Terapötik Hedef Validasyonu:

Transkript

1 Terapötik Hedef Validasyonu: Sinekten insana Metiner Tosun EÜ Eczacılık Fakültesi Farmakoloji AD

2 Ca +2 : Yaşam ve ölüm sinyali Nature,

3 Temel olaylar Küresel Ca 2+ dalgaları Hücre içi Küresel Ca 2+ dalgaları Hücrelerarası Membran uyarılması Mitokondri metabolizması Vezikül sekresyonu Düz kas gevşemesi Mitoz bölünme Sinaptik plastisite Fertilizasyon Düz kas kasılması İskelet kasının kasılması Kalp kasının kasılması Karaciğer metabolizması Gen transkripsiyonu Hücre çoğalması Yara iyileşmesi Silya hareketi Glial hücre fonksiyonu Safra akımı İnsülin sekresyonu Endotelde NO sentezi Nature,

4 Model organizmalar 1 Virüsler Bakteriler ( E. coli) 4

5 Model organizmalar 2 Yuvarlak kurt (C. elegans): Maya (S. cerevisiae) 5

6 Model organizmalar 3 Meyve sineği (Drosophila melanogaster) Zebra balığı (Denio reriro) 6

7 Model organizmalar 4 Bitki (Arabidopsis thaliana) Fare (Mus musculus) + kültür hücreleri 7

8 Transient Receptor Potential, (trp) Kronoloji Abnormal electroretinogram from a Drosophila mutant. Nature 224, Induction of photoreceptor voltage noise in the dark in Drosophila mutant. Nature 258, (Kendiliğinden oluşan trp mutant sinek) Molecular characterization of the Drosophila trp locus: a putative integral membrane protein required for phototransduction. Neuron 2,

9 Lantan Drosophila mutant trp fotoreseptörü taklit etmektedir. Sens Neural Behav Physiol 166, (TRP nin görmedeki işlevinin anlaşılması) 9

10 trp kronolojisi: devam The trp gene is essential for a light-activated Ca 2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron 8: trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca 2+ entry. Cell. 85, 1996 The genome sequence of Drosophila Science 287,

11 Drosophila TRP ve insan TRPC1 kanal proteinlerinin yapısal ve topolojik özellikleri. Curr Opin Neurobiol,

12 THE RUNNERS UP Science 298,

13 7 TRP ailesi Montell, STKE,

14 TRP proteinlerinin filogenetik ağacı. Nilius, Pflügers Arch Europ J Physiol,

15 TRP lerin çeşitli türlerdeki fizyolojik işlevleri Sinek: görme. Minke, Biophys Struct Mech, 1977; Montell et al., Science, Nematod: zararlı kimyasalları algılama. de Bono et al., Nature, Maya: hipertonisite algılama. Denis & Cyert, J Cell Biol, Fare: feromon algılama. Stowers et al., Science, İnsan: ayrımsal tat ve sıcaklık algılama. Zhang et al., Cell,

16 TRP-aracılı fizyolojik mekanizmalar ve olası patolojik durumlar Sinyal iletimi Damar düz kas tonus ve mikrovasküler permeabilite Damar endoteli ve düz kas fonksiyonları Fertilizasyon Böbrek, mesane ve ince bağırsak fonksiyonları Nöronal gelişim ve plastisite Hipoksik hücre ölümü Kanser Enflamasyon 16

17 TRP ekspresyonu ile ilişkili hastalıklar 1 Impaired endothelium-dependent vascular relaxation in TRPC4-KO mice, Freichel et al., Nat Cell Biol, 2001 Inflammation of airways: possible role in asthma TRPP-PKD2; Autosomal dominant polycystic kidney disease, Cai et al., J Biol Chem, TRPM8; upregulated in several types of cancer, breast, colon, prostate, lung, skin, Peier et al., Cell, 2002; Mckemy et al., Nature, 2002; Tsaveler et al., Cancer Res,

18 TRP ekspresyonu ile ilişkili hastalıklar 2 Vascular injury enhances plasticity in TRPC expression, Berghdahl et al., Am J Physiol Cell Physiol, TRPC channel overexpression & increased PASMC proliferation and pulmonary vascular medial hypertrophy in IPAH patients, Yu et al., PNAS, 2004, Landsberg & Yuan, News Physiol Sci, 2004, Zhang et al., Am J Physiol Cell Physiol, Neuronal degeneration & TRP channel, Geng, Biochim Biophy Acta, Alzheimer s-disease-linked prenisilin2 variants influences TRPC6-enhanced Ca2+ entry into HEK293 cells, Lessard, Cellul Signal,

19 Sıçanda hedef keşfi: Depo-kontrollü kalsiyum girişinin işlevsel varlığı 19

20 İzole damarda [Ca2+]i ve kasılma yanıtlarının eşzamanlı izlenmesi PSS in out Force Transducer PC Detector UV Excitation 340/380 nm 20

21 R340/380 Canlı damar dokusunda membran depolarizasyonuna bağlı eşzamanlı [Ca 2+ ] i ve kasılma yanıtları (Tosun, JPET, 1998) 1,05 Ca 2+ 1, mm KCl 10 M Verapamil Kontraksiyon 10 mn 10 min 21

22 Force (mn) R340/380 [Ca 2+ ]i değişimlerinden bağımsız vazokonstriksiyon (Tosun, JPET, 1998) 1,15 Wash Ca 2+ 1,10 1,05 1,00 Ca 2+ - bağımsız yanıt -9 3x 5x 7x -8 3x -7 3x -6 log [U46619] 20 Kontraksiyon Time (h)

23 R340/380 Ca 2+ ve kasılma kenetinin ayrıştığı durumlar (Tosun JPET, 1998) ER stresi 1.15 Sadece [Ca 2+ ] i Sadece kontraksiyon 1.10 Ca M CPA 1 10 M Verapamil mm Ni M U4 1 M NE Kontraksiyon 10 mn 30 min 23

24 Ca 2+ indikatörü yüklü VSM hücreiçi Ca 2+ depoları Golovina& Blaustein, Science,

25 Depo kontrollü Ca 2+ girişi (SOC): 3 teori (Clapham, Nature, 2003). 25

26

27 TRP1 ve TRP6: Sıçan aortunda yaşa bağlı zıt ekpresyon profili

28 Yaşlanma sürecinde sıçan aortunda TRPC1 azalırken TRPC6 artar (Erac et al 2009, AGE) 28

29 Yaşlanma sürecindeki sıçan aortunda TRPC protein dağılımı değişmektedir (Erac et al 2009, AGE) 29

30 TRPC6 adrenoseptör (AR) sinyal iletimi ile ilişkili olup yaşlı aortta AR duyarlığı artmaktadır (Erac et al 2009, AGE) 30

31 Yaşlanma ile azalan TRPC1 ekspresyonunu in vitro post-transkripsiyonel gen susturma (PTGS) yöntemi ile taklit ederek terapötik hedef tanımlama 31

32 Gen susturma: RNA interferans NATURE

33 RNAi mekanizmasının keşfi Fire, A. et al. Nature 391, (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in C. elegans. RNAi memeli hücrelerinde de operasyonel Elbashir, S.M. et al. Nature 411, (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. 33

34 A7r5 embriyonik sıçan hücrelerinde TRPC üyeleri (Selli et al, 2009 Vascul Pharmacol) 34

35 CyPB expression TRPC1 geni susturulmuş A7r5 hücrelerinde TRPC6 ekspresyonu artmaktadır (Selli et al, 2009, Vascul Pharmacol) 60 NT sirna CyPB sirna ** n=3 35

36 [Ca 2+ ] i (340/380) SR Ca 2+ salıverilişi ve SR stresi sonrası depo-kontrollü Ca (SOC) SOC Fura-2/AM time 36

37 Reseptörden bağımsız Ca 2+ girişi sitrpc1-transfekte A7r5 hücrelerinde artmaktadır (Selli et al, 2009, Vascul Pharmacol) 37

38 SOC girişi sitrpc1-transfekte A7r5 hücrelerinde artmaktadır (Selli et al, 2009, Vascul Pharmacol) 38

39 TRPC6 mrna/ actin in vivo sitrpc1 uygulanması: TRPC6 ekspresyonu aortta artmaktadır Control +sitrpc1-treated 30 ~%60 % VSM n=3 0 Endotelium n=1 (3 pooled) 39

40 Sonuçlar: TRPC1 in SOC bileşiminde temel düzenleyici olduğu ve azalmasının TRPC6 tarafından kompanse edildiği düşünülmektedir. TRPC6 artışı yaşlanmayla ilişkili vazospastik hastalıklarda ilaç hedefi olabilir. 40

41 TRP iyon kanallarının insan kanser hücre hatlarında araştırılması: Devam eden çalışmalar ve gelecek HTS 41

42 shrna eksprese eden plazmid ve kanser hücre hatları Transfeksiyondan 72 s sonra Protein ekspresyonu 42

43 SR Ca 2+ salıverilişi ve SOC TRPC1 susturulmuş kanser hücrelerinde artmaktadır 43

44 Real time Cell Analyzing (RTCA) (xcelligence, Roche) proliferasyonu, sitotoksisite, adhezyon, canlılık, invazyon ve migrasyon 44

45 RTCA: Optimizasyon çalışmaları (farklı sayıda ekilen aynı kanser hücre hattı )

46 RTCA: (Benzer sayıda ekilen farklı kanser hücre hatları) 46

47 Gelecek: Tüm genom nicel gen ekspresyon analizi Direct Hybridization Assay HumanHT-12 BeadChip (> 25,000 gen, > 48,000 probe 47

48 Teşekkür Yasemin Eraç & Çiğdem Selli, (Doktora öğr.) EÜ Eczacılık Fak. Farmakoloji AD K Can Akçalı, Bilkent Üni., Fen Fak., Mol Biol ve Genetik AD Buket Kosova, EÜ Tıp Fak., Tıbbi Biol. AD Esra Erdal, D.E.Ü. Tıp Fak. Tıbbi Biol. AD TÜBİTAK Proje destekleri TRPC Gen Ailesinin Karsinogenezdeki İşlevsel Ekspresyon Kalıbının Post- Transkripsiyonel Gen Susturma ile Araştırılması. M Tosun (P.Y.), B Kosova, E. Erdal, Y Eraç, Ç Selli, SBAG-108S072 Vazospazm Gelişiminde Kapasitatif Kalsiyum Girişinin Farmakolojik ve Moleküler Yaklaşımlarla Kontrolü. M Tosun (P.Y.), B Kosova, Y Eraç, Ç Selli, SBAG-3033 Sıçan Vasküler Düz Kasında Trpc Gen Ailesinin Ayrımsal Ekspresyonlarının Yaşlanma Sürecindeki Yeri. M Tosun (P.Y.), KC Akçalı, B Kosova, Y Eraç, SBAG