T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRPC GEN AİLESİNİN YAŞA BAĞLI AYRIMSAL EKSPRESYONU VE DEĞİŞEN VASKÜLER REAKTİVİTE PROFİLLERİ

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRPC GEN AİLESİNİN YAŞA BAĞLI AYRIMSAL EKSPRESYONU VE DEĞİŞEN VASKÜLER REAKTİVİTE PROFİLLERİ Doktora Tezi Uzm. Ecz. Yasemin ERAÇ DANIŞMAN Doç. Dr. Metiner TOSUN İZMİR 2007

2

3 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRPC GEN AİLESİNİN YAŞA BAĞLI AYRIMSAL EKSPRESYONU VE DEĞİŞEN VASKÜLER REAKTİVİTE PROFİLLERİ Farmakoloji Anabilim Dalı Programı Doktora Tezi Uzm. Ecz. Yasemin ERAÇ DANIŞMAN Doç. Dr. Metiner TOSUN İZMİR 2007 i

4 ii

5 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ Başkan : Doç Dr. Metiner TOSUN Üye : Prof. Dr. Levent Üstünes Üye : Prof. Dr. Zeliha KERRY Üye : Yard. Doç. Dr. K. Can AKÇALI Üye : Yard. Doç. Buket KOSOVA Doktora Tezinin kabul edildiği tarih:... iii

6 ÖNSÖZ Güvenini ve sabrını sunarak yaşamımdaki ideallerimden birine ulaşma şansı tanıyan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Aslı Özer e, Sabır ve özveri ile bilimsel ve düşünsel gelişimime yön veren ve katkıda bulunan, desteğini her zaman hissettiğim danışman hocam Sayın Doç. Dr. Metiner Tosun a, Bilimsel desteği ve arkadaşlığıyla bana yeni ufuklar açan ve çalışma şevki veren Yrd. Doç. Dr. Buket Kosova ya, Bana güvenerek gelişmiş laboratuar olanaklarını sunan ve bilimsel gelişimimde büyük katkısı olan Yrd. Doç. Dr. K. Can Akçalı ya, Doktora çalışmamın her aşamasında varlığını yanımda hissettiğim sevgili arkadaşım Ar.Gör. Çiğdem Selli ye, Bilgi ve deneyimlerini paylaşan başta Prof. Dr. Zeliha Kerry ve diğer tüm değerli hocalarıma ve çalışma arkadaşlarıma RNA, protein izolasyonu ve elektroforez aşamalarındaki teknik yardımlarından dolayı Bilkent Üniversitesi, Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümünden yüksek lisans öğrencisi Iraz T. Aydın a ve doku kesitlerinin alınmasını sağlayan Sayın Turan Daştandır a Eşim Bayrı Eraç a ve aileme teşekkür ederim. Doktora tezimi oluşturan proje büyük oranda TUBİTAK (SBAG-2735) ve kısmen Ege Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Uygulama Merkezi EBİLTEM (05BİL016) ve EÜ Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP-04ECZ011) tarafından desteklenmiştir. İzmir, 2007 Yasemin ERAÇ iv

7 İÇİNDEKİLER 1. GENEL BİLGİLER Kalsiyum Ca +2 -sinyal dinamikleri ve homeostazı Kalsiyum homeostazında rol oynayan hücre içi sistemler SR Ca +2 Kanalları Mitokondri Ca +2 -bağlayan proteinler Sarko(endo)plazmik retikulum Ca +2 pompası Ca +2 homeostazında rol oynayan hücre membranındaki sistemler Hücre membranı Ca +2 -ATPaz Hücre membranındaki Na + /Ca +2 değiş-tokuşçusu Sarkolemmal Ca +2 Kanalları Voltaja duyarlı Ca +2 Kanalları Ligand/ Reseptör-kontrollü Ca +2 Kanalları (ROCC) Depo-kontrollü Ca +2 Kanalları TRP KANALLARI TRPC kanalları TRPC TRPC TRPC TRPC TRPC TRPC TRPC TRPV Kanalları TRPM Kanalları TRPML Kanalları TRPP Kanalları TRPA Kanalları TRPN Kanalları YAŞLANMA ve DAMAR SİSTEMİ Yapısal Değişiklikler Hücresel Yaşlanma İşlevsel Değişiklikler GEREÇ VE YÖNTEM Hayvanlar Vasküler Reaktivite Deneyleri Total RNA İzolasyonu ve Ters Transkripsiyon cdna Sentezi TRPC Genlerine Spesifik Primerlerin Belirlenmesi Kantitatif / Real-Time PCR Primerlerin hazırlanması Standart Eğrinin Çizimi Erime Eğrisi Analizi SDS-PAGE ve Western Blot Protein İzolasyonu Proteinlerin Yüklenmesi ve Elektroforez Proteinlerin Transferi Membranın Bloke Edilmesi ve Antikorlar ile İnkübasyonu v

8 2.10. İmmünohistokimya İstatiksel Analiz BULGULAR Fonksiyonel Çalışmalar: TRPC mrna Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi Western Blot İmmünohistokimya TARTIŞMA TRPC Ekspresyonu ve Vasküler Reaktivite Yaşlanma Süresince Endotelyuma-Bağlı Gevşeme Yanıtları Üzerine Prostaglandinlerin Etkisi SONUÇ VE ÖNERİLER ÖZET KAYNAKLAR vi

9 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1.1: L-tipi Ca +2 kanalı alt birimlerinin membran topolojisi Şekil 1.2: SOC girişi için önerilen mekanizmalar Şekil 1.3: STIM1 ve SOCC aktivasyonu Şekil 1.4: STIM1 etkisiyle SOC kanallarının aktivasyonu için önerilen modeller Şekil 1.5: Drosophila melanogaster de TRP kanallarının keşfi Şekil 1.6: TRP kanallarının yedi altailesi Şekil 1.7: TRP kanallarının filogenetik ağacı Şekil 1.8 : TRPC ailesinin üyeleri ve önerilen membran topolojisi Şekil 1.9: TRPC kanallarının yapısı Şekil 2.1: Genel çalışma şeması Şekil 2.2: Örnek bir mrna dizisi (TRPC1) Şekil 2.3: Sıçan, fare ve insan arasında TRPC1,3-6 proteinlerinin Clustal W analizi Şekil 2.4: TRPC1 proteininin aa dizisi Şekil 2.5: TRPC6 ve β-aktin genleri için amplifikasyon süresince floresans emisyonundaki artış Şekil 2.6: Standart eğri çizimi ve grafikleri Şekil 2.7: PCR ürünün erime eğrisi analizi Şekil 2.8: TRPC6 genine ait erime eğrisi analizine bir örnek Şekil 2.9: TRPC1, 3, 4, 5 ve 6 proteinleri için önerilen membran topolojileri Şekil 3.1: Genç ve yaşlı sıçan aortunda ACh ve CPA doz yanıt eğrileri Şekil 3.2: Endotel kaynaklı gevşemeler üzerine siklooksijenaz inhibitörlerinin etkisi Şekil 3.3: PE ve SNP doz-yanıt eğrileri Şekil 3.4: Reseptör aracılı ve reseptörden bağımsız endotel kaynaklı gevşeme yanıtları Şekil 3.5: Düz kas ve endotelyal TRPC mrna ekspresyonunun RT-PCR ile belirlenmesi Şekil 3.6: Tüm gruplara ait sıçan torasik aortunda TRPC 1, 3-6 proteinlerinin WB ile belirlenmesi Şekil 3.7: TRPC proteinlerinin IHC yöntemi ile belirlenmesi vii

10 TABLO LİSTESİ Tablo 1.1: TRPC 1-7 genlerinin insan ve sıçan kromozomlarındaki lokalizasyonu ve ekzon sayıları Tablo 2.1: rtrpc1 proteini için önerilen membran topolojisi Tablo 2.2: rtrpc3 proteini için önerilen membran topolojisi Tablo 2.3: rtrpc4 proteini için önerilen membran topolojisi Tablo 2.4: htrpc5 proteini için önerilen membran topolojisi Tablo 2.5: htrpc6 proteini için önerilen membran topolojisi Tablo 2.6: Primerlerin hazırlanması Tablo 2.7: PCR da kullanılan primer dizileri Tablo 2.8: PCR karışımının hazırlanması Tablo 2.9: Her bir primer için belirlenen bağlanma sıcaklıkları, MgCl 2 konsantrasyonları ve uzama süreleri Tablo 2.10: LC Deney Protokolü Tablo 3.1: Genç ve yaşlı sıçanlarda endotelyuma bağlı gevşeme yanıtları üzerine indometazin ve NS 398 in etkileri Tablo 3.2: Yaşlanmanın endotel ve vasküler kaynaklı gevşemeler üzerine etkisi Tablo 3.3: ACh ve CPA doz-yanıt eğrileri için paralellik testi sonuçları Tablo 3.4: Genç ve yaşlı gruba ait sıçan torasik aortunda TRPC 3,4 ve 6 mrna ekspresyon düzeylerinin TRPC1 düzeyine normalize edilmesi viii

11 Kısaltmalar [Ca +2 ] i ACh AMV ANK APS ATP BPB BLAST BSA Ca +2 CC CCE cdna COX CPA DAB DAG DEPC DS EC 50 ECL EDTA enos Hücre içi Ca +2 konsantrasyonu Acetylcholine, Asetilkolin Avian myeloblastosis virüsü Ankirin Amonyum persülfat Adenosine triphosphate, Adenozin trifosfat Bromophenol blue, Brom fenol mavisi Basic local alignment search tool Bovine serum albumin, Sığır serum albumini Kalsiyum iyonu Coiled-coil Capacitative calcium entry, Kapasitatif kalsiyum girişi Complementer DNA, Komplementer DNA Cyclooxygenase, Siklooksijenaz Cyclopiazonic acid, Siklopiazonik asit 3,3 -diaminobenzidin Diaçil gliserol Diethyl pyrocarbonate, Dietilpirokarbonat Distile su Maksimum yanıtın %50 sini oluşturan agonist konsantrasyonu Enhanced chemiluminescence, güçlendirilmiş kemilüminesans Etilen diamin tetra asetik asit Endotelyal NOS ix

12 ET EtOH FTS HRP IHC IP 3 IP 3 R ROCC LSAB MgCl 2 M-MuLV mrna NCX NO NOS PAGE PCR pd 2 PDZ Endotelin Etanol Fizyolojik tuzlu su, %0.9 luk NaCl çözeltisi Horseradish peroksidaz İmmunohistochemistry, İmmunohistokimya İnositol-1,4,5-triphosphate, İnositol-1,4,5-trifosfat IP 3 reseptörü Receptor-operated Ca 2+ channels, Reseptör-kontrollü Ca +2 kanalları Labeled streptavidin biotin Magnezyum klorür Moloney murine leukemia virüsü Mesajcı Ribonükleik asit Na + /Ca 2+ exchanger, Na + /Ca +2 değiştokuşçusu Nitrik oksit, Nitrik oksit sentaz Poliacrylamide gel electrophoresis, Poliakrilamid jel elektroforezi Polimerase chain reaction, Polimeraz zincir reaksiyonu EC 50 negatif logaritması Post-synaptic density protein, Disc-large tumour supressor, Zonula occludens protein PE PLC PVDF RNAi RT Phenylephrine, Fenilefrin Phospholipase C, Fosfolipaz C Polyvinylidene fluoride, Poliviniliden florid RNA interference, RNA ya müdehale Reverse transcription, Ters transkripsiyon x

13 RT-PCR SDS SERCA sirna SNP SOCC SR/ER TBS TBS-T TEMED TIR TM T m TRP TRPA TRPC TRPL TRPM TRPML TRPN TRPP TRPV VSM Real-time PCR, Gerçek zamanlı PCR Sodyumdodesilsülfat Sarko(endo)plazmik retikulum Ca +2 -ATPaz Small interfering RNA Sodyum nitroprusiyat Store-operated Ca 2+ channels, Depo kontrollü Ca +2 kanalları Sarko(endo)plazmik retikulum Tris buffered saline Tween-20 içeren TBS N,N,N',N'-tetramethylethylene-diamine, Tetrametiletilendiamin Tripure isolation reagent, Tripure izolasyon çözeltisi Transmembran, Membranı geçen Melting temperature, Erime sıcaklığı Transient receptor potential, geçici membran potansiyeli, TRP ankryin TRP canonical TRP-like TRP melastatin TRP mucolipin NOMPC, no mechanoreceptor potential C TRP polisistin TRP vanilloid Vascular smooth muscle, Damar düz kası xi

14 GİRİŞ Farklı TRP (transient receptor potential) proteinlerinin uyaranın tipi ve şiddetine bağlı olarak kalsiyum (Ca +2 ) iyon geçirgenliklerini değiştirerek hücresel yanıt kalıplarını modüle ettikleri bilinmektedir. Söz konusu hücresel ince ayarın heteromultimerik iyon kanalı oluşumuna katılan TRP alt tiplerindeki değişimiyle sağlandığına inanılmaktadır. Her geçen gün, çok yönlü işlevsel önemlerine ilişkin kanıtların arttığı TRP iyon kanallarının geleneksel inhibitörlerinin bulunmaması bu kanalların çalışma mekanizmasının aydınlatılmasını zorlaştırmaktadır. Bu nedenle öncelikle TRP gen ailesinin farklı stres durumlarındaki dokuya-spesifik ayrımsal ekspresyonlarının belirlenmesi hastalıkların tanısında kritik önem taşımaktadır. Damar düz kasının kasılma ve gevşeme yanıt kalıpları patolojik durumların yanı sıra yaşlanma sürecinde de değişiklik göstermektedir. Günümüzde vazospastik olgularda kullanılan geleneksel ilaçlar göreceli afinitelerinden yararlanma dışında ne dokuya ne de yaşa özgü kullanılmaktadırlar. Çok sayıda doku ve sistemde varlığı tespit edilen TRP proteinlerinin birçok fizyolojik ve patofizyolojik olaylarla ilişkisinin gösterilmesi TRP kanallarının önemini giderek artırmaktadır. Ayrıca gelişimsel süreçte işlevleri gösterilen TRP kanallarının yaşlılık damar fizyolojisindeki yeri henüz bilinmemektedir. Bu nedenlerle damar düz kas tonusu ve kan basıncının düzenlenmesinde önemli rolleri olduğu bildirilen TRPC alt tiplerinin yaşlanma sürecindeki ekspresyon düzeylerini saptamak ve bu süreç içinde vasküler yanıt kalıplarındaki değişimlerle olası etkileşimini incelemek çalışmamızın amacını oluşturmaktadır. 1

15 Dokuları besleyen kan akımının sağlıklı devamlılığı damar düz kasının tonusunu düzenleyen mekanizmaların fizyolojik sınırlarda çalışmalarına bağlıdır. TRPC iyon kanallarının damar düz kas kontraksiyon/gevşeme ve kan basıncının kontrolündeki rolleri nedeniyle yeni terapötik hedefler olma olasılıkları yüksek görülmektedir. Bu çalışmanın bulguları yaşlanma ile ilişkili vasküler reaktivite değişimlerinden sorumlu patofizyolojik mekanizmaların daha ileri düzeyde aydınlatılmasında kullanılabileceği gibi yeni tedavi yöntemleri ve ilaç hedeflerinin belirlenmesinde de yararlı olacaktır. Ayrıca, bazı TRP alt tiplerinin ekspresyon düzeylerindeki artışın özellikle bazı hiperplazi ve kanser olgularında artış göstermesi proliferasyon nedeniyle lümeni daralan damar hastalıklarının tanı ve tedavisinde yeni stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. 2

16 1. GENEL BİLGİLER Diğer TÜBİTAK (SBAG3033) ve EÜBAP (06ECZ013) projelerimiz kapsamında TRPC proteinleri ile ilişkili depo-kontrollü Ca +2 canlı izole doku ve hücre kültür hatlarında, hücre içi gerçek zamanlı Ca +2 ölçümleri yapılarak söz konusu kanalların işlevsel özellikleri incelenmiştir. Doktora tez projem kapsamında yaşlanma sürecinde izlediğim TRPC kanal proteinlerinin ekspresyonel değişimleri ve vasküler yanıt kalıplarındaki olası işlevselliği araştırılarak yorumlanmıştır. TRPC lerin moleküler yapıları ve sinyal mekanizmaları bu tez kapsamında olmamakla birlikte hücre içi Ca +2 düzenlenmesindeki kritik önemleri ve TRP süper gen ailesi içindeki yerleri kapsamlı bir şekilde araştırılarak devam eden çalışmalarımıza gerektiğinde referans oluşturmak amacıyla da derlenerek teze eklenmiştir. Ayrıca, mrna oligonükleotid dizileri, amino asit içerikleri ve olası membran topolojilerinden, oligonükleotid primer, antikor seçiminde ve gen-protein bulgularının karşılaştırılmasında yararlanılmıştır Kalsiyum Hücresel süreçlerin hemen hemen tümünde kalsiyumun düzenleyici bir rol oynadığının belirlenmesi 20. yüzyıl biyolojisinin en önemli buluşlarından biri olarak kabul edilmektedir (190). 19. yüzyıl sonlarında kalsiyum (Ca +2 ) sadece kemik stabilitesi için gerekli yapısal bir element olarak bilinmekteydi (44). Kalp hücrelerine Ca +2 girişinin kontraksiyonu başlatan bir sinyal olduğu 1883 yılında Ringer tarafından açıklanmıştır (261). Ringer in bu buluşunun bir dönüm noktası olduğu ancak 1940 larda kalsiyumun yapısal rolünden tamamen bağımsız olarak hücre biyokimyasında işlevsel bir element olduğunun gösterilmesi ile anlaşılmıştır. 3

17 Ringer in gözlemleri sonucunda kalp kasının kasılabilmesi için kalsiyumun gerekli olduğunun anlaşılmasını iskelet kasının kasılmasında da aynı iyonun işlevinin belirlenmesi, sarkoplazmik/endoplazmik retikulum (SR) Ca +2 -ATPaz ın (SERCA) keşfi (82,120) ve kalsiyumun troponin ile etkileşerek aktomiyozin aktivitesini düzenlediğinin bulunuşu izlemiştir (83,336). Günümüzde artık Ca +2 hücrenin oluşumundan ölümüne kadar hücreleri yönlendiren bilginin evrensel ve çok yönlü taşıyıcısı olarak tanımlanmaktadır. Son yıllarda hücre bölünmesi, hücresel motilite, hormon sekresyonu, metabolizma, sinir sisteminin işleyişi, protein döngüsü, gen ekspresyonu, gelişimsel düzenlenme ve programlı hücre ölümü (apoptoz) gibi hücresel süreçlerde kalsiyumun mesajcı rolü gösterilmiştir (23,29). Kalsiyum diğer tüm sinyal ajanlarından farklı olarak ikinci ulak işlevini geri besleme mekanizmaları aracılığı ile kontrol edebilmektedir. Örneğin membran taşıyıcıları ile hücre içerisine hareketini kalsiyum kendisi kontrol edebilmektedir (44). Kalsiyum iyonlarının aynı zamanda enzimlerin düzenlenmesinde de işlev gördükleri bilinmektedir (310). Ayrıca Ca +2 sadece aktif hücrelerde oluşturulan bir ikinci ulak değil aynı zamanda bir hormon ya da büyüme faktörü gibi hücre membranının dışında da gerçek bir birinci ulak olarak çalışabilmektedir. Hücre içi Ca +2 konsantrasyonu ([Ca +2 ] i ) ve hareketi doğru kontrol edildiğinde hücre işlevi için son derece gerekli bir element iken, bu kontrol düzgün yapılamadığında nekrotik ya da apoptotik hücre ölümü gerçekleşebilmektedir. Kalsiyum homeostazındaki küçük bir aksaklık önemli hücresel yolakların işlevlerinin bozulmasına ve birçok hastalığa neden olmaktadır (310). 4

18 Dinlenim durumunda kas ve diğer hücrelerin sitoplazmik serbest Ca +2 konsantrasyonu nm civarında olup bu konsantrasyon sarko(endo)plazmik retikulum (SR/ER) lümeni ya da ekstraselüler alandaki serbest Ca +2 konsantrasyonundan bin kat ya da on bin kat daha düşüktür (0,1-2,0 mm) (190). Hücre membranı ve endoplazmik retikulumda bulunan güçlü Ca +2 pompaları (187,249) ve mitokondrinin (80,264) katkısı ile hücresel sınırlar arasındaki bu yüksek [Ca +2 ] yokuşu sağlanmaktadır. Her bir hücre tipi farklı yere ve zamana bağlı (spasyo-temporal) özelliklere sahip Ca +2 -sinyal sistemleri oluşturmak üzere Ca +2 -sinyal kit bileşenlerinin bir setini sentezlemektedir. Kalsiyum ya hücre içi depolardan ya da ekstraselüler alandan kaynaklanır. Ekstraselüler kaynaklı olması durumunda, hücre içi ulaklar, ekstraselüler agonistler, ağrılı uyarı, gerilim, membran depolarizasyonu ve de hücre içi depoların boşalması gibi uyarılara yanıt olarak hücre dışından hücre içerisine Ca +2 girişini kontrol eden çeşitli membran kanalları rol oynamaktadır. Endoplazmik retikulum ya da kastaki karşılığı olan SR gibi hücre içi depolardan Ca +2 salıverilişi kalsiyum tarafından ya da hücre içi depolardaki salıverici kanalları modüle eden ya da uyaran geniş bir ikinci ulak grubu (örneğin, inositol-1,4,5-trifosfat, IP 3 ), siklik ADP riboz (cadpr), nikotinik asit adenin dinükleotid fosfat (NAADP), sifingozin- 1-fosfat (S1P) tarafından kontrol edilmektedir (24). 5

19 Kalsiyum tarafından düzenlenen hücresel süreçler Enerji kaynaklarının oluşumu Membrana bağlı işlevler Hormonal düzenleme Glikojenoliz (fosforilaz β kinaz), Lipaz ve fosfolipazlar, α-gliserofosfat dehidrogenaz, Piruvat dehidrogenaz fosfat fosfataz, NAD-bağımlı izositrik dehidrogenaz α-ketoglutarat dehidrogenaz, NADH-dehidrogenaz (bitki mitokondrisi), β-hidroksibutirat dehidrogenaz Ekzitasyon-kontraksiyon keneti, Ekzitasyon-sekresyon keneti (örneğin, nörotransmiterler) Bazı hücre membranı kanalları, Bazı aksiyon potansiyelleri, Hücre-hücre bağlantıları (tight junctions) camp ve cgmp oluşumu/yıkılımı, Depo veziküllerinden bazı hormonların salıverilmesi Diğer işlevler Işık emisyonu, hücre döngüsü, fertilizasyon, bazı proteolitik enzimler, Ekzitasyon-transkripsiyon keneti Bazı protein kinazlar, protein fosfataz (calcineurin), Ulakların üretimi (örn. nitrik oksid), görme, bellek oluşumu ve depolanması, apoptoz 6

20 1.2. Ca +2 -sinyal dinamikleri ve homeostazı Kalsiyum homeostazında rol oynayan hücre içi sistemler SR Ca +2 Kanalları a) IP 3 reseptör Ca +2 kanalı G-proteinine kenetli reseptörlerin agonist ile etkileşmesi sonucunda aktive olan fosfolipaz C (PLC) fosfatidil-inositol-bifosfatı (PIP 2 ) hidrolize ederek IP 3 oluşumuna neden olmaktadır. ACh, noradrenalin (α 1 reseptörleri), vazopresin, trombin, ATP, PDGF, EGF gibi birinci ulaklar PLC yi aktive ederler. Bu agonistlerin çoğu G- proteinine kenetli reseptörler aracılığı ile etki gösterirken, bazı agonistler tirozin kinaz aktivitesine sahip reseptörlere bağlanarak etki gösterirler (6). IP 3 hücre içine difüze olur ve ER/SR da bulunan IP 3 reseptörü (IP 3 R) olarak bilinen Ca +2 salıveren kanallar aracılığı ile Ca +2 salıverilişine neden olmaktadır. IP 3 ün bağlanması IP 3 reseptörünün konformasyonunda değişiklik meydana getirerek kanalı açmaktadır. Kanalın açılması ile ER/SR daki yüksek konsantrasyonda depolanan Ca +2 sitoplazmaya geçer. IP 3 R ler açılmak için IP 3 e ihtiyaç duymasına rağmen aktivasyonları sitozolik taraftaki Ca +2 konsantrasyonu ile düzenlenmektedir. IP 3 R lerin açılışı Ca +2 konsantrasyonundaki ufak artışlarla (0,5-1 µm) artarken, daha yüksek Ca +2 konsantrasyonlarında (>1 µm) inhibe olmaktadır. Bu düzenlemeye kalsiyumun reseptörü doğrudan etkilemesinin yanı sıra kalmodulin de dolaylı olarak aktivatör ya da inhibitör olarak aracılık etmektedir (286,311). IP 3 R aktivitesinin sitozolik Ca +2 konsantrasyonuna bağlı olması birçok hücrede görülen Ca +2 sinyalinde rol alan

21 faktörlerin oluşması için önemlidir. Sitozolik etkilerine ek olarak Ca +2 lümenden gösterdiği işlevi ile IP 3 R lerinde duyarlık artışına da neden olabilmektedir. Bu duyarlıkta ER nin lüminal şaperonları kalretikulin ve kalneksinin (IP 3 reseptörleri ile etkileşen Ca +2 -bağlayan proteinler) rol oynadığı önerilmektedir (24). b) Ryanodin reseptörü Ca +2 kanalı Ryanodin reseptörlerinin (RyR) tetramerik yapıları ve işlevleri IP 3 R lere benzemektedir. RyR lerin IP 3 R ler ile paylaştıkları bir diğer özellik iki reseptörün de sitozolik Ca +2 konsantrasyonlarına duyarlı olmasıdır. Fakat RyR ler genellikle daha yüksek konsantrasyonlarla aktive ve inhibe olurlar (1-10 µm de aktivasyon; >10 µm de inhibisyon). Hemen hemen bütün memeli dokularında ifade edilen IP 3 R lerin aksine, RyR ler genel olarak kas ve nöron gibi uyarılabilen hücre tiplerinde bulunmaktadır (19). Ryanodin reseptörleri bitkisel bir alkoloid olan ryanodine karşı yüksek bağlanma afinitesi gösterirler. Düşük konsantrasyonda (1-10 µm) ryanodinin bağlanması reseptörü aktive ederken, yüksek konsantrasyonları (~100 µm) kanalın açılmasını irreversibl olarak inhibe etmektedir (280). Ryanodin reseptörleri kafeinin milimolar konsantrasyonları ile de aktive olmaktadır. Kafein varlığında RyR lerin kalsiyuma olan duyarlığı artmaktadır. IP 3 R ler ve RyR ler birçok farklı sinyal yolağının kesişme noktasıdır (25). c) Nikotinik Asid Adenin Dinükleotid Fosfat ADP-riboz siklazın (ADP-ribose cyclase, cadpr) hem sitozolik hem de membrana bağlı formu Nikotinik Asid Adenin Dinükleotid Fosfat (NAADP + ) oluşumu için NADP + nin nikotinamid grubunun nikotinik asitle değişimini katalize eder. NAADP son zamanlara kadar hücre içi ulak olarak kabul edilmesine rağmen 8

22 cadpr etkisinin araştırıldığı çalışmada Ca +2 salıverme potansiyelinin olduğu gözlenmiştir (102). Piridin nükleotidlerinin türevi olan NAADP Ca +2 salıveren ulak ailesine yeni katılmıştır NAADP IP 3 R ve RyR lerden farklı bir mekanizma ile Ca +2 salıverilişine neden olmaktadır (102). İlginç bir şekilde, SERCA blokörü thapsigargin (TG) ile ER Ca +2 deposunun boşaltılması IP 3 ve cadpr nin etkisini yok ederken, NAADP yi etkilememektedir (102) Mitokondri a) Mitokondride bulunan Ca +2 giriş yolakları İzole mitokondri inorganik fosfat varlığında mitokondri iç membranında lokalize ve kalsiyuma afinitesi düşük olan (yaklaşık Km 10 µm) Ca +2 tek yönlü taşıyıcısı (Ca +2 üniportörü) aracılığı ile yüksek miktarda kalsiyumu tamponlama kapasitesine sahiptir (80). Mitokondriyal Ca +2 transportunun temel fizyolojik rolü mitokondriyal enerji metabolizmasına bağlı anahtar enzimlerin aktiviteleri ile ilgili olarak mitokondriyal matriksteki Ca +2 konsantrasyonunu ([Ca +2 ] M ) kontrol etmektir (166). b) Mitokondride bulunan Ca +2 çıkış yolakları Mitokondriyal membran potansiyelinin etkisi altındaki [Ca +2 ] M Na + -bağımlı ve Na + - bağımsız Ca +2 çıkış yolakları (264) ile mitokondriyal matriksten sitoplazmaya kalsiyumun çıkışını kolaylaştıran non-selektif yüksek permeabiliteye sahip geçiş porları (permeability transition pore, PTP) aracılığı ile dengelenmektedir (72). Na + - bağımlı Ca +2 çıkışı sarkolemmal Na + /Ca +2 değiş-tokuşçusu (NCX) ten farklı olan mitokondriyal NCX ile katalize olmaktadır. Mitokondriyal NCX için değiş-tokuş oranı 3 Na + :1 Ca +2 şeklindedir. PTP nin açılması membran potansiyeli, Ca +2 ve ph 9

23 ile düzenlenir ve siklosporin A ile inhibe olur (72,264). PTP kalbin post-iskemik reperfüzyon hasarı ile ilişkili hücre ölümünde (72) ve belki de apoptozun diğer şekillerinde rol oynamaktadır (80,93) Ca +2 -bağlayan proteinler Ca +2 homeostazında mitokondri (313), çekirdek (29), SR/ER lümeni (190) ve sitoplazmada (129) bulunan, Ca +2 afiniteleri geniş bir aralıkta olan Ca +2 bağlayan proteinlerin de katkısı bulunmaktadır. Hücre uyarıldığı zaman Ca +2 hücre içerisine geçer ve yaklaşık 200 gen tarafından kodlanan farklı Ca +2 -bağlayan proteinler ile etkileşir (24). Hücre uyarıldığı sürece bu proteinler Ca +2 ile yüklenirken dinlenim halinde kalsiyumdan ayrılırlar. Temel işlevleri Ca +2 sinyallerinin yer ve zamana bağlı olarak ince ayarlarının yapılmasıdır. Bunların bazıları fosforilaz kinaz ve mitokondriyal dehidrojenazlar gibi hücrenin fizyolojik ihtiyacına göre enerji üretimini ayarlayan Ca +2 -duyarlı enzimlerdir. Diğer bir grubu plazma membranı Ca +2 ATPaz (PMCA) (109) ve aktomiyozin ATPaz (90) gibi enzimlerin aktivitelerini Ca +2 -bağımlı olarak düzenleyen kalmodülin (CaM) ve troponin gibi proteinler oluşturmaktadır. SR lümeninde bulunan Ca +2 bağlayan proteinler lümen Ca +2 konsantrasyonunun doğrudan düzenlenmesinde (200) işlev görürken çekirdekte bulunan proteinler gen ekspresyonunun düzenlenmesinde görev almaktadır (272). Fosfolamban (PLB) kalpteki SERCA nın önemli bir inhibitörü (37), kalsekestrin terminal sisternadaki ana Ca +2 tamponu (202), kalretikulin ve kalneksin protein katlanmasında şaperon protein (54); (60) olarak görev yapmaktadır. 10

24 Annexin fold, C-2 domain ve EF-hand motifi gibi yapısal modüllere sahip proteinler spesifik olarak Ca +2 ile kompleks oluşturabilmektedirler. EF-hand proteinleri en önemli ve bugüne kadar en iyi anlaşılan Ca +2 -bağlayan proteinlerdir. Günümüzde yüzlerce proteinde bulunduğu bildirilen EF-hand motifi ilk olarak Kretsinger (163) tarafından parvalbumin molekülünde tanımlanmıştır. EF-hand motifini taşıyan proteinler ve yukarıda bahsedilen diğer proteinler hücredeki kalsiyumun tamponlanması için önemlidir. Çünkü bu proteinler hücrenin sitoplazmik fazında Ca +2 konsantrasyonunun mikromolar düzeyin altına düşürülmesine yardımcı olmaktadırlar. Bu proteinlerin tamponlama fonksiyonlarından belki de daha önemlisi Ca +2 sinyalinin iletimi ile ilgili olanıdır. Kalsiyuma bağlanarak kalsiyumun taşıdığı bilginin deşifre edilmesini ve bu bilginin hücresel hedeflere (enzim) aktarılmasını sağlamaktadırlar. Bilginin deşifre sürecinin moleküler mekanizması sadece EFhand proteinleri ve CaM için açıklanabilmiştir. Kalsiyumun uzun bir protein olan kalmoduline bağlanmasıyla meydana gelen ilk konformasyonel değişiklik sonucunda proteinin boyutlarında değişiklik meydana gelmezken, Ca +2 bağlayan 2 hidrofobik paketi (özellikle metiyonin kalıntıları) açık hale gelir. Kalmodulin, hedef proteinlerin bağlanma bölgeleri ile etkileşimi mümkün kılan metiyoninden zengin bir proteindir. İkinci olarak daha dramatik bir yapısal değişiklik meydana gelmektedir. Ca +2 - algılayıcı proteinin (CaM) uzun yapısı hedef enzimin bağlanma bölgesinin etrafında firkete yapı oluşturmak üzere katlanır. Bu noktada Ca +2 sinyalinin iletimi tamamlanmış olur (44). EF-hand Ca +2 -algılayıcı proteinleri ve anneksin, gelsolin gibi EF-hand motifi içermeyen Ca +2 bağlayan proteinler hücre içerisinde sınırlı miktarlarda bulunmaktadır. Bu proteinlerin miktarları çok önemlidir, örneğin kalmodulinin 11

25 miktarı çok kısa sürede mikromolar düzeylere ulaşabilmektedir (159). Membranda bulunan ya da membranın iki tarafı arasında Ca +2 transportundan sorumlu Ca +2 bağlayan proteinler için miktarla ilgili sınırlamalar söz konusu değildir. Ca +2 taşıyan proteinler Ca +2 mesajının iletim sürecinde rol oynamamaktadırlar. Evrimsel süreçte bu proteinler, hücrenin sinyal iletimi için gerekli olan konsantrasyon sınırları içerisinde sitozol ve organellerde Ca +2 konsantrasyonun korunması için gelişim göstermişlerdir (45) Sarko(endo)plazmik retikulum Ca +2 pompası Hücre membranı üzerinden hücreye alınan ve hücreden uzaklaştırılan kalsiyum normal koşullarda hücrelerin normal fonksiyonel döngüleri süresince kullandıkları toplam kalsiyumun küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Hücreler tarafından kullanılan kalsiyumun büyük bir kısmı organel membranında bulunan taşıyıcılar ile kontrol edilmektedir. SR membranında bulunan SERCA lar PMCA lar ile aynı etki mekanizması ve membran topolojisine sahiptir (169,186). SERCA lar bir ATP molekülünün hidrolizi sonucunda iki kalsiyum iyonunun sitoplazmadan SR lümenine elektrojenik transportunu katalize eder. Ca +2 altında SR lümeninden salıverilen 2 Ca +2 transportu tersinirdir. Uygun koşullar için bir ATP molekülü meydana gelmektedir (299). İki Ca +2 iyonunun transferi 4 pozitif yükü temsil etmektedir. SR katyon ve anyon kanalları aracılığı ile iyon akışı ve H + iyonunun zıt-transportu Ca +2 transportu süresince membran potansiyelindeki büyük değişiklikleri önlemektedir (347). 12

26 SERCA ailesi farklı genler tarafından kodlanan 3 ana izoformdan (SERCA1-3) oluşmaktadır. SERCA izoformları ve splice varyantlarının işlevi farklıdır (188). Ekspresyonları yetişkinlerde ve gelişim süresince hormonlar, kontraktil aktivite ve inervasyon ile ayrımsal olarak kontrol altındadır ve dokuya spesifiktir (189). SERCA1a ve SERCA1b izoformları yetişkin ve yeni-doğan hızlı-kasılan iskelet kaslarında daha çok eksprese olurken, SERCA2a esas olarak yavaş-kasılan iskelet kası, kalp kası ve yeni-doğan iskelet kaslarında bulunmaktadır. SERCA2a ayrıca kasolmayan hücrelerde de eksprese olmaktadır. SERCA2b izoformu düz kas ve kas olmayan hücrelerde bulunmaktadır. SERCA3 gen ürünleri birçok kas ve kasolmayan hücrede geniş bir dağılım göstermektedir. Kalp, düz kas ve yavaş kasılan kaslarda bulunan SERCA, fosfolamban olarak bilinen hidrofobik bir protein ile düzenlenmektedir (303). PLB SERCA ile hem sitozolik nükleotid bağlanma bölgesinde (nükleotid bağlanma bölgesinde Lys400) (147) hem de membranı geçen bölgesinde etkileşerek pompayı inaktif konumda tutmaktadır. CaMKII ve PKA tarafından PLB nin fosforile edilmesi sonucunda pompanın inhibisyonu ortadan kalkmaktadır. SERCA tarafından SR içerisine alınan Ca +2 düşük afiniteli Ca +2 -bağlayan proteinlerle (kalsekestrin, kalretikülin gibi) kompleks halinde depolanmaktadır. Proteine-bağlı Ca +2, sitozolik Ca +2 sinyal fonksiyonu için gerektiğinde salıverilmek üzere hazır halde bulunan lümendeki serbest Ca +2 ile dengede bulunmaktadır. Spesifik olmayan sürekli fakat düşük düzeyde Ca +2 sızıntısı meydana gelirken, SR lümeninden aktif Ca +2 salıverilmesi bugüne kadar belirlenen 2 tip spesifik kanal (IP 3 R ve RyR) aracılığı ile gerçekleşmektedir (190). 13

27 SERCA ekspresyon düzeylerinin hastalıklarla ilişkisi Brody Hastalığı nda SERCA içeriğinin azalması: Brody Hastalığı ekzersiz süresince ağrısız kasılmalarla karakterize nadir görülen kalıtımsal bir hastalıktır (38). Tip 2 iskelet kası liflerinin SERCA1 izoformunu kodlayan ATP2A1 genindeki mutasyonlar sonucu oluşan SR Ca +2 taşıma aktivitesindeki azalma kasın yavaş gevşemesine neden olmaktadır (185,233). Bazı mutasyonlar SERCA proteinin ve Ca +2 ATPaz aktivitesinin tamamen kaybolmasına neden olmaktadır. Bazı durumlarda ise protein miktarında değişiklik olmaksızın ATPaz aktivitesinde yaklaşık %50 azalma görülebilmektedir (17,312). ATP2A1 genindeki bir bozuklukla ilişkili olmayan, SERCA1 aktivitesini modüle eden henüz tanımlanmamış proteinlerin rol oynadığı durumlar da bulunmaktadır (359). SR Ca +2 depolarının tekrar dolması kompansasyon için anahtar element olabilir. Çünkü Ca +2 depolarına bağlı olan kontraksiyonun aktivasyonu Brody Hastalığı nda etkilenmemektedir. ATP2A2 geninin Null-mutasyonu: ATP2A2 geninin 5 ucu ve promoter bölgelerinin elimine edilmesi ile heterozigot transjenik fareler oluşturulmuştur (149). Homozigot mutantların yaşamaması SERCA2 nin yaşamsal olduğunu göstermektedir. Heterozigot hayvanlara ait kalp örneklerinde SERCA2 mrna düzeyleri %45, SERCA2 protein miktarı ve aktivitesi %35 azalmıştır. Bu bulgular ATP2A2 geninin her iki kopyasının da normal aktivite için gerekli olduğunu göstermektedir. ATP2A2 geninin bir kopyasının kaybı ve bununla ilişkili olarak aktivitedeki azalma belirgin fizyolojik sonuçlara neden olmuştur. Ortalama arter basıncı ve sol ventrikül sistolik basıncı kontrol hayvanlarına göre heterozigot farelerde daha düşük saptanmıştır (245). İlişkileri henüz tam olarak kanıtlanmamış 14

28 olmasına rağmen SERCA2 geninin ruh hastalıkları, epilepsi ve mental gerilik gibi hastalıklarla ilişkisi olabileceği önerilmektedir (146). Kalp kası hücrelerinde sirna (small interfering RNA) aracılığı ile SERCA2 mrna ve protein ekspresyonunun belirgin derecede azaltılması sonucunda geçici reseptör potansiyeli (transient receptor potential, TRP) kanal proteinlerinden TRPC4 ve TRPC5 ile NCX proteinlerinin ekspresyonlarında artış gözlenmiştir (278). Bu çalışmada SERCA2 nin susturulması sonucunda TRPC4, TRPC5 ve NCX ekspresyon ve aktivitesindeki artış, azalmış SR Ca +2 alımı ve döngüsü için kompansatuvar bir mekanizma olarak önerilmiştir (278). Kalp yetmezliği ve kardiyak hipertrofi gibi hastalıkların Ca +2 ATPaz ın azalmış ekspresyon düzeyleri ile ilişkili olabileceği önerilmiştir. Ca +2 homeostazındaki değişim ve bozulmuş miyokard fonksiyonunun kalbin Ca +2 ATPaz içeriğinin artırılması ile düzeltilebileceği bildirilmiştir (189). ATP2A3 geninin null-mutasyonu: ATP2A3 geninin kodladığı SERCA3 endotel hücrelerinde, nefes borusu, barsak ve salgı bezlerinin epitel hücrelerinde, trombosit, mast hücresi ve lenfositlerde eksprese olmaktadır. ATP2A3 geni homozigot olarak null-mutant fareler yaşar, ürer ve fenotiplerinde herhangi bir hastalık gözlenmez (177). Aynı hayvanlara ait PE ile kastırılmış aortlarda asetilkolinin neden olduğu gevşeme yanıtları azalmıştır. Asetilkolinin neden olduğu gevşeme endotel hücrelerinde sentezlenen nitrik okside bağlıdır. Endotelyumda sentezlenen NO düz kasa difüze olur ve cgmp-bağımlı bir mekanizma ile gevşemeye neden olur. ATP2A3 -/- hayvanlara ait NO donörü, sodyum nitroprusidin neden olduğu düz kasa bağlı gevşeme yanıtlarında herhangi bir değişiklik 15

29 gözlenmemiştir (177). Bu hayvanlarda SERCA3 yokluğundan dolayı aorta endotel hücrelerinde bulunan asetilkoline duyarlı Ca +2 depolarının tükenmesinin (NO sentezi için gerekli Ca +2 sinyal iletimini bozduğu için) ACh-aracılı gevşeme yanıtlarındaki azalmanın nedeni olabileceği önerilmiştir (190) Ca +2 homeostazında rol oynayan hücre membranındaki sistemler Hücre membranı Ca +2 -ATPaz Ekstraselüler alandan Ca +2 girişini kompanse etmek üzere hücre membranı Ca +2 -ATPaz (Plasma membrane Ca +2 ATPase, PMCA) aktiviteleri ayarlanmaktadır, fakat bu düzenlemenin mekanizması hakkında çok az şey bilinmektedir. Sağlam eritrositlerde PMCA hücre dışından görece yavaş Ca +2 girişini dengelemek için yeterlidir. Aktivite süresince fazla Ca +2 girişinin meydana geldiği uyarılabilir hücrelerde (kalp, iskelet kası, sinir sistemi) hücre içi Ca +2 konsantrasyonunu normal seviyelere getirebilmek için NCX sistemine ihtiyaç duyulmaktadır (109) Hücre membranındaki Na + /Ca +2 değiş-tokuşçusu NCX ler membranın iki tarafı arasında bir Ca +2 iyonuna karşılık üç sodyum iyonunun elektrojenik değişimini katalize eder (249). Na + -K + -ATPaz (NKA) ile sürdürülen Na + gradiyenti tarafından değiş-tokuş yönlendirilir (301). NCX in net çalışma yönü membran potansiyeli, sitoplazma ve ortamdaki Na +, Ca +2 konsantrasyonları ile belirlenmektedir. NCX in esas görevi [Ca +2 ] i yükseldiğinde kalsiyumu hücreden uzaklaştırmaktır. NCX in transport yönü sadece membranın her iki tarafındaki Na + ve Ca +2 konsantrasyon gradiyentine değil aynı zamanda membran 16

30 potansiyeline de bağlıdır. Belirli koşullar altında NCX tersine çalışarak net Ca +2 girişini katalize edebilmektedir. Bunun tipik örneği kalpte aksiyon potansiyelinin plato fazı süresince meydana gelmektedir. Bu fazda NCX ters yönde çalışmakta ve kalp hücresine Ca +2 girişine neden olmaktadır. NCX in ters yöndeki etkisi aubainin ve NKA inhibitörü diğer ilaçların pozitif inotropik etkilerini açıklamaktadır. Aubain ile NKA inhibisyonu hücre içinde Na + konsantrasyonunu artırarak NCX in ters yönde çalışmasına neden olur (44) Sarkolemmal Ca +2 Kanalları Hücre membranındaki Ca +2 kanalları, kalsiyumun hücre membranından elektrokimyasal yokuş yönünde pasif olarak geçişine izin veren membran proteinleridir. Ca +2 kanalının bir kere açılması yüzlerce ya da binlerce Ca +2 iyonunun sitoplazma içerisine girmesine neden olarak hücre içi Ca +2 konsantrasyonunda belirgin bir artış meydana getirmektedir. Bu Ca +2 giriş kanalları aktivasyon mekanizmalarının temeline bağlı olarak 3 ana gruba ayrılabilirler: 1. voltaj-kontrollü Ca +2 kanalları (VOCC, voltage-operated Ca +2 channels) 2. ligand/reseptör-kontrollü Ca +2 kanalları (L/ROCC, ligand/receptor-operated Ca +2 channels) 3. depo-kontrollü Ca +2 kanalları (SOCC, store-operated Ca +2 channels) (30,44,45,195). 17

31 Voltaja duyarlı Ca +2 Kanalları En iyi bilinen Ca +2 kanalları voltaja duyarlı Ca +2 kanallarıdır. VOCC membran potansiyelinde meydana gelen değişikliklere göre açılır ve kapanır (218). Kanalın açılması hücre membranının depolarizasyonundan birkaç milisaniye sonra meydana gelirken, kanalın kapanması membranın repolarizasyonundan sonra 1 milisaniyeden daha kısa sürede gerçekleşmektedir (79,86,167). Bu kanalların kalsiyuma selektivitesi oldukça yüksektir, bu nedenle fizyolojik koşullarda tek değerlikli katyonların daha fazla miktarda olduğu durumda bile Ca +2 tercih edilmektedir (126). VOCC sadece nöron, iskelet kası, kalp gibi uyarılabilir hücrelerde değil aynı zamanda uyarılamayan hücrelerde de bulunmaktadır. VOCC ilk olarak biyofiziksel özelliklerine göre düşük- ve yüksek-voltaj ile aktive olan kanallar olarak sınıflandırılmışlardır (46). Daha sonra fizyolojik özelliklerine ilaveten farmakolojik özelliklerine göre 6 sınıfa (L, N, P, T, R ve Q) ayrılmışlardır (126). Memeli voltajaduyarlı Ca +2 kanalları 5 protein altbiriminden (α 1, α 2, β, γ, δ) meydana gelmektedir (52,97,134,305) (Şekil 1.1). α 1 altbirimi kanal işlevi görürken diğer altbirimler kanal kapısının düzenlenmesinde rol oynamaktadırlar. α 1 altbirimi 6 defa membranı geçen (6TM) domainlerin 4 kez tekrarlanması ile meydana gelmiştir. Her bir modüldeki membranı geçen dördüncü segment (S4) pozitif yüklü amino asidler içermektedir ve bu bölgenin voltaja duyarlı bölge olarak görev yaptığı düşünülmektedir (308). 18

32 Şekil 1.1: L-tipi Ca +2 kanalı alt birimlerinin membran topolojisi Kanal 5 altbirimden oluşmuştur: α1, α2, δ, β ve γ. α1 altbirimi kanal poru, voltaj duyarlığı ve kapı özelliği taşıyan büyük bir membranı geçen proteindir. α2- δ altbirimi birbirine disülfid bağları (S) ile bağlanmış bir heterodimerdir. β altbirimi tamamen hücre içinde bulunur. γ altbirimi membranın içerisinde bulunur. (36) Ligand/ Reseptör-kontrollü Ca +2 Kanalları (ROCC) Çok sayıda Ca +2 kanalı glutamat, ATP, asetilkolin (ACh), serotonin gibi ligandların hücre membranındaki kendi reseptörleri ile etkileşmesi ile aktive olmaktadır. Membran depolarizasyonundan bağımsız mekanizmalar ile reseptör aktivasyonunun neden olduğu hücre içerisine Ca +2 girişi ROCC aracılığı ile gerçekleşmektedir (28). Ligandın bağlanması kanal proteininin yapısında konformasyonel bir değişikliğe neden olarak kanal kapısının açılmasına ve hücre içerisine iyonun girmesine neden olmaktadır. Düz kasta kaydedilen ROC akımların hepsi farklı Ca +2 selektivitelerine sahip non-selektif katyon akımı özellikleri taşımaktadır. Bu nedenle ROC ler daha çok reseptör-kontrollü kalsiyum kanalları olarak tanımlanmaktadır (195). En iyi bilinen ROCC nikotinik ACh reseptörleri, N- metil-d-aspartat (NMDA) reseptörleri ve ATP reseptörleridir (P2X 7 ). Birçok G- 19

33 proteinine kenetli reseptör fosfolipaz C-β ya kenetlenmektedir. Böylece agonistler bu reseptörlerle etkileşerek IP 3 oluşumuna ve daha sonra Ca +2 salıverilmesine neden olmaktadır. Reseptör aktivasyonu bu nedenle SOC aktivitesine neden olmaktadır. Fakat farklı ROC kanallarının olduğuna dair birçok neden bulunmaktadır. ROC kanalları agonistin G-proteinine kenetli reseptörlere bağlanmasına ihtiyaç duyar fakat Ca +2 salıverilişine bağımlı değillerdir (16) Depo-kontrollü Ca +2 Kanalları Tez çalışma konumuzun temelini oluşturan damar düz kasındaki Ca +2 depolarının doluluk oranı ile hücre içine giren Ca +2 miktarı arasındaki söz konusu ilişki ilk kez 1980 lerin başlarında gösterilmiştir (47). SOC kavramı ise ilk olarak 1986 yılında Putney tarafından ileri sürülmüştür (253). SOC fikri hücre içi depolardan Ca +2 salıverilişi, Ca +2 girişi ve deponun yeniden dolması arasındaki ilişkinin pankreatik acinar hücrelerinde araştırıldığı birçok deneyden kaynaklanmaktadır. Bu ve bu konu ile ilgili diğer çalışmalarda gözlenen sonuçlar doğrultusunda depolardaki Ca +2 miktarının, uyarılamayan hücrelerde, kapasitatif kalsiyum girişi (capacitative calcium entry, CCE) olarak adlandırılan hücre içine Ca +2 girişinin büyüklüğünü kontrol ettiği önerilmiştir (240). Depoların dolu olduğu koşullarda, Ca +2 girişi meydana gelmezken, depolar boşaldığında Ca +2 girişi olmaktadır. Depoların boşalması sonucunda meydana gelen Ca +2 girişi agonist ile uzun süreli etkileşim durumunda hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda yeterli artışın devam ettirilmesine ve boşalan depoların agonist uzaklaştıktan sonra yeniden doldurulmasını sağlamaktadır (22,254). 20

34 SOC girişinin hücre fizyolojisinde birçok önemli işlevi vardır. Öncelikle bu giriş agonist aktivasyonu sonrasında boşalan hücre içi depoların yeniden dolmasını sağlamaktadır. İkinci olarak SOC girişi hücresel fonksiyonlar için gerekli olan hücre içi serbest Ca +2 konsantrasyonundaki artışın korunmasını sağlar. Ayrıca SOC girişi Ca +2 osilasyonlarının genliğinin korunmasında, sitokinlerin salıverilmesinde (340), gen transkripsiyonunda (172) ve enzimatik aktivitenin sağlanmasında da (89) rol oynamaktadır. Endoplazmik retikulumun (ER) agoniste duyarlı Ca +2 deposu olmasının yanında protein katlanma süreci de ER lümen içerisinde gerçekleşmektedir. ER de birçok sayıda Ca +2 -bağımlı şaperon protein sentez ve sonraki aşamaları gerçekleştirildikten sonra hedef bölgelere gönderilmektedir (240). ER aynı zamanda veziküler trafik (104), stres sinyallerinin salıverilmesi (155), kolesterol metabolizmasının düzenlenmesi (39) ve apoptozda (93) rol oynamaktadır. Bu süreçlerin çoğu lümen içi Ca +2 gerektirmektedir. Protein katlanması, ER stres yanıtları ve apoptoz ER Ca +2 içeriğinin boşalması ile indüklenebilmektedir. ER nin Ca +2 kaynağı olarak rol oynaması nedeni ile stimülasyon sonrasında ER Ca +2 içeriğinin azalacağı çok açıktır. Fakat ER nin işlevsel bütünlüğünü koruma amacı ile Ca +2 içeriği çok fazla düşmez ya da düşük bir düzeyde korunmaktadır. Bu nedenle ER nin Ca +2 ile tekrar dolması tüm ökaryotik hücreler için önemli bir süreçtir. ER Ca +2 içeriğindeki azalma SOCC leri aktive ettiği için, protein sentezi ve katlanması için gerekli olan ER Ca +2 düzeylerinin belirli aralıklarda sürdürülmesinin bu Ca +2 giriş yolağının esas işlevi olduğuna inanılmaktaydı. Fakat artık günümüzde SOCC lerin ökaryotik hücre fizyolojisinde başka birçok önemli role sahip oldukları kabul edilmektedir. Ayrıca, bu kanalların fonksiyonlarında meydana gelen 21

35 bozukluklar sayısı giderek artan birçok hastalıkla ilişkilendirilmektedir (240). SOC girişindeki değişikliklerin akut pankreatit, tip 2 diyabet, primer immün yetmezlik, Alzheimer hastalığı, hipertansiyon ve bazı kanser tiplerinin patofizyolojilerinden sorumlu oldukları gösterilmiştir (240). SOCC depoları boşaltan herhangi bir süreç ile aktive olabilmektedir (135,239). Fizyolojik olarak deponun boşalması IP 3 düzeylerindeki artışla ya da depolardan Ca +2 salıverilmesine neden olan diğer Ca +2 -salıverici sinyaller aracılığı ile gerçekleşmektedir. Bunların yanında SERCA inhibitörleri olan tapsigargin (TG) (314), siklopiazonik asit (CPA) (277) ve di-ter-bütilhidrokinon (BHQ) (214)) uygulanması kalsiyumun aktif olarak SR içine pompalanmasını inhibe ederek SR nin pasif olarak boşalması sonucunda SOC girişini reseptörden bağımsız olarak aktive ederler. SOCC lerin deponun boşalması ile nasıl aktive olduğu bilinmemektedir. Deponun boşalması boşalma mekanizmasından bağımsız olarak depo-kontrollü akımı uyarmaktadır. PLC aktivasyonunu, IP 3 aktivitesini ve IP 3 reseptörlerindeki Ca +2 kanallarının açılmasını bypass ettiği için, TG veya CPA gibi SERCA inhibitörleri SOC girişi ile ilgili çalışmalar için en uygun ajanlardır (310). Bu ajanlar düz kasta olduğu kadar diğer dokularda da SOCC lerin işlevini aydınlatmanın yanı sıra depo- ve reseptör-kontrollü mekanizmalar arasında ayrım yapılabilmesinde de kullanılmaktadırlar (195). Birçok hücrede hücre membranındaki reseptörlerin stimülasyonu ile depodan salıverilen ve sonrasında hücre dışından içeriye giren kalsiyumun neden olduğu 22

36 bifazik Ca +2 sinyali meydana gelmektedir. Birçok çalışma hücre membranındaki Ca +2 kanallarının açılmasını IP 3 ya da sitoplazmik serbest Ca +2 konsantrasyonundaki değişikliklerden çok deponun boşalmasının bir sonucu olarak gerçekleştiğini göstermektedir (22). Farklı hücre membranı G-proteinine-kenetli (G q /G 11 ) reseptörlerin nörotransmiterler ile stimülasyonu sonucunda gerçekleşen PLC ve PtdIns(4,5)P 2 hidrolizinin aktivasyonu diaçilgliserol (DAG) ve IP 3 oluşumu ve daha sonra hücre membranından Ca +2 girişi ile sonuçlanmaktadır (24). Daha önceden ROC girişine neden olduğu bildirilen nörotransmiter yanıtları aynı zamanda SOC girişini de içerebilmektedir. Diğer bir deyişle, ROCC nin aracılık ettiği gösterilen bazı yanıtlara, SOC girişi katkıda bulunabilir veya söz konusu katyon girişi aktivasyon mekanizmaları birbirinden farklı iki ayrı tipte kanallar ile de gerçekleşebilir (195). SOC girişi birçok hücrede bulunmasına rağmen bugüne kadar daha çok uyarılamayan hücrelerde çalışılmıştır. SOC üzerine yapılan çalışmalar SERCA inhibitörleri ile olduğu kadar fizyolojik agonistler ile (hormonlar, nörotransmiterler, nükleotidler) de gerçekleştirilmiştir. Giriş fazını ayırmak için özel bir deney protokolü kullanılır. Hücreler Ca +2 bulunmayan ortamda uyarıldıklarında, depolardan salıverilen kalsiyumun neden olduğu geçici [Ca +2 ] i artışı sonucunda depolar boşalır. Ca +2 düzeyleri bazal düzeylere geri döndüğünde, ortama Ca +2 eklenmesi hücre membranındaki SOCC lerden güçlü bir Ca +2 girişine neden olmaktadır (310). SOC girişi ile ilgili çözülmemiş iki temel problem bulunmaktadır: i) SOCC lerin moleküler yapıları ve ii) deponun boşalması ile SOCC lerin açılışı arasındaki ilişkinin mekanizmasıdır. Depo boşalması ile SOCC aktivasyonuna 23

37 yönelik belki de en basit mekanizma kalsiyumun-neden olduğu Ca +2 girişi (Ca +2 - induced Ca +2 entry, CICE) olarak düşünülebilir. Bu fikre göre deponun boşalması sonrası sitozole salıverilen Ca +2 aracılığı ile kanallar aktive olmaktadır. Ancak 3 temel nokta bu mekanizmanın geçerli olmadığını kanıtlamaktadır. İlk olarak, EGTA ya da BAPTA gibi Ca +2 şelatörlerinin yüksek konsantrasyonları ile hücre içi Ca +2 konsantrasyonu çok düşük düzeylere sabitlendiğinde, I CRAC (Ca +2 -salıverilişinin aktive ettiği Ca +2 akımı; Ca +2 release-activated Ca +2 current) hala IP 3 ve TG ile aktive edilebilmektedir (95,135). Gerçekte, EGTA ya da BAPTA nın yüksek konsantrasyonları tek başına depoyu boşaltarak SOC kanallarını açabilmektedir (239). İkinci olarak, Ca +2 içeren pipet solusyonları ile hücrelerin Ca +2 konsantrasyonlarının mikromolar düzeylere getirilmesi I CRAC ı aktive etmemektedir (95). Son olarak membranı geçebilen metal şelatör olan TPEN depolara girebilir ve herhangi bir Ca +2 salıverilişine neden olmaksızın deponun Ca +2 içeriğini azaltmaktadır. Depodaki bu azalma tek başına I CRAC aktivasyonu için yeterlidir. Genel olarak bu sonuçlar sitoplazmadaki kalsiyum konsantrasyonundaki artışın depo boşalması ile SOC girişi arasındaki sinyal olamayacağını göstermiştir (239). Geçen birkaç yıl boyunca, depo-kontrollü giriş aktivasyonu için birçok model önerilmiştir. Bunlar aşağıda özetlenmiştir: Difüze olabilen mesajcı: Putney ve arkadaşları depo boşalması sonrasında bir mesajcının depolardan hücre içine salıverildiğini ve bu mesajcının daha sonra hücre membranına difüze olarak Ca +2 kanallarının açılmasına neden olduğunu önermişlerdir (306). İlk kez uyarılmış Jurkat T hücrelerinde asit-ekstraksiyon fraksiyonunda düşük molekül ağırlıklı bir faktörün varlığı bildirilmiştir (258). Ca +2 24

38 giriş faktörü (Ca +2 influx factor; CIF) olarak adlandırılan bu madde ya TG ile ya da fosfoinosit yolağına kenetli reseptörlerin bir agonisti ile deponun boşalması sonrasında Jurkat T hücrelerinin SR sinden salıverilmektedir (258). CIF in Ca +2 - bağımsız PLA 2 aktivasyonu aracılığı ile etki gösterdiğine inanılmaktadır (285). CIF ile ilgili çözülmemiş iki problem bulunmaktadır: 1) CIF kurbağa oositlerine injekte edildiğinde, submaksimal konsantrasyonlarda bile nispeten stabil görünmektedir; 2) oositlerde CIF ile aktive olan kanallar lantana nispeten duyarsız iken, endojen SOC kanalları lantan ile tamamen inhibe olmaktadır (67). Difüze olabilen mesajcılar arasında CIF ten başka cgmp, tirozin kinazlar, küçük GTP-bağlayan proteinler, sitokrom P-450 nin bir ürünü, protein kinaz C ve Ca +2 kalmoduline bağlı bir basamak da sayılmaktadır (9,267). Veziküler füzyon (Sekresyon-benzeri): Ekzositoz modeli (veziküler füzyon) ilk defa Fasolato ve arkadaşları tarafından önerilmiştir (91). Bu modele göre, SOC kanalları dinlenim durumunda hücre membranında bulunmazken, depo boşaldığında vezikül füzyonu (ekzositotik mekanizma) ile SOC kanalları hücre membranının yapısına katılmaktadırlar (26,49). Bu fikri destekleyen önemli moleküler kanıtlar gösterilmiştir (344). Putney ve arkadaşlarının konformasyonel kenetlenmede önerdikleri gibi IP 3 reseptörleri ve veziküllerde bulunan kanallar fiziksel olarak etkileşir fakat difüze olabilen bir sinyal hipotezi gibi diğer mekanizmalar da eşit olarak bu ilişkiyi açıklayabilir. Bu öneri ile ilgili esas problem ekzositozun Ca +2 - bağımlı olduğunun düşünülmesidir. Fakat SOC girişinin aktivasyonu en fazla [Ca +2 ] i düşük düzeylere tamponlandığı zaman meydana gelmektedir. Hücre içi Ca +2 konsantrasyonu çok düşük düzeylere azaldığında ise bu azalma kanalları aktive 25

39 etmek için yeterlidir (33,162). Ayrıca, iki çalışmada aktivasyondan önce kanalların zaten hücre membranında bulundukları gösterilmiştir (33,365). Ca +2 regülasyonu: Diğer bir öneri, kanalların regülasyonunun kendi yakın çevrelerindeki Ca +2 konsantrasyonunun kontrolü aracılığı ile gerçekleştiğidir. Hücre membranındaki kanalların çevresindeki hücre içi Ca +2 (hücre membranının alt bölgeleri) konsantrasyonunun kanalları inhibe ettiği kabul edilmiş bir gerçektir (162,252). Bu nedenle, depoların boşalması hücre membranı ile ER arasındaki küçük, sınırlı bir alanda hücre içi Ca +2 konsantrasyonunda bir düşüş ile sonuçlanabilir ve bu da kanalları aktive edebilir. Bu görüşe göre SOC kanallarının açılması aktivasyon sinyali ile değil inaktive edici sinyal kalsiyumun uzaklaştırılması ile gerçekleşmektedir (240). Elektrofizyolojik çalışmalar SOC kanallarının [Ca +2 ] i ile inhibisyona olan yüksek duyarlığını açık bir şekilde göstermiştir (239). Hücrede sadece Ca +2 konsantrasyonundaki düşüşün I crac olarak bilinen CCE nin aktivasyonuna neden olduğunu gösterilmiştir (162). Bu öneri ile ilgili iki temel problem bulunmaktadır. İlk olarak, sitoplazmik Ca +2 tamponlanmasının karşısında depo boşalmasının I crac ı aktive etme kapasitesidir (239). Eğer subsarkolemmal Ca +2 deposu ile plazma membranı üzerindeki kanallar arasındaki mesafe kısıtlı ise bu sorunun üstesinden gelinebilir (256). İkinci problem, ER Ca +2 pompa inhibitörü TG nin I crac ı aktive etme yeteneğidir. Ca +2 -regülasyon mekanizması için önerilen modeller (10,253) kanallara yakın sınırlı bölgedeki hücre içi Ca +2 konsantrasyonunun ER den sızan ve ER ye pompa ile alınan Ca +2 arasındaki denge ile düzenlendiğini kabul etmektedir. TG uygulanması kanalların çevresindeki Ca +2 konsantrasyonunun azalmasını önler 26

40 ve aktivasyonun oluşması beklenmez. Önemli nokta dolu bir ER den bu sınırlandırılmış bölgeye Ca +2 girişi olabilir. Bu giriş doğası bilinmeyen kanallar aracılığı ile gerçekleşiyor olabilir, olasılıkla bu kanallar ER nin dışına sabit bir şekilde Ca +2 sızıntısına aracılık etmektedirler. Bu bölgeden kalsiyumun uzaklaştırılması ya mobil tamponlarla ya da hücre membranındaki TG ye duyarlı olmayan pompalar aracılığı ile gerçekleşmektedir. Konformasyonel (direkt) kenetlenme: Bu noktada, SOC girişi için en çok kabul gören mekanizma konformasyonel kenetlenmedir. ER ve hücre membranı arasında difüze olabilen bir mesajcıdan çok direkt bir protein-protein etkileşmesinin rol aldığı kenetlenme mekanizmasından bahsedilmiştir (142). İskelet kasında VOCC ler direkt protein-protein etkileşimi aracılığı ile hücre içi Ca +2 salıveren kanallar olan, RyR ile kenetlendiği bilinmektedir. İskelet kasında bilgi Ca +2 kanalından T-tübül membranında RyR ye doğru akarken (84), SOC girişi için bilginin akışı ters yöndedir. Konformasyonel kenetlenme ile hücre içi Ca +2 depo membranındaki IP 3 reseptörleri ve hücre membranındaki SOC kanalları arasında fiziksel bir etkileşim önerilmektedir. Konformasyonel kenetlenme modeli için iki olasılık gösterilmiştir. Klasik konformasyonel kenetlenme hipotezi IP 3 reseptörleri ve SOC kanalları arasında protein-protein etkileşimini sağlamak için Ca +2 deposunun hücre membranına yeterince yakın olması gerektiğini önermektedir (22). Bu hipotez dinlenim koşullarında IP 3 R ile ekzojen olarak eksprese ettirilen klasik geçici reseptor potansiyeli (canonical transient receptor potential; TRPC) kanalları ile etkileştiğinin 27

41 gösterilmesi ve IP 3 R dizilerinin SOC girişini aktive ettiğinin bulunması ile desteklenmiştir (69). Klasik konformasyonel kenetlenme mekanizmasının düzenlenmiş hali olan yeni konformasyonel kenetlenme modeli ile IP 3 R leri içeren Ca +2 depolarının bir kısmının başlangıçta hücre membranından uzakta olduğu ve daha sonra yeni protein kenetlenmesini kolaylaştırmak için hücre membranına doğru hareket ettiği önerilmiştir. Bu hipotez ile uyumlu olarak, Ca +2 depolarının boşalması Ca +2 depolarının SOC kanalları ve IP 3 R arasında tersinir etkileşimi sağlaması amacıyla hücre membranına doğru yaklaşmalarına neden olmaktadır (267). Doğal olarak eksprese edilen TRPC1 ve tip II IP 3 R nin (IP 3 RII) insan trombositlerinde dinlenim koşulunda birlikte immünopresipitasyona uğratılamazken Ca +2 deposunun boşalması sonrasında birlikte çöktürüldüğü gözlenmiştir (267). Kenetlenme süreci aktin hücre iskeleti ile düzenlenmektedir (266) (Şekil 1.2). 28

42 Şekil 1.2: SOC girişi için önerilen mekanizmalar Tüm modellerde agonist aktivasyonu sonucunda IP 3 oluşur ve Ca +2 deposu boşalır. Diğer yandan tapsigarjin, CPA gibi ajanların etkisi ile SR pasif olarak boşalmaktadır. (A) deponun boşalmasını takiben, CIF SR dan salıverilir ve hücre membranındaki SOCC leri aktive eder. (B) SR nin boşalması SOCC leri içeren veziküllerin hücre membranı ile birleşmesine neden olur. (C) SOCC ler hücre membranının alt bölgesindeki Ca +2 konsantrasyonundaki bölgesel artış nedeniyle inaktif halde kalırlar. Deponun boşalmasıyla bu bölgelerden kalsiyumun uzaklaşması sonucunda kanallar aktif hale geçerler. (D) depoların boşalması IP 3 R de yapısal bir değişikliğe neden olarak reseptörün hücre membranındaki SOCC ler ile protein-protein etkileşimine girmesine neden olmaktadır. R, agonist reseptör; Ag, agonist; G, G protein; PLC, fosfoinosit fosfolipaz C; SOCC, store-operated (depo-kontrollü) Ca +2 kanalı; SR, sarkoplazmik retikulum; CIF, Ca +2 influx factor (giriş faktörü); SP, scaffolding protein (çapalama proteini) (256). Tüm bu depo boşalması ile SOC girişinin aktivasyonu arasındaki ilişkinin aydınlatılmasına yönelik mekanizmalara ek olarak yeni bir model önerilmiştir (265). SOCC lerin bir örneği olan TG nin aktive ettiği Ca +2 kanallarını kullanarak Drosophila S2 hücrelerinde RNA interference (RNAi) temeline dayanan tarama (screening) metodu kullanılmıştır. Bu çalışmada TRP genleri, diğer bilinen Ca +2 29

43 geçirgen kanal genleri ve sinyal molekülleri ile etkileştiği tahmin edilen bazı genleri kapsayan toplam 170 gen taranmıştır. Stromal interaction molekülü (STIM) proteinini kodlayan gen olan Stim in Drosophila S2 hücrelerinde RNAi-aracılığı ile susturulması sonucunda TG nin neden olduğu Ca +2 girişi belirgin şekilde azalmıştır. STIM1 geni baskılanmış S2 hücrelerinde SOC akımının direkt ölçümü sonucunda I CRAC ın kaybolduğu gözlenmiştir. STIM1 in susturulması Jurkat T hücrelerinde I CRAC ı, HEK293 epitel hücrelerinde ve SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde SOC girişini azaltmıştır (265). STIM2 nin susturulması ise etki göstermemiştir. Ayrıca RNAi aracılığı ile STIM1 geninin susturulduğu çalışmada da SOC girişinin şiddet ve hızının azaldığı gösterilmiştir (176). STIM1 in susturulması ile oluşan SOC girişindeki inhibisyonun miktarı kullanılan sirna dozuna bağlı olarak artmaktadır. STIM1 in aşırı ekspresyonunun ise SOC girişinin hız/büyüklüğünü artırdığı bildirilmiştir (176,265). Bu sonuçlar STIM (Drosophila) ve STIM1 (memelilerde) SOC kanallarının aktivasyon mekanizmasındaki önemli rollerini göstermektedir. STIM1 in rolü hakkındaki ipucu yapısında ve hücresel lokalizasyonunda gizlidir. Protein membranı bir kere geçmekte ve NH 2 ucu ER nin lümeninde ya da hücre dışında (hücre membranında bulunuyor ise) bulunmaktadır. NH 2 ucu EFhand motifi taşımaktadır. Proteinde aynı zamanda protein-protein etkileşme bölgeleri, sitoplazma tarafında 2 tane çift bükümlü (coiled-coil) bölge ve ER lümeni kısmında (ya da ekstraselüler alanda) steril α motif (SAM) bulunmaktadır (Şekil 1.3). STIM1 tek başına SOC kanalı oluşturamaz. Çünkü STIM1 kanal-benzeri diziye sahip değildir ve proteinin aşırı ekspresyonu Ca +2 girişini sadece hafif bir şekilde artırmıştır. STIM1 proteininin Ca +2 bağlayan bölgesindeki mutasyonların spontan SOC girişlerine neden olduğu bildirilmiştir (173,292). 30

44 STIM1 in ER daki Ca +2 miktarını algılayabilen bir sensör proteini olarak depo boşalmasını takiben nasıl SOC kanallarını aktive ettiğine yönelik olası mekanizma Şekil 1.4 de gösterilmektedir. Dinlenim durumundaki yani uyarılmamış hücrenin kalsiyum depoları dolu halde iken STIM1 proteini ER membranının yüzeyinde düzgün bir şekilde dağılmış vaziyettedir. Bu halde iken ER de bulunan serbest Ca +2 iyonları STIM1 in EF hand motifine bağlı halde bulunurlar. Hücrenin uyarılması sonucunda depoların boşalması üzerine Ca +2 STIM1 in EF bölgesinden ayrılarak STIM1 proteinlerinin yapısında değişikliğe neden olur ve bu proteinler ER nin hücre membranına yakın punkta (delik) bölgelerinde toplanırlar. SOC kanallarının aktivasyonu için bu aşamada önerilen iki mekanizma bulunmaktadır. Buna göre ya bir araya gelen STIM1 proteinleri hücre membranına geçerek SOC kanallarını aktive ederler (eklenme modeli, (358) ya da ER nin hücre membranına yakın punkta bölgesinde kümeleşen STIM1 proteinleri SOC kanallarına kenetlenerek Ca +2 girişini aktive ederler (etki modeli, (176), Şekil). Huang ve arkadaşları STIM1 in karboksil ucunun I CRAC ve doğal SOC kanallarına ilaveten TRPC1 kanallarını da aktive ettiğini göstermişlerdir (136). 31

45 Şekil 1.3: STIM1 ve SOCC aktivasyonu Agonistin reseptöre (R) bağlanması sonucunda G-proteini (G) aracılığı ile PLC aktive olmaktadır. PLC aktivasyonu IP 3 oluşumuna neden olur ve sonra IP 3 reseptörünü (IP 3 R) aktive ederek SR dan Ca +2 salıverilmesine neden olur. SR boşalmasını takiben SR, hücre membranı ya da her ikisinde birden bulunan STIM1 aracılığı ile SOCC aktive olur. STIM1 yapısında NH 2 ucunda Ca +2 bağlayan EF-hand ve SAM bölgesi bulundurur. Membranı bir kez geçer (transmembrane, TM). Bu bölgeler SR lümenine ya da ekstraselüler alana bakmaktadır. Özellikler EF-hand bölgesi SR Ca +2 düzeylerine duyarlı ya da hücre membranında kalsiyumun düzenlenmesinde görev alan bir bölgedir. COOH-ucunda 2 coiled-coil (CC) bölgesi ve serin/prolin- (S/R) ve lizin- (K) zengin bölgeler bulunur (255). 32

46 Şekil 1.4: STIM1 etkisiyle SOC kanallarının aktivasyonu için önerilen modeller (A) ER depoları dolu dinlenim durumundaki hücreler. Ca +2 bağlı STIM1 molekülleri (mor) esas olarak ER de gösterilmiştir, fakat hücre membranında (PM) da bulunduğuna dair kanıtlar bildirilmiştir. SOCC ler (sarı) kapalı halde. (B) ER deposunun boşalması sonrasında ER STIM1 proteinleri punktada toplanırlar. Punkta bölgeleri ER nin hücre membranına yakın farklı bölgeleridir. (C) eklenme modelinde, STIM1 proteini hücre membranına yaklaşır ve membrana geçer. (D) PM deki yüksek STIM1 içeriği SOCC leri aktive eder. (E) etki modelinde, kümeleşmiş STIM1 ler PM deki SOCC lere yapısal olarak kenetlenirler ve PM deki STIM1 lerin bu bölgeye yaklaşmasına neden olurlar. (F) Bu düzenlenme sonrasında SOC kanalları aktif hale gelirler (292). Yapılan son çalışmalar SOC aktivasyonunda STIM1 proteinine ilaveten hücre membranında bulunan orai1 (CRACM1) adlı proteinin de görev aldığını bildirmektedir. Orai1 proteinin membranda kanal oluşturduğu ve bu kanalın aktivitesinin STIM1 ile kontrol edildiği düşünülmektedir (198,288). Orai1 membranı dört kez geçen hücre membranında bulunan bir proteindir (94,329). Orai1 proteininin 33

47 hücre membranında CRAC nin bir komponenti ya da CRAC lerin düzenleyicisi olarak işlev gösterdiği önerilmiştir (329). Deponun boşalması sonrasındaki süreçte STIM1 in hücre membranına yaklaşarak Orai1 ile etkileşmesi ile SOCC leri aktive ettiği düşünülmektedir (198). SOC girişinde Orai1 in gerekliliği bilinmesine rağmen tek başına Orai1 in eksprese ettirildiği hücrelerde SOC girişinin baskılandığı gösterilmiştir. Orai1 ve STIM1 in birlikte eksprese ettirildiği hücrelerde ise SOC girişinin hızı ve miktarında artış gözlenmiştir (288) TRP KANALLARI Omurgalılarda ışık, fotoreseptör hücrelerinde cgmp-kapılı kanalların kapanmasına ve sonrasında membranın hiperpolarizasyonuna neden olurken, meyve sineği Drosophila melanogaster deki fotoreseptör protein rodopsinin ışık ile aktivasyonu PLC stimülasyonuna (G- proteini aracılığı ile), IP 3 oluşumuna ve sonuçta sürekli bir membran depolarizasyonuna neden olmaktadır. Depolarizasyon, biri kalsiyuma diğeri sodyum ve kalsiyumun ikisine birden geçirgen iki farklı kondüktanstan kaynaklanmaktadır (195). Bu yolaklar aracılığı ile özellikle de Ca +2 - selektif olan yolakla fotoreseptör hücreye Ca +2 girişi Ca +2 -bağımlı ışık adaptasyonu açısından önemlidir yılında Cosens ve Manning izole ettikleri spontan mutant Drosophila melanogaster de uzun süre ışık maruziyeti sonrasında sürekli olmayan geçici anormal elektroretinogram (ERG) gözlemişlerdir (64). Daha sonra bu nesil A- tipi mutant olarak isimlendirilmiş ve bu fenotipik özellik fotopigment rejenerasyonunda yetmezlik olarak tanımlanmıştır (Cosens DJ, 1971, V17). İşlevsel Ca +2 -selektif giriş yolağı olmayan mutant sinekler aşırı ışık ile kör olmaktadırlar. Bu mutantlarda ışık maruziyeti sürekli yanıt yerine sadece geçici bir membran 34

48 depolarizasyonu oluşturmaktadır (Şekil 1.5). Yabanıl (wild) -tip sineklerin fotoreseptörlerinde ölçülen reseptör potansiyelinin plato fazı mutant sineklerde görülmemektedir. Sonuç olarak bu mutasyon transient receptor potential, trp olarak isimlendirilmiştir yılında, Minke ve arkadaşları bu mutantı ayrıntılı olarak incelemişler ve fotopigment döngüsünün normal olduğunu transdüksiyon kaskatının daha ileri aşamasında bir kusur olduğunu göstermişlerdir (207). trp geninin klonlanması ve sekanslanması (213), yapılan patch clamp çalışmaları (115), TRP homoloğu TRPL (TRP-like) ve TRPγ kanallarının bulunması, TRP protein dizisinin analizini gerçekleştirmesi (250) sonucunda TRP proteinlerinin yeni bir Ca +2 geçirgen katyon kanalı olma olasığı artmıştır (115,250). TRP ve TRPL nin fotoreseptör hücrelerinin ışıkla aktive olan kanallar olduğuna dair bir diğer kanıt Niemeyer (1996)ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. trpl mutantını izole eden Zuker ve arkadaşları trpl;trp double mutant sineklerin kör olduklarını göstermiştir (226,276). Drosophila fototransdüksiyon yolağının diğer bir önemli özelliği transducisome olarak isimlendirilen bir sinyal kompleksinden meydana geliyor olmasıdır. Transducisome un moleküler yapısı INAD (Inactivation No After Depolarization) proteinidir. INAD proteini 5 adet PDZ (Post-synaptic density protein, Disc-large tumour supressor, Zonula occludens protein) domaininden oluşmaktadır (74). TRP ve transdüksiyon kaskatının diğer komponentleri TRPL, PLCβ, rodopsin, göze-spesifik protein kinaz C (INAC), kalmodulin (CaM) ve NINAC (miyozin III; NINA, neither inactivation nor afterpotential) INAD aracılığı ile birbirine kenetlenir (257,322). 35

49 Drosophila TRP proteininin fosfoinosit-aracılı Ca +2 geçirgen kanal olarak tanımlanması (27,71,116) ve memeli homoloğunun keşfi (362) araştırmacıların TRP kanallarındaki Ca +2 sinyali üzerine olan incelemeleri artırmasına neden olmuştur (339,363). Sonuç olarak biyolojik mekanizmalar üzerine birbirinden bağımsız yapılan çok sayıdaki çalışma TRP süperailesinin varlığını ortaya çıkarmıştır (211,229,243). Şekil 1.5: Drosophila melanogaster de TRP kanallarının keşfi Drosophila daki ışık yanıtına PLCβ ve ışıkla aktive olan kanallar aracılık etmektedir. Kanalların aktive olması ile sodyumun neden olduğu kısa süreli bir depolarizasyon ve kalsiyumun neden olduğu daha uzun bir depolarizasyon (adaptasyon) meydana gelir. Yabanıl-tip ve trp mutant sineklerden alınan elektroretinogram (ERG) kayıtları (206). Mutant sinekler sadece geçici bir reseptör potansiyeli (trp, transient receptor potential) göstermiştir (74). Günümüzde memelilerde yaklaşık 30 (Drosophila da 13 ve Caenorhabditis. elegans da 17) üye içeren TRP kanalları yeni bir katyon kanalı ailesini oluşturmaktadır (Şekil 1.6). TRP kanalları çevresel uyarılardaki değişiklikleri ayrımsal olarak belirleyen evrensel biyolojik sensörlerdir. TRP kanalları sıcak/soğuk, doğal kimyasal bileşikler (mentol, kafur, acı biber), mekanik uyaran, lipid tabakanın içeriğindeki değişiklikler gibi birçok uyaran ile açılmaktadır. TRP kanalları kan basıncı ve düz kas tonusunun düzenlenmesi, renal Ca +2 / Mg +2 iletimi, keskin tad ve 36

50 kokulu bileşiklerin (hardal, sarımsak gibi), mekanik değişikliklerin, ağrının, ısının, tadın, kokunun, sesin, feromonların, ışığın algılanması gibi çok önemli birçok süreçte rol oynamaktadır (57,205,211,229,243,331). Amino asid benzerliklerine göre TRP süperailesi 7 alt aileye ayrılmaktadır: TRPC (klasik ya da canonical, TRPC1-7), TRPM (melastatin, TRPM1-8), TRPV (vanilloid reseptör, TRPV1-6), TRPA (ankyrin zengin protein, TRPA1), TRPP (polisistin), TRPML (mukolipin), TRPN (NOMPC, no mechanoreceptor potential C) (57,62,68,212,215). Memelilerde sadece TRPA ailesinden sadece TRPA1 üyesi bulunurken, TRPP ve TRPML ailelerinin her birinin 3 üyesi de memelilerde bulunmaktadır. TRPN ise şimdiye kadar sadece C. elegans, Drosophila ve zebra fish de belirlenmiştir (Şekil 1.7). TRP kanallarının temel yapısını, bazı TRPP ler hariç, membranı 6 kez geçen bölgelerin (transmembran, TM1-6) oluşturduğu önerilmektedir. TM5 ve 6 segmentleri arasındaki hidrofobik halkanın iyon kanalı oluşturan por olduğu ve NH 2 ve -COOH uçlarının sitoplazmada bulunduğu düşünülmektedir. TRP alttipleri homoya da heterotetramerik yapılar oluşturarak fonksiyon göstermektedirler (57,133,326). İn vivo olarak, fonksiyonel TRP kanal komplekslerinin bir araya gelişi homo/heteromultimerleşme ve yapısal proteinler ile kompleks oluşumlar tarafından yönetilmektedir (74). Farklı dokularda önerilen fizyolojik işlevler ile heterolog ekspresyon sistemlerinde gözlenen TRP kanallarının işlevsel özellikleri arasındaki farklılıklar bu oluşumlar ile açıklanabilir. 37

51 Memeli hücrelerinde depo boşalmasının ardından aktive olan Ca +2 giriş yolağı ile Drosophila da (ve trp-yoksun mutant) ışık ile aktive olan Ca +2 giriş yolağı arasındaki işlevsel benzerlik, SOC girişini sağlayan proteinin trp geni tarafından kodlanan protein ile benzer olabileceğini düşündürmektedir (117). TRP kanalları VOCC α 1 -alt biriminin membranı geçen bölümlerine yapısal olarak belirgin benzerlik göstermesine rağmen VOCC lerde voltaja duyarlığı oluşturduğu düşünülen çok sayıda pozitif yük taşıyan S4 bölgesi TRP proteininde bulunmamaktadır. Pratikte voltaj-kapılı kanalların açılması Kv/Na V /Ca V kanallarındaki yüklü S4 segmentinin hareketi sonucunda gerçekleşmektedir. TRP kanallarında S4 segmentinde bu iyonik yüklü kalıntılar olmasa da bu kanalların açılması voltaj değişikliklerinden etkilenmektedir. TRPV1, M4, M5 ve M8 TRP kanalları arasında voltaj değişikliklerine en duyarlı altiplerdir. Buradaki en önemli soru polipeptid zincirindeki hangi kalıntılar voltaj değişikliklerine hassastır. Genelde TRP kanal kapısı voltaj ile yönetilmemektedir, fakat sıcaklık, bağlanma ve voltaj değişiklikleri ile ilişkili enerji farklılıklarından etkilenmektedir. TRP nin C-terminal bölgesinin hücre içi Ca +2 depolarının boşalmasının ardından kanalların aktivasyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir (284). 38

52 Şekil 1.6: TRP kanallarının yedi altailesi Ankyrin tekrarları (A), coiled-coil bölgesi (cc), protein kinaz bölgesi (sadece TRPM6/7 de), membranı geçen bölgeler (TM) ve TRP bölgesi (211). Şekil 1.7: TRP kanallarının filogenetik ağacı Dört farklı model organizma farklı renkte gösterilmiştir: Siyah: insan; kırmızı: sinek, Drosophila melanogaster; yeşil: solucan, Caenorhabditis elegans; mavi: balık, Danio rerio. Ölçek amino asit başına düşen substitüsyon sayısını ifade eden evrimsel uzaklığı belirtmektedir (229). 39

53 TRPC kanalları Memeli TRPC kanalları Drosophila TRP ve TRPL kanallarının homologlarıdır. Memelilerde toplam yedi TRPC proteini (TRPC1-7) belirlenmiştir (339,362,363). TRPC ailesi dizi ve işlevsel benzerliklerine göre 3 alt gruba ayrılmaktadır: TRPC1/4/5, TRPC3/6/7 ve TRPC2 (58,204). Bazı araştırmacılar ise TRPC kanallarını 4 alt gruba ayırmaktadır: TRPC1, TRPC2, TRPC3/6/7 ve TRPC4/5 (74,211,243). Fare ve sıçanların aksine insanlarda sadece 6 TRPC proteini eksprese edilmektedir, çünkü fare ve sıçanda vomeronazal organda feromon-duyargası olarak işlev gören TRPC2 geni insan genomunda prematüre sonlanma bölgesi içerdiğinden yalancı gendir (pseudogene) (339) (Şekil 1.8, Tablo 1.1). Şekil 1.8 : TRPC ailesinin üyeleri ve önerilen membran topolojisi Kanalın düzenlenmesinde önerilen önemli bölgeler ve protein-protein etkileşimleri görülmektedir (243). 40

54 Tablo 1.1: TRPC 1-7 genlerinin insan ve sıçan kromozomlarındaki lokalizasyonu ve ekzon sayıları Gen Kromozomal lokalizasyonu Ekzon sayısı TRPC İnsan Sıçan İnsan Sıçan TRPC1 3q q TRPC2 11p15.4-p15.3 1q TRPC3 4q27 2q TRPC4 13q13.1-q13.2 2q TRPC5 Xq23 Xq TRPC6 11q21-q22 8q Yedi adet memeli TRPC alt tipinin sitoplazmik C-ucunda TRP kutusu (TRP box) olarak isimlendirilen değişmeyen bir amino asit dizisi bulunmaktadır (Glu- Trp- Lys-Phe-Ala-Arg, EWKFAR). C-ucunda ayrıca evrim süresince korunmuş prolince zengin bir motif, CIRB (kalmodulin/ip 3 R bağlanma, calmodulin/ip 3 R binding) bölgesi ve çift bükülmüş sarmal (coiled-coil, CC) bölgesi olduğu önerilmektedir. Ayrıca TRPC4 ve TRPC5 proteinlerinin uzamış C-uçlarında bir PDZ-bağlanma bölgesi bulunmaktadır. N-ucunda 3 ya da 4 adet ankyrin tekrarları taşımaktadır (58,204,211). Ankyrin tekrarlarının 33 amino asitten oluştuğu ve protein-protein etkileşimlerine aracılık ettiği düşünülmektedir (205). Diğer protein-protein etkileşim bölgelerinin aksine ankyrin tekrarları korunmuş bir yapı ya da diziyi tanımaz, buna karşılık bu tekrarlar bağlanma partnerleri ile bağlanma yüzeylerini birbirine uygun hale getirir. Bu nedenle TRPC ankyrin tekrarlarının bağlanma partnerlerinin tahmin edilebilmesi zordur (327). Eğer TRP heteromerik kanalların bir alt birimi olarak işlev gösteriyorsa, ankyrin tekrarı TRP yerleşiminde ve alt birim etkileşimlerinde rol 41

55 oynamaktadır. TRPC3 proteininin N-ucunun ankyrin tekrarlarına kadar silinmesi kanalların membrana hedeflenmesi ve işlevlerini bozmazken, ankyrin tekrarlarının silinmesi hücre içi kompartmanlarda proteinlerin birikmesine neden olmuştur (337). Buna benzer bir bulgu TRPC6 proteininin ilk ankyrin tekrarını da içeren N-terminali 131. amino asitin olmadığı mutantlarda da gözlenmiştir (337). TRPC1 proteininde olduğu gibi tüm ankyrin tekrarları kanalların işlevsel ekspresyonu için kritik bir önem taşımaz, çünkü 4 ankyrin tekrarından üçüncüsünün olmadığı splice varyant da depo-boşalması ile aktive olan kanalları oluşturmaktadır (364). Ankyrin tekrarlarının evrim süresince TRP ailesinin çoğu üyesinde yüksek derecede korunmuş olması onun önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. Fakat hala TRP fonksiyonundaki rolü tam olarak bilinmemektedir (205). NH 2 ucunda ayrıca bir CC bölgesi ve bir caveolin bağlanma bölgesi olduğu tahmin edimektedir (327) (Şekil 1.9). CC bölgesi her yerde var olan bir protein motifidir ve genelde oligomerizayonun kontrolünde kullanılır. CC dizileri alpha-heliks katlanması yapan, heptad tekrarlarından (1. ve 4. aa lar hidrofobik olan yedili peptid tekrarları) oluşur. Bu alfa-helikslerin birbirleri ile etkileşerek ikili (dimer) veya üçlü (trimer) grift yapılar geliştirmesi ile süpersarmal peptid dizileri oluşur. TRPC kanallarının N- ve C-uçlarının her birinde bir CC bölgesi bulunmaktadır. CC bölgeleri TRPC kanallarının farklı özelliklerde tetramerik iyon kanalı oluşturmasına neden olan homo- ve heteromerizasyonlarına ya da TRPC kanallarının CC içeren proteinlerle etkileşimini sağlamasına aracılık etmektedir. TRPC1 CC-N bölgesi homodimerizasyonda rol oynarken, CC-C ucu dimerleşme yapamaz (87). Mikrotübül destabilize edici fosfoprotein statminin (stathmin) CC bölgesinin TRPC5 CC-N bölgesi ile etkileştiği düşünülmektedir (105). Bu etkileşim olasılıkla TRPC4 ve 42

56 TRPC5 için özeldir, çünkü TRPC1 ve TRPC7 statmin sarmal bölgesi ile etkileşim göstermez. Hücre membranındaki kaveolinden (Cav) zengin mikrobölgeler kaveola (caveolae) olarak tanımlanmaktadır (161). Antikor aracılı çökeltme coimmunoprecipitation çalışmaları kaveolinlerle TRPC1 ve TRPC3 ün ko-lokalize olduğunu göstermiştir (34,179,180). Cav-1 bağlanması genellikle aromatik-zengin bölgelerde meydana gelmektedir (65). TRPC ailesinin tüm üyelerinin sitozolik N- ucunun TM1 e yakın bölgesinde böyle bir korunmuş bölge bulunmaktadır (34). Bu bölgenin silinmesi TRPC1 in hücre membranına hedeflenmesini önler ve SOC girişini etkiler (34). TRPC kanallarının por bölgesinde ve poru sınırlayan ekstraselüler halka bölgesindeki nokta mutasyonların etkisini araştıran çalışmalar bulunmaktadır. TRPC5 ve TRPC6 proteinlerinin por heliksinde bulunan korunmuş LFW motifinin AAA ile değişmesi dominant negatif mutantların oluşmasına neden olmuştur (133,297). Jung ve arkadaşları (2003) TRPC5 in por loop unda yüklü kalıntılar belirlemiştir (151). Bu bölgelerdeki glutamik asitin (E) glutamine (Q) dönüşmesi (E543Q ve E595Q/E598Q) lantanın etkisinin kaybolmasına neden olur (151). Aynı şekilde TRPC1 proteinindeki E576K (K, lizin) ya da D581K (D, aspartik asit) mutasyonların SOC girişini azaltırken Na + akımını değiştirmemesi bu bölgenin Ca +2 selektivitesi için önemli olduğunu göstermektedir (178). Geleneksel olarak bu tür mutasyonların selektif olmayan bir kanalın özellikle Ca +2 geçirgenliğini etkileyebileceği düşünülemez. TRPC1, 4 ve 5 proteinlerinde E576 korunmuş bir bölgedir ve CX4CE (C, sistein) motifi bu alt tiplere özgüdür. Bu sisteinler olasılıkla 43

57 ekstraselüler alana bakan yüzeyi oluştururlar. Sisteinler TRPC1, 4 ve 5 arasında heteromer yapıyı oluşturan disülfid bağlarını oluşturabilir (133). EWKFAR motifinin (TRP box) altında bulunan prolinden zengin motif (LPXPFXXXPSPK) TRPC kanallarının tümünde korunmuş bir bölgedir. Bu bölgenin Homer (TRPC1 için) ve/veya diğer immünofilinler (immunophilin) ile etkileşimden sorumlu olduğu düşünülmektedir (283,350). Yukarıda da belirtildiği gibi TRPC4 ve TRPC5 uzamış C-uçları PDZ-bağlayan bölge ile sonlanır. Bu bölgenin bir kısmı TRPC4β splice varyantında bulunmayıp otoinhibitör işlevi olduğu önerilmektedir (274). Bu bölge aynı zamanda CaM ve IP 3 R nin C-uçları ile de etkileşmektedir (199,319). TRPC5 proteininde bu bölgenin işlevi hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. TRPC4 ve TRPC5 proteinlerinin C-uçlarındaki benzerlik derecesi de oldukça düşüktür (327). TRPC4 ve TRPC5 proteinlerinin PDZ bağlayan TRL motifi kanalların PLCβ ve hücre iskeletine kenetlenmesinde rol oynayan NHERF (Na + -H + değiş-tokuşunu düzenleyici faktör, Na + -H exchanger regulatory factor) proteininin PDZ bölgesi ile etkileşiminden sorumludur (309). 44

58 Şekil 1.9: TRPC kanallarının yapısı ANK, ankyrin tekrarları; CC-N ve CC-C NH 2 - ve COOH-ucundaki coiled-coil bölgeler. C-ucunun en ucundaki gri alan TRPC4 ve 5 kanalları için özeldir. PDZ-B, PDZ bağlanma bölgesi; CC-N, N-ucu coiled-coil bölgesi; CC-C, C-ucu coiled-coil bölgesi; ANK1-4, ankyrin tekrarları 1-4; CIRB, kalmodulin/ip 3 reseptör bağlanma bölgesi (calmodulin/ IP 3 receptor binding region); PLC, fosfolipaz C; IP 3 R, IP 3 reseptörü; CaM, kalmodulin; NHERF, Na + -H + değiş-tokuşunu düzenleyici faktör.. Peptid dizileri (tek harfli kodları): LWF, tüm TRPC proteinlerinde kanal oluşturduğu düşünülen korunmuş aa motifi. EWKFAR, TRP kutusunun aa dizisi. LPXPFX 3 PSPK, prolinden zengin bölge (327). TRPC kanallarının aktivasyon mekanizmaları Memeli TRPC proteinlerinin heteromultimerik yapılar oluşturarak fonksiyon gösterdikleri önerilmiştir (58,205). TRPC1, 2, 4, ve 5 kanallarının depo-kontrollü olarak aktive olabileceği önerilmiştir. Bu proteinlerden herhangi birinin eksprese ettirildiği hücre kültür hatlarında IP 3 ya da tapsigarjin uygulaması katyon girişine neden olmuştur (246,247,325,363). SOC girişinin mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır (bkz, SOC kanalları). SOC kanalları ile aktive olduğu önerilen TRPC kanallarının aksine diğer TRPC kanallarının (özellikle TRPC6 ve 7) DAG ile 45

59 aktive olduğu önerilmektedir (130,235). TRP kanallarının açılmasında DAG ve PUFA nın (polyunsaturated fatty acids, çoklu doymamış yağ asitleri) doğrudan ya da dolaylı etki gösterdiği henüz açıklık kazanmamıştır. TRPC proteinlerinin DAG ile dolaylı aktivasyonu mitokondriyal kenetsizlenmeye neden olabilen uzun zincirli yağ asiti metabolitlerinden kaynaklanıyor olabilir (211). Bazı TRPC kanalları depokontrollü mekanizma ile aktive olurken diğerlerinin DAG oluşumu ile aktive olması farklı TRPC proteinlerinin farklı mekanizmalarla düzenlendiklerini düşündürmektedir (211). Fare TRPC2 kanalı vomeronazal nöronlarda DAG artışı ile aktive olurken (182) fare sperminde Ca +2 salıverilişi ile aktive olmaktadır (153). Aktivasyon mekanizmalarındaki bu farklılıklar TRPC2 vomeronazal nöronlarda ve spermde farklı alt tipler ile heteromultimerik yapı oluşturmalarına ya da alternatif mrna düzenlenmesinden oluşan farklı TRPC2 izoformlara bağlı olabilir (131,325). Farklı aktivasyon mekanizmaları TRPC3 için de söz konusu olabilir. Bir çalışmaya göre, TRPC3 aktivasyonu DAG oluşumuna bağlı iken (130), diğer çalışma TRPC3 kanalının SOC kanalı olduğunu göstermiştir (363). TRPC3 kanalı tip I IP 3 R ile direkt etkileşebildiği için bu kanalın konformasyonel kenetlenme ile aktive olabileceği önerilmiştir (158). IP 3 R nin N ucundaki IP 3 bağlanma bölgesi ve membranı geçen bölgeleri ile TRPC3 kanalının C ucunun membranı geçen bölgesine doğru küçük bir kısmı bu etkileşimi sağlayan bölgelerdir (157). IP 3 R ler ve TRPC kanalları arasındaki direkt etkileşimler genel bir fenomen olabilir. Çünkü insan trombositlerinde TRPC1 proteini tip II IP 3 R ile birlikte ko-immunopresipite olmuşlardır (267). TRPC3 kanalının aktivasyonuna yönelik farklı mekanizmaların bildirilmesi çalışmalarda kullanılan farklı hücre tiplerinden kaynaklanıyor olabilir. Farklı hücre hatları TRPC3 proteini ile etkileşen farklı endojen proteinler eksprese 46

60 ediyor olabilir ve bu da kanalın aktivasyon mekanizmasını değiştirebilir. Bu nedenle, TRPC proteinlerinin düzenlenme mekanizmalarını araştıran çalışmaların in vivo ortamlarda yapılması çok önemlidir (211). Doğal bir TRPC3-bağımlı kanalın kondüktansı neonatal sıçanların beyinlerinde yapılan bir çalışma ile belirlenmiştir. Bu çalışmada nörotrofin BDNF (brain-derived neurotrophic factor, beyin-kaynaklı nörotrofik faktör) ün TrkB reseptörünü stimüle etmesi ve ardından PLCγ kenetlenmesi ile başlayan sinyal yolağı ile TRPC kanalı aktive olmaktadır (174). Bu kondüktans, I BDNF, DAG ile aktive olmazken IP 3 R inhibitörleri ile kaybolmuştur. Bu nedenle, en azından bir endojen TRPC3 kondüktansı DAG değil IP 3 R aktivitesine gereksinim duymaktadır (211). TRPC3 ve diğer TRPC kanalları büyük olasılıkla yabanıl hücrelerde esas olarak hücre içi kompartmanlarda yer almaktadır (41,174,296). Bu sonuç TRPC kanallarının veziküler membranda bulunduklarını ve hücre membranına düzenli bir şekilde gidipgelerek çalıştıklarını göstermektedir. Eğer bu öneri gerçeği yansıtıyorsa bu durum in vitro ortamda bazı TRPC kanallarının aktif oluşunu açıklayabilir. SOC girişinin veziküler trafik inhibitörleri ile bloke edilmesi (290) ve hedef membranlar ile veziküllerin birleşmesi için gerekli olan SNAP-25 proteininin inhibisyonunun SOC girişini önlediğinin bulunması (344) bazı SOC kanallarının ekzositoz ile aktivasyon olasılığını desteklemektedir. Birçok in vitro çalışma ekzositoz ve endositozun hücre membranındaki TRPC proteinlerinin konsantrasyonunu değiştirdiği ve bu yolla TRPC-bağımlı katyon girişini modüle ettiği hipotezini desteklemektedir (49,144,179,197). 47

61 Ayrıca, hücre iskeleti de hücre membranından TRPC proteinlerinin ayrılması ve membrana eklenmesinin kontrolünde rol oynamaktadır (144,179). Reseptörlerin uyarılarak PLC aktivasyonuna kenetlenmesi de hücre membranındaki TRPC kanallarının konsantrasyonunu artırmaktadır (49). Ayrıca ekzositozda rol oynayan proteinler TRPC proteinlerinin hücre membranına hareketlerine de katkıda bulunmaktadırlar (26,197). SOC kanalları ve Ca +2 depolarının boşalması arasındaki kenetlenme mekanizması günümüzde hala tam olarak netlik kazanmamıştır (256). Bu süreçte TRPC proteinlerinin rolü de tartışmalıdır. DAG TRPC3, TRPC6 ve TRPC7 için olası bir mediyatör iken, TRPC1, TRPC4 ve TRPC5 aktivasyonu net değildir. TRPC ailesinde SOC kanalı olarak en çok kabul gören TRPC1 kanalıdır fakat henüz SOC kanallarının bilinen özellikleri ile TRPC1 kanalının özellikleri birbirine tam uymamaktadır (255,256) TRPC1 TRPC1 yaygın doku dağılımı gösteren bir proteindir (132) ve bu kanal için birçok aktivasyon mekanizması ve fizyolojik rol önerilmiştir. TRPC1 yüksek miktarlarda düz kas, beyin, kalp, testis, over, endotel hücreleri ve salgı bezlerinde eksprese olmaktadır (205). TRPC1 kanalı genellikle SOC kanalları için bir aday olarak önerilmektedir (178,219,241,342,350). Fakat bazı araştırmacılar tek başına eksprese olduğunda TRPC1 kanalının tapsigarjin ya da IP 3 ün neden olduğu depoboşalmasına duyarlı olmadığını göstermişlerdir. TRPC1 kanalının sadece diğer TRPC izoformları ile heterotetramer yapılar oluşturduğu zaman kanal fonksiyonu gösterdiğine dair kanıtlar artmaktadır (296). Çünkü TRPC1 kanalının temel 48

62 lokalizasyon bölgesi hücre içi kompartmanlardır ve TRPC1 in hücre membranına translokasyonu için diğer TRPC kanalları ile etkileşmesi gerekmektedir (133). TRPC1 ve IP 3 R arasında yapısal protein homer in rol oynadığı önerilmiştir (350). TRPC ve homer arasındaki etkileşim ER nin Ca +2 doluluğu ile düzenlendiği ve TRPC1 aktivasyonu için bu kompleksin birbirinden ayrılması gerektiği önerilmiştir (350). Diğer araştırmacıların TRPC1 in DAG-duyarsız olduğunu göstermesiyle birlikte (130) TRPC1 kanalının ekstraselüler Ca +2 yokluğunda DAG nin membranı geçebilen analoğu olan 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG) ile hafif olarak aktive olduğu bildirilmiştir (175). TRPC1 beyinde birçok önemli süreçte rol almaktadır (243). TRPC1 nöronlarda metabotropik glutamat reseptörleri aracılığı ile aktive olmaktadır. TRPC1 burada ekzitatör postsinaptik potansiyelin oluşumundan sorumludur (16,57). Endotel hücrelerinde (2), trombositlerde (40), düz kas hücrelerinde (16) ve B-lenfositlerde (219) TRPC1 agonist, büyüme faktörü ve PKC-aracılı Ca +2 girişi için aracılık etmektedir. TRPC1 damar düz kas hücresinde kontraksiyon ve proliferasyonda önemli rol oynamaktadır (74). Sıçan kuyruk arterinde TRPC1 proteininin antikor ile blokajı endotelinin neden olduğu kontraksiyonu inhibe etmiştir (20). Bazal arterde endotelinin neden olduğu kontraksiyonda TRPC1 in hiçbir rolü olmamasına rağmen, düz kas hücrelerinde SOC girişi potansiyalize olmuştur (21). Bu sonuçların aksine TRPC1 aşırı ekspresyonu CPA uygulanmasından sonra pulmoner arter kontraksiyonunu artırmıştır (165). Serebral arteriyollerde TRPC1 SOC girişinde rol oynarken (342), SOC girişi kontraksiyonu başlatamamıştır (96). TRPC1 protein ekspresyonu düz kas adaptasyonu ve proliferasyonunu başlatan koşullarda artmaktadır (21,302). 49

63 TRPC2 TRPC2 insanlarda daha önceden belirtildiği gibi psödogen olarak kabul edilmektedir (339). TRPC2 sıçanlarda vomeronazal sensory nöronların (VSN) dendritlerinde fazla miktarda eksprese olmaktadır. TRPC2 burada DAG ile aktive olur ve feromon algılanmasında önemli bir rol oynar (345). TRPC2 geninin silindiği farelerde sosyal ve cinsel davranışlarında bir takım bozukluklar (örneğin cinsiyet ayıramama, erkek fareler arasında saldırganlık) gözlenmiştir (295). TRPC2 ayrıca spermatozoada da eksprese edilmektedir ve yumurtadaki zona pellucida sperm reseptörü (ZP3) ile stimülasyonu sonrasında sperm içine Ca +2 girişinde önemli rol oynamaktadır (153). TRPC2 nin SOC girişinde görev aldığı önerilse de henüz bu netlik kazanmamıştır (132) TRPC3 TRPC3 esas olarak beyin, düz kas ve kalp kası hücrelerinde eksprese olmaktadır. TRPC3 insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK293) de aşırı eksprese olmaktadır ve reseptör-aracılı olduğu kadar tapsigarjin ile de aktive olma özelliği taşıdığı önerilmiştir (363). TRPC3 DAG ile aktive olan reseptör-kontrollü kanallar olan TRPC3/6/7 alt ailesine dahildir (130). ROC kanalları agonistin kanal proteininden farklı yerde bulunan PLC-kenetli membran reseptörüne bağlanması ile aktive olmaktadır. Kanal DAG ile uyarılabilse de TRPC3 TRPC6 nın aksine yüksek bir yapısal aktiviteye sahiptir (74). TRPC3 ve TRPC6 yüksek aa benzerliği taşısa da bu iki proteinin glikozilasyon bölgelerinde farklılık bulunmaktadır. TRPC3 bir tek glikozilasyon bölgesi taşırken (325) TRPC6 da iki bölge bulunmaktadır (75). TRPC6 proteininin glikozilasyon şartlarına benzetmek için TRPC3 proteinine ikinci bir 50

64 glikozilasyon bölgesinin eklenmesi sonucunda görülen TRPC3 bazal aktivitesindeki belirgin azalma proteine karbonhidrat bağlanmasının kanal aktivitesi için ne kadar önemli olduğunu göstermektedir (75). TRPC3 aktivitesi aynı zamanda Src-aracılı tirozin kinaz fosforilasyonuna da ihtiyaç duymaktadır (328) ve kanal proteininde fosforile tirozin kalıntısı (Y226) bulunduğu bildirilmiştir (156). F226Y-TRPC3 mutant iyon kanalları bazal aktivitede herhangi bir değişiklik göztermezken DAG- ve depo-aracılı yanıtlar tamamen kaybolmuştur (156,328). TRPC6 -/- fare modelinde gerçekleştirilen bir çalışmada TRPC3 ün özellikleri belirlenmiştir(77). TRPC6 geninin susturulması sonucunda yapısal olarak aktif TRPC3 kanalları TRPC6 nın yerini almış ve düz kasa bazal ya da agonist-aracılı Ca +2 girişi artmıştır. Sonuç olarak, TRPC6 yoksun düz kas hücrelerin wild tip hücrelere göre daha fazla depolarize olması, VOC kanallarının da aktivasyonuna neden olarak düz kas kontraktilitesini artırmaktadır (77). TRPC3 kanalının yüksek bazal aktivitesi idrar kesesi gibi bazı düz kas dokularında eksprese olan tonik olarak aktif kanallarla (TAC, tonically active channels) moleküler açıdan bir korelasyon gösteriyor olabilir (315). Fakat henüz TRPC3-yoksun fare modeli bildirilmediği için bu konuda direkt bir kanıt bulunmamaktadır (74). TRPC3 kanalının kalp kası, nöron ve endokrin hücrelerinde aktif olan NCX1 ile kenetli olduğu gösterilmiştir. NCX1 iyon değişiminin yönü membran potansiyeli ve Na + / Ca +2 konsantrasyon farkı ile belirlenmektedir. PLC nin reseptör-aracılı uyarılması hücre içi Ca +2 konsantrasyonunda artış ile sonuçlanır ve bu artış NCX in ileri forward modunu aktive ederek, TRPC3 kanalı aracılığı ile Na + girişine neden olur. Na + girişi ile VOC kanalları aktive olur ve hücre içi yüksek Ca +2 konsantrasyonu ile inhibe olan bu kanalların inhibisyonu gecikir. NCX hücresel Ca +2 51

65 sinyalini iki yönlü olarak yönetebildiği için TRPC3 kanalları ile böyle bir Na + girişindeki artış sonuç olarak hücre içi Ca +2 konsantrasyonunu artıran, Na + konsantrasyonunu azaltan, VOC kanallarını inhibe eden ve Ca +2 depolarını yeniden dolduran NCX in ters (reverse) modda çalışmasına neden olur (85,268). Bu özellikler her iki proteinin de eksprese edildiği düz kas hücreleri için önemli olabilir TRPC4 TRPC4 en çok endotelyum (98,316) ve düz kasta (16) eksprese olurken, barsak pacemaker hücreleri (317,334), beyin (132), böbrek (168) ve adrenal bezde (248) de eksprese edilmektedir. TRPC4 -/- farelerle yapılan çalışmalar TRPC proteininin damar düz kasının endotelyum-bağımlı damar gevşemesi ve endotelyal geçirgenliğin düzenlenmesi için gerekli olduğunu göstermiştir (98,316). sirna aracılığı ile TRPC4 proteininin susturulması pulmoner arter hücrelerinde SOC girişini baskılarken hücre içi Ca +2 konsantrasyonu ve Ca +2 salıveren sinyallerde herhangi bir etki göstermemiştir (357). Mesangial hücrelerde (böbrek kan damarları etrafındaki hücreler) yapılan bir antisense çalışması da TRPC4 kanalının SOC kanalı olarak işlev gösterdiği bulgusunu desteklemektedir (335). Fakat TRPC4 ve TRPC5 in heterolog olarak eksprese ettirildiği hücrelerde muskarinik ACh reseptörlerinin aktivasyonununun (ROCC) neden olduğu yanıtlara benzer yanıtlar gözlenmiştir (138,140). PDZ proteini NHERF ile etkileşerek PLCβ ya kenetlenir (119,232). Ayrıca TRPC4 ün glial hücrelerinde başka bir PDZ proteini olan ZO-1 ile etkileşimin TRPC4 ün hücre membanındaki lokalizasyonunda önemli olduğu bildirilmiştir (291). Diğer TRPC ler lantan ile inhibe olurken, ekstraselüler lantanın (La 3+ ) mikromolar konsantrasyonları TRPC4 kanalını aktive etmektedir (273). 52

66 TRPC5 TRPC5 proteini esas olarak beyinde eksprese olmakla birlikte pulmoner arterlerin düz kas hücrelerinde TRPC5 mrna ekspresyonuna dair tartışmalı bulgular bildirilmiştir (194,224,333,335,349). Bununla beraber TRPC5 antikorları ile düz kasta TRPC5 proteininin varlığı gösterilmiştir. Ayrıca TRPC5 proteinin antikorla inhibe edilmesi sonucunda arteriyollerde SOC girişinin inhibe edildiği bildirilmiştir.(343). TRPC5 kanallarının membranın altındaki havuzda depolandığı ve büyüme faktörleri ile stimulasyona yanıt olarak hızla membrana hareket ettiği önerilmiştir (26). TRPC5 homomerlerinin oluşturduğu kanallar ile TRPC1-TRPC5 heteromultimer kanalların akımları birbirinden farklı olması TRPC1 kanallarının TRPC4 ve TRPC5 in düz kastaki selektif olmayan katyon kanalı işlevlerinde yardımcı bir rol oynadıklarını düşündürmektedir (296). TRPC4 e benzer şekilde TRPC5 PLC (273) aracılığı ile La 3+ ya da gadoliniumun (Gd 3+ ) ekstraselüler mikromolar konsantrasyonları ile (151,352) aktive olmaktadır. TRPC5 NHERF ile etkileşir (232) ve santral sinir sisteminde (SSS) özellikle beynin gelişimi için önemli olan heteromerik katyon kanalı oluşturmak üzere TRPC1 ile etkileşir (296,297). Nöronlarda TRPC5 sinoptotagmin ve nöronal transport için kanalın veziküle yüklenmesini sağlayan fosfoprotein statmin ile ilişkilidir (105) TRPC6 TRPC6 mrna ilk olarak fare beyninden izole edilmiş (31) ve insan plasentasından klonlanmıştır (130). Northern blot analizleri TRPC6 nın en çok akciğerde eksprese edildiğini göstermektedir (31). Sıçan akciğerinden amino ucu daha kısa olan 3 splice varyantı klonlanmıştır (356). TRPC6 DAG-duyarlı reseptör 53

67 aracılı depo-bağımsız bir katyon kanalıdır (130). TRPC6 kanalları hücre membranının altındaki veziküllerde tutulur ve reseptör aktivasyonuna yanıt olarak hızla hücre membranına taşınır (49). TRPC6 kanalının damar ve pulmoner düz kas hücrelerinde önemli rolü olduğunu gösteren birçok çalışma bulunmaktadır. Antisense oligonükleotidler kullanılarak düz kasta TRPC6 geninin susturulduğu bir çalışmada TRPC6 kanalının vasküler α 1 -adrenerjik reseptörlerin aktive ettiği Ca +2 kanallarının önemli bir komponenti olduğu gösterilmiştir (141). Aort düz kas hücresi A7r5 hücre hatlarında TRPC6 vazopresin, serotonin (5-HT) ve PDGF (trombosit-kaynaklı büyüme faktörü, platelet-derives growth factor) ile aktive olan kalsiyum kanallarını oluşturmaktadır (152). Ayrıca, TRPC6, Bayliss etkisi olarak bilinen damar için basıncın neden olduğu depolarizasyonda ve küçük arter ve arteriyollerin kasılmasında da önemli bir rol oynamaktadır (338). Membran depolarizasyonunu takiben VOC kanallarının aktivasyonu sonucunda rezistan arterlerde kasılma meydana gelir. TRPC6-yoksun farelerde TRPC6 fonksiyon kaybının havayolu ve damar düz kas tonusunda azalma ile birlikte azalmış hava yolu kontraktilitesi ve hipotansiyon oluşturması beklenirken, bronkokonstriktör uygulanan hava yolu düz kasında hiperaktivite ve izole trakea ve aort halkalarında daha yüksek agonist-aracılı kontraksiyon ve NO sentaz inhibitörü ile daha da artan yükselmiş sistemik kan basıncı gözlenmiştir (75,77). Bu etkiler TRPC3 tipi kanalların TRPC6 kanallarının yerine geçmesi ile açıklanabilir. Buna göre yapısal olarak aktif TRPC3 kanalları bazal ve agonist-aracılı Ca +2 girişini artırarak düz kas kontraktilitesini artırmıştır (75,77). Çoğu düz kas hücresinde TRPC3 ve TRPC6 proteinlerinin ekspresyon paternlerinin çakışıyor olması (16) düz 54

68 kasa reseptör-aracılı Ca +2 girişinde TRPC3/TRPC6 heterotetramerik kanal kompleksinin rol oynadığını düşündürmektedir (108) TRPC7 TRPC7 ilk defa fare beyninden klonlanmış ve HEK293 hücrelerinde heterolog olarak eksprese ettirilmesinden sonra fonksiyonu araştırılmıştır (235). TRPC7 reseptör uyarılması sonrası DAG ile aktive olan selektif olmayan bir kanaldır. Buna karşılık endojen olarak eksprese olmadığı HEK293 hücrelerindeki TRPC7 aşırı ekspresyonu SOC aktivitesine neden olmuştur (260). TRPC7 kalp, göz ve akciğerde eksprese olurken daha düşük düzeylerde beyin, testis ve dalakta eksprese olmaktadır (235). Henüz fizyolojik fonksiyonuna yönelik bir veri ve TRPC7-yoksun fare modeli bulunmamaktadır (74) TRPV Kanalları Memelilerde altı üyeye sahip TRPV (vanilloid) ailesi 4 alt gruba ayrılmaktadır: TRPV1/TRPV2, TRPV3, TRPV4 ve TRP5/6 (18,110). TRPV ailesinin üyeleri tetramerik kompleks olarak işlev göstermektedir. TRPV kanallarının tümü 3-5 NH 2 - ucu ankyrin tekrarlarına sahiptir (243). TRP ailesinin en yüksek Ca +2 selektif kanalları TRPV5 ve TRPV6 kanallarıdır ve bu kanallar [Ca +2 ] i ile düzenlenmektedir (229). Bu iki kanal fizyolojik koşullar altında kalsiyumu iletirken, ekstraselüler kalsiyumun yokluğunda tek değerli katyonları iletir. TRPV1-yoksun farelerle yapılan çalışmalarda bu kanalın ağrı ve ısı uyaranlarına yanıt oluşturulmasına aracılık ettiği gösterilmiştir (48). Bu kanalın inflamasyon, astım ve pankreatit gibi hastalıklarda rol oynadığı düşünülmektedir (171,223). Sıcaklığa duyarlı bu kanallar sadece periferdeki 55

69 nöron ve sensör liflerinde değil deride de bulunmaktadır (56,215). TRPV2 gerilim ile aktive olan bir kanaldır ve damar düz kasında mekanosensör olarak işlev göstermektedir (16). TRPV2 olasılıkla iskelet kası ve kalp kasının dejenerasyonu ve ağrı yolağında da rol oynamaktadır (145). TRPV4 ün fizyolojik fonksiyonları arasında santral ve periferal termoduyarlık, mekanoduyarlık (endotel hücrelerinin shear strese yanıtı gibi), osmoduyarlık ve bazal Ca +2 homeostazı yer almaktadır (230,231). TRPV5 böbrekte Ca +2 reabsorbsiyonu için önemli iken TRPV6 barsakta önemlidir (70) TRPM Kanalları TRPM ailesi (Melastatin) üyeleri dizi benzerliklerine göre 4 gruba ayrılmaktadır: TRPM1/3, TRPM2/8, TRPM4/5 ve TRPM6/7. TRPM4 ve 5 kanalları Ca +2 geçirgen değilken, TRPM6 ve 7 Ca +2 ve magnezyuma yüksek geçirgenlik gösterir. TRPC ve TRPV kanallarının aksine TRPM kanalları ankyrin tekrarları içermez (243). Melanoma hücrelerinde ekspresyonu azalan TRPM1 proteini (melastatin) tümör baskılayıcı protein olarak düşünülmektedir. Melanoma gelişimi ile melastatin ekspresyonu arasında ters bir korelasyon bulunmaktadır (81,201). TRPM1 kanalı için henüz bir aktivatör gösterilmemiştir. TRPM1 kanalının yapısal olarak aktif bir Ca +2 giriş kanalı olduğu önerilmiştir (342). 56

70 TRPM2 en çok beyinde eksprese olurken çeşitli periferal hücre tiplerinde bulunmaktadır (160). TRPM2 nin oksidatif stres/reaktif oksijen türleri, TNF-α aracılı Ca +2 girişi ve hücre ölümünde de rol oynadığı önerilmektedir (114). TRPM3 ekspresyonu böbrek, beyin, testis ve omirilikte gösterilmiştir (106,170). TRPM3 kanalları endojen muskarinik reseptör aktivasyonu ve ekstraselüler osmolaritedeki azalma ile aktive olmaktadır, ayrıca SOC kanalı olabileceğine dair yorumlar da bulunmaktadır (106,170). TRPM4 en çok kalp, pankreas, plasentada, TRPM5 dil, akciğer, testis, sindirim sistemi ve beyinde eksprese olmaktadır (323). Ayrıca dildeki tat reseptör hücrelerindeki TRPM5 kanallarının tatlı, amino asit ve keskin tadın iletimi için gerekli oldukları gösterilmiştir (360). Hücre içi Ca +2 konsantrasyonundaki artışla aktive olan tek TRP kanalları TRPM4 ve TRPM5 kanallarıdır (227). TRPM6 ve TRPM7 nin Mg +2 homeostazında rol oynamak gibi önemli işlevleri bulunmaktadır (210). TRPM6 nın Mg +2 homeostazındaki görevi ile uyumlu olarak hücre içi Mg +2 konsantrasyonundaki azalma kanalı aktive eder (330). TRPM7 nöronal hücre ölümü (1) ve hücre döngüsünün regülasyonunda da rol oynamaktadır (307). TRPM8 in ilk olarak prostatta belirlenmesiyle birlikte duyu nöronlarında da yüksek ekspresyonu gösterilmiştir (57). TRPM8 kanalının esas olarak duyu nöronlarında ısı algılanmasından sorumlu olduğu düşünülmektedir. TRPM8 ayrıca androjenlerle düzenlenmektedir ve prostat epitelyum hücrelerinde Ca +2 homeostazı 57

71 için önemli olduğu önerilmiştir (354). TRPM8 proteininin prostat kanseri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (320,355). Tsaveler ve arkadaşları, TRPM8 proteininin benign prostat hiperplazi ve prostat karsinoma hücrelerinde yüksek, normal prostat epitelyum hücrelerinde düşük düzeyde eksprese olduğunu göstermiştir (320). Daha sonra ise anti-androjen tedavinin TRPM8 ekspresyonunu azalttığı gözlenmiştir (124). Total serum prostat spesifik antijen (PSA) konsantrasyonu gri-bölge de (grey-zone) olan hastalardan alınan malign doku örneklerinde TRPM8 mrna düzeyinin belirgin derecede artmış olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle total PSA nın gri-bölgede olduğu şüpheli durumlarda tedavi kararlarının verilmesini kolaylaştırmak amacı ile biyopsi örneklerinde prostat kanserinin ayrımsal olarak teşhisi için TRPM8 ekspresyonunun belirlenmesi gerekli olabilir (100,355). Ayrıca normal insan dokularında TRPM8 mrna sı az ya da hiç belirlenemezken göğüs, akciğer, kolon ve deri tümörlerinde eksprese oldukları gösterilmiştir (320) TRPML Kanalları TRPML (mukolipin) ailesi 3 üyeden oluşmaktadır: TRPML1-3. TRPML proteinleri nispeten daha küçük (600 kalıntıdan daha az) proteinlerdir ve diğer TRP ailelelerine daha az dizi benzerliği göstermektedir (211,243). TRPML1 ya da mukolipin geninin mutant ürünlerinin lizozomal depo hastalığı mukolipidozis tip IV den sorumlu olduğu belirlenmiştir (8,300). Lizozomal Ca +2 düzeylerinin TRPML1 aracılığı ile kontrolü lizozomun oluşumu ve döngüsünde önemli rol oynamaktadır (251). TRPML1 düşük ph da 58

72 inhibe olurken, mukolipidozisin neden olduğu mutasyonlar akımın ph aracılığı ile inhibisyonunu önler (251). TRPML2 ve TRPML3 kanalları tam olarak karakterize edilememişlerdir. TRPML3 saç hücresinin olgunlaşması ve hücre içi vezikül transportu için önemlidir (73). TRPML3 mutasyonları varitint-waddler (Va) fare fenotipinden sorumludur ve erken dönemde başlayan işitme kaybı, vestibüler defekt, pigmentasyon anomalileri, perinatal ölümlerle ilişkilidir (Palma Di F, Kim H, V99, 2002).TRPML3 ün hangi mekanizma ile işitme ve pigmentasyon düzenlenmesini etkilediği bilinmemektedir. TRPML3 e benzer şekilde TRPML2 de Va allelinden sorumludur Ayrıca kalıtımsal ve sporadic neurosensory hastalıkları için aday bir gen olarak önerilmektedir (73) TRPP Kanalları TRPP (polisistin) ailesi yapısal olarak 2 gruba ayrılmaktadır, 1) polikistik böbrek hastalığı (polycystic kidney disease 1, PKD1, TRPP1)-benzeri proteinler, PKD1/TRPP1, PKDREJ, PKD1L1, PKD1L2 ve PKD1L3, 2) polikistik böbrek hastalığı 2 (PKD2, TRPP2)-benzeri proteinler, PKD/TRPP2, PKD2L1/TRPP3 ve PKD2L2/TRPP5 (68,216). TRPP2 otozomal polikistik böbrek hastalığında (autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD) mutasyona uğramış gen ürünü olarak keşfedildi (208). TRPP2 TRPP1 kanalı ile işlevsel polisistin kompleksi oluşturmasını sağlayan coiled-coil motifi taşımaktadır (68). TRPP2 motile ve primary cilia (silia)da bulunmaktadır (68). Nodal siliar (ciliary) hareketi gelişim süresince doğru organ 59

73 lokalizasyonu için çok önemlidir. TRPP2 yoksun fareler sağ/sol asimetri bozuklukları göstermektedir (244). TRPP1 ve TRPP2 genlerindeki mutasyonlar otozomal dominant böbrek hastalığına neden olmaktadır. TRPP2 deki mutasyonların hangi mekanizma ile ADPKD ile sonuçlandığı henüz tam anlaşılamamış olsa da, bu mutasyon olasılıkla böbrekteki akışa duyarlığın bozulması ile ilişkilidir (68). TRPP2 böbrek, kalp ve iskelet kasının gelişimine de katkıda bulunur. Ayrıca bir hücre içi kanalı olarak etki gösterir ve fertilizasyonda rol oynar (228). TRPP5 testislerde eksprese olur ve burada Ca +2 geçirgen kanal olarak fertilizasyonda rol oynadığı önerilmiştir (111) TRPA Kanalları TRPA ailesinin tek memeli üyesi TRPA1 proteinidir. TRPA1 proteini saç hücrelerinde, DRG ve TG nöronlarında eksprese olmaktadır (294). TRPA1 kanalı N- terminalinde 14 ankyrin tekrarı taşımaktadır. TRPA1 ağrı, ısı ve mekanik uyarıların algılanmasında rol oynamaktadır (196,331) TRPN Kanalları Bu aile sadece C. elegans, Drosophila ve zebra fish de bulunur (63). Drosophila TRPN1 no mechanoreceptor potential C, NOMPC olarak isimlendirilmiştir, bu nedenle bu ailenin ismi TRPN dir (332). TRPN kanalları da TRPA1 kanalları gibi N-uçlarında çok sayıda ankyrin tekrarları taşır (281). Mekanik uyarılara duyarlı kanal olarak görev yapar. (139) 60

74 1.4. YAŞLANMA ve DAMAR SİSTEMİ Gelişmiş ülkelerde yaşlanma, 28 yaş sonrasında ölüm ve hastalıklar açısından en önemli risk faktörünü oluşturmaktadır. Artmış vasküler oksidatif stres ve sonuç olarak NO, anjiyotensin II ve endotelin gibi endotel-kaynaklı moleküllerin anormal aktivitesi, lipid düzeyleri, diyabet, hareketsiz yaşam tarzı ve genetik faktörler kardiyovasküler hastalıkların başlangıç ve gelişiminde rol oynamaktadır (11). Hipertansiyon, koroner kalp hastalığı, konjestiv kalp yetmezliği, felç gibi hastalıkların görülme sıklığı ve olasılığı yaşın ilerlemesi ile birlikte artmaktadır (221). Yaşlanma sadece vasküler hastalıkların gelişmesine neden olmaz, aynı zamanda glomerülosklerozis (61), metabolik değişiklikler, vücut kütle indeksinde artış, insüline direnç gelişimi ve/veya diyabet, lipid metabolizma bozuklukları gibi hastalıklara da neden olmaktadır (351). Hipertansiyon olasılığının yaşlılarda daha fazla olması kronik böbrek yetmezliğinde görülen artmış Na + duyarlığı ve sempatik sinir sistem aktivasyonu (237), steroid-olmayan anti-inflamatuvar ilaçlar gibi belirli ilaçlara karşı anormal yanıtlar oluşması gibi durumlarla ilişkili olabilir (220). Bununla birlikte yaşa-bağlı hastalıkların patojenezi böbrek, damar ve kan hücrelerinde yerel hücresel değişiklikleri de içerdiği için bu hastalıkların nedenleri daha karmaşıktır (35) Yapısal Değişiklikler Yaşlanma ile birlikte geniş arterlerin yüzeylerinde pürüzler, lümende genişleme, özellikle intima ve medya tabakaları olmak üzere damar duvarlarında kalınlaşma meydana gelir (92). Sağlıklı yaşlı arterlerde endotelyal lezyonlar ve kesintiler gözlenmezken, endotel hücreleri düzensiz yapıda olabilir ve endotel 61

75 tabakanın alt bölgesine doğru damar düz kas hücrelerininin proliferasyonu ve/veya göçü, kollajen, elastin ve proteoglikanların birikimi, makrofaj ve lökositlerin sayısında artış meydana gelebilmektedir. Adezyon molekülleri, matriks metalloproteinazlar, transforming büyüme faktörü-β gibi inflamatuvar ve/veya aterosklerotik süreçlerde rol oynayan maddeler ve inflamatuvar öncüsü sitokinlerin miktarlarında artış gözlenmektedir (92). Yaşlı sıçanlara ait aort medya tabakasındaki düz kas hücreleri genç sıçanlara göre daha büyüktür. Medya tabakasında yaşlanma ile birlikte fibronektin ve tip-2 matriks metalloproteazlar gibi ekstraselüler matriks proteinler çöker ve bu olay damar düz kas hücrelerinin intima tabakasına göçünü kolaylaştırır (221). Arteryal kan damarlarının lümene bakan yüzeyini endotel hücreleri oluşturur. Endotel hücreleri damar tonusu, damar geçirgenliği, anjiyojenez ve inflamasyon yanıtlarının oluşumunda önemli rol oynamaktadır (221). Sağlıklı koşullarda, endotel hücreleri sürekli olarak pıhtılaşma, trombosit fonksiyonu, damar dinamiği, vasküler gelişim ve inflamasyon kontrolünde rol oynayan vazoaktif ve trofik maddeler oluşturur. Bu maddeler arasında prostasiklin, NO, endotelyum-kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF), süperoksid anyonları (O - 2 ), anjiyotensin II, endotelin-1 (ET1) ve endoperoksidler bulunmaktadır (183,184). Yaşlanma özellikle kalp-damar sistemindeki değişikliklerle (damar duvarı düzeyinde) ilişkilidir. Arterlerde medya tabakasında kalınlaşma, düz kas hücrelerinin sayı ve kollajen içeriğinde artış ve bunlara bağlı olarak arterde sertleşme meydana gelir (101,217). Yaşa-bağlı olarak arter duvarlarının kalınlaşması damar sertliği ile birlikte görülmektedir. Arter duvarının kasılma ve gevşeme döngülerinin tekrarları 62

76 elastinin tükenmesine ve kollajenin depolanmasına neden olmaktadır. Damar sertliği belirli gen polimorfizmi varlığında daha da şiddetlenebilir (221). Damarlarda meydana gelen bu değişiklikler daha ileri düzeyde periferik sistolik kan basıncı ve nabız basıncında artışa neden olur (221). Endotelyal düzeyde ise endotelyumda kalınlaşma ve tek çekirdekli hücrelerin varlığı bildirilmiştir (193). Lipid-yüklü makrofajların (269) depolandığı endotel hücrelerinden oluşan erken dönem ateroskleroz plakları aortta belirlenebilir. Bu plaklar hiperkolesterolemi ile daha da ilerler (222). Damar endotel hücre hasarı aterojenezde önemli bir basamaktır (269). Sağlıklı koşullarda sağlam endotel hücreler damarları aterosklerozdan korumaktadır. ET-1 gibi endotelyal faktörlerin de deneysel ateroskleroz oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir (184). Bu nedenle yaşlanma süresince bu mediyatörlerin üretim ve aktivitesinde bir değişiklik olması halinde hastalık gelişmesi beklenmektedir. Kısa-ömürlü bir gaz molekülü olan NO en önemli endojen vazodilatördür. Ayrıca anti-agregan ve anti-inflamatuvar özelliklere sahiptir (137). NO nun O - 2 ile reaksiyona girmesi sonucunda NO biyoaktivitesi azalır ve hücre için toksik peroksinitrit oluşur (113). Normalde ateroskleroza dirençli olan sıçanlarda yaşlanma ile birlikte bazal ve uyarılmış NO biyoaktivitesinde belirgin bir azalma belirlenmiştir (12,321). Sıçan koroner arterlerinde endotelyum-bağımlı yolakların işlevlerinde de bozukluklar gözlenmiştir (103). İnsan üst kol arteri brakiyal (brachial) arterde de endotelyum-bağımlı gevşeme yanıtlarında azalma bildirilmiştir (304). Yaşla ilişkili olarak NO biyoaktivitesindeki azalma NO sentazın inflamatuvar izoformu olan NOS2 nin ekspresyonunda (66,103), O 2 - oluşumunda ve NADPH oksidaz aktivitesindeki artışla ilişkilidir (66,112). Sonuç olarak, vasküler peroksinitrit oluşumu artar ve vasküler proteinlerde işlevsel değişiklikler ile nitrozilasyona neden 63

77 olur (66,113). Yaşlanma ile birlikte L-arjinin/NO yolağında da değişiklikler meydana gelmektedir. Bu gözlemler ayrıca dolaşımdaki NO metabolitlerinde azalma (259), bazal NO salıverilmesinde değişiklikler (12,128) ve renal NO metabolit atılımında azalmayı da kapsamaktadır (128). Vasküler endotelyal büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor, VEGF) gibi diğer endotelyal faktörler de yaşa-bağlı değişiklikler arasındadır ve bu faktörler NO-bağımlı olarak düzenlenmektedir. Deneysel veriler VEGF varlığında yeni damarların oluşumu (anjiyojenez) aracılığı ile gerçekleşen doku tamirinin de yaşlı farelerde bozulduğunu düşündürmektedir (262,263) Hücresel Yaşlanma Günümüzde telomer uzunluğu hücre yaşının belirlenmesinde doku-spesifik biyolojik işaret olarak kabul edilmektedir. Telomerler kromozomların ucunda bulunan özelleşmiş yapılardır. Telomeraz ters (reverse) transkriptaz enzimi ile korunmadığı sürece her replikasyon sonrasında telomer boyu kısalır. Yarı-korunmuş DNA replikasyonunun bir sonucu olarak kromozomların uçları tamamen kopyalanmaz. Bunun sonucunda her hücre bölünmesi ile telomerlerin boyu kısalır. Telomer kısalması insan somatik hücrelerinin sınırsız proliferasyonunu önlemektedir (203). Telomer uzunluğu kritik bir uzunluğa geldiğinde artık hücre için daha fazla replikasyon mümkün değildir ve hücre yaşlı hale gelir. Telomer uzunluğu ve ilyak arter, ven ve abdominal aort endotel hücrelerininin kronolojik yaşı arasında ters orantılı bir ilişki bulunmaktadır (221). Telomeraz kendi RNA sını kalıp olarak kullanarak kromozomların uçlarına telomerleri ekleyen reverse transkriptaz etkili 64

78 bir ribonükleoproteindir. Bu konuda yapılan ilk çalışmalarda telomeraz aktivitesi normal somatik hücrelerinde değil kanser ve kök hücrelerinde saptandığı için telomeraz aktivitesinin tümör gelişimi ve kök hücrelerin kendilerini yenilemeleri için gerekli olduğu önerilmekteydi. Fakat günümüzde telomeraz aktivitesinin telomer uzunluğuna bağlı ya da telomer uzunluğundan bağımsız mekanizmalar ile normal somatik hücrelerde hücre proliferasyonunu düzenlediği düşünülmektedir. İnsan endotel hücreleri ve damar düz kas hücreleri PKC-bağımlı yolak aracılığı ile (mitojenik uyarı varlığında aktive olan) telomeraz aktivitesi göstermektedir. Fakat bu aktivite telomeraz enziminin yaşlanma ile birlikte ekspresyonunun düşmesi nedeni ile azalmaktadır ve sonuç olarak telomer kısalır ve hücre yaşlanır (203). Hücrenin yaşlanmasına çeşitli stres türleri de neden olmaktadır (43). Hücreler DNA hasarı ile yaşlanma sürecine girmektedirler (181). Hücreler kanser öncü genleri ya da tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu değiştiren kromatin organizasyonundaki epigenetik değişikliklere yanıt olarak da yaşlanma sürecine girebilir. Oksidatif stres, DNA hasarı damar hücrelerinde yaşlanmayı hızlandırarak daha ileri düzeyde aterojeneze neden olabilmektedir (191). Telomer kısalması internal meme arterlerine kıyasla ilyak arter endotelinde daha hızlı oluşmaktadır (51). Yüksel hemodinamik stres düzeyleri endotel hücre turnover hızını artırmaktadır. Koroner kalp hastalığı olan kişilerden alınan koroner arter endotel hücrelerinde telomer kısalmasının daha ileri düzeyde olduğu bildirilmiştir (234). Kalp krizi riski kısa telomerli kişilerde yaklaşık 2-3 kat daha fazladır (271). Ayrıca lökositlerdeki telomer kısalması ya da düşük telomeraz aktivitesinin kalp hastlıkları, sigara, diyabet, fizyolojik stres, insülin direnci ve yüksek tansiyon ile ilişkili olabileceği 65

79 bildirilmiştir. Telomer bütünlüğünün bozulmasının endotel fonksiyon bozukluğuna neden olabileceği in vitro çalışmalarla gösterilmiştir (203). Hücre yaşlanmasında birbirinden farklı uyaranlar etkili olsa da, bunlar genelde hücresel yaşlanmanın başlangıç ve devamında rol oynayan iki yolağın her ikisi ya da birinde birleşirler. Bu yolaklar p53 ve prb tümör baskılayıcı proteinler ile düzenlenir (42,181). p53 ve prb proteinleri transkripsiyonel düzenleyicilerdir ve DNA tamiri, hücre ölümü ve hücre döngüsünün düzenlenmesinden sorumludurlar (279). Fonksiyonu bozulmuş telomerler hasarlı DNA ya benzerler ve bu nedenle p53- bağımlı yanıtı tetiklerler (125) İşlevsel Değişiklikler Yaşlanma süresince damarların elastik yapısındaki azalmaya neden olan damar sertliği sadece damar düz kasının yapısal özelliklerini değil tonusunun salgısal ve endotelyal regülasyonunu da etkilemektedir. Yaşlı damarlarda artmış endotelyal geçirgenlik ve azalmış NO-bağımlı vazodilatör yanıtlar gözlenmektedir (92). Ayrıca β 2 -adrenerjik reseptör-aracılı agonist yanıtları da yaşlanma ile birlikte (reseptörlerin sayı ve afinitelerindeki azalma nedeni ile) azalmaktadır. Yukarıda belirtilen yaşabağlı fonksiyonel değişiklikler aterosklerozu olmayan normal tansiyonlu yaşlı hastalarda gözlenmesine rağmen, bu değişikliklerin çoğu aterosklerotik damarlarda da bulunmaktadır. Yaşlı damarlarda aterosklerotik damarlardaki gibi damar sertliği gözlenirken, fokal lezyonlar, damar daralması ve plak yırtılması gibi olaylar 66

80 meydana gelmemektedir. Yaşlanma ve aterosklerozis birbirine oldukça benzeyen biyokimyasal yolaklar sonucu oluşmaktadır. Yaşlanan damar yapısı ateroskleroz hastalığın erken dönemlerinde damarda meydana gelen değişiklikler gibi görünmektedir. Birçok çalışma fonksiyonel düzeyde noradrenalin (12) ve ET-1 (12,78) gibi agonistlere yanıt oluşturan vazokonstriktör mekanizmalarda yaşlanmaya bağlı olarak değişiklikler göstermişlerdir. Endotelyumun vazodilatör işlevinin azalması ve düz kas hücrelerindeki değişikliklerin her ikisi birden damar vazokonstriktör aktivitedeki değişikliklere neden olabilir. Ayrıca birçok klinik ve deneysel çalışma yaşlanma ile birlikte endotel fonksiyon bozukluğu meydana geldiğini bildirmiştir. ACh muskarinik reseptörleri aktive ederek gevşeme yanıtlarına neden olmaktadır. Endotelyumdaki muskarinik (M3) reseptörlerin aktivasyonu sonucunda [Ca +2 ] i artar. Endotelyumdaki [Ca +2 ] i artışı nitrik oksit sentazı stimüle ederek NO sentez ve salıverilmesine neden olur. NO nun yanında endotelyumdan prostasiklin ve EDHF de salıverilir. Endotelyumdan salıverilen bu gevşetici faktörler damar düz kasında gevşemeye neden olur. Aort gibi conduit arterlerinde NO daha baskınken EDHF rezistans arterlerde daha önemlidir (53,209). Deneysel çalışmalar ACh nin endotelyuma-bağımlı gevşeme yanıtlarının yaşlı sıçan aortasında belirgin derecede azaldığını gösterirken, femoral (12) ya da mezenterik arter (298) gibi belirli damarlarda yanıtların değişmediğini göstermiştir. Benzer heterojen sonuçlar yaşlı sıçan aortu ve üst (superior) mezenterik arter arasında siklooksijenaz izoenzimlerinin ekspresyonu konusunda da belirlenmiştir (127). Bu deneysel bulgu damar yaşlanmasında sadece mediyatör aktivitesi değil transkripsiyonel düzeyde enzimlerin düzenlenmesinin de bölgesel olarak farklılık gösterdiğini düşündürmektedir. Ayrıca 67

81 yaşlanmaya bağlı endotelyal gevşeme yanıtlarındaki azalma tüm tür ve bu türlerin her neslinde gözlenmemektedir. İnternal meme arteri ve radyal arter gibi belirli arterlerde yüksek yaşa rağmen ateroskleroz nadiren gelişir. Yaşlı sıçanlarda antioksidan enzim süperoksid dismutaz aktivitesinin ise değişmediği gösterilmiştir (12). Bozulmuş NO biyoaktivitesine ilaveten, anjiyotensin II, ET-1 (13), prostaglandin H 2 /tromboksan A 2 gibi kastırıcı ajanların damar aktivitelerinde ve prostaglandin H sentaz enzim ekspresyonundaki artış da yaşlanma ile birlikte gözlenir (127,293). ET-1 sadece damar dinamiğinde değişiklik oluşturmaktan değil aynı zamanda yaşa bağlı olarak gelişen patolojik süreçlerden de sorumludur (5). Hipertansiyon yokluğunda yaşlanma renal endotelin ekspresyonunu artırmaktadır (13,103). Laboratuvarımızdaki bulgularımız SERCA inhibisyonu sırasında endotelin reseptör yanıtlarının selektif ET A reseptör antagonisti tarafından geri çevrilememesi (318) SOC girişinden sorumlu TRPC proteinlerinin yaşlanmayla beraber hipertansiyon gibi vazospastik olguların artışında işlevi olduğunu düşündürmektedir. SOC girişine aracılık eden TRPC üyelerinin artışı var olan vasospazmı ilerletecektir. Bu çalışma bu yönüyle yaşlanmaya bağlı gelişen hipertansiyon oluşumunda TRPC lerin olası katkısını öneren ilk çalışma niteliğini taşımaktadır. 68

82 2. GEREÇ VE YÖNTEM Dokulardan RNA ve protein izolasyonu, cdna sentezi ve immünohistokimyasal (IHC) analizler için örneklerin toplanması Bilkent Üniversitesi Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik AD laboratuvarlarında, tüm kantitatif RT-PCR çalışmaları ise Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji AD laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Aynı seri Sprague-Dawley sıçanların izole organ banyosunda damar dokuları kullanılarak yapılan fonksiyonel çalışmalar, immünohistokimya, SDS-PAGE, western blot çalışmaları ve analizleri Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji AD laboratuvarında gerçekleştirilmiştir (Şekil 2.1) Hayvanlar Çalışmamızda Sprague-Dawley türü erkek sıçanlar (n=36) kullanıldı. Sıçanlar genç (8-16 haftalık), yetişkin (40-48 haftalık) ve yaşlı (64-80 haftalık) olmak üzere 3 gruba ayrıldı. Deney hayvanları Bilkent Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümünde çevresel koşulları kontrol altında tutulan (22 ºC, 12 saat gece-gündüz döngüsü sağlanmış) HEPA filtreli ve laminar akımlı özel odalarda yetiştirilmişlerdir. Tüm hayvanlara Ulusal Bilim Akademisi (National Academy of Science) tarafından hazırlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Rehberi kriterlerine göre muamele edilmiştir. 69

83 Torasik aort 3 yaş grubu Vasküler reaktivite RNA izolasyonu Protein izolasyonu Doku fiksasyonu cdna sentezi SDS-PAGE IHC RT-PCR WB Şekil 2.1: Genel çalışma şeması Vasküler Reaktivite Deneyleri Doku izolasyonu CO 2 ile asfikse edilerek öldürülen sıçanların torasik aortları dikkatli bir şekilde çıkarıldıktan sonra soğutulmuş ve gazlandırılmış fizyolojik tuzlu su (FTS) çözeltisine (Krebs-Ringer bikarbonat çözeltisi, mm içeriği: NaCl: 118; KCl: 4,73; MgSO 4 : 1,2; CaNa 2 EDTA: 0,026; NaH 2 PO4: 1,2; CaCl 2 : 2,5; NaHCO 3 : 25; glukoz: 11) alındı (318). Dış yüzeylerinde bulunan yağ ve bağ dokusu özenle temizlendikten sonra damarlar 3 mm lik halkalar halinde kesildi. Gerektiğinde damar lümeninden geçirilen Krebs ile ıslatılmış pamuk ipliğin intimal yüzeye nazikçe sürtülmesiyle dokular endotelsizleştirildi. Her bir damar halkası lümeninden geçirilen iki paslanmaz çelik tel aracılığı ile sıcaklığı 37 C de sabit tutulan ve karbojen gaz karışımı (%95 O 2 ve %5 CO 2 ) ile 70

84 gazlandırılan 25 ml Krebs çözeltisi içeren cam organ banyolarına takıldı. Üstteki çelik tel doğrudan ince öngerilim ayarına izin veren pozisyon-ayarlayıcıya monte edilmiş bir izometrik kuvvet ölçere (Force-displacement transducer, FDT 10-A Commat, Ankara) bağlandı. İzole organ banyo deneyleri Aort preparatı 45 dakika FTS içinde dengelenmesi için öngerilimsiz bırakıldı. Dokular bu süre boyunca her 15 dakikada bir (37 C) Krebs çözeltisi ile yıkandı. 45 dk sonunda, her bir doku 0,5 g lık (5 mn) artışlarla kademeli olarak sıçan aortu için daha önceden belirlenen optimum dinlenim gerilimi olan 2 g ye (20 mn) gerildi. Optimum gerilimdeki dokular deneye başlamadan önce 30 dk stabilizasyona bırakıldı. Stabilizasyon sonrası, dokular maksimum kasılma yanıtına ulaşana dek 100 mm KCl ile muamele edildi. Endoteli sağlam dokular 1 µm, endotelsiz dokular 300 nm fenilefrin (PE) ile iki kez uyarıldılar ve endotel yokluğu ikinci PE kasılma yanıtı üzerine ACh (1 µm) uygulanarak kontrol edildi. ACh gevşeme yanıtı %60 dan fazla olduğu durumda damarlar endoteli sağlam olarak kabul edildi. Tüm organ banyosu ölçümleri dijital bir veri kazanım sistemi (Biopac., ABD) ile izlenerek bilgisayara kaydedildi. mn cinsinden belirtilen gerilimler çapraz kesit alanına göre normalize edildi [Gerilim(mN)/ Çapraz kesit alanı (mm 2 )= Gerilimdeki değişimler x Damar halkasının çevre uzunluğu)/2 x Islak ağırlık] (318). Deneysel Protokol Endotelli damarlarda PE ( M) ile oluşturulan kasılma yanıtı platoya (yaklaşık 100 mm KCl yanıtının %80 i) ulaştığı zaman ACh ( M) ve CPA 71

85 ( M) uygulandı. Düz kasın NO duyarlığını test etmek amacıyla, endotelsiz damarlarda PE öngerilimi üzerine NO donörü (Sodyum nitropurisiyad, SNP, M) ile gevşeme yanıtları alındı. ACh ve CPA gevşeme yanıtları selektif olmayan COX inhibitörü indometazin (10-5 M) ve selektif COX-2 inhibitörü NS-398 (10-6 M) varlığında ya da yokluğunda oluşturuldu. Gevşetici ajanların yanıtları % PE öngerilimi ifade edilerek karşılaştırılacakları için bu ön-gerilimin her deneyde benzer düzeyde olmasına dikkat edildi. Bu amaçla daha önce belirlenen 100 mm KCl yanıtlarının %80 ini oluşturan PE konsantrasyonunda gevşetici ajanlar uygulandı. Bu anlamda PE-ön gerilimleri gruplar arasında karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır. α 1 -adrenerjik reseptör-aracılı kontraksiyon yanıtları endotelsiz dokularda kümülatif (eklenici) PE ( M) uygulanması ile elde edildi. PE maksimum % kasılma yanıtları 100 mm KCl yanıtlarına normalize edilmiştir Total RNA İzolasyonu ve Ters Transkripsiyon Servikal dislokasyon ile öldürülen sıçanlardan torasik aort izole edildi. Endotelyuma ait total RNA endoteli sağlam aort lümenininden 22-G iğne kullanılarak 1 ml Tripure RNA izolasyon çözeltisinin (Roche Applied Science) geçirilmesi ile elde edildi (282). Üç aorttan elde edilen endotelyal lizatlar (endotelyal örnekler) bir araya getirildi. Endoteli uzaklaştırılmış aortlar ise FTS içerisinde dış yüzeyinde bulunan yağ ve bağ dokuları temizlendikten sonra Tripure çözeltisi içerisinde homojenize edildi. Homojenizasyon buz içinde tutulan falkon tüplerinde gerçekleştirildi. RNA ları parçalayan RNAaz ları inhibe etmek amacıyla RNA izolasyonu sırasında kullanılan tüm cerrahi malzemeler RNase ZAP (Sigma) ile, FTS 72

86 ve diğer malzemeler (pipet ucu, falkon, eppendorf tüp vs.) dietilpirokarbonat (DEPC) içeren distile su (DS) ile etkileştirildi. Tripure solusyonunu üreten firmanın izolasyon protokolü kullanılarak damar düz kası ve endotelyum lizatlarından total RNA izolasyonu yapıldı. Toplanan RNA örneklerinin bütünlüğü agaroz jel elektroforezi yapılarak kontrol edildi. Örneklerin RNA konsantrasyonları (dilüsyonları) 260 nm (A 260 ) dalga boyundaki absorbanslarının ölçülmesi ile hesaplandı. Tripure RNA izolasyon protokolü: Her mg doku için 1 ml TriPure izolasyon çözeltisi (TriPure Isolation Reagent, TIR) polipropilen santrifüj tübüne alındı (15-25 C). Taze ya da dondurulmuş doku tüpe alındı ve homojenizatör yardımı ile homojenize edildi. Örnekler nükleoprotein komplekslerinin tamemen ayrılmasını sağlamak üzere 5 dk C de bekletildi. Her 1 ml TIR için 0,2 ml kloroform eklendi ve tüp şiddetli bir şekilde sn çalkalandı. 15 dk C de bekletildi. Çözeltiyi 3 faza ayırmak için +4 C de g de 40 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrasında en üstteki sulu faz yeni bir tüpe alındı. 0,5 ml izopropanol eklendi ve tüp birkaç sefer karıştırıldı. RNA çökmesi için 5-10 dk C de bekletildi ve örnekler +4 C de g de 10 dk santrifüj edildi. Üstteki faz atıldı ve 1 ml %75 etanol eklendi. RNA pelleti etanol içerisinde 2-3 sn vortekslenerek yıkandı. 73

87 Örnekler +4 C de 7500 g de 5 dk santrifüj edildi. Üstteki faz atıldı. RNA pelletinden kalan etanol hava ile uzaklaştırıldı ve DEPC ile etkileştirilmiş RNAaz içermeyen su içerisinde RNA pelleti çözüldü cdna Sentezi Total RNA örneklerinde RevertAid First Strand cdna Sentez kiti (MBI Fermentas) kullanılarak cdna örnekleri oluşturuldu. cdna sentez protokolü: cdna sentezi Thermal Cycler PCR cihazı (Techne Genius, İngiltere) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 8 µl RNA + 1 µl Primer (Random hekzamer) + 3 µl DEPC-H 2 O PCR tüpüne eklendi. Hızlı santrifüj edildi. 70 C de 5 dk bekletildi, buzda soğutuldu ve hızlı santrifüj edildi. 4 µl Reaksiyon tamponu + 1 µl RNaz inhibitörü + 2 µl dntp karışımı PCR tüpüne ilave edildi. 37 C de 5 dk bekletildi. Reaksiyon karışımına 1 µl ters transkriptaz (reverse transcriptase, RT) enzimi eklendi. Önce 42 C de 60 dk daha sonra 70 C de 10 dk bekletildi. 74

88 2.5. TRPC Genlerine Spesifik Primerlerin Belirlenmesi 1. Proje başlama tarihinde henüz sıçan genomu tamamlanmadığı için TRPC genlerine ait primerlerin belirlenmesi TRPC insan genine ait primerlerin modifiye edilmesi ile gerçekleştirildi. Hedeflenen genlerin (TRPC1,3-6) internet ortamındaki veri bankaları ve interaktif programlar aracılığı ile DNA, mrna ve protein dizileri bulundu. Bu amaçla kullanılan başlıca sitelerin adresleri aşağıdadır. ( ). 2. Bu adreslerde hedef genin kromozomal lokalizasyonu, genom, transkript, protein uzunluğu, fonksiyonlarına dair bilgiler, 3 boyutlu moleküler yapıları, ekzon-intron bölgeleri, mutasyon ve filogenetik bilgileri, yapıları, diğer türlere benzerliği, fizikokimyasal özellikleri hakkında bilgi, gen ile ilgili haritalandırılmış bilgiler ve referans yayınlara ulaşılabilmektedir. 3. İkinci aşama olarak primer dizilerimizin hedef genimize spesifik olup olmadığı araştırıldı. Bu amaçla ( ) internet adresinde nucleotide-nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool blastn) analizi yapılarak primerlerin hedef gen için ne kadar spesifik olduğu araştırıldı. 4. Primer dizisinin gende hangi bölgeyi hedeflediği kontrol edildi. Burada dikkat edilen konular primerin hedeflediği yani amplifiye edilen bölgenin (amplikon): intron içeren bir bölge olmaması türler arasında korunmuş bölgelere karşılık geliyor olması 75

89 kullanacağımız Light Cycler Real-Time PCR cihazı için uygun büyüklükte olması (150 bç-550 bç) gerekmektedir. Örnek: TRPC1 geni için araştırılan aşağıdaki primer dizisinin incelenmesi, İleri (forward, F): 5 TGG TAT GAA GGG TTG GAA GAC 3 Geri (reverse, R): 5 TGC TGT TCA CAG AAG ATG CC 3 İleri primer 5 3 yönünde aynen, geri primer dizisi 3 5 yönünde yazılıp komplementeri mrna dizisinde araştırıldı. Buna göre, R primer, GG CAT CTT CTG TGA ACA GCA halinde arandı (Şekil 2.2). TRPC1 mrna (NM_053558) 1 ctgcccccgt cctgggccgc gatgatggcg gccctgtacc cgagcacgga cctctctggc 61 gtctcctcct cctccctgcc ttcctcccca tcctcctcat cgcccaacga agtgatggcg 121 ctgaaggatg tgcgagaggt gaaggaggag aacaccttga atgagaagct tttcttgctg 181 gcgtgcgaca agggtgacta ttatatggtt aaaaagattt tggaggaaaa cagttcaggt 241 gacttgaaca taaattgcgt agatgtgctt gggagaaatg ctgttaccat aactattgaa 301 aacgaaagct tggatatact gcagctgctt ttggactacg gttgtcagaa acttatggaa 361 cgaattcaga atccggaata ctcaacaaca atggatgttg caccagttat tttagctgct 421 catcgtaaca actatgagat cctcacaatg cttctgaagc aggacgtggc tttgcccaag 481 ccccatgctg ttggctgtga atgcacgctg tgttctgcga aaaacaaaaa ggacagcctc 541 agacattcca ggtttcgtct tgatatctat agatgtctgg ccagtccagc tctaataatg 601 ttaacagagg aggatccaat tctgagagcg tttgaactta gtgctgactt aaaggaactc 661 agccttgtgg aggtggaatt ctggaatgac tatgaagagc tagcccgtca gtgcaaaatg 721 tttgctaaag atttgcttgc gcaagctcgg aattctcgtg aactggaagt tatcctaaac 781 catacatcta gtgatgagcc tcttgacaaa cgaggactac tagaagaaag aatgaattta 841 agtcgtctga aacttgctat caaatataac cagaaggagt ttgtctccca gtcaaattgc 901 cagcagttcc tgaacaccgt ttggttcgga cagatgtcag gttaccgccg taagcccacc 961 tgtaagaaga taatgactgt tttgacagtt ggcattttct ggccagttct gtcactgtgt 1021 tacttgatag ctcccaaatc tcaattcggc agaatcattc acacaccgtt catgaagttt 1081 attattcatg gagcttcata tttcacattc ttgctgttac tcaatctcta ctcacttgtc 1141 tacaatgagg acaagaaaaa tacaatgggg ccagcccttg agagaataga ctaccttctc 1201 atactgtgga ttattgggat gatttggtca gacattaaga ggctgtggta TGAAGGGTTG 1261 GAAGACttct tagaagaatc tcgtaaccag ctcagctttg ttatgaattc cctttacttg 1321 gcaacttttg ccctcaaagt ggtggctcac aacaagtttc atgattttgc cgaccggaag 1381 gactgggatg cgttccaccc cacactggta gcagaagggc ttttcgcctt tgcaaacgtt 1441 ctgagttacc ttcggctctt ctttatgtac acaaccagct ctattttggg cccactgcag 1501 atttcaatgg gacagatgtt acaagatttt gggaaatttc taggaatgtt ccttcttgtt 1561 ctgttttcct tcacgattgg actgacacag ctctatgaca aagggtacac ttccaaagag 1621 cagaaggact gcgtaggcat CTTCTGTGAA CAGCAaagca acgacacctt ccactcgttc 1681 attggcacct gctttgctct gttctggtac atcttctcct tagcgcatgt ggccatcttt 1741 gtcaccaggt ttagctatgg ggaagaactg cagtccttcg ttggggctgt gattgtcgga 1801 acttacaatg tcgtggttgt gatcgtgctt acaaagctac tggtagcgat gcttcataag 1861 agcttccagc tgatagcaaa tcatgaggat aaagaatgga agtttgctcg agcgaagcta 1921 tggctcagct actttgatga caaatgcaca ctgcccccac ctttcaacat cattccttct 1981 ccgaagacta tctgctatat gatcagcagc ctcagcaagt gggtgtgctc gcacacctcc 2041 aaaggcaagg tcagacggca gaacagcttg aaggagtgga gaaacttaaa acaaaagaga 2101 gatgagaact accagaaggt gatgtgctgc ctagtgcatc gatacctgac ctccatgcga 2161 cagaagatgc agagcacaga ccaagccacc gtggagaatc tcaatgaact gcgccaagat 2221 ctgtcaaaat tccgaaatga aataagggat ttgcttggct ttcggacttc taaatatgct F R 76

90 2281 atgttttatc ccaaaaatta gccattttct aaatcttgta gaaataattt tctttaataa 2341 atctgaaaga ctgtatttgc atacctttca attaaatcaa taagatatat atgggcataa 2401 acaattacac agaagccatt ctttaaatat ttatagcata aacatatgtt gtgtaaatat 2461 gtatatagag ctagtttttt aaaacctgtc tgtgactttt tgtagaagca aaaccatttt 2521 gttagcatgc tactttgttt tcttagttgg tcagtgctta cattcgacgt gtgtaagagg 2581 ggcagctctc agtgtacgca tggcccactc catttatacg cgaagatcag caaacgcggc 2641 taccttaaga cacacttgaa gagctcatgc tgttgaaatc tcttgtttta ggagttcaca 2701 cagagttcag tatatattgt ttaggagttt agcttcatct aaaataccct actttttctt 2761 ttgttagaat cttaagcagc agagaaaagt ttataataaa tatttgaatt taacccagtc 2821 atggtgatga atgcctttaa tcccagcact cgggaggcag aggcaggcag atctctgagt 2881 tcaaggtcag cctggtctac agagtgggtt ccaggatagc cccggctaca cagagaaacc 2941 ctgtcttgga aaaataaaaa acaacaaaaa aaaatttaaa ttatttattt atgtctatct 3001 aaattcacgt tggtatttgt tgtgtagtat atttactttt acatggttat aatttatatt 3061 tttaattttg ttttgacata acattatttt atatatattt ccctatatta aggtagttta 3121 tatgtttaaa tatttataga cgtctgtgaa ttttgaaaaa tagtagccat cttttaccca 3181 tagaatactt gtttctattt ataccctcgc agaggtacct cttaagcatt tggctaagtt 3241 tagcttttcc ttccaatttt tcaagttgga gtaaaactca tcgttacaaa gtagaagctg 3301 cttatcttca tgtgcggtca cagtgggctt ggccggagag cactgggcct tgcttgcaga 3361 aggctgcttt ccgttcactc caaggctctt gagctcctct tccaaagttt ctcccacaga 3421 gcctaccaca gcttctacaa aactggcctc gtgcttgcgg cttgagatgt aaagcattgt 3481 ttattcaatt tgaaaataaa aagaatttga ctgcttttca gtgttcatgt aaaggtggag 3541 ctgaaggttt ccccagctat ggcacagaca ttcctgcagc acgtttggtg agaaattacc 3601 ttcggaactg aacgtcagct ggcattgagg ccacagagtg cagacagccc tggtctgtga 3661 gcgccgccca ccccggggca gctgaagatc ccagtgtagg tttcatcttg ctttttgcat 3721 ttgtttttaa tgtcccaggt ttaagtgttc cctcttttgg gcaaattctt ataaaaatgt 3781 ttattgtaaa attatatatt ttgtctacaa tgggattatg cgcttccaag ttgatatttt 3841 acatcaggat ttttagtcat tctaaaaaaa atacctaatt attaaaaaat ttatagagta 3901 cctatgtgtg catgaattac tgacgaggta tattttgaat gacagcatat tgtaagaaaa 3961 gagtgaataa aatttggcat tagattataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa Şekil 2.2: Örnek bir mrna dizisi (TRPC1) Koyu, büyük ve altı çizili gösterilen nükleotidler ileri ve geri primerleri, italik gösterilen nükleotidler ise primerlerin çoğaltacağı bölgeleri göstermektedir. Bu örnekteki mrna dizisi içerisinde F ve R primerlerin hedeflediği bölgeler dikkate alındığında PCR ürününün uzunluğu 410 bç olacağı belirlendi. 5. PCR ürünümüzün dizisi belirlendikten sonra bu bölgenin dizisi farklı türler (sıçan, insan ve fare gibi) arasında karşılaştırılarak benzerlikleri araştırıldı. ( ) adresinde hedef bölgenin dizisi ilgili bölgeye kopyalandı, karşılaştırılmak istenen türler seçildi ve blast analizi yapıldı. Yaşlanma süresince TRPC 1, 3-6 genlerinin RNA ekspresyon düzeylerini 77

91 karşılaştıracağımız bölgenin türler arasında ne kadar korunmuş olduğu kontrol edildi. Korunmuşluğun yüksek olması bulgularımızı insana uyarlayabilmemizi sağlayacaktı. 6. RNA düzeyinde karşılaştırdığımız hedef bölgeyi amino asit (aa) düzeyinde de değerlendirebilmek için, TRPC proteini aa dizilerini de türler arasında karşılaştırmamız gerekmiştir. Bu amaçla Clustal W analizi yapılmıştır ( ) Clustal W DNA ya da proteinler için çoklu eşleştirme (multiple alignment) programıdır. Protein dizilerinin çoklu eşleştirilmeleri korunmuş bölgeler hakkında bilgi verirken aynı zamanda proteinlerin tahmin edilen yapı ve fonksiyonları açısından da önemli bilgiler sağlar. Ayrıca proteinin fonksiyonunu test eden çalışmalar ve protein ailelerine ait yeni üyelerin belirlenmesinde de önemli yararlar sağlamaktadır. Clustal W analizi ile hem TRPC proteinlerinin türler arasındaki benzerlik oranı hem de çalışmamızda hedeflenen bölgelerin türler arasında ne kadar benzer bir bölgeye karşılık geldiği kontrol edildi. TRPC proteinleri için Clustal W sonuçları kutu ve gölge (boxshade) formatında gösterildi ( ) (Şekil 2.3). 7. Primerler ile gerçekleştirilecek olan PCR sonucunda elde edilen ürünün gende hangi ekzonlar arasında bulunduğu belirlendikten sonra bu bölgenin aa dizisi olarak karşılığı saptandı ( ) (Şekil 2.4). Böylece PCR ürünümüzün proteinde hangi bölgelere karşılık geldiği belirlendi (membranı geçen bölgeler, hücre içi, hücre dışı ya da N-, C-ucu, iyon kanalını oluşturan bölgeler gibi, ) (Tablo ). 78

92 8. Ayrıca seçilen primerlerin birbirleri ile dimerleşme yapmadıkları Light Cycler Probe Design 2 software kullanılarak kontrol edildi. Sonuç olarak TRPC1, 3, 4, 5 ve 6 genleri için uygun olan primer dizileri sentez ettirildi (Thermo Elektron Corp., Almanya). 79

93 TRP1_HUMAN TRP1_MOUSE TRP1_RAT MMAALYPSTDLSGASSSSLPSSPSSSSPNEVMALKDVREVKEEN 1 MGAPPPSPGLPPSWAAMMAALYPSTDLSGVSSSSLPSSPSSSSPNEVMALKDVREVKEEN MMAALYPSTDLSGVSSSSLPSSPSSSSPNEVMALKDVREVKEEN TRP1_HUMAN TRP1_MOUSE TRP1_RAT 45 TLNEKLFLLACDKGDYYMVKKILEENSSGDLNINCVDVLGRNAVTITIENENLDILQLLL 61 TLNEKLFLLACDKGDYYMVKKILEENSSGDLNINCVDVLGRNAVTITIENESLDILQLLL 45 TLNEKLFLLACDKGDYYMVKKILEENSSGDLNINCVDVLGRNAVTITIENESLDILQLLL TRP1_HUMAN 105 DYGCQSADALLVAIDSEVVGAVDILLNHRPKRSSRPTIVKLMERIQNPEYSTTMDVAPVI TRP1_MOUSE 121 DYGCQSADALLVAIDSEVVGAVDILLNHRPKRSSRPTIVKLMERIQNPEYSTTMDVAPVI TRP1_RAT 105 DYGCQ KLMERIQNPEYSTTMDVAPVI TRP1_HUMAN 165 LAAHRNNYEILTMLLKQDVSLPKPHAVGCECTLCSAKNKKDSLRHSRFRLDIYRCLASPA TRP1_MOUSE 181 LAAHRNNYEILTMLLKQDVSLPKPHAVGCECTLCSAKNKKDSLRHSRFRLDIYRCLASPA TRP1_RAT 131 LAAHRNNYEILTMLLKQDVALPKPHAVGCECTLCSAKNKKDSLRHSRFRLDIYRCLASPA TRP1_HUMAN 225 LIMLTEEDPILRAFELSADLKELSLVEVEFRNDYEELARQCKMFAKDLLAQARNSRELEV TRP1_MOUSE 241 LIMLTEEDPILRAFELSADLKELSLVEVEFRNDYEELARQCKMFAKDLLAQARNSRELEV TRP1_RAT 191 LIMLTEEDPILRAFELSADLKELSLVEVEFWNDYEELARQCKMFAKDLLAQARNSRELEV TRP1_HUMAN 285 ILNHTSSDEPLDKRGLLEERMNLSRLKLAIKYNQKEFVSQSNCQQFLNTVWFGQMSGYRR TRP1_MOUSE 301 ILNHTSSDEPLDKRGLLEERMNLSRLKLAIKYNQKEFVSQSNCQQFLNTVWFGQMSGYRR TRP1_RAT 251 ILNHTSSDEPLDKRGLLEERMNLSRLKLAIKYNQKEFVSQSNCQQFLNTVWFGQMSGYRR TRP1_HUMAN 345 KPTCKKIMTVLTVGIFWPVLSLCYLIAPKSQFGRIIHTPFMKFIIHGASYFTFLLLLNLY TRP1_MOUSE 361 KPTCKKIMTVLTVGIFWPVLSLCYLIAPKSQFGRIIHTPFMKFIIHGASYFTFLLLLNLY TRP1_RAT 311 KPTCKKIMTVLTVGIFWPVLSLCYLIAPKSQFGRIIHTPFMKFIIHGASYFTFLLLLNLY TRP1_HUMAN 405 SLVYNEDKKNTMGPALERIDYLLILWIIGMIWSDIKRLWYEGLEDFLEESRNQLSFVMNS TRP1_MOUSE 421 SLVYNEDKKNTMGPALERIDYLLILWIIGMIWSDIKRLWYEGLEDFLEESRNQLSFVMNS TRP1_RAT 371 SLVYNEDKKNTMGPALERIDYLLILWIIGMIWSDIKRLWYEGLEDFLEESRNQLSFVMNS TRP1_HUMAN 465 LYLATFALKVVAHNKFHDFADRKDWDAFHPTLVAEGLFAFANVLSYLRLFFMYTTSSILG TRP1_MOUSE 481 LYLATFALKVVAHNKFHDFADRKDWDAFHPTLVAEGLFAFANVLSYLRLFFMYTTSSILG TRP1_RAT 431 LYLATFALKVVAHNKFHDFADRKDWDAFHPTLVAEGLFAFANVLSYLRLFFMYTTSSILG TRP1_HUMAN 525 PLQISMGQMLQDFGKFLGMFLLVLFSFTIGLTQLYDKGYTSKEQKDCVGIFCEQQSNDTF TRP1_MOUSE 541 PLQISMGQMLQDFGKFLGMFLLVLFSFTIGLTQLYDKGYTSKEQKDCVGIFCEQQSNDTF TRP1_RAT 491 PLQISMGQMLQDFGKFLGMFLLVLFSFTIGLTQLYDKGYTSKEQKDCVGIFCEQQSNDTF TRP1_HUMAN 585 HSFIGTCFALFWYIFSLAHVAIFVTRFSYGEELQSFVGAVIVGTYNVVVVIVLTKLLVAM TRP1_MOUSE 601 HSFIGTCFALFWYIFSLAHVAIFVTRFSYGEELQSFVGAVIVGTYNVVVVIVLTKLLVAM TRP1_RAT 551 HSFIGTCFALFWYIFSLAHVAIFVTRFSYGEELQSFVGAVIVGTYNVVVVIVLTKLLVAM TRP1_HUMAN 645 LHKSFQLIANHEDKEWKFARAKLWLSYFDDKCTLPPPFNIIPSPKTICYMISSLSKWICS TRP1_MOUSE 661 LHKSFQLIANHEDKEWKFARAKLWLSYFDDKCTLPPPFNIIPSPKTICYMISSLSKWICS TRP1_RAT 611 LHKSFQLIANHEDKEWKFARAKLWLSYFDDKCTLPPPFNIIPSPKTICYMISSLSKWVCS TRP1_HUMAN 705 HTSKGKVKRQNSLKEWRNLKQKRDENYQKVMCCLVHRYLTSMRQKMQSTDQATVENLNEL TRP1_MOUSE 721 HTSKGKVKRQNSLKEWRNLKQKRDENYQKVMCCLVHRYLTSMRQKMQSTDQATVENLNEL TRP1_RAT 671 HTSKGKVRRQNSLKEWRNLKQKRDENYQKVMCCLVHRYLTSMRQKMQSTDQATVENLNEL TRP1_HUMAN 765 RQDLSKFRNEIRDLLGFRTSKYAMFYPRN TRP1_MOUSE 781 RQDLSKFRNEIRDLLGFRTSKYAMFYPRN TRP1_RAT 731 RQDLSKFRNEIRDLLGFRTSKYAMFYPKN 80

94 TRP3_HUMAN TRP3_RAT TRP3_MOUSE 1 MSTKVKKCREPARVTLPAPEEEEDGEAEGGESQRRRRGWRGVNGGLEPPCPRAPPFPGPD TRP3_HUMAN 1 --MEGSPSLRRMTVMREKGRRQAVRGPAFMFNDRGTSLTAEEERFLDAAEYGNIPVVRKM TRP3_RAT TRP3_MOUSE 61 ASSEGSPSRWRTAGMRDKGRRQAVRGPAFMFGARGPSLTAEEERFLDAAEYGNIPVVRKM TRP3_HUMAN 59 LEESKTLNVNCVDYMGQNALQLAVGNEHLEVTELLLKKENLARIGDALLLAISKGYVRIV TRP3_RAT MLITKG----V TRP3_MOUSE 121 LEESRTLNVNCVDYMGQNALQLAVGNEHLEVTELLLKKENLARIGDALLLAISKGYVRIV TRP3_HUMAN 119 EAILNHPGFAASKRLTLSPCEQELQDDDFYAYDEDGTRFSPDITPIILAAHCQKYEVVHM TRP3_RAT 8 AVLFRCLSMTICHSLVLT-LKSTRAGDDFYAYDEDGTRFSPDITPIILAAHCHKYEVVHL TRP3_MOUSE 181 EAILGHPGFAASRRLTLSPCEQELRDDDFYAYDEDGTRFSPDITPIILAAHCHKYEVVHL TRP3_HUMAN 179 LLMKGARIERPHDYFCKCGDCMEKQRHDSFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVLTA TRP3_RAT 67 LLLKGARIERPHDYFCRCADCAEKQRLDAFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVLTA TRP3_MOUSE 241 LLLKGARIERPHDYFCRCSDCAEKQRLDAFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVLTA TRP3_HUMAN 239 LELSNELAKLANIEKEFKNDYRKLSMQCKDFVVGVLDLCRDSEEVEAILNGDLESAEPLE TRP3_RAT 127 LELSNELAKLANIEKEFKNDYRKLSMQCKDFVVGVLDLCRDSEEVEAILNGDLESVEPLE TRP3_MOUSE 301 LELSNELAKLANIEKEFKNDYRKLSMQCKDFVVGVLDLCRDSEEVEAILNGDLESAEPLE TRP3_HUMAN 299 VHRHKASLSRVKLAIKYEVKKFVAHPNCQQQLLTIWYENLSGLREQTIAIKCLVVLVVAL TRP3_RAT 187 RHGHKASLSRVKLAIKYEVKKFVAHPNCQQQLLTIWYENLSGLREQTISIKCLVVLVVAL TRP3_MOUSE 361 RHGHKASLSRVKLAIKYEVKKFVAHPNCQQQLLTIWYENLSGLREQTIAIKCLVVLVVAL TRP3_HUMAN 359 GLPFLAIGYWIAPCSRLGKILRSPFMKFVAHAASFIIFLGLLVFNASDRFEGITTLPNIT TRP3_RAT 247 GLPFLAIGYWIAPCTRLGKILRSPFMKFVAHAASFIIFLGLLVFNASHRFEGITTLPNIT TRP3_MOUSE 421 GLPFLAIGYWIAPCSRLGKILRSPFMKFVAHAASFIIFLGLLVFNASDRFEGITTLPNIT TRP3_HUMAN 419 VTDYPKQIFRVKTTQFTWTEMLIMVWVLGMMWSECKELWLEGPREYILQLWNVLDFGMLS TRP3_RAT 307 VIDYPKQIFRVKTTQFTWTEMLIMVWVLGMMWSECKELWLEGPREYIVQLWNVLDFGMLS TRP3_MOUSE 481 VIDYPKQIFRVKTTQFTWTEMLIMVWVLGMMWSECKELWLEGPREYIVQLWNVLDFGMLS TRP3_HUMAN 479 IFIAAFTARFLAFLQATKAQQYVDSYVQESDLSEVTLPPEIQYFTYARDKWLPSDPQIIS TRP3_RAT 367 IFIAAFTARFLAFLQATKAHQYVDSHVQESDLSEVTLPPKVQYFTYARDKWLPSDPQIIS TRP3_MOUSE 541 IFIAAFTARFLAFLQATKAQQYVDSHVQESDLSEVTLPPEVQYFTYARDKWLPSDPQIIS TRP3_HUMAN 539 EGLYAIAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVKDIFKFMVLFIMVFFAFMIGMFIL TRP3_RAT 427 EGLYAIAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVEDIFQFMVLFIMVFLAFMIGMFIL TRP3_MOUSE 601 EGLYAIAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVKDIFKFMVLFIMVFLAFMIGMFIL TRP3_HUMAN 599 YSYYLGAKVNAAFTTVEESFKTLFWSIFGLSEVTSVVLKYDHKFIENIGYVLYGIYNVTM TRP3_RAT 487 YSYYLGAKVNPAFTTVEESFKTLFWSIFGLSEVTSVVLKYDHKFIENIGYVLYGIYNVTM TRP3_MOUSE 661 YSYYLGAKVNPAFTTVEESFKTLFWSIFGLSEVTSVVLKYDHKFIENIGYVLYGIYNVTM TRP3_HUMAN 659 VVVLLNMLIAMINSSYQEIEDDSDVEWKFARSKLWLSYFDDGKTLPPPFSLVPSPKSFVY TRP3_RAT 547 VVVLLNMLIAMINSSYQEIEDDSDVEWKFARSKLWLSYFDDGKTLPPPFSLVPSPKSFVY TRP3_MOUSE 721 VVVLLNMLIAMINSSYQEIEDDSDVEWKFARSKLWLSYFDDGKTLPPPFSLVPSPKSFVY TRP3_HUMAN 719 FIMRIVNFPKCRRRRLQKDIEMGMGNSKSRLNLFTQSNSRVFESHSFNSILNQPTRYQQI TRP3_RAT 607 FIMRITNFSKCRRRRLQKDLELGMGNSKSRLNLFTQSNSRVFESHSFNSILNQPTRYQQI TRP3_MOUSE 781 FIMRITNFSKCRRRRLQKDLELGMGNSKSRLNLFTQSNSRVFESHSFNSILNQPTRYQQI TRP3_HUMAN 779 MKRLIKRYVLKAQVDKENDEVNEGELKEIKQDISSLRYELLEDKSQATEELAILIHKLSE TRP3_RAT 667 MKRLIKRYVLKAQVDKENDEVNEGELKEIKQDISSLRYELLEDKSQATEELAILIHKLSE TRP3_MOUSE 841 MKRLIKRYVLKAQVDKENDEVNEGELKEIKRISPAFVMNF

95 TRP4_RAT TRP4_MOUSE TRP4_HUMAN 1 MAQFYYKRNVNAPYRDRIPLRIVRAESELSPSEKAYLNAVEKGDYASVKKSLEEAEIYFK 1 MAQFYYKRNVNAPYRDRIPLRIVRAESELSPSEKAYLNAVEKGDYASVKKSLEEAEIYFK 1 MAQFYYKRNVNAPYRDRIPLRIVRAESELSPSEKAYLNAVEKGDYASVKKSLEEAEIYFK TRP4_RAT TRP4_MOUSE TRP4_HUMAN 61 ININCIDPLGRTALLIAIENENLELIELLLSFNVYVGDALLHAIRKEVVGAVELLLNHKK 61 ININCIDPLGRTALLIAIENENLELIELLLSFNVYVGDALLHAIRKEVVGAVELLLNHKK 61 ININCIDPLGRTALLIAIENENLELIELLLSFNVYVGDALLHAIRKEVVGAVELLLNHKK TRP4_RAT 121 PSGEKQVPPILLDKQFSEFTPDITPIILAAHTNNYEIIKLLVQKGVSVPRPHEVRCNCVE TRP4_MOUSE 121 PSGEKQVPPILLDKQFSEFTPDITPIILAAHTNNYEIIKLLVQKGVSVPRPHEVRCNCVE TRP4_HUMAN 121 PSGEKQVPPILLDKQFSEFTPDITPIILAAHTNNYEIIKLLVQKGVSVPRPHEVRCNCVE TRP4_RAT 181 CVSSSDVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPFLTAFQLSWELQELSKVENEFKSE TRP4_MOUSE 181 CVSSSDVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPFLTAFQLSWELQELSKVENEFKSE TRP4_HUMAN 181 CVSSSDVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPFLTAFQLSWELQELSKVENEFKSE TRP4_RAT 241 YEELSRQCKQFAKDLLDQTRSSRELEIILNYRDDNSLIEEQSGNDLARLKLAIKYRQKEF TRP4_MOUSE 241 YEELSRQCKQFAKDLLDQTRSSRELEIILNYRDDNSLIEEQSGNDLARLKLAIKYRQKEF TRP4_HUMAN 241 YEELSRQCKQFAKDLLDQTRSSRELEIILNYRDDNSLIEEQSGNDLARLKLAIKYRQKEF TRP4_RAT 301 VAQPNCQQLLASRWYDEFPGWRRRHWAVKMVTCFIIGLLFPVFSVCYLIAPKSPLGLFIR TRP4_MOUSE 301 VAQPNCQQLLASRWYDEFPGWRRRHWAVKMVTCFIIGLLFPVFSVCYLIAPKSPLGLFIR TRP4_HUMAN 301 VAQPNCQQLLASRWYDEFPGWRRRHWAVKMVTCFIIGLLFPVFSVCYLIAPKSPLGLFIR TRP4_RAT 361 KPFIKFICHTASYLTFLFLLLLASQHIDRSDLNRQGPPPTIVEWMILPWVLGFIWGEIKQ TRP4_MOUSE 361 KPFIKFICHTASYLTFLFLLLLASQHIDRSDLNRQGPPPTIVEWMILPWVLGFIWGEIKQ TRP4_HUMAN 361 KPFIKFICHTASYLTFLFLLLLASQHIDRSDLNRQGPPPTIVEWMILPWVLGFIWGEIKQ TRP4_RAT 421 MWDGGLQDYIHDWWNLMDFVMNSLYLATISLKIVAFVKYSALNPRESWDMWHPTLVAEAL TRP4_MOUSE 421 MWDGGLQDYIHDWWNLMDFVMNSLYLATISLKIVAFVKYSALNPRESWDMWHPTLVAEAL TRP4_HUMAN 421 MWDGGLQDYIHDWWNLMDFVMNSLYLATISLKIVAFVKYSALNPRESWDMWHPTLVAEAL TRP4_RAT 481 FAIANIFSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYFY TRP4_MOUSE 481 FAIANIFSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYFY TRP4_HUMAN 481 FAIANIFSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYFY TRP4_RAT 541 YEETKGLSCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSIFGLINLYVTNVKAQHEFTDFVGATM TRP4_MOUSE 541 YEETKGLSCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSIFGLINLYVTNVKAQHEFTEFVGATM TRP4_HUMAN 541 YEETKGLTCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSIFGLINLYVTNVKAQHEFTEFVGATM TRP4_RAT 601 FGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFEEGGTLPTPFNVI TRP4_MOUSE 601 FGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFEEGGTLPTPFNVI TRP4_HUMAN 601 FGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFEEGGTLPTPFNVI TRP4_RAT 661 PSPKSLWYLVKWIWTHLCKKKMRRKPESFGTIGRRAADNLRRHHQYQEVMRNLVKRYVAA TRP4_MOUSE 661 PSPKSLWYLVKWIWTHLCKKKMRRKPESFGTIGRRAADNLRRHHQYQEVMRNLVKRYVAA TRP4_HUMAN 661 PSPKSLWYLIKWIWTHLCKKKMRRKPESFGTIGRRAADNLRRHHQYQEVMRNLVKRYVAA TRP4_RAT 721 MIREAKTEEGLTEENVKELKQDISSFRFEVLGLLRGSKLSTIQSANAASSAS-SADSDEK TRP4_MOUSE 721 MIREAKTEEGLTEENVKELKQDISSFRFEVLGLLRGSKLSTIQSANAAS----SADSDEK TRP4_HUMAN 721 MIRDAKTEEGLTEENFKELKQDISSFRFEVLGLLRGSKLSTIQSANASKESSNSADSDEK TRP4_RAT 780 SHSEGNGKDKRKNLSLFDLTTLIHPRSAVIASERHNLSNGSALVVQEPPREKQRKVNFVA TRP4_MOUSE 777 SQSEGNGKDKRKNLSLFDLTTLIHPRSAAIASERHNLSNGSALVVQEPPREKQRKVNFVA TRP4_HUMAN 781 SDSEGNSKDKKKNFSLFDLTTLIHPRSAAIASERHNISNGSALVVQEPPREKQRKVNFVT TRP4_RAT 840 DIKNFGLFHRRSKQNAAEQNANQIFSVSEEITRQQAAGALERNIQLESKGLASRGDRSIP TRP4_MOUSE 837 DIKNFGLFHRRSKQNAAEQNANQIFSVSEEITRQQAAGALERNIELESKGLASRGDRSIP TRP4_HUMAN 841 DIKNFGLFHRRSKQNAAEQNANQIFSVSEEVARQQAAGPLERNIQLESRGLASRGDLSIP 82

96 TRP5_RAT TRP5_MOUSE TRP5_HUMAN 1 MAQLYYKKVNYSPYRDRIPLQIVRAETELSAEEKAFLSAVEKGDYATVKQALQEAEIYYN 1 MAQLYYKKVNYSPYRDRIPLQIVRAETELSAEEKAFLSAVEKGDYATVKQALQEAEIYYN 1 MAQLYYKKVNYSPYRDRIPLQIVRAETELSAEEKAFLNAVEKGDYATVKQALQEAEIYYN TRP5_RAT TRP5_MOUSE TRP5_HUMAN 61 VNINCMDPLGRSALLIAIENENLEIMELLLNHSVYVGDALLYAIRKEVVGAVELLLSYRK 61 VNINCMDPLGRSALLIAIENENLEIMELLLNHSVYVGDALLYAIRKEVVGAVELLLSYRK 61 VNINCMDPLGRSALLIAIENENLEIMELLLNHSVYVGDALLYAIRKEVVGAVELLLSYRR TRP5_RAT 121 PSGEKQVPTLMMDTQFSEFTPDITPIMLAAHTNNYEIIKLLVQKRVTIPRPHQIRCNCVE TRP5_MOUSE 121 PSGEKQVPTLMMDTQFSEFTPDITPIMLAAHTNNYEIIKLLVQKRVTIPRPHQIRCNCVE TRP5_HUMAN 121 PSGEKQVPTLMMDTQFSEFTPDITPIMLAAHTNNYEIIKLLVQKRVTIPRPHQIRCNCVE TRP5_RAT 181 CVSSSEVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPILTAFRLGWELKELSKVENEFKAE TRP5_MOUSE 181 CVSSSEVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPILTAFRLGWELKELSKVENEFKAE TRP5_HUMAN 181 CVSSSEVDSLRHSRSRLNIYKALASPSLIALSSEDPILTAFRLGWELKELSKVENEFKAE TRP5_RAT 241 YEELSQQCKLFAKDLLDQARSSRELEIILNHRDDHSEELDPQKYHDLAKLKVAIKYHQKE TRP5_MOUSE 241 YEELSQQCKLFAKDLLDQARSSRELEIILNHRDDHSEELDPQKYHDLAKLKVAIKYHQKE TRP5_HUMAN 241 YEELSQQCKLFAKDLLDQARSSRELEIILNHRDDHSEELDPQKYHDLAKLKVAIKYHQKE TRP5_RAT 301 FVAQPNCQQLLATLWYDGFPGWRRKHWVVKLLTCMTIGFLFPMLSIAYLISPRSNLGLFI TRP5_MOUSE 301 FVAQPNCQQLLATLWYDGFPGWRRKHWVVKLLTCMTIGFLFPMLSIAYLISPRSNLGLFI TRP5_HUMAN 301 FVAQPNCQQLLATLWYDGFPGWRRKHWVVKLLTCMTIGFLFPMLSIAYLISPRSNLGLFI TRP5_RAT 361 KKPFIKFICHTASYLTFLFMLLLASQHIVRTDLHVQGPPPTVVEWMILPWVLGFIWGEIK TRP5_MOUSE 361 KKPFIKFICHTASYLTFLFMLLLASQHIVRTDLHVQGPPPTVVEWMILPWVLGFIWGEIK TRP5_HUMAN 361 KKPFIKFICHTASYLTFLFMLLLASQHIVRTDLHVQGPPPTVVEWMILPWVLGFIWGEIK TRP5_RAT 421 EMWDGGFTEYIHDWWNLMDFAMNSLYLATISLKIVAYVKYNGSRPREEWEMWHPTLIAEA TRP5_MOUSE 421 EMWDGGFTEYIHDWWNLMDFAMNSLYLATISLKIVAYVKYNGSRPREEWEMWHPTLIAEA TRP5_HUMAN 421 EMWDGGFTEYIHDWWNLMDFAMNSLYLATISLKIVAYVKYNGSRPREEWEMWHPTLIAEA TRP5_RAT 481 LFAISNILSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYF TRP5_MOUSE 481 LFAISNILSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYF TRP5_HUMAN 481 LFAISNILSSLRLISLFTANSHLGPLQISLGRMLLDILKFLFIYCLVLLAFANGLNQLYF TRP5_RAT 541 YYETRAIDEPNNCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSVFGLLNLYVTNVKARHEFTEFV TRP5_MOUSE 541 YYETRAIDEPNNCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSVFGLLNLYVTNVKARHEFTEFV TRP5_HUMAN 541 YYETRAIDEPNNCKGIRCEKQNNAFSTLFETLQSLFWSVFGLLNLYVTNVKARHEFTEFV TRP5_RAT 601 GATMFGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFDEGGTLPPP TRP5_MOUSE 601 GATMFGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFDEGGTLPPP TRP5_HUMAN 601 GATMFGTYNVISLVVLLNMLIAMMNNSYQLIADHADIEWKFARTKLWMSYFDEGGTLPPP TRP5_RAT 661 FNIIPSPKSFLYLGNWFNNTFCPKRDPDGRRRRHNLRSFTERHADSLIQNQHYQEVIRNL TRP5_MOUSE 661 FNIIPSPKSFLYLGNWFNNTFCPKRDPDGRRRRHNLRSFTERHADSLIQNQHYQEVIRNL TRP5_HUMAN 661 FNIIPSPKSFLYLGNWFNNTFCPKRDPDGRRRRRNLRSFTERNADSLIQNQHYQEVIRNL TRP5_RAT 721 VKRYVAAMIRNSKTNEGLTEENFKELKQDISSFRYEVLDLLGNRKHPRRSFSTSSAEFSQ TRP5_MOUSE 721 VKRYVAAMIRNSKTNEGLTEENFKELKQDISSFRYEVLDLLGNRKHPRRSLSTSSADFSQ TRP5_HUMAN 721 VKRYVAAMIRNSKTHEGLTEENFKELKQDISSFRYEVLDLLGNRKHPR-SFSTSSTELSQ TRP5_RAT 781 RDDTNDGSGGARAKSKSVSFNLGCKKKACQGAPLIRTMPRASGAQGKPKAESSGKRSFMG TRP5_MOUSE 781 RDDTNDGSGGARAKSKSVSFNVGCKKKACHGAPLIRTVPRASGAQGKPKSESSSKRSFMG TRP5_HUMAN 780 RDDNNDGSGGARAKSKSVSFNLGCKKKTCHGPPLIRTMPRSSGAQGKSKAESSSKRSFMG TRP5_RAT 841 PSFKKLGLLFSKFNGQTSEPTSEPMYTISDGIAQQHSMWQDIRYSQMEKGKAEACSQSEM TRP5_MOUSE 841 PSFKKLGLFFSKFNGQTSEPTSEPMYTISDGIAQQHCMWQDIRYSQMEKGKAEACSQSQM TRP5_HUMAN 840 PSLKKLGLLFSKFNGHMSEPSSEPMYTISDGIVQQHCMWQDIRYSQMEKGKAEACSQSEI 83

97 TRP6_RAT TRP6_MOUSE TRP6_HUMAN TRP6_RAT TRP6_MOUSE TRP6_HUMAN 1 MSQSPGFVTRRGGSPKAAPGAGARRNESQDYLLMD-ELGDDGYPQLQQPPYGYYPSFRGN 1 MSQSPRFVTRRGGSLKAAPGAGTRRNESQDYLLMD-ELGDDGYPQLPLPPYGYYPSFRGN 1 MSQSPAFGPRRGSSPRGAAGAAARRNESQDYLLMDSELGEDGCPQAPLPCYGYYPCFRGS 60 ENRLTHRRQTVLREKGRRLANRGPAYMFNDHSTSLSIEEERFLDAAEYGNIPVVRKMLEE 60 ENRLTHRRQTILREKGRRLANRGPAYMFNDHSTSLSIEEERFLDAVEYGNIPVVWKMLEE 61 DNRLAHRRQTVLREKGRRLANRGPAYMFSDRSTSLSIEEERFLDAAEYGNIPVVRKMLEE TRP6_RAT 120 CLSLNVNCVDYMGQNALQLAVANEHLEITELLLKKENLSRVGDALLLAISKGYVRIVEAI TRP6_MOUSE 120 CHSLNVNCVDYMGQNALQLAVANEHLEITELLLKKENLSRVGDALLLAISKGYVRIVEAI TRP6_HUMAN 121 CHSLNVNCVDYMGQNALQLAVANEHLEITELLLKKENLSRVGDALLLAISKGYVRIVEAI TRP6_RAT 180 LNHPAFAEGKRLATSPSQSELQQDDFYAYDEDGTRFSHDVTPIILAAHCQEYEIVHTLLR TRP6_MOUSE 180 LNHPSFAEGKRLATSPSQSELQQDDFYAYDEDGTRFSHDVTPIILAAHCQEYEIVHTLLR TRP6_HUMAN 181 LSHPAFAEGKRLATSPSQSELQQDDFYAYDEDGTRFSHDVTPIILAAHCQEYEIVHTLLR TRP6_RAT 240 KGARIERPHDYFCKCTECSQKQKHDSFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVMTALEL TRP6_MOUSE 240 KGARIERPHDYFCKCTECSQKQKHDSFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVMTALEL TRP6_HUMAN 241 KGARIERPHDYFCKCNDCNQKQKHDSFSHSRSRINAYKGLASPAYLSLSSEDPVMTALEL TRP6_RAT 300 SNELAVLANIEKEFKNDYRKLSMQCKDFVVGLLDLCRNTEEVEAILNGDAETRQPGDLAR TRP6_MOUSE 300 SNELAVLANIEKEFKNDYRKLSMQCKDFVVGLLDLCRNTEEVEAILNGDAETRQPGDFGR TRP6_HUMAN 301 SNELAVLANIEKEFKNDYKKLSMQCKDFVVGLLDLCRNTEEVEAILNGDVETLQSGDHGR TRP6_RAT 360 PNLSRLKLAIKYEVKKFVAHPNCQQQLLSIWYENLSGLRQQTMAVKFLVVLAVAIGLPFL TRP6_MOUSE 360 PNLSRLKLAIKDEVKKFVAHPNCQQQLLSIWYENLSGLRQQTMAVKFLVVLAVAIGLPFL TRP6_HUMAN 361 PNLSRLKLAIKYEVKKFVAHPNCQQQLLSIWYENLSGLRQQTMAVKFLVVLAVAIGLPFL TRP6_RAT 420 ALIYWCAPCSKMGKILRGPFMKFVAHAASFTIFLGLLVMNAADRFEGTKLLPNETSTDNA TRP6_MOUSE 420 ALIYWCAPCSKMGKILPRPFMKFVAHAASFTIFLGLLVMNAADRFEGTKLLPNETSTDNA TRP6_HUMAN 421 ALIYWFAPCSKMGKIMRGPFMKFVAHAASFTIFLGLLVMNAADRFEGTKLLPNETSTDNA TRP6_RAT 480 RQLFRMKTSCFSWMEMLIISWVIGMIWAECKEIWTQGPKEYLFELWNMLDFGMLAIFAAS TRP6_MOUSE 480 RQLFRMKTSCFSWMEMLIISWVIGMIWAECKEIWTQGPKEYLFELWNMLDFGMLAIFAAS TRP6_HUMAN 481 KQLFRMKTSCFSWMEMLIISWVIGMIWAECKEIWTQGPKEYLFELWNMLDFGMLAIFAAS TRP6_RAT 540 FIARFMAFWHASKAQSIIDANDTLKDLTKVTLGDNVKYYNLARIKWDPTDPQIISEGLYA TRP6_MOUSE 540 FIARFMAFWHASKAQSIIDANDTLKDLTKVTLGDNVKYYNLARIKWDPTDPQIISEGLYA TRP6_HUMAN 541 FIARFMAFWHASKAQSIIDANDTLKDLTKVTLGDNVKYYNLARIKWDPSDPQIISEGLYA TRP6_RAT 600 IAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVKDIFKFMVIFIMVFVAFMIGMFNLYSYYI TRP6_MOUSE 600 IAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVKDIFKFMVIFIMVFVAFMIGMFNLYSYYI TRP6_HUMAN 601 IAVVLSFSRIAYILPANESFGPLQISLGRTVKDIFKFMVIFIMVFVAFMIGMFNLYSYYI TRP6_RAT 660 GAKQNEAFTTVEESFKTLFWAIFGLSEVKSVVINYNHKFIENIGYVLYGVYNVTMVIVLL TRP6_MOUSE 660 GAKQNEAFTTVEESFKTLFWAIFGLSEVKSVVINYNHKFIENIGYVLYGVYNVTMVIVLL TRP6_HUMAN 661 GAKQNEAFTTVEESFKTLFWAIFGLSEVKSVVINYNHKFIENIGYVLYGVYNVTMVIVLL TRP6_RAT 720 NMLIAMINSSFQEIEDDADVEWKFARAKLWFSYFEEGRTLPVPFNLVPSPKSLLYLLLKF TRP6_MOUSE 720 NMLIAMINSSFQEIEDDADVEWKFARAKLWFSYFEEGRTLPVPFNLVPSPKSLLYLLLKF TRP6_HUMAN 721 NMLIAMINSSFQEIEDDADVEWKFARAKLWFSYFEEGRTLPVPFNLVPSPKSLFYLLLKL TRP6_RAT 780 KKWMSELIQGHKKGFQEDAEMNKRNEEKKFGILGSHEDLSKFSLDRNQLAHNKQSSTRSS TRP6_MOUSE 780 KKWMCELIQGQKQGFQEDAEMNKRNEEKKFGISGSHEDLSKFSLDKNQLAHNKQSSTRSS TRP6_HUMAN 781 KKWISELFQGHKKGFQEDAEMNKINEEKKLGILGSHEDLSKLSLDKKQVGHNKQPSIRSS TRP6_RAT 840 EDFHLNSFSNPPRQYQKIMKRLIKRYVLQAQIDKESDEVNEGELKEIKQDISSLRYELLE TRP6_MOUSE 840 EDYHLNSFSNPPRQYQKIMKRLIKRYVLQAQIDKESDEVNEGELKEIKQDISSLRYELLE TRP6_HUMAN 841 EDFHLNSFNNPPRQYQKIMKRLIKRYVLQAQIDKESDEVNEGELKEIKQDISSLRYELLE TRP6_RAT 900 EKSQNTEDLAELIRKLGERLSLESKQEESRR TRP6_MOUSE 900 EKSQNSEDLAELIRKLGERLSLEPKLEESRR TRP6_HUMAN 901 EKSQNTEDLAELIRELGEKLSMEPNQEETNR Şekil 2.3: Sıçan, fare ve insan arasında TRPC1,3-6 proteinlerinin Clustal W analizi. Boxshade formatında, aynı aminoasitler siyah arka plan (korunmuş bölgeler), %50 den daha fazla benzerlik gösteren aa lar ise gri arka plan üzerinde gösterilmiştir. Protein dizileri üzerindeki siyah çerçeveler kullanılan primerler ile çoğaltılan bölgelerin aa olarak karşılığını göstermektedir. 84

98 TRPC1 proteini aa dizisi Length: 759 AA Molecular weight: Da CRC64: CEBB27A1DF6420F MMAALYPSTD LSGVSSSSLP SSPSSSSPNE VMALKDVREV KEENTLNEKL FLLACDKGDY YMVKKILEEN SSGDLNINCV DVLGRNAVTI TIENESLDIL QLLLDYGCQK LMERIQNPEY STTMDVAPVI LAAHRNNYEI LTMLLKQDVA LPKPHAVGCE CTLCSAKNKK DSLRHSRFRL DIYRCLASPA LIMLTEEDPI LRAFELSADL KELSLVEVEF WNDYEELARQ CKMFAKDLLA QARNSRELEV ILNHTSSDEP LDKRGLLEER MNLSRLKLAI KYNQKEFVSQ SNCQQFLNTV WFGQMSGYRR KPTCKKIMTV LTVGIFWPVL SLCYLIAPKS QFGRIIHTPF MKFIIHGASY FTFLLLLNLY SLVYNEDKKN TMGPALERID YLLILWIIGM IWSDIKRLWY EGLEDFLEES RNQLSFVMNS LYLATFALKV VAHNKFHDFA DRKDWDAFHP TLVAEGLFAF ANVLSYLRLF FMYTTSSILG PLQISMGQML QDFGKFLGMF LLVLFSFTIG LTQLYDKGYT SKEQKDCVGI FCEQQSNDTF HSFIGTCFAL FWYIFSLAHV AIFVTRFSYG EELQSFVGAV IVGTYNVVVV IVLTKLLVAM LHKSFQLIAN HEDKEWKFAR AKLWLSYFDD KCTLPPPFNI IPSPKTICYM ISSLSKWVCS HTSKGKVRRQ NSLKEWRNLK QKRDENYQKV MCCLVHRYLT SMRQKMQSTD QATVENLNEL RQDLSKFRNE IRDLLGFRTS KYAMFYPKN Şekil 2.4: TRPC1 proteininin aa dizisi Koyu ve altı çizili aa lar ileri ve geri primer dizilerini göstermektedir. Yatık gösterilen aa lar ise pimerler ile çoğaltılacak bölgenin aa karşılığı kodlanan dizilerini göstermektedir. 85

99 Tablo 2.1: rtrpc1 proteini için önerilen membran topolojisi (PCR ürünü: aa) Bölge Aralık Uzunluk Tanımı Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Tekrar ANK 1. Tekrar ANK 2. Tekrar ANK 3. 86

100 Tablo 2.2: rtrpc3 proteini için önerilen membran topolojisi (PCR ürünü: aa) Bölge Aralık Uzunluk Tanımı Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Tekrar ANK 1. Tekrar ANK 2. Glikolizasyon bölgesi N-bağlantılı (GlcNAc...) 87

101 Tablo 2.3: rtrpc4 proteini için önerilen membran topolojisi (PCR ürünü: aa) Bölge Aralık Uzunluk Tanımı Domain Sitoplazmik Transmembranbran Domain Ekstraselüler Transmembranbran Domain Sitoplazmik Transmembranbran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembranbran Domain Ekstraselüler Transmembranbran Olası Domain Sitoplazmik Tekrar ANK 1. Tekrar ANK 2. Domain N-bağlantılı (GlcNAc...) Bölge NHERF PDZ bölgesine bağlanmak için gerekli Splice varyant Yok 88

102 Tablo 2.4: htrpc5 proteini için önerilen membran topolojisi (PCR ürünü: aa) Bölge Aralık Uzunluk Tanımı Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Tekrar ANK 1. Tekrar ANK 2. Bölge NHERF PDZ bölgesine bağlanmak için gerekli Glikolizasyon bölgesi N-bağlantılı (GlcNAc...) 89

103 Tablo 2.5: htrpc6 proteini için önerilen membran topolojisi (PCR ürünü: aa) Bölge Aralık Uzunluk Tanımı Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Sitoplazmik Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Domain Sitoplazmik Transmembran Domain Ekstraselüler Transmembran Sitoplazmik Domain Sitoplazmik Tekrar ANK 1. Tekrar ANK 2. Tekrar ANK 3. Tekrar ANK 4. Glikolizasyon bölgesi N-bağlantılı (GlcNAc...) Glikolizasyon bölgesi N-bağlantılı (GlcNAc...) Splice varyant yok (izoform 2). Splice varyant yok (izoform 3). 90

104 2.6. Kantitatif / Real-Time PCR LightCycler (LC) cihazına uygun ve borosilikat camdan yapılmış kapiler tüpler (maksimum 20 µl) önceden soğutulmuş özel metal adaptörlerin içlerine yerleştirildi. PCR karışımı her bir gen için hazırlandıktan sonra, üzerlerine cdna örnekleri pipetlendi ve plastik kapakları kapatıldı. Kapiler tüplerdeki reaksiyon karışımının tamamının kapilerin ucuna toplanmasını sağlamak için, tüpler adaptörleri ile birlikte rpm de 3 saniye santrifüj edildi. Cam kapiler tüpler adaptörlerden çıkartılarak, LC örnek tamburuna yerleştirildi; üzerinde örneklerin bulunduğu tambur LC cihazına yerleştirildikten sonra çalışma başlatıldı. Her çalışmada, reaktifin kontrolü için pozitif kontrol (beyin cdna) ve kontaminasyonun kontrolü için de saf su negatif kontrol olarak kullanıldı Primerlerin hazırlanması Liyofilize halde ve 0.02 µmol sentez skalasında HPLC saflığında ticari olarak satın alınan TRPC1,3-6 ve β-aktin ileri ve geri primerleri 100 pmol/µl konsantrasyonda olacak şekilde firmanın önerisi olan hacimlerde (Tablo 2.6) PCR için uygun saflıktaki RNAaz içermeyen steril distile su eklenerek çözüldü ve 50 µl lik eşit hacimler halinde (aliquot) -20 C de saklandı. 91

105 Tablo 2.6: Primerlerin hazırlanması. HPLC saflığında 0.02 µmol sentez skalasındaki primerlerin stok konsantrasyonu 100 pmol/µl olacak şekilde firma tarafından bildirilen eklenecek su miktarları. Primer Yönü Stok Konsantrasyon Eklenecek su miktarı (µl) rtrpc1 rtrpc3 rtrpc4 rtrpc5 rtrpc6 rβ-aktin İleri 100 pmol/µl 442,7 Geri 100 pmol/µl 114,2 İleri 100 pmol/µl 562,3 Geri 100 pmol/µl 720,6 İleri 100 pmol/µl 236,1 Geri 100 pmol/µl 442,6 İleri 100 pmol/µl 520,9 Geri 100 pmol/µl 360,5 İleri 100 pmol/µl 608,3 Geri 100 pmol/µl 180,8 İleri 100 pmol/µl 673,3 Geri 100 pmol/µl 216,1 TRPC1, 3, 4, 5 and 6- spesifik primerler (Tablo 2.7) ile optimizasyon çalışmaları tamamlandıktan sonra, Real-time PCR sisteminde TRPC1,3-6 ekspresyon düzeyleri orantısal olarak belirlenmek üzere cdna lar çoğaltıldı. Bu amaçla FastStart DNA Master SYBR Green I kiti (Roche Applied Science) kullanıldı. PCR 10 µl hacimde gerçekleştirildi (Tablo 2.8). Hot-start PCR 95 C de 10 dk inkübasyon ile başlatıldı. Bunu takip eden deney protokolü aşağıda tabloda verilmiştir (Tablo 92

106 2.10, LC deney protokolü). Herbir TRPC için bağlanma sıcaklığı ve uzama süreleri Tablo 2.9 de verilmiştir. Tablo 2.7: PCR da kullanılan primer dizileri Gen No Primer dizisi (5-3 ) Yerleşim Ürün (bç) rtrpc1 NM_ İleri TGG TAT GAA GGG TTG GAA GAC Geri TGC TGT TCA CAG AAG ATG CC rtrpc3 NM_ İleri ATG CTG CTT TTA CCA CGG TTG Geri ACA TCA CTG TCA TCC TCG ATT TC rtrpc4 NM_ İleri CTG CAG ATA TCT CTG GGA AGA Geri GCT TTG TTC GAG CAA ATT TCC rtrpc5 NM_ İleri GCA ATC AAA TAT CAC CAG AAA Geri GGA GAA GCA TGA AGA GGA AGG rtrpc6 NM_ İleri GAT ATC TTC AAA TTC ATG GTC ATA Geri ATC CGC ATC ATC CTC AAT TTC rβ-actin NM_ İleri AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT Geri GAC TCA TCG TAC TCC TGC TT

107 Tablo 2.8: PCR karışımının hazırlanması Bileşenler X 2 Final konsantrasyon H 2 O 12,4 µl/ 13,2 µl/ - MgCl 2 (25 mm) 1,6 µl/ 0,8 µl/ 3 mm / 1,5 mm İleri primer (10 µm) 1,0 µl 0,5 µm Geri primer (10 µm) 1,0 µl 0,5 µm LC FS Enzim karışımı 2,0 µl - Enzim (1a) + Reaksiyon karışımı (1b) cdna 2,0 µl - Toplam 20,0 µl Tablo 2.9: Her bir primer için belirlenen bağlanma sıcaklıkları, MgCl 2 konsantrasyonları ve uzama süreleri Gen Bağlanma ( C) MgCl 2 (mm) Uzama süreleri (sn) TRPC TRPC3 58 1,5 17 TRPC TRPC TRPC PCR ürününün miktarı platoya ulaşmadan önce ilk PCR döngülerinde logaritmik olarak artmaktadır. Örnek konsantrasyonunun (kopya sayısının) doğru olarak belirlenebilmesi için sadece bu ilk döngüler göz önünde tutulmuştur. Daha ileri PCR döngüleri PCR ürününün final miktarını belirlerken, başlangıç 94

108 konsantrasyonu konusunda bilgi vermez. Döngülerin her birinin görüntülenmesi PCR nin hangi döngüde log-lineer fazda olduğunu kesin olarak belirler. Her döngüde PCR ürününün miktarı iki katına çıkar. Bu fazda sinyal kolaylıkla arka plandaki sinyalden ayrılabilir. Böylece hedef dizinin başlangıç konsantrasyonu hakkında doğru bilgi alınır. Şekil 2.5 de görüldüğü gibi PCR nin log-lineer fazında sinyal şiddetinde belirgin farklılıklar görülebilirken, izleyen plato fazında sinyallerin ayırt edilmesi zordur. Şekil 2.5: TRPC6 ve β-aktin genleri için amplifikasyon süresince floresans emisyonundaki artış. Döngü sayısı/ Floresans: Hedef genlerin amlifikasyonu ilerledikçe, çift-sarmal DNA ya bağlanan, 470 nm de uyarılan SYBR Green I boyanın 530 nm deki floresans emisyon şiddeti de artar. Eğrinin logaritmik faza girdiği döngü sayısı cdna örneğinde hedef gene ait kopya sayısı hakkında bilgi verir. Logaritmik faza önce girmesi o genin örnekte daha fazla olduğunu gösterir. Örnek grafikte görüldüğü gibi yapısal (house-keeping) gen olan β-aktin beklendiği gibi TRPC6 ya göre çok daha erken bir döngüde logaritmik faza girmiştir. 95

109 2.7. Standart Eğrinin Çizimi Çalışmamızda house-keeping gen olarak kullanılan β-aktin in plazmide klonlanmış cdna ları standart olarak kullanıldı. Ticari olarak alınan β-aktin cdna (liyofilize halde plazmid DNA örnekleri) stok konsantrasyonu kopya şeklindedir. Bu ana stok üzerine 10 µl steril su eklenmesi ile 10 9 kopyaya seyreltildi. Bu ana stok çözeltiden aşağıda belirtilen ardışık dilüsyon ( ) serileri hazırlandı. Kullanılan standart Final konsantrasyon (10 µl PCR hacminde) Standart Standart Standart Standart Standart Standart Standart Her bir TRPC geni için daha önceden ayrı ayrı optimize edilen real-time PCR koşullarında final konsantrasyon kopya olacak şekilde seri dilüsyonlar kullanılarak PCR gerçekleştirildi. PCR tamamlandıktan sonra LC yazılımı her bir örnekteki hedef genin kopya sayısını döngü sayısına karşılık floresans emisyon şiddeti kullanılarak çizilen logaritmik eğri ile belirler. Diğer bir deyişle her bir standartın lineer logaritmik faza girdiği döngü sayısı (yani x-eksenini kestiği noktalar) belirlenmiştir. X ekseninde standart konsantrasyonlarının logaritmalarına karşılık döngü sayısı (Y ekseni) ile grafik oluşturulması ile standart eğri çizildi (Şekil 2.6). Konsantrasyonu 96

110 bilinmeyen örnekler ile PCR işlemi sonunda her gen için ayrı ayrı çizilen bu standart eğriler ile konsantrasyon hesabı yapıldı. C Şekil 2.6: Standart eğri çizimi ve grafikleri A) Döngü sayısına karşılık floresans emisyonunun (F1) logaritmik eğrisi. B) standartların logaritmik konsantrasyonlarına karşılık logaritmik faza girdikleri döngü sayıları ile çizilen doğru (standart). C) örneklerin hesaplanan konsantrasyonları. Her bir örnekteki TRPC genlerinin nicel oranı kendi kalibrasyon eğrilerine göre belirlendikten sonra bu değerler aynı örnekteki β-aktin referans genine orantılanarak normalize edildi. Nicel oran = Örnekteki TRPCx gen kopya sayısı / Örnekteki β-aktin referans geninin kopya sayısı 97

111 2.8. Erime Eğrisi Analizi Her bir çift sarmal DNA ürünü kendine özel erime sıcaklığına (T m ) sahiptir. T m DNA ların %50 sinin tek sarmal hale geldiği diğer yarısının çift sarmal halde kaldığı sıcaklık olarak tanımlanmaktadır. Çift sarmal DNA nın T m sini belirleyen en önemli faktörler uzunluk ve içerdiği GC sayısıdır. Son PCR döngüsünden sonra ürünler 95 C de denatüre edildi, daha sonra 50 C de bağlanmaları sağlandı. Bu aşamadan sonra 50 den 99 C ye kadar yavaşça ısıtıldı. Sıcaklıktaki 0.2 C lik artışlarda floresans ölçüldü. Fragman denatüre olduğu için çift sarmal ürüne bağlı boyanın floresans şiddeti (F1) giderek düşer (Şekil 2.7A). Bu fragmanın T m si erime eğrisinin birinci negatif türevinin (-df/dt) alınması ile kolaylıkla hesaplanabilir. Bu erime eğrisinin dönme noktası -df/dt eğrisinin pik yaptığı noktayı gösterir (Şekil 2.7B). SYBR Green I boyası ile PCR ürününün T m sinin belirlenmesi (Şekil 2.8), PCR ürününün belirlenmesini Spesifik PCR ürününün primer-dimer gibi spesifik olmayan ürünlerden ayrılmasını sağlar. PCR ürününün Tm kontrolü jel elektroforezinde ürünün uzunluğunun kontrol edilmesi ile karşılaştırılmalıdır. Bu amaçla tüm PCR ürünleri %2 lik agaroz jelde yürütülerek ürün büyüklüğü ve bütünlüğü kontrol edildi. 98

112 Şekil 2.7: PCR ürünün erime eğrisi analizi Denatürasyon sonucu floresans şiddetinde görülen azalma (A) ve emisyonun zamana bağlı değişimi (B). Şekil 2.8: TRPC6 genine ait erime eğrisi analizine bir örnek 99

113 Tablo 2.10: LC Deney Protokolü Program I: DENATÜRASYON Parametre Değer Döngü sayısı 1 Segment 1 Hedef Sıcaklık ( C) 95 ºC İnkübasyon zamanı 10 dk Sıcaklık değişimi ( C/sn) 20 Program II: AMPLİFİKASYON Parametre Değer Döngü sayısı 50 Tipi Kantitasyon Segment 1 Denatürasyon Segment 2 Bağlanma Segment 3 Uzama Hedef ısı ( C) 95 ºC Tablo 72 ºC İnkübasyon zamanı 10 sn 10 sn Tablo Sıcaklık değişimi ( C/sn) Okuma modu Yok Yok Tek 100

114 Program III: ERİME EĞRİSİ ANALİZİ Parametre Değer Döngü sayısı 1 Tipi Erime eğrileri Segment 1 Segment 2 Segment 3 Hedef sıcaklık ( C) 95 ºC 50 ºC 99 ºC İnkübasyon süresi 0 sn 15 sn 0 sn Sıcaklık değişimi ( C/sn) Okuma modu yok yok Sürekli Program IV: SOĞUTMA Parametre Değer Döngü sayısı 1 Tipi Yok Segment 1 Hedef sıcaklık ( C) 40 ºC İnkübasyon süresi 30 sn Sıcaklık değişimi ( C/sn)

115 2.9. SDS-PAGE ve Western Blot Western Blot tekniği ile doku örneklerindeki protein ekspresyon düzeyleri spesifik antikorlar yardımı ile belirlenmiştir. Birbirini takip eden süreçler: Protein izolasyonu SDS-Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Proteinlerin jelden membrana transferi Spesifik olmayan bağlanmaların inhibisyonu (blocking) Antikor hibridizasyonu (Primer ve sekonder antikorlar) Görüntüleme (ECL ve radyografi) Protein İzolasyonu 1. Protein izolasyonu deterjan lizis çözeltileri ile hücrelerin parçalanarak proteinlerin salıverilmesi esasına dayanmaktadır. Proteinler intakt torasik aorttan Camiolo çözeltisi (0,075 M potasyum asetat; 0,3 M NaCl; 0,01 M EDTA; 0.25% Triton-X 100; 0,1 M L-arjinin baz tuzu) ile izole edildi mg doku 1 ml Camiolo çözeltisi içerisinde homojenize edildikten sonra 3000 rpm de 20 dk (+4 C) santrifüj edildi. 3. Üstteki proteini içeren kısım yeni bir tübe alındı ve -80 C de saklandı. 4. Endotelyal total proteinin düşük miktarından dolayı, çalışmamızda Western Blot (WB) çalışmaları için damar düz kas ve endotel hücrelerini içeren intakt aort kullanıldı. Protein konsantrasyonları (µg/ µl) bovine serum albumin (BSA) standart olarak kullanılarak Bradford protein miktar tayini (32) ile belirlendi. 102

116 Proteinlerin Yüklenmesi ve Elektroforez Ön denemeler sonucunda 40 µg protein yüklenmesine karar verildi. Her örnekten istenilen miktarda protein yüklenebilmesi için gerekli hacim aşağıdaki formül ile hesaplandı: Yüklenecek protein miktarı (µg) / örnek konsantrasyonu (µg/ µl) = µl yüklenecek örnek hacmi Her örnek için hesaplanan hacimde protein üzerine örnek yükleme tamponu (Cracking buffer, genelde %50 oranında) ilave edildi. Örnek yükleme çözeltisi indirgeyici bir ajan olan β-merkaptoetanol (β-me) içermektedir. β-me tampon içerisine örnek yükleneceği zaman ilave edildi. Hazırlanan protein örnekleri jele yüklenmeden önce 5 dk C de kaynatılarak SDS nin proteinlerin etrafını kuşatarak proteinleri denatüre etmesi sağlandı (tampon içerisinde bulunan SDS deterjanının proteinlere bağlanması ile proteinler negatif yüklü hale gelir). Protein örnekleri %8 SDS-PAGE jeline yüklenerek SDS-protein komplekslerinin molekül ağırlıklarına göre ayrılmaları sağlandı. Tankın içine yerleştirilen jel yürütme tamponu içerisinde stacking jel için 120 V, resolving için 150 V voltaj uygulanarak örnekler ~45-60 dk yürütüldü Proteinlerin Transferi PVDF (Immobilon-P polyvinylidene difluoride, PVDF, Sigma) membran 30 sn metanolde bekletildi. Daha sonra jel ve membran 2 dk kadar transfer çözeltisi içerisinde inkübe edildi. Ayrıca kullanılacak olan, whatman filtre kağıdı ve süngerler de transfer çözeltisi içerisinde bekletildi. Proteinlerin jelden membrana transfer 103

117 edilmesi için whatman kağıtları ve süngerler ile bir sandviç oluşturuldu. Katod ızgara üzerine sırasıyla transfer tamponunda ıslatılmış sünger, 2 whatman kağıdı ve jel yerleştirildi. Bunların üzerine jele uygun büyüklükte kesilen membran, 2 whatman kağıdı konuldu. Sistem transfer tamponu doldurulmuş tank içerisine yerleştirildi. Yarı-kuru (semi-dry) transfer işlemi oda sıcaklığında 15 V de 1,5 saat süre ile gerçekleştirildi (negatif yüklü proteinler katottan anoda doğru hareket ederler). Transfer işlemi sonrasında proteinlerin etkin bir şekilde transfer olup olmadığını kontrol etmek amacıyla membran Ponceau Blue çözeltisi ile muamele edildi. Membranın Ponceau ile inkübasyonu geçicidir ve sonrasında antikorların bağlanması için bir engel oluşturmaz, birkaç kez su ile yıkanması sonucunda bu çözelti membrandan uzaklaştırılır. Transfer olan proteinler kırmızı/pembe renkte görülür. Transferin etkinliğini kontrol etmek amacı ile jel Coomassie Blue çözeltisi ile boyandı Membranın Bloke Edilmesi ve Antikorlar ile İnkübasyonu Membran TBS-T içerisinde 5 dk yıkandıktan sonra bloklama çözeltisi (%5 yağsız süt tozu içeren Tween-20-Tris çözeltisi, TBS-T) içerisinde 2 saat oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. Membranın daha sonra protein büyüklük belirleyicisi (PageRuler Prestained Protein ladder, Fermentas) yardımı ile belirlenen uygun yerinden kesildi. Böylece aynı membranda hem yükleme kontrolü olarak kullanılan β-aktin proteini hem de TRPC1,3-6 proteinleri belirlenebilmiştir. β- aktin proteininin (~43 kda) bulunduğu düşünülen membranın alt kısmı anti- β-aktin antikoru (1:1500 dilüsyon, Abcam) ile membranın kalan kısmı anti-trpc1, anti- 104

118 TRPC3, anti-trpc4, anti-trpc5 ve anti-trpc6 antikorları (1:200 dilüsyon, blocking çözeltisi içerisinde, Alomone Labs) ile +4 C de bir gece boyunca inkübe edildi. Antikor ve primerlerin tanıma bölgeleri Şekil 2.9 da gösterilmiştir. Primer antikorlarla inkübasyon sonrasında membran TBS-T ile 5, 15, 5, 5 ve 5 dk (toplam 30 dk) çalkalayıcı üzerinde yıkandı. Membran horseradish peroxidase (HRP)-bağlı keçi anti-rabbit sekonder antikor (DakoCytomation) 1:1500 dilüsyonda (5 µl sekonder antikor + 7,5 ml blocking çözeltisi) 1 saat süresince inkübe edildi. Membran tekrar TBS-T ile yıkandı. Son olarak membran ECL Plus Detection Reagent (Enhanced Chemiluminescence, Amersham Biosciences) ile 5 dk inkübe edildi. Fazla ECL karışımı (975 µl A + 25 µl B) uzaklaştırıldıktan sonra membran bir camın üzerine yerleştirilerek üzeri şeffaf naylon film ile kaplandı. Daha sonra karanlık odada membran röntgen film kasetine yerleştirildi. Kodak röntgen filmi membranın üzerine yerleştirildi. Farklı süreler (1dk-1 saat) film ve membran etkileştirilerek her protein için en uygun süre belirlendi. Daha sonra film banyo edildi. ECL ve ECL + kitlerinin HRP-bağlı sekonder antikorlar için uygun olduğu belirlendi. Bu filmlerin tarayıcı yardımı ile bilgisayar ortamına aktarılmasının ardından Photo-Capt Version 12.4 programı kullanılarak TRPC proteinleri ve β-aktin bandlarının yoğunlukları (optik yoğunluk) hesaplandı. Daha sonra TRPC protein ekspresyon düzeyleri β-aktin proteininin optik yoğunluğuna normalize edildi (TRPCx / β-aktin). 105

119 Şekil 2.9: TRPC1, 3, 4, 5 ve 6 proteinleri için önerilen membran topolojileri Çalışmada kullanılan antikorların proteindeki epitop bölgeleri (bağlanma bölgeleri) kırmızı ile gösterilmiştir. Siyah çerçeve içine alınan bölgeler her gene spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR çalışmalarında elde edilen ürünlerin proteinde karşılık gelen bölgelerini göstermektedir İmmünohistokimya Tüm yaş gruplarından toplanan damar örnekleri %4 fosfatla tamponlanmış formaldehit içerisinde 4 C de bir gece bekletildi. 106

120 Ertesi gün doku örnekleri PBS (ph 7.4) ile yıkandılar ve sonrasında parafine gömüldü. Mikrotom ile 5 mikron boyutunda damar kesitleri alındı. Çalışılacak damar kesitlerinden parafini uzaklaştırmak için 3x 10 dk ksilende inkübe edildi. Daha sonra damar kesitleri dehidratasyon amacıyla % etanol serisinin her birinde 2 dk bekletildi. ddh 2 O içerisinde 2-3 dk hidratasyon aşamasını takiben endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek amacı ile %3 H 2 O 2 ile 30 dk inkübe edildi (peroksidazlar hidrojen peroksit ile reaksiyona girerek daha sonraki aşamada diaminobenzidin (DAB) substratını ya da diğer peroksidaz substratlarını azaltabilir). Kesitler 2 dk 1x PBS ile yıkandı. Antikor ile spesifik olmayan bağlanmaları en aza indirmek amacı ile dokular üzerine %2 BSA/PBS damlatılarak 1 saat inkübe edildi. BSA dokuların üzerinden uzaklaştırıldıktan sonra belirli oranda seyreltilmiş anti-trpc1 (1:50), anti-trpc3 (1:150), anti-trpc4 (1:50), anti-trpc5 (1:150) and anti-trpc6 (1:100) primary poliklonal antikorlar ile +4 C de bir gece boyunca inkübe edildi. Bağlanmayan antikorların uzaklaştırılması amacı ile 3 kez 2 dk 1xPBS ile yıkandı. Doku kesitleri önce biotinlenmiş fare (anti-mouse) ve tavşan (antirabbit) Ig (DakoCytomation, Danimarka) sekonder antikoru ve sonra streptavidin-hrp (DakoCytomation, Danimarka) ile 15 er dk oda 107

121 sıcaklığında inkübe edildi (Şekil). Yine bağlanmayan sekonder antikorlar uzaklaştırılmak üzere 3 kez 2 dk 1x PBS ile yıkandı. Doku kesitlerinin üzerine Liquid DAB+ (DakoCytomation) uygulanarak kahverengi çökelti oluştuktan sonra kesitler dh 2 O ile yıkandılar. Daha sonra hematoksilen ile zıt boyama (counterstain) yapıldı. Boyama tamamlandıktan sonra önce dh 2 O daha sonra çeşme suyu ile kesitler yıkandı. Son olarak Faramount Aqueous Mounting Medium (DakoCytomation) kullanılarak kesitler (üzerine lamel kapatılarak) sabitlendi. İmmünoreaktiviteyi analiz etmek için kesitlerdeki immün-pozitif hücrelerin sayısı yarı-nicel yöntemle skorlandı (3). Skorlama: 0, yok; 1, hafif; 2, orta; 3, yüksek İstatiksel Analiz Tüm veriler ortalama ve ± O.S.H. (ortalamanın standart hatası) olarak ifade edilmiştir. n deneyde kullanılan denek sayısını göstermektedir. Ortalamalar arasındaki farkın anlamlılığı Student s t-testi (iki grup arasında) ya da çoklu karşılaştırmalar için ANOVA ve sonrasında Student-Newman Keuls testi ile analiz edilmiştir. Ortalamalar arasındaki fark P<0.05 olduğunda istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Maksimum etki (E max ) ve maksimum etkinin %50 sini oluşturan ilaç konsantrasyonu (EC 50 ) kademeli konsantrasyon yanıt-eğrileri oluşturulduktan sonra en küçük kareler yöntemi ile iteratif nonlinear eğri yerleştirme programı (KaleidaGraph TM 3.0, Synergy Software) kullanılarak hesaplanmıştır. İstatistiksel karşılaştırmalarda EC 50 değerlerinin geometrik ortalamaları (pd 2 ; EC 50 nin negatif logaritması) kullanılmıştır. 108

122 3. BULGULAR 3.1. Fonksiyonel Çalışmalar: Genç ve yaşlı guruba ait endoteli sağlam damar segmentlerinde endotelyuma bağlı gevşeme yanıtlarını kontrol etmek amacıyla muskarinik reseptör aktivatörü ACh ve SERCA pompasını inhibe ederek SOC kanalları aracılığı ile hücre içi Ca +2 konsantrasyonunu artıran CPA ile doz-yanıt eğrileri oluşturuldu. Tüm deneyler boyunca yaşlanma ile PE yanıtlarında değişiklik oluşma ihtimaline karşılık gevşetici ajanlar öncesinde PE ile oluşturulan ön-gerilimlerin eşit olmasına dikkat edildi. Bu amaçla daha önce belirlenen 100 mm KCl yanıtlarının yaklaşık %80 ini oluşturan eşit etkin PE konsantrasyonunda ( M) gevşetici ajanlar uygulandı. Yapılan analizler sonucunda PE öngerilimlerinin genç ve yaşlı sıçanlarda istatistiksel olarak birbirinden farklı olmadığı belirlendi. ACh ve CPA nın neden olduğu endotelyuma bağımlı maksimum gevşeme yanıtları (% gevşemeler) yaşlanma süresince belirgin derecede azalırken (P<0.01) pd 2 değerlerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 3.1, Tablo 3.2). 109

123 A) Genc Yasli 0 ** ** * pd 2 Genc: 6.64 ± 0.08 Yasli: 6.57 ± 0.20 % Gevseme 50 * ** ** ** ** [ACh] B) 0 Genc Yasli pd 2 Genc: 5.90 ± 0.10 Yasli: 6.01 ± 0.09 % Gevseme 50 ** [CPA] Şekil 3.1: Genç ve yaşlı sıçan aortunda ACh ve CPA doz yanıt eğrileri Genç ( ) ve yaşlı ( ) sıçan aortlarında PE ön-gerilimi üzerine A: ACh ( M) ve B: CPA ( M) ile oluşturulan doz-yanıt eğrileri. Bütün yanıtlar % PE plato yanıtına normalize edilmiştir. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. Grafikte görülen pd 2 değerleri (-log EC 50 ), bireysel olarak hesaplanan pd 2 değerlerinin ortalamasıdır (n=4-6, *P<0.05; **P<0.01 genç ve yaşlı, student t testi). 110

124 Yaşlanma sürecinde endotel kaynaklı gevşeme yanıtları üzerine prostaglandinlerin etkisini incelemek amacıyla aşağıdaki 3 farklı protokol (Kontrol, IND, NS398) gerçekleştirilmiştir: Fenilefrin (PE) ön gerilimi üzerine ACh / CPA Indometazin inkübasyonu (10-5 M, 30 dk) sonrası PE ön gerilimi üzerine ACh / CPA Selektif COX2 inhibitörü NS398 inkübasyonu (10-6 M, 30 dk) sonrası PE ön gerilimi üzerine ACh/ CPA (Şekil 3.2, Tablo 3.1) Uygulanan bu protokoller sonrasında genç ve yaşlı sıçanlarda tek başına ACh ve CPA (kontrol) ile alınan yanıtlara göre indometazin belirgin bir değişiklik oluşturmamıştır. Genç sıçanlarda NS398 hem kontrol hem de indometazin inkübasyonu koşullarında alınan ACh ve CPA yanıtlarını belirgin bir şekilde azaltmıştır (P<0.01). Yaşlı sıçanlarda ise her iki COX inhibitörü de (indometazin ve NS398) ACh yanıtlarını etkilemezken, CPA yanıtlarını belirgin bir şekilde azaltmıştır (P<0.01 Kontrol ve NS398; P<0.05 IND ve NS398)(Tablo 3.1). 111

125 A) B) Genc 100 Kontrol IND ** NS Yasli Kontrol IND NS398 % ACH gevseme 50 % ACH gevseme C) D) 100 Genc Kontrol IND NS Yasli Kontrol IND NS398 % CPA Gevseme 50 ** % CPA Gevseme 50 * Şekil 3.2: Endotel kaynaklı gevşemeler üzerine siklooksijenaz inhibitörlerinin etkisi Genç (A, C) ve yaşlı (B, D) grupta, indometazin (IND, 10 µm, gri sütun) ya da NS398 (10-6 M, siyah sütun) varlığında ve yokluğunda (kontrol, beyaz sütun) PE öngerilimi üzerine ACh (A, B) ve CPA (C, D) % gevşeme yanıtları. Kümülatif veriler (n=4-6, **P<0.01, IND ve NS398; P<0.01, kontrol ve NS398, Student- Newman Keuls testi). 112

126 Tablo 3.1: Genç ve yaşlı sıçanlarda endotelyuma bağlı gevşeme yanıtları üzerine indometazin ve NS 398 in etkileri Bütün yanıtlar % PE plato yanıtına normalize edilmiştir. (n=4-6, **P<0.01, IND ve NS398,, P<0.01kontrol ve NS398; Newman Keul testi). Genç % Gevşeme Kontrol IND NS398 ACh 85 ± 2 74 ± 5 ** 39 ± 5 CPA 77 ± 4 66 ± 8 ** 33 ± 5 Yaşlı % Gevşeme Kontrol IND NS398 ACh 62 ± 3 51 ± 4 45 ± 7 CPA 51 ± 4 46 ± 6 ** 26 ± 3 Yaşlanmanın α 1 -AR yanıtları ve düz kasa bağlı gevşeme yanıtlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak amacı ile endotelsiz dokularda α 1 -AR agonisti PE nin kontraksiyon ve SNP gevşeme doz-yanıt kalıpları belirlenmiştir (Şekil 3.3, Tablo 3.2). Endotelsiz dokularda gerçekleştirilen maksimum PE maksimum kontraksiyonları ve SNP ile oluşturulan endotelyumdan bağımsız maksimum gevşeme yanıtları yaşlanma ile değişmezken yaşlı sıçanlarda bu iki ajanın doz-yanıt eğrileri sola kaymıştır. 113

127 A) 120 % Kontraksiyon ** ** * pd 2 Genc: 7.45 ± 0.07 Yasli: 7.89 ± 0.08 ** 0 * [PE] B) 0 Genc Yasli 20 pd 2 % Gevseme * Genc: 7.96 ± 0.11 Yasli: 8.53 ± 0.22 * [SNP] Şekil 3.3: PE ve SNP doz-yanıt eğrileri Genç ( ) ve yaşlı ( ) endotelsiz sıçan aortlarında (A) PE ( M) ve (B) PE öngerilimi üzerine SNP ( M) ile oluşturulan doz-yanıt eğrileri. Bütün yanıtlar % PE plato yanıtına normalize edilmiştir. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. Grafikte görülen pd 2 değerleri (-log EC 50 ), bireysel olarak hesaplanan pd 2 değerlerinin ortalamasıdır. (n=5-6, *P<0.05; **P<0.01 genç ve yaşlı, student t testi). 114

128 Tablo 3.2: Yaşlanmanın endotel ve vasküler kaynaklı gevşemeler üzerine etkisi ACh, CPA ve SNP % maksimum gevşeme yanıtları, duyarlık değişimleri (pd 2 ) ve PE maksimum kontraksiyonları (% kontraksiyon) ile duyarlığı (pd 2 ) üzerine etkileri. PE maksimum % kasılma yanıtları 100 mm KCl yanıtlarına normalize edilmiştir. Grup Maksimum % Gevşeme pd 2 ACh Genç 85±2 6,6±0,1 Yaşlı 62±3 ** 6,6±0,2 Genç 77±4 5,9±0,1 CPA 1 Yaşlı 51±4** 6,0±0,1 SNP Genç 100 8,0±0,1 Yaşlı 100 8,5±0,2 * Maksimum % Kontraksiyon PE Genç 188±14 7,5±0,1 Yaşlı 195±7 7,9±0,1 ** ACh, CPA ve SNP uygulanmadan önce dokulara PE ile ön-gerilim uygulandı. PE ve SNP deneyleri endotelsiz damarlarda gerçekleştirildi. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. *P<0.05; **P<0.01 genç ve yaşlı (n=4-6). 1 DMSO üst sınırının (% 0,1) aşılmaması için CPA en fazla 10µM konsantrasyonda kullanılmıştır. ACh ve CPA nın neden olduğu endotel kaynaklı gevşemelerin işlevsel olarak ilişkili olup olmadığını test etmek amacıyla her iki ajanın doz-yanıt eğrilerinin doğası değerlendirildi (Şekil 3.4). Bu amaçla iki eğri için paralellik testi yapıldı (Tablo 3.3). 115

129 A) Genc ACh CPA 0 % Gevseme pd 2 ACh: 6.64 ± 0.08 CPA: 5.90 ± 0.10 ** Konsantrasyon B) Yasli ACh CPA 0 % Gevseme pd 2 ACh: 6.57 ± 0.20 CPA: 6.01± 0.09 * Konsantrasyon Şekil 3.4: Reseptör aracılı ve reseptörden bağımsız endotel kaynaklı gevşeme yanıtları (A) Genç ve (B) yaşlı sıçan aortlarında PE ön-gerilimi üzerine ( ) ACh ( M) ve ( ) CPA ( M) ile oluşturulan doz-yanıt eğrileri. Bütün yanıtlar % PE plato yanıtına normalize edilmiştir. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. Grafikte görülen pd 2 değerleri (-log EC 50 ), bireysel olarak hesaplanan pd 2 değerlerinin ortalamasıdır. (n=4, *P<0.05; **P<0.01 genç ve yaşlı, student t testi). 116

130 Tablo 3.3: ACh ve CPA doz-yanıt eğrileri için paralellik testi sonuçları Sağlam dokularda fenilefrin kontraksiyonu sonrası elde edilen ACh ve CPA dozyanıt eğrilerinin eğimlerinin genç ve yaşlı sıçanlarda karşılaştırılması. Paralellik testi: n=4 için t %95 = 2.447, eşleştirilmiş veriler (bd: belirgin değil). n Genç t (hesaplanan) 0,151 bd 0,358 bd 0,017 bd 0,672 bd Yaşlı t (hesaplanan) 0,154 bd 0,008 bd 0,134 bd 0,071 bd pd 2 değerleri anlamlı bir şekilde farklı olmasına rağmen, ACh ve CPA doz-yanıt eğrilerinin eğimleri genç ve yaşlı 4 sıçan aortunun tümünde birbirine paralellik göstermektedir TRPC mrna Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi Genç ve yaşlı sıçanlarda torasik aort ve endotelyumda TRPC1, 3-6 mrna düzeylerini belirlemek amacıylar kantitatif real-time PCR gerçekleştirildi (Şekil 3.5). Sıçan torasik aortunda genç ve yaşlı grubun her ikisinde de TRPC1 mrna sı en fazla eksprese olan alt tiptir. Diğer TRPC alt tiplerinin ekspresyonları TRPC1/ β-aktin e normalize edildiklerinde oluşan sıralama her iki yaş grubunda da aşağıdaki gibidir (Tablo 3.4): TRPC1>> TRPC6 > TRPC3>> TRPC4 117

131 Tablo 3.4: Genç ve yaşlı gruba ait sıçan torasik aortunda TRPC 3,4 ve 6 mrna ekspresyon düzeylerinin TRPC1 düzeyine normalize edilmesi. Bütün değerler % TRPC1/ β-aktin e normalize edilmiştir. TRPC6 TRPC3 TRPC4 TRPC1/ β-actin Genç %10,87 %5,30 %1,48 Yaşlı %10,68 %7,32 %2,63 Çalışmamızda TRPC5 mrna sı sıçan beyninde bulunurken damar düz kas örneklerinde belirlenemedi (Şekil 6.5 B). Endotelyum ve damar düz kasında TRPC 1, 3-6 mrna miktarlarını belirlemek amacıyla hedef β-aktin dizisini taşıyan, kopya sayısı bilinen plazmidlerin seri dilüsyonları kullanılarak her gen için standart eğriler oluşturuldu. Bu eğriler ile her örnekteki TRPC ve β-aktin mrna düzeyleri belirlendikten sonra TRPC değerleri β- aktin değerlerine bölünerek rölatif TRPC miktarları bulundu. Yaşlanma süresince damar düz kasında TRPC1, 3-6 mrna düzeylerinde anlamlı bir değişiklik olmazken (Şekil 3.5 C) endotelyal TRPC4 ve TRPC3 mrna düzeyleri yaşlı sıçanlarda keskin bir şekilde azalmıştır (Şekil 3.5 D). Ancak bir sıçana ait aorttan izole edilen endotelyal RNA miktarı yeterli düzeyde olmadığı için 3 aorttan izole edilen endotelyal RNA örnekleri birleştirildi. Bu şekilde 6 hayvandan endotelyal RNA izolasyonu yapıldı. İstatistiksel olarak endotel örnekleri için denek sayımızın iki olması nedeniyle endotel örneklerine ait bulgulardaki yaşa bağlı değişimler orantısal olarak verildi. Buna göre yaşlanma süresince endotelyal TRPC4 dokuz, TRPC3 ise üç kat azalmıştır. Ayrıca TRPC1 mrna düzeyleri azalırken (yaklaşık 1,4 kat), TRPC6 yaklaşık olarak 2 kat artmıştır (Şekil 3.5 D). 118

132 A) B) C) D) Düz kas 200 Endotel Genç Yasli TRPCx / B-aktin TRPCx / B-aktin TRPC1 TRPC3 0 TRPC4 TRPC6 0 TRPC1 TRPC3 0 TRPC4 TRPC6 Şekil 3.5: Düz kas ve endotelyal TRPC mrna ekspresyonunun RT-PCR ile belirlenmesi A: TRPC1, 3-6 ve β-aktin genlerine spesifik primerler kullanılarak gerçekleştirilen PCR sonrası elde edilen ürünlerin jel elektroforez görüntüleri. Ürünlerin büyüklüklerini (TRPC1, 410 bç; TRPC3, 226 bç; TRPC4, 412 bç; TRPC5, 271 bç, TRPC6, 321 bç; β-aktin, 244 bç) belirlemek amacıyla 50-bç moleküler ağırlık belirteci kullanıldı. Genç ve yaşlı sıçan aort örnekleri sol sütun, endotelyum örnekleri ise sağ sütunda gösterilmiştir. PCR ürünleri %2 agaroz jel elektroforezi sonrası EtBr ile etkileştirilerek görüntülenmiştir. B: VSM ve sıçan beyninde (pozitif kontrol) TRPC5 ve β-aktin PCR ürünleri. C ve D: Genç (beyaz sütun) ve yaşlı (siyah sütun) sıçanlarda damar düz kası (C, n=4-6) ve endotelyum (D, birleştirilmiş örnekler, n=2x3) rölatif TRPC1, 3, 4 ve 6 mrna düzeyleri. Her örnek 3 kez çalışılmış ve bu sonuçların ortalaması dikkate alınmıştır. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. (VSM, vascular smooth muscle, damar düz kası, End, endotelyal) 119

133 3.3. Western Blot Genç, yetişkin ve yaşlı gruplara ait sıçanlardan izole edilen proteinler ile TRPC 1, 3-6 proteinlerine özel antikorlar kullanılarak Western Blot (WB) çalışmaları yapılmıştır. Sağlam aorttan (damar düz kası + endotelyum) elde edilen proteinler ile gerçekleştirilen WB sonucu elde edilen TRPC protein bantlarının (TRPC1 ~ 120 kda, TRPC3 ~ 107 kda, TRPC4 ~ 95 kda, TRPC5 ~ 100 kda ve TRPC6 ~ 105 kda, Şekil 3.6 A) her birinin optik yoğunluğu β-aktin bandının (~ 43 kda) yoğunluğuna normalize edilerek yarı-nicel analiz yöntemi ile TRPC proteinlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir (Şekil 3.6B). Beyinden elde edilen total protein pozitif kontrol, β-aktin ise yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. WB sonuçlarına göre yaşlanma süresince TRPC6 protein ekspresyonu belirgin derecede artmıştır (yaklaşık 4 kat, P<0.01, genç ve yaşlı). Diğer yandan yaşlı sıçanlarda TRPC1 ve TRPC3 protein düzeylerinde azalma gözlenirken (yaklaşık 2 ve 4 kat, sırası ile) kümülatif veriler istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır. TRPC4 protein düzeyleri ise yetişkin sıçanlarda genç sıçanlara göre belirgin derecede azalmıştır (P<0.05, genç ve yetişkin). Şekil 3.6B de görüldüğü gibi genç sıçanlarda TRPC4 proteininin ekspreyonu yaşlı sıçanlardan yaklaşık olarak 2 kat daha fazladır. TRPC5 mrna düzeyinde damar düz kasında belirlenemezken, protein düzeyinde yetişkin sıçanlarda genç ve yaşlı sıçanlara göre belirgin derecede artmıştır (P<0.01, yetişkin ve yaşlı; P<0.05, yetişkin ve genç, Şekil 3.6B). 120

134 A B Şekil 3.6: Tüm gruplara ait sıçan torasik aortunda TRPC 1, 3-6 proteinlerinin WB ile belirlenmesi A: Genç, yetişkin ve yaşlı sıçan sağlam aortlarından izole edilen proteinlerde WB ile belirlenen TRPC bantları (TRPC1~ 120 kda, TRPC3~ 107 kda, TRPC4 ~ 95 kda, TRPC5 ~ 100 kda ve TRPC6 ~ 105 kda). B: Tüm yaş gruplarına ait TRPC protein düzeylerinin kümülatif verileri. TRPC bant yoğunlukları β-aktin proteinin bant yoğunluğuna normalize edilerek protein ekspresyon düzeyleri yarı-nicel yöntemle belirlenmiştir (n=3). β-aktin yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. **P<0.01 yaşlı ve genç; #P<0.05 yetişkin ve genç; ++P<0.01 yetişkin ve yaşlı, Student-Newman Keuls testi. Değerler ortalama ve ortalamanın standart hatası (Ort±O.S.H.) olarak verilmektedir. 121

135 3.4. İmmünohistokimya Aort ve endotelyum için yapılan IHC analizi yaşlanma süresince TRPC kanal alt birimlerinin değişen ekspresyonlarını yerleşimine bağlı olarak görmemizi sağlamıştır. TRPC6 dışındaki tüm alt tipler yaşlanma ile birlikte azalmıştır (Şekil 3.7). Bulgularımız TRPC6 ekspresyonunun belirgin derecede arttığını göstermektedir (Şekil 3.7J). Ayrıca yaşlı aort segmentlerinde TRPC1, TRPC4 ve TRPC6 proteinlerinin ekspresyonları adventisyada daha yoğun gözlenmektedir (Şekil 3.7B, F, J). Diğer yandan anti α-aktin antikorunun tüm damar düz kas tabakası boyunca pozitif boyama verdiği gözlenmiştir (veri gösterilmedi). Antikorlarımızın spesifik bağlanmalarını kontrol etmek amacıyla birinci antikor kullanmadığımız deneylerde beklendiği gibi hiçbir boyama gözlenmedi (Şekil 3.7K). 0: Şekil 4K 1: Şekil 4D, G, H 2: Şekil 4B, E, F, I; 3: 4A, C, J. 122

136 Şekil 3.7: TRPC proteinlerinin IHC yöntemi ile belirlenmesi TRPC antikorları ile TRPC proteinlerinin genç ve yaşlı sıçan torasik aort kesitlerinde belirlenmesi. A, B: TRPC1; C, D: TRPC3; E, F: TRPC4; G, H: TRPC5; I, J: TRPC6; K: NK Endotelyum ve düz kas tabakalarında pozitif boyama kahverengi renkte görünmektedir. Negatif kontrol (NK) deneyleri birinci antikorun yokluğunda gerçekleştirildi. Mavi renkli noktalar hematoksilenle boyanmış hücre çekirdeklerini göstermektedir. A daki ölçek çizgisi 40 µm dir. 123