıklıkla tercih edilen bir elektrot malzemesi olarak karşımıza çıkmaktadır. Grafenin sensör yapımı haricinde nanoelektronik, enerji depolama ve polimer-kompozit malzeme yapımı gibi birçok alanda yaygın olarak kullanımı ne kadar ilgi çeken bir malzeme olduğunu göstermektedir. Grafenin sensör olarak kullanımı için kolaylık, maliyet ve uygunluk açısından kimyasal yöntem ile hazırlanması ön plana çıkmaktadır. Grafenin kimyasal yöntem ile hazırlanması sırasında yapıdaki karbon zincirinde eksiklikler (kusurlar) ve grafen oksit yapısından kalan tam olarak indirgenmeyen oksijen içeren fonksiyonel gruplar meydana gelmektedir. Bu etkiler, grafenin iletkenliğini olumsuz yönde etkilemektedir. Çünkü elektriksel iletkenliği sağlayan elektronlar, aromatik halkada iyi bir biçimde delokalize olamamaktadır. Proje kapsamında önerilen indirgenme metodu ile grafen oksit yapısının özellikle orta bölümünde yer alan fonksiyonel grupların (hidroksil, epoksi ve karbonil) uzaklaşması sağlanacak ve yapıdaki C=C bağlarının restorasyonunu sağlanarak grafenin elektrodik (iletkenlik, kapasitans vs.) özelliklerinin iyileştirilmesi sağlanacaktır. Projede, Hummers metodu ile hazırlanacak grafen oksit in fosforik asit indirgeyici ajan varlığında indirgenmesi sağlanarak yüksek kalitede grafen sentezi gerçekleştirilecektir. Projenin oluşturulmasında, farmasötik preparatlar içerisinde bulunan silodosin ve nebivolol adlı ilaç etken maddelerin miktar tayinlerine yönelik elektrokimyasal çalışmanın hemen hemen hiç olmaması, sensör olarak kullanılacak grafenin daha önce hiç kullanılmamış olması ve rutin kullanıma uygun olarak düşünülmesi etkili olmuştur. Dolayısıyla, bu projedeki her bir etken madde ile ilgili çalışmanın bilimsel makale olarak yayınlanması ihtimalini kuvvetlendirmektedir. Ayrıca, bu yöntemlerin geliştirilmesi için özellikle AR-GE laboratuvarlarında ciddi miktarlarda bütçe ve zaman ayrılması dolayısıyla bu proje ile hazır bir şekilde kullanıma uygun, hızlı, duyarlı, seçici ve ekonomik bir yöntem sunulacaktır. Böylelikle projenin, bilimsel etkisinin yanı sıra özellikle ülkemizdeki ilaç sanayinde kullanımına yönelik bir araştırma konusu olduğunu da göstermektedir.

4 Project Name: Development of a new generation electrochemical nanosensors based on high-quality graphene for quantification of active ingredient in some pharmaceutical formulations The amount of active ingredients in pharmaceutical formulations has a great importance, and As is known, drugs take the desired effect when they are taken dependently certain doses for living beings. However, when they are taken under/over certain dose, it can dose unexpected vital risks. Therefore, quantitation and quantitation method of active ingredient in pharmaceutical preparations are quite important. At this point, it is aimed to develop the electrochemical nanosensors for the determination of electroactive drug molecules which have high sensitivity and selectivity, fast, practical, economic and suitable for routine usage within the scope of the project. At first, Graphene will be synthesized by an effective reduction method which was published previously by authors in the literature. The graphene synthesized will be used for the fabrication of modified electrodes and then the electrochemical behaviour of silodosin and nebivolol will be investigated by proposed modified electrodes. The proposed modified electrodes will be applied to determine the drug molecules in pharmaceutical dosage forms. Taking into account the advantages of graphene-based nanosensors that will be developed like being simple, sensitive, selective and practical for quantitation of active ingredient in pharmaceutical preparations so they will be preferred for routine analyses in the pharmaceutical industry. Graphene is an electrode material which is often preferred recently because of its very large surface area, high electron-transfer capability and excellent conductivity. The fact that graphene is commonly used for many areas like nano-electronic, energy storage and polymer composite material apart from making sensor indicates it is very attracted material. Using the graphene as a sensor, its highlight with preparing in a chemical way in terms of simplicity, cost and convenience. During preparation of graphene with the chemical way, it take places defects the carbon chain on the structure and oxygen containing functional groups which are remained from graphene oxide after the reduction process don t be fully reduced. These influences affect negatively the graphene conductivity because electrons which are provide electrical conductivity can t delocalize well in the aromatic ring. The reduction method proposed will be provided by removing of functional groups (hydroxyl, epoxy and carbonyl) which are especially placed on the basal plane of graphene oxide structure within the scope of the project. Moreover, this method will provide restoration of C=C bonds in the structure, and the electrodic properties (conductivity, capacitance etc.) of graphene will be enhanced by this way. In this project, high-quality graphene will be synthesized to reduction of graphene oxide by the prepared with Hummers method using phosphoric acid as a reducing agent. There are several subject that have influence on creation of the project: Any electrochemical study was not observed for the quantitation of chosen silodosin and nebivolol in pharmaceutical preparations, and graphene has never been used previously as an electrode material for proposed drug molecules, and it also suitable material for routine analysis. This project reveals that each electrochemical nanosensor and drug molecules in this project has a high originality increases the possibility of the project being published as a scientific article. Besides, a suitable for instant usage, fast, sensitive, selective and economic method will be presented with this project because of sizeable amount of budget and time are spared in the R&D laboratories in order to develop these methods. In this way, the project is also a research subject regarding its usage in the pharmaceutical industry in our country besides its scientific influence. II. Amaç ve Kapsam Projenin amacı, farklı tedavi özelliği olan elektroaktif ilaç etken maddelerin analizinde rutin olarak kullanılabilecek yüksek hassasiyete ve seçiciliğe sahip pratik, özgün, ön işleme gerek duyulmayan ve ekonomik elektrokimyasal nanosensörlerin geliştirilmesidir. Proje kapsamında hedeflenen amaç aşağıda

5 belirtilmiştir; Proje kapsamında, yüksek kalitede grafen sentezi gerçekleştirilecek ve grafen ile oluşturulan modifiye elektrotlarla farklı tedavi özelliği olan ve rol model olarak seçilen iki farklı ilaç etken maddesinin elektrokimyasal olarak miktar analizi gerçekleştirilecektir. Öncelikle kullanılacak modifiye elektrotun kalitesini belirleyecek olan grafenin sentezi sırasında yapısında meydana gelen oksijen içeren fonksiyonel gruplar ve yapı iskeletindeki kusurlar nedeniyle iletkenliği olumsuz yönde etkilenmektedir. Bu sebeple, Hummers metoduyla hazırlanan grafen oksitin fosforik asit varlığında indirgenmesi sağlanarak yüksek kalitede grafen sentezi gerçekleştirilecek ve grafen oksit yapısının orta bölümündeki oksijence zengin grupların (hidroksil, epoksi ve karbonil grupları) yapıdan tamamen uzaklaşması sağlanacaktır. Sentezlenen yüksek kalitede grafen ile modifiye elektrotlar oluşturarak bazı ilaç etken maddelerin miktar tayini analizinde kullanılması sağlanacaktır. Bu sayede, elektroaktif olan tüm ilaç etken maddelerin elektrokimyasal olarak tayini için rutin olarak kullanılabilecek grafen temelli nanosensörler geliştirilmiş olunacaktır. III. Materyal ve Yöntem Proje kapsamında uygulanan sentez yöntemleri aşağıda detaylı şekilde belirtilmiştir; GRE/NFN sensörlerin hazırlanması 1. Basamak: Grafen oksit (GO) Hummers [1] metodu ile toz grafitten sentezlenmiştir. 2. Basamak: Toz GO dan bir balona alınarak üzerine H 3PO 4 ilave edilir. Balon geri soğutucu düzeneğe bağlanarak yüksek sıcaklıkta 2 saat boyunca reaksiyona sokulur. Reaksiyon bitiminde elde edilen grafen çözeltisi (GRP) ultra saf su ile yıkanır ve elektrokimyasal ölçümler için çözelti konsantrasyonu 1,0 mg/ml olacak şekilde ayarlanır. Elde edilen grafen çözeltileri karakterizasyon işlemleri için önce etüvde (60 C) daha sonra da vakum etüvde (60 C) birer gün bekletilir [2]. 3. Basamak: 1,0 mg/ml konsantrasyonuna sahip grafen çözeltisinin üzerine hacimce %2 den az olacak şekilde nafyon çözeltisi ilave edilir ve 5 dk ultrasonikasyon işlemi uygulanır. Bu süre sonunda oluşan GRP/NFN çözeltisi içerisinden 10 μl alınarak camsı karbon elektrot (GCE) üzerine damlatılır ve kuruyana dek etüvde bekletilir. Bu prosedür sonunda önerilen modifiye elektrotlar (GRE/NFN) elde edilir. GRP/PtNPs/NFN/GCE sensörlerin hazırlanması, 1. Basamak: Toz GO dan iki boyunlu bir balona uygun miktar alınarak üzerine ultra saf su eklenir, 1 saat ultrasonikasyon işlemi yapılır. Devamında, GO süspansiyonu üzerine 1000 ppm H 2PtCl 6 çözeltisinden eklenerek 15 dakika boyunca manyetik karışıtırıcı da karıştırılır. Daha sonra, bu çözeltiye 100 mg katı NaBH 4 yavaş yavaş eklenir. Karışım yüksek sıcaklıkta 6 saat boyunca reaksiyona sokulur. Elde edilen siyah renkli çözelti, bir kaç kez ultra saf su ile yıkanarak kontaminasyonlar ve safsızlıklar ortamdan uzaklaştırılır. Karakterizasyon işlemleri için çözelti, önce etüvde (60 C) daha sonra da vakum etüvde (60 C) birer gün bekletilir [3]. 2. Basamak: 1,0 mg/ml konsantrasyonuna sahip Pt nanopartikül katkılı grafen kompozit çözeltisinin üzerine hacimce %2 den az olacak şekilde nafyon çözeltisi ilave edilir ve 5 dk ultrasonikasyon işlemi uygulanır. Bu süre sonunda oluşan GRP/PtNPs/NFN çözeltisi içerisinden 10 μl alınarak GCE üzerine damlatılır ve kuruyana dek etüvde bekletilir. Bu prosedür sonunda önerilen modifiye elektrotlar (GRP/PtNPs/NFN/GCE) elde edilir. IV. Analiz ve Bulgular Projenin ilk basamağında, nebivolol (NBV) adlı etken madde için grafen temelli elektrokimyasal nanosensör geliştirilmiştir. Geliştirilen sensör ile ilgili çalışma, uluslararası SCI index e sahip bir dergide yayınlanmıştır.

6 Bunun yanı sıra, proje kapsamında NBV ile ilgili elde edilen veriler doğrultusunda yurtdışındaki bir uluslararası bir kongrede poster sunumu gerçekleştirilmiştir. Makaleye ait detayları ve poster sunumunu ekler kısmında bulabilirsiniz. Projenin ikinci döneminde ise, proje kapsamında önerilen diğer etken madde olan silodosin'in (SLN) elektrokimyasal analizi için grafen/platin nanopartikül nanokompozit temelli elektrokimyasal nanosensör geliştirilmiştir. Yapılan çalışmalar aşağıda ifade edilmiştir; Projenin ilk döneminde NBV adlı etken madde için yüksek kaliteye sahip grafen sentezlenmiş ve sentezlenen grafen nanoplakalar ile modifiye grafen elektrotlar (GRP/GCE) oluşturulmuştur. Oluşturulan bu elektrotlar kullanılarak SLN adlı etken maddenin analizi de gerçekleştirilmeye çalışılmış fakat SLN molekülünün GRP/GCE yüzeyinde yüksek bir adsorpsiyon ile tutulmasından dolayı elektrokimyasal analizi gerçekleştirilememiştir. Bu noktada, projede önerilen B planı çerçevesinde grafen nanoplakaların (GRP) yüzeyleri platin nanopartiküller (PtNPs) ile katkılanarak GRP/PtNPs nanokompozit malzemeler sentezlenmiştir. Bu kompozit malzemelerin kullanımı ile camsı karbon elektrot (GCE) yüzeyleri modifiye edilerek yeni nesil sensörler geliştirilmiştir. Geliştirilen bu sensör ile elektrot yüzeyinin elektron verme kabiliyeti hızlandırılmış ve SLN molekülünün elektrot yüzeyindeki güçlü adsorpsiyonu elimine edilmiştir. Bu ön denemenin başarıyla gerçekleşmesinin ardından GRP/PtNPs nanokompozit malzeminin yapısal ve morfolojik karakterizasyonuna geçilmiştir. GRP/PtNPs nanokompozit oluşumu x-ışını kırınım (XRD) spektroskopisi ve fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR) ile incelenmiştir. Ayrıca, nanokompozitin yüzey morfolojisi ise geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile incelenmiştir. GO ve GRP/PtNPs ye ait FTIR görüntüleri şekil 1 de gösterilmiştir. GO nun FTIR spektrumunda, 3225 cm - 1 de hidroksil (-OH) titreşim gerilmesi, 1730 cm -1 de karbonil (C=O) titreşim gerilmesi, 1220 cm -1 de epoksi (C-O-C) titreşim gerilmesi ve 1039 cm -1 de fenolik hidroksil (C-O) ye ait karakteristik bantlar gözlemlenmiştir. Ayrıca, 1592 cm -1 de oksitlenmemiş grafit yapılarına ait (C=C) titreşim bandı görümektedir. GRP/PtNPs oluşumundaki indirgenme prosesinin ardından, 1720 cm -1 de gözlenen C=O bandı ve kaydadeğer biçimde pik pozisyonunda kaymanın gözlenlediği C=C (1540 cm -1 ) bandı PtNPs/GRP nanokompozit içerisindeki GRP tabaklarına ait bantlar olarak karşımıza çıkmıştır. Bu sonuçlar, indirgenme prosesinin başarılı olduğunu göstermektedir. Şekil 1. GO ve GRP/PtNPs ye ait FTIR spektrumları

7 Şekil 2 de gözlemlenen XRD sonuçlarında, 2θ=11.8 de gözlenen (002) kırınım desenine sahip keskin pik GO in tabakalar arası uzaklığının 0.75 nm olduğunu gösterir. İndirgenme prosesinin ardından, 2θ=23.0 ye kayan (002) kırınım piki, GO in GRP ye dönüştüğünü desteklemektedir. Şekil 2B de gözlenen 39.8, 46.2 ve 67.4 kırınım pikleri, Pt kristalinin yüzey merkezli kübik (fcc) deki (111), (200) ve (220) yüzeylerine aittir. Bu yeni piklerin oluşumu, Pt moleküllerinin kimyasal olarak Pt nanopartiküllerine dönüştüğünü gösterir [4]. PtNPs lerin ortalama boyutları Scherrer eşitliği kullanılarak 5 nm civarında hesaplanmıştır [5]. Elde edilen sonuçlar ile TEM görüntülerinin sonuçları birbiriyle uyum göstermektedir. Şekil 2. GO (A) ve GRP/PtNPs (B) nin XRD spektrumları GO ve GRP/PtNPs nin morfolojik yapıları TEM ile belirlenmiştir. Şekil 3A daki görüntüde karakteristik buruşuk, geçirgen formda geniş GO nanotabakalar görülmektedir. Şekil 3B de ise küresel biçimde boyutları yaklaşık olarak 10 nm den küçük olan PtNPs görülmekte ve bu PtNPs, GRP nanotabakalar üzerinde homojen bir şekilde dağılmıştır. TEM görüntülerinden de görüldüğü üzere, iyi bir biçimde PtNPs ile dekorlanmış GRP nanotabakalar gözlemlenmiş ve önerilen nanokompozitin fabrikasyon metodunu doğrulamaktadır. (A) (B) Şekil 3. GO (A) ve GRP/PtNPs (B) nin TEM görüntüleri

8 Hazırlanan GRP/PtNPs nanokompozitler, GCE yüzeylerine kaplanarak GRP/PtNPs/GCE sensörler oluşturulmuştur. Oluşturulan bu sensörlerin, elektrokimyasal açıdan kalitesinin gösterilmesi adına, K 3Fe(CN) 6 çözeltisi içerisinde dönüşümlü voltamogramları (CV) alınarak Randles-Sevcik eşitliği [6] kullanılarak elektroaktif yüzey alanı belirlenmiş ve konvansiyonel olarak sıklıkla elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan GCE ile karşılaştırılmıştır. PtNPs/GRP modifikasyonun ardından, geliştirilen elektrodun yüzey alanının GCE'ye yaklaşık olarak 1.2 kat daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Bu beklenen durum, modifikasyonun başarılı olduğunu göstermektedir. Geliştirilen grafen temelli sensörlerin elektrokimyasal açıdan en büyük problemlerinden biri, grafen nanoplakaların üst üste yığın hale gelerek elektronik özelliklerini kaybetmesidir. Bu noktada, nafyon, kitosan veya yüzey aktif maddeler kullanılarak grafenin yığın oluşturulma problemi çözümlenebilmektedir. Nafyon'un (NFN), grafen nanotabakalarının üst üste yığın hale gelerek elektronik özelliklerini kaybetmesini engelleyici özelliğinin yanı sıra sensörün kullanım ömrünü de artırması en önemli avantajlarından biri olarak göze çarpmaktadır. Bu nedenle geliştirilen GRP/PtNPs nanokompozit çözeltisi ortamına NFN ilavesi yapılarak GRP/PtNPs/NFN nanokompozit malzemesi oluşturulmuştur. Devamında ise, bu nanokompozit kullanılarak GCE yüzeyleri modifiye edilerek GRP/PtNPs/NFN/GCE nanosensörlerin fabrikasyonu gerçekleştirilmiştir. GRP/PtNPs/NFN/GCE nanosensörler, SLN molekülüne karşı oldukça iyi elektrokatalitik aktivite ve hassasiyet göstermiştir. Bunun yanı sıra, GCE, GRP/GCE, GRP/NFN/GCE ve GRP/PtNPs/GCE sensörlerinin yüzeylerinde de SLN nin elektrokimyasal davranışı adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltametrisi (AdsDPV) kullanılarak incelenmiş (Şekil 4) ve en iyi voltametrik cevap GRP/PtNPs/NFN/GCE sensöründe elde ediliği için SLN için bu sensör ile elektrokimyasal çalışmalara devam edilmiştir. Şekil 4. ph 2 B-R Tamponu içerisindeki 10 µm SLN için farklı modifiye elektrotlar kullanılarak alınan adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltamogramları (a) GCE; (b) GRP/GCE; (c) GRP/NFN/GCE; (d) GRP/PtNPs/GCE; (e) GRP/PtNPs/NFN/GCE

9 GRP/PtNPs/NFN/GCE sensörü ile SLN in elektrokimyasal analizine başlamadan önce çeşitli analiz parametreleri incelenmiş ve bunların optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. İncelenen parametreler aşağıda sunulmuştur; (A) (B) (C) (D) Şekil 5. (A) 100 µm SLN nin farklı ph lardaki GRP/PtNPs/NFN/GCE kullanılarak elde edilen pik akımları; (B) 100 µm SLN nin GRP/PtNPs/NFN/GCE üzerinde farklı tarama hızlarında elde edilen pik akımlarının logaritmalarının (log I p) tarama hızlarının logaritmalarına (log v) karşı elde edilen grafiği; (C) Biriktirme potansiyelinin SLN pik akımı üzerindeki etkisi; (D) Biriktirme süresinin SLN pik akımı üzerindeki etkisi 1. Ortam ph sının SLN in oksidasyon pik akımına etkisi araştırılmış ve maksimum akım sinyali ph 2 Britton-Robinson tampon (BRT) sisteminde gözlemlenmiştir. (Şekil 5A) 2. SLN nin GRP/PtNPs/NFN/GCE yüzeyindeki elektrot reaksiyonunun incelenmesi için, 50 µm SLN nin ph 2 BRT çözeltisi içerisinde çeşitli tarama hızlarında dönüşümlü voltamogramları alınmıştır. Bunun sonucunda, elektrot yüzeyinde adsorpsiyon ve difüzyon un birlikte olduğu bir oksidasyon prosesi ve tersinmez bir elektrot reaksiyonu gözlemlenmiştir. (Şekil 5B) Elde edilen regresyon eşitliği aşağıda gösterilmiştir; log Ipa (A) = log v (V s -1 ) (R 2 = ) 3. GRP/PtNPs/NFN/GCE yüzeyinde SLN molekülü için, adsorpsiyon temelli bir oksidasyon prosesinin de gerçekleşmesi tespitinin ardından, bu tür adsorpsiyon kontrollü sistemlerde yüzeyde biriktirme potansiyelinin ve süresinin pik akımına etkisi söz konusudur. Bu bakımdan, elektrot yüzeyinde bu iki parametre incelenmiş ve maksimum oksidasyon pik akımı 0.2 V (Biriktirme potansiyeli) ve 210 s (Biriktirme süresi) de elde edilmiştir. (Şekil 5C ve 5D) Elde edilen yukarıdaki optimizasyon parametreleri sonucunda, GRP/PtNPs/NFN/GCE sensör yüzeyinde SLN molekülünün AdsDPV yöntemiyle elektrokimyasal tayini yapılmıştır (Şekil 6). Doğrusal çalışma aralığı nm ve gözlenebilme sınırı (LOD) 0.55 nm olarak hesaplanmıştır (Tablo 1). Elde edilen analitiksel bulgular (Çalışma aralığı, LOD değeri, hassasiyet vs.), literatürdeki yöntemlerle kıyaslandığında oldukça effektif ve hassas bir elektrokimyasal yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır (Tablo 2). Ayrıca, önerilen

10 voltametrik metot elektrokimyasal analiz metotları içerisinde en düşük LOD değerine sahip metot olarak karşımıza çıkmaktadır. Şekil 6. GRP/PtNPs/NFN/GCE kullanılarak artan SLN konsantrasyonuna ( nm aralığında) karşı elde edilen adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltmogramları (İç grafik: SLN için doğrusal çalışma aralığı) Tablo 1. GRP/PtNPs/NFN/GCE kullanılarak gerçekleştirilen voltametrik metot ile SLN molekülü için elde edilen validasyon parametreleri Parametreler GRP/PtNPs/NFN/GCE Pik potansiyeli, V Doğrusal çalışma aralığı, nm Eğim, µa/µm Kesme noktası, µa Korelasyon Katsayısı Gözlenebilme sınır (LOD), nm 0.55 Tayin sınırı (LOQ), nm 1.80 Tablo 2. SLN molekülünün tayini için geliştirilen analitiksel yöntemlerin karşılaştırılması Method Linearity range LOD Reference UV µm µm [7] HPLC µm 6.16 µm [8] RP-HPLC µm µm [9] UHPLC µm µm [10] LC-MS/MS µm 0.30 nm [11] GRP/AuNPs/GCE µm 3.80 nm [12] GRP/PtNPs/NFN/GCE nm 0.55 nm [Bu çalışmada]

11 Proje kapsamında SLN in analizi için önerilen GRP/PtNPs/NFN/GCE sensörün gerçek numunelerdeki uygulanabilirliğinin araştırılması için sağlıklı bir insandan temin edilen kan plazması içerisinde SLN analizi yapılmıştır. Analiz öncesi, kan matriksindeki tüm proteinler çöktürülmüş ve daha sonra spiked metotu uygulanarak SLN içeren kan plazması yapılmıştır. Bu plazma içerisinde, SLN analizi GRP/PtNPs/NFN/GCE kullanılarak optimum şartlar altında gerçekleşmiştir ve elde edilen sonuçlar Tablo 3 te gösterilmiştir. Kan plazması sonuçlarından elde edilen bulgular doğrultusunda, GRP/PtNPs/NFN/GCE sensörün analitiksel uygulamalar için iyi bir doğruluk ve kesinliğe sahip olduğu açıkça görülmektedir. Bu bakımdan, önerilen GRP/PtNPs/NFN/GCE sensörün klinik ve endüstri çalışmalarında NBV tayini için umut vaadeden alternatif bir analitik sensör olarak kullanılabileceği tarafımızdan ön görülmektedir. Tablo 3. GRP/PtNPs/NFN/GCE kullanılarak gerçekleştirilen kan plazmasından SLN analizi sonuçları Parametreler GRP/PtNPs/NFN/GCE Eklenen SLN konsantrasyonu (µm) 1.50 Bulunan SLN konsantrasyonu (µm) 1.51 BSS (%) 4.81 Ortalama geri kazanım (%) t değeri 0.25 Tüm analizler standart ekleme metodu kullanılarak yapılmıştır (n=5). %95 güven seviyesinde t' değerinin teorik değeri 2.78 dir (n=5). V. Sonuç ve Öneriler Proje kapsamında, NBV ve SLN adlı etken maddelerin elektrokimyasal tayini ve oksidatif davranışlarının incelenmesi için literatürde ilk olacak şekilde grafen temelli elektrokimyasal nanosensorler üretilmiştir. NBV molekülünün tayini için, etkili bir indirgeme yöntemi ile hazırlanmış grafen nanotabakalar sentezlenmiş ve bu grafen nanotabakalar kullanılarak modifiye elektrotlar hazırlanmıştır. GRE/NFN sensör, NBV ün voltametrik sinyalini konvansiyonel GCE ye göre oldukça artırmıştır. SLN molekülünün tayini için de, Pt nanopartikül katkılı grafen nanotabakalar sentezlenmiş ve bu nanokompozitler kullanılarak modifiye elektrotlar hazırlanmıştır. GRP/PtNPs/NFN/GCE sensör SLN e karşı oldukça iyi bir elektrokimyasal aktivite göstermiştir. Hazırlanan bu nanomalzemeler, geniş elektroaktif yüzey alanları, mükemmel elektriksel iletkenlikleri, yüksek elektrokatalitik etki ve adsorpsiyon kabiliyeti gibi özellikleri sayesinde NBV ve SLN in elektrokimyasal tayinlerinde oldukça etkili bir sensör davranışları göstermişlerdir. Önerilen bu sensörler, özellikle gerçek numunelerde (kan, tablet vs.) düşük miktarlarda (<µm) ilaçların analizini yapabilecek umut vaadeden, yüksek hassasiyet ve seçiciliğe sahip bir elektrokimyasal nanosensörler olarak karşımıza çıkmıştır. VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar Bu projenin çıktıları doğrultusunda bilime katkısı iki başlık altında toplanmaya çalışılmıştır. İlk olarak, ilaç sanayinde ilaç etken maddelerin tayinine yönelik devamlı olarak çeşitli yöntemler geliştirilmekte ve bu yöntemlere büyük miktarlarda bütçeler ayrılmaktadır. İlaç fabrikaların AR-GE bölümünde ilaç analizleri için geliştirilen yöntemlerde aranan en önemli faktörlerin maliyet, kolaylık ve rutin analizlere uygunluğu oldukları düşünüldüğünde, proje kapsamında geliştirilen sensörlerin ilaç sanayinde kullanımı olduğu kaçınılmaz bir sonuç olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu sensörlerin, özellikle rol model olarak belirlenen antihipertansif ve prostat büyümesine karşı tedavi edici ajanların analizlerinde umut vaadeden analitiksel platformlar olarak kullanabileceği düşünülmektedir. İkinci olarak ise, grafen veya grafen temelli nanokompozit malzemelerin temel bilimler, mühendislik ve sağlık gibi birçok alanda yaygın olarak kullanımı bu yeni nesil karbon malzemenin önemini açıkça ortaya koymaktadır. Son dönemlerde çip olarak sıklıkla kullanılan perde baskılı elektrotların (SPE adı verilen) ana ölçüm sistemi karbon temelli malzemeden oluşmaktadır. Bu noktada, proje kapsamında sunulan grafen veya

12 grafen temelli nanokompozit malzemeler kullanılarak SPE gibi konvansiyonel sistemler kolaylıkla modifiye edilerek aynı anda binlerce grafen temelli elektrotun üretimi kolaylıkla sağlanabilinecektir. Proje kapsamında önerilen sentez yöntemlerinin, ucuz, kolay uygulanabilir ve yüksek kaliteye sahip olması gibi temel özellikler düşünüldüğünde çip üretiminde/modifikasyonunda kullanımı söz konusudur. Bu gibi avantajlar göz önüne alındığında, biyolojik ve ilaç moleküllerinin tayinlerine yönelik yüksek hassasiyete ve seçiciliğe sahip mikroçipler (tek kullanımlık) geliştirilmesi hususunda, projemiz çıktılarının literatüre katkı sağlayacağını düşünmekteyiz. VII. Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları IX. Kaynaklar [1] W.S. Hummers, R.E. Offeman, Preparation of graphitic oxide, J. Am. Chem. Soc.80 (1958) [2] E. Er, H. Çelikkan, An efficient way to reduce graphene oxide by waterelimination using phosphoric acid, RSC Adv. 4 (2014) [3] Engin Er, Hüseyin Çelikkan, Nevin Erk, Highly sensitive and selective electrochemical sensor based onhigh-quality graphene/nafion nanocomposite for voltammetricdetermination of nebivolol, Sensors and Actuators B 224 (2016) [4] Y. Li, W. Gao, L. Ci, C. Wang, P.M. Ajayan, Catalytic performance of Ptnanoparticles on reduced graphene oxide for methanol electro-oxidation,carbon 48 (2010) [5] P. Scherrer, Estimation of the size and internal structure of colloidal particlesby means of röntgen, Nachr. Ges. Wiss. Göttingen 2 (1918) [6] A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical Methods Fundamentals Applications,2nd ed., John Wiley and Sons Inc., NewYork, [7] K.K. Jahan, S.M. Malipatil, Development and validation of new spectrophotometric methods for the quantitative estimation of silodosin in bulk drug and pharmaceutical formulations, Int. J. Pharm. Res. Anal. 4 (2014) 65. [8] K.K. Jahan, S.M. Malipatil, Development and validation of new HPLC method for the quantitative estimation of silodosin in bulk and pharmaceutical formulation, World J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (2014) 960. [9] T.P. Aneesh, A. Rajasekaran, Development and validation of HPLC method for the estimation of silodosin in bulk and pharmaceutical dosage form, Int. J. Biol. Pharm. Res. 3 (2012) 693. [10] J.V. Shaik, S. Saladi, S.S. Sait, Development of Stability-Indicating UHPLC Method for the Quantitative Determination of Silodosin and Its Related Substances, J. Chromatogr. Sci. 52 (2014) 646. [11] X. Zhao, Y. Liu, J. Xu, D. Zhang, Y. Zhou, J. Gu, Y. Cui, Determination of silodosin in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. B 877 (2009) [12] E. Er, H. Çelikkan, N. Erk, M.L. Aksu, A new generation electrochemical sensor based on Graphene nanosheets/gold nanoparticles/nafion nanocomposite for determination of Silodosin, Electrochimica Acta 157 (2015)

13 X. Ekler a. Mali Bilanço ve Açıklamaları: Proje bütçesinden yapılan harcamalar projenin ilk döneminde yapılmıştır, ikinci dönemde herhangi bir harcama yapılmamıştır. Yapılan harcamalar aşağıda bütçe kodları ile belirtilmiştir; Tüketime Yönelik Mal ve Malzeme: 613,60 TL Menkul Mal, Gayri-maddi Hak Alım, Bakım ve Onarım Giderleri: ,70 TL Mamul Mal Alımları: ,00 TL Toplam Bütçe Ödeneği: ,00 TL Harcanan Ödenek Miktarı: ,30 TL Kalan Ödenek Miktarı: 1.135,70 TL b. Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Proje kapsamında alınan tüm cihaz ve malzemeler, yüksek lisans ve doktora öğrencilerinin tezlerinin yapılmasında, yayınların üretilmesinde kullanılacaktır. Buna ilaveten, projede alınan her bir cihazın kullanım alanları ayrıntılı şekilde belirtilmiştir; Autolab Metrohm marka potansiyostat/galvonastat sistemi, kontrol bilgisayar paketi ve katı hücre standı, ileride tasarlanacak elektrokimyasal temelli çalışmalarda rahatlıkla uzun süre kullanılabilecek yeterliktedir. Kesintisiz Güç Kaynağı (UPS): Elektrik kesintilerinden kaynaklı potansiyostat/galvanostat cihaz hassasiyetini ve dayanıklılığını olumsuz yönde etkileyecek olan etmenler UPS cihazı sayesinde ortadan kaldırılmıştır. Hassas terazi ve otomatik pipet seti: İlerideki çalışmalarımızın da temelini oluşturan ilaçların yüksek hassasiyette tartılmasında ve analitik uygulamalar sırasında ilaç numunelerin hazırlanmasında kullanılacaktır. Isıtıcılı manyetik karıştırıcı: Karbon temelli nanomalzemeler ile oluşturulacak elektrokimyasal sensörlerin hazırlanması sırasında kullanılacaktır. Perde baskı eletrot (SPE) kablosu: Teknolojik ilerlemeler dolayısıyla SPE elektrotlar çalışmaların pratikliğini, popülerliğini ve kalitesini kayda değer biçimde artırmaktadır. Bu nedenle, SPE kabloya ilerideki çalışmalarda özellikle ihtiyaç duyulacaktır. c. Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) ---- d. Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar): 1. Yazılı Bildiri: Engin Er, Hüseyin Çelikkan, Nevin Erk, The importance of graphene in electrochemical sensor applications and a novel graphene-based nanosensing material for the determination of nebivolol, Euroanalysis 2015, 6-10 September 2015, Bordeaux-France. 2. Yazılı Bildiri: Engin Er, Hüseyin Çelikkan, Nevin Erk, An ultra-sensitive PtNPs@Graphene/Nafion electrochemical sensing-platform for detection of silodosin in human plasma, 3rd International Congress on Biosensors, 5-7 October 2016, Ankara-Turkey. e. Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler: 1. Engin Er, Hüseyin Çelikkan, Nevin Erk, Highly sensitive and selective electrochemical sensor based on high-quality graphene/nafion nanocomposite for voltammetric determination of nebivolol, Sensors and Actuators B, 224 (2016)