EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ)

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ) SİVRİBURUN KARAGÖZ (Diplodus puntazzo, Cetti 1777) BALIKLARINDA LARVAL DÖNEM BOYUNCA TESPİT EDİLEN SİNDİRİM ENZİMLERİ AKTİVİTESİNDEKİ DEĞİŞİMLER Sevim AKTÜLÜN Su Ürünleri Yetiştiricilik Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: Şubat 2007 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Atilla ALPBAZ Bornova-İZMİR

2 86 ÖZGEÇMİŞ T.C. vatandaşı olan Sevim AKTÜLÜN, tarihinde Elazığ da doğdu. İlk ve orta öğrenimini tamamladıktan sonra 1992 yılında Fırat Üniversitesi E.M.Y.O. Su Ürünleri Bölümünü kazandı öğretim yılında Ege Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesine dikey geçiş yaptı ve 1996 yılında fakülteyi iyi derece ile bitirdi. Aynı yıl E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalında yüksek lisans eğitimine başladı yılında Pınar Deniz Ürünleri A.Ş. de işe başladı yılında yüksek lisans eğitimini tamamlayarak Su Ürünleri Yüksek Mühendisi ünvanını aldı. Aynı yıl E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalında doktora eğitimine başladı yılında Akuvatur Su Ürünleri A.Ş. de işe başladı. Halen aynı firmada çalışan Sevim AKTÜLÜN evlidir.

3 III Sayın Sevim AKTÜLÜN tarafından DOKTORA TEZİ olarak sunulan Sivriburun Karagöz (Diplodus puntazzo, Cetti 1777) Balıklarında Larval Dönem Boyunca Tespit Edilen Sindirim Enzimleri Aktivitesindeki Değişimler başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oy birliği/oy çokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri İmza Jüri Başkanı : Prof. Dr. Atilla ALPBAZ Raportör Üye: Prof Dr. Osman ÖZDEN Üye : Prof. Dr. Altan LÖK Üye : Yrd. Doç. Dr. Cüneyt SÜZER Üye : Yrd. Doç. Dr. Selma KATALAY

4 85 Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., 1994a. Influence of diet on pepsin and some pancreatic enzymes in sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Comp.Biochem. Physiol., 109A: Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., 1994b. Development and response to a diet change of some digestive enzymes in sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Fish Physiol. Biochem., 12: Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., High dietary lipid levels enhance digestive tract maturation and improve Dicentrarchus labrax larval development. J. Nutr., 129: Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., Ontogeny of the gastrointestinal tract of marine fish larvae. Comp. Biochem. Physiol., 130C: Zambonino Infante, J.L., Cahu, C.L., Peres, A., Quazuguel, P., and Le Gall, M.M., Sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae fed different Artemia rations: growth, pancreas enzymatic response and development of digestive functions. Aquaculture, 139:

5 V ÖZET SİVRİBURUN KARAGÖZ (Diplodus puntazzo, Cetti 1777) BALIKLARINDA LARVAL DÖNEM BOYUNCA TESPİT EDİLEN SİNDİRİM ENZİMLERİ AKTİVİTESİNDEKİ DEĞİŞİMLER AKTÜLÜN, Sevim Doktora Tezi, Su Ürünleri Yetiştiricilik Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof Dr. Atilla ALPBAZ Şubat 2007, 86 sayfa Bu çalışmada, sivriburun karagöz balığının larval dönem (0 45 gün) süresince tespit edilen sindirim enzim aktivitelerindeki değişimler incelenmiştir. Deneme sonunda larvalara ait total boy ve ağırlık gelişimleri incelendiğinde, total boy 13.55±0.49 mm ve ağırlık ise ±86.18 mg tespit edilmiştir. Larvalarda yaşama oranı 25. güne %25 30, 25. günden sonra %85 98 civarında saptanmıştır. Tripsin aktivitesi ilk olarak larva yumurtadan çıktığında tespit edilmiş, ağız açılımının olduğu 3. günde eksojen besin alımı ve larval gelişime bağlı olarak sonraki günlerde artış göstermiştir. 25. günden itibaren azalmaya başlayan tripsin aktivitesi deneme sonuna kadar azalım eğilimini sürdürmüştür. Pepsin aktivitesi ilk olarak mide oluşumu ile birlikte 32.günde tespit edilmiştir. Bu günden itibaren artarak devam eden pepsin spesifik aktivitesi en yüksek değerine 40. gün ulaşmış ve bu günden sonra deneme sonuna kadar azalmaya devam etmiştir.

6 84 Tseng, H.C., Grendell, J.H., Rothman, S.S., Food, deodenal extracts, and enzyme secretion by the pancreas. Am. J. Physiol., 243, G304-G312. Tunesi, L., Vacchi M.&Mori, M., Osservazioni sugli stadi giovanilli del genere Diplodus nelle acque del Golfo Tigullio (Mar Ligure ).In: Atti del 11 th Congresso di Ocean ologia e Limnologia, 1996(ed. By Albertelli G., De Maio A.& Piccazzo M.), pp AIOL, Genova. Uslan, H. A., Enzim Kinetiği. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s: Walford, J., Lam, T.J., Development of the digestive tract and proteolytic enzyme activity in sea bass (Lates calcarifer) larvae and juveniles. Aquaculture, 109: Vivasª, M., Rubioª, V.C., Sachez-Vazquezª, F.J., Mena, C., Garcia, B., Madridª*, J.A., Dietary self-selection in harpsnout seabream(diplodus puntazzo)fed paired macronutrient feeds and challenged with protein dilution. Aquaculture 251: Worthington, T.M., Enzymes and related biochemicals. Biochemical Products Division. Worthington Diagnostic System Freehold, NJ.

7 Amilaz enzim aktivitesi ilk olarak 2. günde tespit edilmiş ve 10. güne kadar spesifik aktivitesi artarak devam etmiştir. Bu günden sonra azalan aktivite, mikropartikül toz yem girişine bağlı olarak 35. günde artmış ve deneme sonuna kadar dalgalanarak devam etmiştir. Lipaz enzim aktivitesi ilk olarak 4. günde tespit edilmiş, 20. güne kadar atarak devam etmiştir. Bunun ardından enzim aktivitesinde azalma eğilimi gözlenmiş ve 35. günden itibaren mikropartikül toz yem girişine bağlı olarak yükselmeye başlamıştır. Anahtar sözcükler: Sivriburun karagöz, Diplodus puntazzo, larval gelişim, yaşama oranı, sindirim enzimleri.

8 83 Tarrojen, Atienza, M., Chatzifotis, S., Divanach, Pascal, macronutrient selection by sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo). Aquaculture (Baskıda). Tekman, Ş., Öner, N., Genel Biyokimya Dersleri, İstanbul Üniversitesi Yayınları No:3773, Eczacılık Fakültesi No:67, İstanbul. Telefoncu, A., 1997a. Enzimlerin Endüstriyel Uygulamaları. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s: Telefoncu, A., 1997b. Tedavi ve İlaç Tasarımında Enzimler. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s: Tramati, C., Savona, B.,and Mozzola, A., Astudy of the pattern of digestive enzymes in Diplodus puntazzo(cetti, 1777)(Osteichthyes sparidae): evidence fort he definition of nutritional protocols. Laboratory of Marine Biology and Sea Resources, Department of Animal Biology, University of Palermo, Via Archirafi 18, Palermo Italy.Aquaculture International 13:89-95 Trevor Palmer, B.A., Understanding Enzymes, Second Edition. Ellis Horwood Limited, 1985.

9 VII ABSTRACT VARIATIONS ON DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES IN SHARPSNOUT SEABREAM (Diplodus puntazzo, Cetti, 1777) DURING LARVAL DEVELOPMENT AKTÜLÜN, Sevim Ph.D. in Faculty of Fisheries, Aquaculture Department Supervisor: Prof. Dr. Atilla ALPBAZ February 2007, 86 pages In this study, specific activities of main digestive enzymes were investigated in sharpsnout sea bream, Diplodus puntazzo, during larval development (0-45 days). At the end of the experiment, total length development and weight were determined as 13.55±0.49 mm and ±86.18 mg. Moreover, survival rates were changed between 25 and 30% until day 25, after this date it changed between 85 and 98%. Trypsin was firstly detected as early as hatching and then increased from day 3 related with mouth opening and exogen food intake depend on larval development. From day 25, specific activity of trypsin decreased and continued to decline until end of the experiment. Pepsin was detected on day 32 related with stomach formation. After this date, it continued to increase and reached up to peak on day 40 and kept this level until end of the experiment. Amylase was firstly determined on day 2 and increased to day 10. After this date, slight decreases were measured but it increased

10 82 Rondon, M., Hermandez, M.D., Egea, M.A.,Garcia, B., Rueda, F.M., Martinez, F.J., Effect of feeding rate on fatty acid composition of sharpsnout seabream(diplodus puntazzo). Aquac. Nutr. 10, Rønnestad, I., Rojas Garcia, C.R., Kamisaka, Y., Koven, W., Barr, Y., Fyhn, H.J., and Conceição, L.E.C., Ontogeny of digestive function of marine fish larvae. Larvi 01-Fish&Shellfish Larviculture Symposium, C.J. Hendry, G. Van Stappen, M. Wille and P. Sorgeloos (Eds), European Aquaculture Society, Special Publication, No:30, pp: , Oostende, Belgium, Sterchi, E., E. and Stöcker, W., Proteolytic Enzymes Tools and Targest. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Süzer, C., Mercan (Pagellus erythrinus, L.1758) balıklarında larval dönem boyunca tespit edilen sindirimenzimleri aktivitesindeki değişimler. E.Ü. fen Bilimleri Enstitüsü, Su ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Bornova-İZMİR.. Suzer, C., Fırat, K. and Saka, Ş., Ontogenic development of the digestive enzymes in common pandora, Pagellus erythrinus, L. larvae. Aquaculture Research 37,

11 again concurrently with microparticulate food introduction and fluctuated until end of the experiment. Lipase was firstly detected on day 4 and increased to day 20. Then, activity of lipase was decreased and increased with microparticulate food introduction from day 35. Keywords: Sharpsnout sea bream, Diplodus puntazzo, larval development, survival rate, digestive enzymes.

12 81 Michale, V., Perdichizzi, F. And Basciano, G., Aspect of the reproductive biology of the sharpsnout seabream Diplodus puntazzo (Cetti, I. Gametogenesis and gonadal cycle in captivity during the third year of life. Aquaculture 140: Moyano, F. J., Diaz, M., Alarcon, F. J., and Sarasquete, M. C., Characterisation of digestive enzyme activity during larval development of gilthead seabream (Sparus aurata). Fish Physiology and Biochemistry 15, Papandroulakis, N., Kentouri, M., Maingot, E., and Divanach, P., Mesocosm: a reliable technology for larval rearing of Diplodus puntazzo and Diplodus sargus sargus. Aquaculture International 12, Péres, A., Zambonino Infante, J.L., Cahu, C.L., Dietary regulation of activities and mrna levels of trypsin and amylase in sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Fish Physiol. Biochem., 19: Ribeiro, L., Zambonino-Infante, J.L., Cahu, C., Dinis, M.T., Development of digestive enzymes in larvae of Solea senegalensis, Kaup Aquaculture, 179:

13 IX TEŞEKKÜR Tez çalışmam süresince yönlendirme ve desteğini gördüğüm danışmanım sayın Prof. Dr. Atilla ALPBAZ a, Şu ana kadar yaptığımız tüm çalışmalarda maddi manevi yardım ve desteklerini asla esirgemeyip daima yol gösteren değerli hocalarım sayın Prof. Dr. Kürşat FIRAT ve Doç. Dr. Şahin SAKA ya Seminer ve tez çalışmamın yürütülmesinde, tamamlanmasında ve yazım aşamasında bilgi, yardım ve desteklerini her zaman hissettiğim sevgili arkadaşlarım sayın Yrd. Doç. Dr. Cüneyt SUZER e, Araş. Gör. Dr. Deniz ÇOBAN a ve Araş. Gör. Dr. H.Okan KAMACI ya, Çalışmamın yürütülmesinde sahip oldukları olanakları sınırsızca kullanmamı sağlayan ve yardımlarını esirgemeyen Akuvatur Yönetim Kurulu Başkanı sayın Dr. Haluk TUNCER e, Bu güne kadar yürüttüğümüz her çalışmada ve doktora öğrenimim boyunca sahip olduğu bilgi ve manevi desteği esirgemeyen Teknomar Su Ürünleri A.Ş. Tesis Yöneticisi, Su Ürünleri Mühendisi ve sevgili eşim Bülent HAMZAÇEBİ ye Beni bu günlere hiçbir karşılık beklemeden sevgiyle getiren ve her zaman inanan ve destekleyen sevgili aileme teşekkürü bir borç bilirim. Sevim AKTÜLÜN Şubat, 2007

14 80 Lazo, J.P., Holt, G.J., Arnold, C.R., Ontogeny of pancreatic enzymes in larval red drum Sciaenops ocellatus. Aquaculture Nutrition, 6: Le Vay, L., Rodriguez, A., Kamarudin, M.S., Jones, D.A., Influence of live and artificial diets on tissue composition and trypsin activity in Penaeus japonicus larvae. Aquaculture, 118 : Loy, A., Busilacchi, S., Costa, C., Ferlin, L., Cataudella, S.,2000. Comparing geometric morphometrics and outline fitting methods to monitor fish shape variability of Diplodus puntazzo (teleostei: Spridae). Aquacultural Engineering 21: Marangos, C., Larviculture of the sheep shead bream, Puntazzo puntazzo (Gmelin 1789)(Pisces sparidae). CIHEAM-Options Mediterraneennes vega Sagro aquaculture LTD 296, ST. Andrews STr, Limassol CYPRUS Martinez, I., Moyano, F.J., Fernández-Diaz C., and Yufera, M., Digestive enzyme activity during larval development of the Senegal sole (Solea senegalensis). Fish Physiol. Biochem., 21: Métais, P. and Bieth, J., Détermination de l α-amylase par une microtechnique. Ann. Biol. Clin. 26,

15 XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET V ABSTRACT VII TEŞEKKÜR IX ŞEKİLLER DİZİNİ XIII ÇİZELGELER DİZİNİ XV 1. GİRİŞ 1 2. LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo, Cetti.1777) Balığının Biyolojik Özellikleri Morfolojisi Karşılştırmalı Morfolojisi Üreme Özellikleri Enzimler Enzimlerin Özellikleri Enzimlerin Yapısı ve Sınıflandırılması Oksidoredüktazlar Transferazlar Hidrolazlar Liyazlar İzomerazlar Ligazlar 20

16 79 Kolkovski, S., Tandler, A., Kissil, G.W., Gertler, A., The effect of dietary exogenous digestive enzymes on ingestion, assimilation, growth and survival of gilthead sea bream larvae. Fish Physiol. Biochem., 12: Kolkovski, S., Digestive enzymes in fish larvae and juvenilesimplications and application to formulated diets. Aquaculture, 200: Kolkovski, S., Tandler, A., Izquierdo, M.S., Effects of live food and dietary digestive enzymes on the efficiency of microdiets for sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Aquaculture, 148: Krogdahl, A. and Sundby, A., Characteristics of pancreatic function in fish. In: Pierzynowski, S.G., Zabielski, R. (Eds.), Biology of the Pancreas in Growing Animals. Elsevier Science, Amsterdam, pp Kurokawa, T. and Suzuki, T., Formation of the diffuse pancreas and the development of digestive enzyme synthesis in larvae of the Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture, 141 : Kuz mina, V.V., Influence of age on digestive enzyme activity in some freshwater teleosts. Aquaculture, 148:

17 İÇİNDEKİLER (Devamı) Sayfa 2.8. Enzimlerin Aktivitesini Etkileyen Faktörler Sıcaklık ph Enzim Konsantrasyonu Substrat Konsantrasyonu Zaman Diğer iyon ve kimyasal maddelerin etkisi MATERYAL VE METOD Anaç Yönetimi Yumurta Temini ve İnkübasyonu Larval Üretim ve Deneme Düzeni Enzim Analizleri Tripsin Pepsin Amilaz Lipaz Protein İstatistik ARAŞTIRMA BULGULARI Anaç Yönetimi ve Yumurta İnkübasyonu Larval Gelişim Enzim Analizleri Tripsin (E.C ) 52

18 78 Hidalgo, M.C., Urea, E., and Sanz, A., Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits. Proteolytic and amylase activities. Aquaculture, 170: Izquierdo, M.S. and Henderson, R.J., The determination of lipase and phospholipase activities in gut contents of turbot (Scophthalmus maximus) by fluorescence-based assays. Fish Physiol. Biochem., 19: Karlson, P., Biyokimya. Arkadaş Tıp Kitapları Seri No: 7, Çeviren: Prof. Dr. Azmi Telefoncu, İstanbul. Kim, B.G., Divakaran, S., Brown, C.L., and Ostrowski, A.C., Comparative digestive enzyme ontogeny in two marine larval fishes: Pacific threadfin (Polydactylus sexfilis) and bluefin trevally (Caranx melampygus). Fish Physiol. Biochem., 24: Kocabıyık, S., Genetik Mühendisliğinde Enzimler. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s: Kolios, P., Kiritsis, S., and Katribusas, N., Larval rearing and growout of the red porgy (Pagrus pagrus) in the Riopesca hatchery (Greece). Hydrobiologia, 358:

19 İÇİNDEKİLER (Devamı) Sayfa Pepsin (E.C ) Amilaz (E.C ) Lipaz (E.C ) TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR DİZİNİ 74 ÖZGEÇMİŞ 86

20 77 Divakaran, S., Kim, B.G., and Ostrowski, A.C., Digestive enzymes present in Pasific threadfin Polydactylus sexfilis (Bloch and Schneider 1801) and bluefin trevally Caranx melampygus (Cuvier 1833). Aquaculture Research, 30: Fernández, I., Moyano, F.J., Diaz, M, Martinez, T., Characterization of α-amylase activity in five species of Mediterranean sparid fishes (Sparidae, Teleostei). J. Exper. Mar. Biol. And Ecol., 262: Franicevic, V., Improvements in intensive rearing of Puntazzo puntazzo(gmelin 1789) (Pisces, Sparidae) larvae. In : Billard, R, De Pauw, N.(Eds.), Aquaculture Europe, 89. E.A.S. Special Publication NO.10, Ghent, Belgium. Pp Georgiou, G., Stephanou, D., Contribution to the study of maturation and spawning problems of the sharpsnout sea bream (Puntazzo puntazzo). CIHEM options Mediterranean. Gözükara, E.M., Biyokimya 2, Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul. Hernandez, M.D., Egea, M.A., Rueda, F.M., Aguado, F., Martynez, F.J., Garcia, B., Effect of commercial diets with different P/E ratios on sharpsnouth seabream Diplodus puntazzo growth and nutrient utilization. Aquaculture 195,

21 XIII ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının genel görünüşü 4 Şekil 2.2. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo,cetti 1777) balığının morfometrik tanımlamaları ve yüzgeç formülleri 6 Şekil 2.3. Karagöz, sivriburun karagöz ve sargoz balıklarının karşılaştırmalı morfolojisi 9 Şekil 2.4. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının dağılım alanları 10 Şekil 2.5. Enzimlerin genel çalışma prensibi 14 Şekil 2.6. Substrat-Enzim mekanizması 16 Şekil 3.1. Denemede kullanılan anaç tankı 32 Şekil 3.2. Yumurtaların inkübe edildiği 200 litrelik inkübatörler 34 Şekil 3.3. Denemede kullanılan larva tankı 35 Şekil 3.4. Denemede kullanılan A-Rotifer ve B-Artemia 36 Şekil 3.5. Tripsin enzim aktivitesi analiz yöntemi 43 Şekil 3.6. Pepsin enzim aktivitesi analiz yöntemi 44 Şekil 3.7. Amilaz enzim aktivitesi analiz yöntemi 46 Şekil 3.8. Lipaz enzim aktivitesi analiz yöntemi 47

22 76 Cahu, C.L., and Zambonino Infante, J.L., Substitution of live food by formulated diets in marine fish larvae. Aquaculture, 200: Cahu, C.L., Zambonino Infante, J.L., Escaffre, A.M., Bergot, P., Kaushik, S., Preliminary results on sea bass Dicentrarchus labrax larvae rearing with compound diet from first feeding. Comparison with carp Cyprinus carpio larvae. Aquaculture, 169, 1 7. Day, O.J., Howell, B.R., Jones, D.A., The effect of dietary hydrolysed fish protein concentrate on the survival and growth of juvenile Dover sole Solea solea L. during and after weaning. Aquacult. Res., 28: Diaz, M., Moyano, F.J., Garcia-Carreno, F.L., Alarcon, F.J. and Sarasquete, M.C., Substrate SDS-PAGE determination of protease activity through larval development in sea bream. Aquaculture International 5, Dinçkaya, E., 1997b. Enzimolojiye Genel Bakış. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s:1-15. Dinçkaya, E., 1997b. Enzimolojiye Genel Bakış. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu 1997 (Editör Azmi Telefoncu), s:1-15.

23 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Sayfa Şekil 4.1. Sivriburun karagöz larvalarının total boy ve ağırlık gelişimi 51 Şekil 4.2. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen tripsin enzim aktivitesi değişimi 53 Şekil 4.3. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen pepsin enzim aktivitesi değişimi 54 Şekil 4.4. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen amilaz enzim aktivitesi değişimi 55 Şekil 4.5. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen lipaz enzim aktivitesi değişimi 56

24 75 Buchet, V., Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., Variation in activities of some digestive enzymes during larval development of Sciaenops ocellatus. In: Creswell, L., Harache, Y. (Eds.), Island Aquaculture and Tropical Aquaculture. Communications and Abstracts Martinique 97 European Aquaculture Society International Conference, Les Trois Ilets, Martinique, 4-9 May European Aquaculture Society, Oostende, pp Buchet, V., Zambonino Infante, J.L., and Cahu, C.L., Effect of lipid level in a compound diet on the development of red drum (Sciaenops ocellatus) larvae. Aquaculture, 184: Cahu, C.L. and Zambonino Infante, J.L., Early weaning of sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae with a compound diet: effect on digestive enzymes. Comp. Biochem. Physiol., 109A: Costa, C., Descrittori morfologici in sargo pizzuto (Diplodus puntazzo, Cetti Sparidae Teleostea, Pisces): gli efftti dellall evamenta Degree Thesis, University of Roma Tor Vergala; 117 pp. Cahu, C.L., and Zambonino Infante, J.L., Is the digestive capacity of marine fish larvae sufficient for compound diet feeding? Aquacult. Int., 5,

25 XV ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Sivriburun karagöz Balığının Yumurtlama Periyodu 11 Çizelge 2.2. Pankreas ve Mideden Proenzim Halinde Sentezlenen Başlıca Proteolitik Enzimler 23 Çizelge 3.1. Denemelerde kullanılan Proton Mikropartikül Yemin Besin Madde İçeriği 37 Çizelge 3.2. Sivriburun Karagöz Larva Üretim Protokolü 39

26 74 KAYNAKLAR DİZİNİ Alliot, E., Enzymologie digestive. III. Evolution de quelques activités digestives au cours du développement larvaire des téléostéens. In: Nutrition des poissons. pp Edited by M. Fontaine. Actes de colloque Cnerna-Paris. Baglole, C.J., Goff, G.P. and Wright, G.M., Distribution and ontogeny of digestive enzymes in larval yellowtail and winter flounder. J. Fish Biol. 53: Bodington, P., Enterprise experiences in the culture of new sparids. Recent advencesin Mediterranean Aquaculture Finfish Species Diversication. Proceedings of the seminar of the CIHEAM Network on Teknology of Aquaculture in the Mediterranean(TEAM), organized by CIHEM and FAO, Saragoza May, 1999, pp Boglione a, C., Costaª, C., Di Datoª, P., Ferziniª, G., Scardiª, M., Cataudellaª, S.,2003. Skeletal quality assessment of reared and wild sharpsnout sea bream and Pandora juveniles. Aquaculture, 227: Bradford, M.M., A rapid sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72:

27 73 optimizasyonu belirlemektedir. Özellikle, biyotik faktörlerden besleme, larval gelişim ve yaşama oranını doğrudan etkilemektedir. Larva üretim çalışmalarında, kullanılan yemin boyutları ve özellikleri ile birlikte larva gelişimine bağlı olarak larvanın besin madde gereksinimi de önemlidir. Bu bağlamda, sindirim enzimleri aktivitesinin değişimleri belirleyici bir rol oynamaktadır. Larval dönemde meydana gelen fizyolojik olayların ve söz konusu bu enzimlerin aktivitelerindeki günlere bağlı değişimlerin bilinmesiyle oluşturulacak besleme stratejileri larval gelişimi hızlandırıp yaşam oranını da artıracaktır. Sonuç olarak, son yıllarda Akdeniz ülkelerinde alternatif türler arasında sıklıkla anılmaya başlanan sivriburun karagöz larvalarında sindirim enzim aktiviteleri ontogenisinin incelendiği bu çalışmada, enzim gelişim profilleri aktivitesi bugüne kadar tespit edilmiş Sparid larvalarındaki tabloya benzer bir profil sergilemiştir. Ayrıca, fonksiyonel mide oluşumunun en büyük göstergesi olarak kabul edilen pepsin enzimi sentezi 32. günde başlamış ve bu türün sövraj uygulamalarının bugünden itibaren rahatlıkla başlayabileceği düşüncesini oluşturmuştur. Bu durum yapılan yetiştiricilik çalışmalarından elde edilen değerlerin biyoteknoloji kullanılarak daha bilimsel ve daha geçerli üretim protokol ve metodlarının tanımlanıp uygulanması için oldukça önemlidir.

28 72 lipid miktarı ile doğrudan ilişkilidir. Bunun yanı sıra larvada meydana gelen önemli morfolojik ve fizyolojik değişimler bu enzim aktivitesini olumsuz yönde etkilemektedir. Öte yandan, özellikle mikropartikül toz yem girişinin ardından Lipaz enzim aktivitsinde de göreceli artışlar tespit edilmiştir. Bu artışın en büyük nedeninin mikropartikül toz yem içeriğindeki lipid miktarı olduğu düşünülmektedir (Zambonino Infante and Cahu, 2001; Cahu and Zambonino Infante, 2001). Sindirim enzimleri aktivitesinin tespiti ve günlere bağlı değişimlerinin bilinmesi larva kalitesinin yükselmesi deniz balıkları larva üretiminde ve yaşama oranının artırılmasında önemli bir aşama oluşturmaktadır. Mikropartikül yem girişinin yapılacağı günlerin tespiti, larval gelişimi hızlandırmak açısından aktivitelerin değişimi ile bağlantılı olup oldukça önemlidir. Bununla birlikte, kültürü yapılan türlerin beslenme alışkanlıklarına göre besleme stratejilerinin belirlenmesi ve protokollerin oluşturulması, sindirim enzim aktivitelerinin gelişimi sonucunda belirlenmektedir. Larva üretim çalışmalarında, canlı yem üretim prosesinin kompleks bir yapı sergilemesi, spesifik koşullara gereksinim duyması ve üretim maliyetinin yüksek olması üreticileri mikropartikül yem kullanımına yönlendirmektedir. Öte yandan mikropartikül yemlerin üretim ve stok açısından kompleks proseslere gereksinim duymaması, besin madde içeriğinin larvanın besin gereksinimlerine göre düzenlenebilmesi önemli bir avantaj oluşturmaktadır. Başarılı bir larval üretimin temelini, biyotik (besleme, genetik, fizyoloji vb) ve abiyotik (sıcaklık, ışık, tuzluluk vb) faktörlerin

29 71 güne kadar gözlenen bu artışın pankreasın oluşmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Öte yandan 20. ile 25. günler arasında gözlenen aktivitedeki yavaşlamanın, rotiferin azalmasına bağlı olarak ortama herhangi bir zenginleştirme uygulaması yapılmayan Artemia nauplii girilmesi, 15. ile 20. günler arasında gözlenen aktivitedeki artışın HUFA açısından zenginleştirilen Artemia metanauplii verilmesi nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Ayrıca Selco türevli ticari zenginleştiricilerin içeriğindeki trigliseridlerde bu dönemde lipaz aktivitesini artıran etkenlerden sayılabilir. Bu değerlere benzer sonuçlar, Senegal dil balığı (Solea senegalensis) (Martinez et al., 1999), eşkine (Sciaenops ocellatus) (Buchet et al., 1997, 2000) ve levrek (Dicentrarchus labrax) (Zambonino Infante and Cahu,1999) için bildirilmiştir günler arasında tespit edilen lipaz enzim aktivitesindeki azalmanın nedeni olarak metamorfoz başlangıcının olduğu düşünülmektedir. Özellikle pepsin aktivite tayini sırasında, 30. günde önemsiz miktarlarda pepsin sentezlenmesi populasyondaki bazı bireylerin mide oluşumu ve metamorfoz geçirmekte olduğu düşüncesini oluşturmuştur. Denemenin 40. gününe kadar, aktivitenin aynı düzeylerde seyretmesi bu enzimin metamorfozdan büyük ölçüde etkilendiğini göstermektedir. Senegal dil balığı (Solea senegalensis )(Martinez et al., 1999), levrek (Dicentrarchus labrax) (Zambonino Infante and Cahu,1999) çipura Sparus aurata (Fernandez et al., 2001) ve eşkine (Sciaenops ocellatus) (Buchet et al., 2000) larvalarında da bu durum metamorfoz ile ilişkili bulunmuştur. Sonuç olarak, larval dönemdeki lipaz aktivitesi kullanılan yem içeriğindeki trigliserid ve

30 70 sayısı>12) yağ asitlerini içeren triaçilgliserolleri hidroliz edebilir. Kısa zincirli yağ asitleri içeren triaçilgliseroller bağırsak mukozasından sindirilmeden emilir. Sonuç olarak, besinlerle alınan ve uzun zincirli yağ asitleri içeren triaçilgliserollerin bağırsak boşluğunda lipazın etkisiyle sindirilmesinde oluşan ve emilen son ürünlerin başlıcaları 2- monoaçilgliseroller ve serbest yağ asitleridir (Izquierdo and Henderson, 1988; Karlson, 1992; Gözükara, 1997). Lipaz enzimi ilk olarak 4. günde tespit edilmiş ve 20. güne kadar artış göstermiştir. Senegal dil balığı (Solea senegalensis) larvalarında lipaz aktivitesi ilk olarak 3. günde tespit edilmiştir. Ayrıca pankreasın oluşumu süresince (6-10. gün) aktivitenin arttığı ve sonrasında azaldığı belirtilmiştir (Martinez et al., 1999). Yine bir sparid üyesi olan kırma mercan (Pagellus erythrinus) larvalarındada Lipaz enzim aktivitesi tespiti ilk olarak 4. günde tespit edilmiş, sonraki günlerde spesifik aktivitesi artarak devam etmiştir. Benzer şekilde, levrek larvalarında ilk olarak 5. günde tespit edilmiş ve sonraki günlerde aktivitesi artarak devam etmiştir (Zambonino Infante et al. 1996; Zambonino Infante and Cahu, 1999). Teleost balıklarda larval periyodun ilk günlerinde pankreas sindirim tüpünden tomurcuklanarak oluşmakta ve pankreatik enzimler sentezlenmeye başlamaktadır (Krogdahl and Sundby, 1999). Öte yandan yine Japonya da kültürü yoğun olarak yapılan Japon dil balığı (Paralichthys olivaceus) türünün larvalarında pankreas oluşumu incelenmiştir. 2. günden itibaren pankreas enzimlerinin sentezlemeye başladığını ve 3. gün ve sonrasında ise lipaz ve enzim aktivitesinin tespit edildiğini bildirilmiştir (Kurokawa and Suzuki, 1996). Bu çalışmada lipaz aktivitesinde 10.

31 69 oranına bağlı olarak göreceli bir artış sözkonusudur. Perés et al. (1998) (Dicentrarchus labrax) levrek larvalarında yaptığı bir çalışmada da amilaz enzim aktivitesinin larval periyodun ilk günlerindeki artışını sonraki günlerde azalma izlemiş, bu sonuçtan yola çıkarak genç larvalardaki mrna amilaz enzim düzeyinin yaşı daha büyük olan larvalara göre daha yüksek olduğunu ve sonraki günlerde azalmanın sabit düzeyde devam etmesinin nedenin mrna düzeyinin kopyalanarak devam ettiği bulunmuştur. Özellikle endojen besin rezervlerinin absorbsiyonu sırasında amilaz enzim aktivitesinin yükseldiği belirtilmiş, balık türü ve su sıcaklığına göre değişim gösteren vitellüs kesesi ve yağ damlasının absorbsiyonu bu enzim aktivitesinin seyrinde önemli bir rol oluşturmaktadır. Sonuç olarak, bir çok balık türünün larval aşamasında amilaz enziminin spesifik enzim aktivitesinin genetik olarak programlandığını belirtmiştir (Peres, 1998). Bu durum, Zambonino Infante and Cahu (1994b), Krogdahl and Sundby (1999), Riberio et al. (1999), Buchet et al. (2000), Kolkovski (2001), Zambonino Infante and Cahu (2001) ve Cahu and Zambonino Infante (2001) tarafından yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçlar açısından genetik programlanmayı doğrular niteliktedir. Lipaz enzimi, lipidlerin ve triaçilgliserollein sindiriminde rol oynayan lipolitik enzimlerin en önemlilerinden biridir. Besinlerle alınan triaçilgliseroller midede hiçbir reaksiyona uğramadan bağırsağa geçer ve burada oldukça büyük damlalar halinde bulunur. Bağırsak boşluğunda kolatların yani safra asitleri tuzlarının yardımıyla emülsiyon haline geçer ve bu şekilde daha ince dağılarak lipaz tarafından rahatlıkla hidroliz edilir. Lipaz ancak uzun zincirli (C atom

32 68 edilmiştir. Bu dönemde, ilk 5 gün amilaz spesifik aktivitesinde düzenli bir artış saptanmış ancak bugünden sonra larval dönem sonuna kadar azalma olduğu belirtilmiştir (Martinez et al., 1999). Yine aynı şekilde, eşkine (Sciaenops ocellatus) larvalarının sindirim enzimlerinin incelendiği bir çalışmada ilk olarak amilaz enzim aktivitesi larvalar yumurtadan çıktıktan hemen sonra, 1. günde tespit edilmiştir (Buchet et al., 1997). Bununla birlikte, Polynemidae familyasından (Polydactylus sexfilis) ve Carangidae familyasından (Caranx melampygus) türlerinde enzim aktivitesi artışı ağız açılmadan önce saptanmış, daha sonra metamorfoza kadar bu oranlar azalan bir eğilim göstermiştir (Kim et al., 2001). Çipura larvalarında SDS-PAGE yöntemiyle sindirim enzimlerinin izlendiği çalışmada, amilaz enzim aktivitesinin ilk olarak ağız açılımı ve beslemenin ertesi günü olan 4. günde tespit edildiği Fernandez et al. (2001) ve Moyano et al. (1996) tarafından bildirmiştir. Görüldüğü gibi, buraya kadar anlatılan çalışmalardan elde edilen veriler karşılaştırıldığında amilaz spesifik aktivite modelinin bulgularımızla büyük benzerlikler taşıdığı görülmektedir. Sözü edilen türlerin hepsinde aktivite ilk olarak ağız açılımı ve ilk besin girişinden 1 gün önce ya da ağız açılıp ilk besin alımını takiben tespit edilmiştir. Bu çalışmada tespit edilen amilaz enzim spesifik aktivitesi de yukarıda açıklanan bu modele birebir uymaktadır. Ayrıca, özellikle sövraj döneminde mikropartikül toz yem girişine bağlı olarak aktivitenin yükseldiği diğer çalışmalarda da kaydedilmiştir. Çünkü ticari olarak üretilen mikropartikül toz yemler genellikle %10 dan fazla nişasta içerirler. Bu oran zenginleştirilmiş Artemia metanauplii bireylerindeki nişasta miktarından fazla olduğu için spesifik aktivitede de nişasta

33 67 eder ve amiloz moleküllerine etkisiyle hidrolizin ilk safhalarında oluşan ürünler dört ya da daha fazla sayıda glikoz birimi içeren oligosakkaridlerdir. α amilazın bunları da hidroliz etmesi sonucunda son ürün olarak çok miktarda α maltoz ve az miktarda glikoz oluşmaktadır (Karlson, 1992; Gözükara, 1997; Hidalgo et al., 1999; Fernandez et al., 2001). Araştırmada amilaz aktivitesi ilk olarak ağız açılmadan 1 gün önce tespit edilmiştir. Bununla birlikte, 3. günden itibaren ortama rotifer girilmesiyle birlikte aktivite yükselmeye başlamış ve 10. güne kadar artışı devam etmiştir. Ancak 10. günden sonra amilaz aktivitesi azalmaya başlamış ve 10. günden sonra denemenin sonuna kadar hemen hemen aynı düzeyde devam etmiştir. Ancak, 32. günde mikropartikül toz yem girişine bağlı olarak aktivitede bir artış tespit edilmiş, sonrasında ise yavaş bir azalma eğilimi ile deneme sonuna kadar devam etmiştir. Diğer türlerle yapılan çalışmalar incelendiğinde, elde ettiğimiz sonuçlara benzer sonuçların alındığı görülmüştür. Levrek larvalarında farklı besinlere verilen tepkilerin incelendiği bir çalışmada, amilaz aktivitesinin ağız açılımından 1 gün önce tespit edildiği bildirilmiştir (Zambonino Infante and Cahu, 1994b). Bunun yanı sıra, Senegal dil balığı (Solea senegalensis) larvalarında da amilaz aktivitesinin ağız açılımından 2 gün sonra tespit edildiği ve larval üretimin ilk günlerindeki artışın ardından 15. güne kadar giderek azalan bir aktivite izlendiği vurgulanmıştır (Riberio et al., 1999). Yine bu türün larvalarındaki sindirim enzimleri aktivitesinin incelendiği diğer bir çalışmada, amilaz enzimini ağız açılımından hemen sonra tespit

34 66 Denemede pepsin aktivitesinin 40. günden itibaren azalmaya başladığı gözlenmiştir. Bu azalmanın nedeni mide oluşumundan sonra mikropartikül yem oranının artırılmasına bağlı olarak, zenginleştirilmiş Artemia girişinin azaltılmış olmasıdır. Özellikle yüksek oranda HUFA içeren besin madde içeriği artan Artemiaların larva tarafından daha az alınması bu aktivitenin azalmasına neden olduğunu düşündürmektedir. Benzer sonuçlar, Zambonino Infante and Cahu (1994a) ve Cahu and Zambonino Infante (1994) ve Cahu and Zambonino Infante (1997) tarafından bildirilmiştir. Özellikle mikropartikül yemlerin pepsin ve bazı pankreatik sindirim enzimlerine olan etkilerinin incelendiği çalışmada (Zambonino Infante and Cahu, 1994a), levrek larvalarında pepsin enzim aktivitesinin 24. günde tespit edildiği ve fonksiyonel midenin bu günden itibaren oluştuğu bildirilmiştir. Ayrıca, mikropartikül yemin kullanıldığı gruplarda pepsin aktivitesinin daha yüksek olduğu, farklı besin madde içeriğine sahip yemlerde ise protein oranının yüksek olduğu yemlerle beslenen larvalarda pepsin aktivitelerinin daha yüksek olduğunu vurgulamıştır. Mikropartikül yem kullanımının tripsin enziminin yanı sıra özellikle pepsin spesifik aktivitesini artırdığı diğer araştırıcılar tarafından da belirtilmiştir (Kolkovski et al., 1993; Kolkovski et al., 1997; Kolkovski, 2001; Zambonino Infante and Cahu, 2001; Cahu and Zambonino Infante, 2001). Karbonhidratların sindiriminde görev alan enzimlerin en önemlilerinden biri de amilazdır. Pankreastan salgılanan amilaz enzimi besinlerle alınan nişastayı hidrolitik olarak yıkar. Bu enzim, nişasta moleküllerinin iç kısımlarındaki α-(1 4) glukozid bağlarını hidrolize

35 65 ettiği peptid bağlarına etki eder. Bu şekilde proteinlerden proteozlar, peptonlar, çeşitli büyüklükteki peptidler ve kısmen de serbest amino asitler meydana gelir. (Zambonino Infante and Cahu, 1994a; Gözükara, 1997; Sterchi and Stöcker, 1999;). Bu çalışmada, pepsin spesifik aktivitesi ilk olarak mide oluşumunun gözlendiği 32. günde tespit edilmiştir. Bununla birlikte, 30. günde yapılan spesifik enzim tayininde düşük miktarlarda enzimatik aktivite tespit edilmiştir. Bu durum populasyonu oluşturan bazı bireylerin fonksiyonel mide oluşumlarını erken tamamlamasıyla ilişkilidir. Hızlı gelişim gösteren bireyler, su sıcaklığı ve besin içeriği ile bu gelişimlerini artırırlar. Bu çalışmada 32. günden önce tespit edilen önemsiz düzeydeki (p>0.05) pepsin aktivitesindeki artışların hızlı gelişim gösteren bireylerin örnekleme içinde yer almasından kaynaklanmış olabileceğini düşündürmektedir. Çünkü larval enzimoloji çalışmalarında bütün vücut homojenatı tekniği (whole body homogenate) kullanılmakta ve pepsin enzim aktivitesinin tespit edilmesi ise fonksiyonel mide ve sindirim sistemi oluşumunun net bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. Bu durum, Zambonino Infante and Cahu (2001), Cahu and Zambonino Infante (2001) ve Kolkovski (2001) tarafından da bildirilmiştir. Metamorfoz dönemine bağlı mide oluşumu ile pepsin aktivitesindeki artışların tespiti çipurada 40. gün (Moyano et al, 1996;), levrekte 24. gün (Zambonino Infante and Cahu,1994a.), kırma mercanda 25. gün (Suzer et al., 2006) çizgili levrekte 17. gün (Walford and Lam, 1993), kalkanda 8. gün (Day et al., 1997), çizgili levrekte 17. gün (Kolkovski, 2001) olarak bildirilmiştir.

36 64 Özellikle günler arasında gözlenen tripsin aktivitesinin yükselmesinin nedeni olarak canlı yem olarak kullanılan Artemia metanaupliinin ticari zenginleştiricilerle zenginleştirilmesi sonucu artan besin madde içeriği olduğu düşünülmektedir. Benzer sonuçlar levrek larvalarında farklı oranlarda yapılan besleme uygulamasının enzim aktivitesi üzerine olan etkileri incelenmiş ve besleme oranının azalmasına bağlı olarak enzim aktivitesinin azaldığı vurgulanmıştır (Zambonino Infante et al., 1996). Ayrıca, dil balığı (Pseudopleuronectes americanus) ve sarıkuyruk (Seriola sp.) larvalarından oluşan 3 farklı grupta yapılan denemelerde, en yüksek sindirim enzimleri aktivitesine mikropartikül yemin kullanıldığı grupta en az aktiviteye ise aç bırakılan grupta rastlanmış, yem alımı ve besin madde içeriğinin enzim aktivitesini doğrudan etkilediği vurgulanmıştır (Baglole et al., 1998). Tripsin aktivitesinin alınan yemin protein miktarı, larva yaşı ve yem alımı ile doğrudan ilişkili olduğunu gösteren sonuçlar, kuruma karidesinde (Penaeus japonicus) Le Vay (1993), çizgili levrekte (Lates calcarifer) Walford and Lam, (1993); tatlı su levreği (Perca fluviatilis) ve turnada (Esox lucius) Kuz mina (1996), levrekte Cahu and Zambonino Infante, (2001), ve çipurada Kolkovski (2001) tarafından da elde edilmiştir. Proteinlerin sindiriminde rol alan enzimlerden biri de mideden salgılanan pepsin enzimidir. Midedeki asiditenin artmasıyla birlikte ph 2.0 ye yükselmekte ve aktif pepsinin varlığında polipeptidin N terminalinden 42 amino asitlik bir kısmın koparılması ile proenzim aktif formu olan pepsin haline dönüşmektedir. Pepsin, protein molekülünün iç kısımlarına özellikle tirozin ya da fenilalanin iştirak

37 63 intestinal proteazların sindirim tüpüne besin alımıyla birlikte sentezlenmeye başladığını bildirmiştir (Kim et al., 2001). Bu çalışmadaki sonuçlar, denemelerden elde edilen verilerle paralellik göstermektedir. Ayrıca, eşkine (Sciaenops ocellatus) türünde yapılan sindirim enzim gelişimi ile ilgili çalışmalarda tripsin enziminin larvaların yumurtadan çıktığı anda tespit edildiğini ancak aktivitenin ilk beslenme ile başlandığını vurgulamıştır (Lazo et al., 2000; Buchet et al. 1997). Aynı doğrultudaki veriler levrek larvalarından da elde edilmiştir. Zambonino Infante and Cahu (1994b), levrek (Dicentrarchus labrax) larvalarının besin değişimlerine karşı enzimatik olarak verdikleri tepkileri incelemiş ve levrek larvalarında ağız açılımından 1 gün önce tripsin enziminin proenzimi olan tripsinojen varlığını saptamış, ağız açılımı ile birlikte enzimin sentezlendiğini ve spesifik aktivitesinin tespit edildiğini bildirmiştir. Tripsin spesifik aktivitesinin larval dönem süresince değişmesinin nedeni yalnızca larva yaşına bağlı değildir. Özellikle yem alımı ve kullanılan canlı yem ya da mikropartikül yemin besin madde içerikleri de son derece önemlidir (Cahu and Zambonino Infante, 2001; Kolkovski, 2001). Bu çalışmada günler arasındaki azalmanın ardından, 10. günde başlayan aktivite artışının 20. güne kadar sürmesinin nedeni olarak yukarıda bahsedilen bu 3 faktörün etkisinin olduğu düşünülmektedir. Çünkü larvaların büyümesine bağlı olarak, rotiferden artemiaya geçilmesi enzim aktivitesini arttırmıştır. Bununla birlikte gerek rotifer gerekse Artemianın besin madde içeriğinin ticari zenginleştiricilerle artırılması da enzim aktivitesini artırmıştır.

38 62 (akışkanlı ya da yeşil su tekniği) ve larvalara uygulanan besleme protokolü yer alır. Araştırma bulgularına bakıldığında, tripsin enzimi ilk olarak ağız açılımı ile birlikte eş zamanlı olarak tespit edilmiştir. Özellikle 3. günde ağız açılımı ve ekzojen besin alımı ile birlikte ani bir yükselme göstermiştir. Larvalarda aktif mide ve sindirim sistemi oluşumu gerçekleşene kadar ince, uzun ve dar bir yapıdaki sindirim tüpü bu görevi yerine getirmektedir. Özellikle larval evredeki sindirim enzimlerinin aktivitesinde kör kese (pyloric caeca) önemli rol oynamaktadır. Sindirim tüpündeki besinin pyloric caeca daki hormonu aktif hale getirmesiyle uyarılma başlamakta ve pankreastan tripsin enzimi salgılanmaktadır (Alliot, E., 1979; Divakaran et al., 1999; Kim et al., 2001; Cahu and Zambonino Infante, 2001; Zambonino Infante and Cahu, 2001). Benzer şekilde, larval dönemde sindirim enzim aktivitelerindeki değişimlerin incelendiği çalışmalarda da tripsin enzim aktivitesi ağız açılımı ve larval beslemenin yapıldığı ilk günlerde tespit edilmiştir. Riberio et al. (1999) Senegal dil balığının (Solea senegalensis) larval dönemdeki sindirim enzim aktivitelerini incelemiş ve tripsin aktivitesini ilk kez ağzın açıldığı, beslemenin yapıldığı 2. günde tespit etmiştir. Benzer şekilde, Suzer et al. (2006) kırma mercan (Pagellus erythrinus) larvalrının sindirim enzimleri ontogenisini izledikleri çalışmada tripsin enzim aktivitesini ilk olarak ağız açılımı ile eş zamanlı olarak 3. günde tespit etmişler ve larval gelişime bağlı olrak artış izelemişlerdir. Polynemidae familyasından (Polydactylus sexfilis) ve Carangidae familyasından (Caranx melampygus) türlerinin sindirim enzim aktivitelerinin incelendiği bir diğer çalışmada, pankreatik ve

39 61 değiştiğini belirtmiştir. Araştırmacıların elde ettiği bu değerler, bu çalışmadan elde edilen larval yaşama oranı sonuçları ile benzerlikler göstermektedir. Pankreatik enzimlerin salgılanması Pankreozimin adı verilen bir hormon tarafından kontrol edilmektedir. İnce bağırsağın başlangıç kısmındaki mukoza hücrelerinden kan dolaşımına hormonun salgılanması ise duedonumunda bulunan peptidler, proteinler, karbonhidratlar ve diğer birçok maddenin bulunması ile uyarılmaktadır (Gözükara, 1997). Pankreatik enzimlerin aktivasyonu bağırsak mukoza hücrelerinden salgılanan Enterokinaz enzimi tarafından başlatılmaktadır. Bu bileşik bazen enzim aktivatörü olarak kabul edilirse de aslında bir enzimdir (Karlson, 1992; Gözükara, 1997; Tekman vd., 1994; Krogdahl and Sundby, 1999; Kolkovski, 2001; Zambonino Infante and Cahu, 2001). Bu bağlamda, tripsin enzimi proteinlerin sindiriminde görev alan pankreatik bir enzimdir. İnce bağırsağa pankreas kanalıyla dökülen pankreas özsuyu proteinlere doğrudan etki eden tripsin, kimotripsin ve karboksipeptidaz adı verilen enzimleri içermektedir. Tripsin, inaktif şekli olan tripsinojen şeklinde salgılanmakta ve tripsinojeni ince bağırsaklardan salgılanan enterokinaz aktive etmektedir. (Alliot, 1979; Gözükara, 1997; Sterchi and Stöcker, 1999; Rønnestad et al., 2001; Cahu and Zambonino Infante, 2001). Sindirim enzimlerinin aktivitesi birçok etkenin etkisi altındadır. Tripsin spesifik enzim aktivitesinin larval dönem süresince değişmesini etkileyen temel faktörler içinde larva yaşı, kullanılan üretim tekniği

40 60 oranlarının canlı yemlere göre daha yüksek olması nedeniyle larval büyüme bu periyotta daha fazladır. Bu çalışmada da kullanılan Proton grubu toz yem girişi 32. günde başlamıştır. Larval büyüme verilerinde özellikle 35. günden sonra izlenen geşim trendi toz yem girişi ile eş zamanlı olarak saptanmıştır. Bu bağlamda, çalışmada kullanılan sövraj uygulaması önceki sivriburun karagöz larva üretim çalışmaları ve diğer sparid larva kültür verileri ile büyük benzerlikler taşımaktadır. Larval gelişim verileri incelendiğinde total boy ve ağırlık gelişiminin günlere göre üssel bir gelişim gösterdiği tespit edilmiştir. Önceki sivriburun karagöz larva çalışmaları ile kıyaslandığında, Boglione et al. (2003) elde ettiği sonuçta 40. günde larva boyunun yaklaşık 12 mm ye ulaştığını bildirmiştir. Öte yandan, Papandroulakis et al., (2004) ise aynı gün için larva boyunu 16 mm olarak belirtmiştir. Bu çalışmada, 45. günde larva boyu mm olarak tespit edilmiş ve diğer araştırıcıların sonuçları ile paralellik göstermiştir. Kuşkusuz, larval gelişim ve yaşama oranı gibi parametreler larva üretim çalışmalarında birçok faktörün etkisi altında olduğundan benzer ya da yaklaşık sonuçların elde edilmesi olağandır. Aradaki farklılıkların larva besleme protokolü ya da ortam koşullarındaki farklılıktan kaynaklandığı düşünülmektedir. Öte yandan, yaşama oranları verileri incelendiğinde de benzer profili görmek mümkündür. Bu çalışmada larval yaşama oranı 25. güne kadar %25 30, 25. günden sonra ise %85 98 dolayında hesaplanmıştır. Benzer şekilde, Papandroulakis et al., (2004) yaptıkları çalışmada larval yaşama oranını %53.7±7.5 olarak bildirirken Franicevic (1989) ise 60. güne kadar süren periyotta yaşama oranının %18-22 arasında

41 59 Larval beslemede ilk olarak %30 S type olarak adlandırılan lorica boyu küçük rotifer ile birlikte %70 L type olarak adlandırılan lorica boyu göreceli büyük rotifer kullanılmıştır. Sparidae larvalarının ağız açılımları gerçekleştiği sırada, ağız açıklıklarının levrek türüne göre daha küçük olması nedeniyle ilk beslemeye küçük rotiferlerle (S type) başlanması yaygın olarak kullanılmaktadır. Benzer uygulama, önceki sivriburun larva üretim çalışmalarında (Franicevic, 1989; Marangos, 1993) ve diğer sparid üyelerinin larval kültüründe (Kolios et al., 1997; Suzer, 2003) kullanılmıştır. Rotiferin ardından beslemeye A 0 olarak adlandırılan Artemia nauplii ile devam edilmiş, larval ağız açıklığı ve gelişime bağlı olarak devamında nauplii bireylerinin saat Selco adı verilen ticari zenginleştiricilerle yapılen zenginleştirme işlemi sonrasında A 1 olarak adlandırılan Artemia metanauplii formunda verilmiştir. Artemia nauplii bireylerinin larval gelişime bağlı olarak, gerek boyut gerekse besin madde kompozisyonu açısından yetersiz kaldığı bilinen bir gerçektir (Cahu and Zambonino Infante, 2001). Larval biyoteknolojinin gelişimine paralel olarak üretilen yüksek oranda doymamış yağ asidi (DHA, EPA) içeren zenginleştiricilerin Artemia nauplii bireylerinin besin madde içeriklerini ve boyutlarını artırması sayesinde larval beslemede yaygın olarak kullanılmaktadır. Artemia metanauplii ile beslemenin devamında ortama mikropartikül toz yem girişi yapılmıştır. Besin madde içeriği larvaların biyolojik gereksinimleri doğrultusunda istenilen kompozisyonda üretilen mikropartikül toz yemler sövraj aşamasında büyük rol oynamaktadır. Özellikle ham protein miktarı başta olmak üzere diğer bileşen

42 58 akuakültür ortamında denemiş, ve üretim protokolünün çipura ile benzerlikler taşıdığı kanısına varmıştır. Bu çalışmada kullanılan üretim protokolü, yukarıda adı geçen araşırıcılarla birlikte başta çipura (Sparus aurata) ve özellikle aynı familya üyesi olan fangri (Pagrus pagrus) (Kolios et al., 1997) ve kırma mercan (Pagellus erythrinus) (Suzer, 2003) balıkları için yaygın olarak kullanılan üretim protokolleri baz alınarak oluşturulmuştur. Larvalarda ağız açılımı 3. günde gözlenmiştir. Ağız açılımı ile birlikte tank yüzeyinde 80 lüx düzeyinde aydınlatma sağlanmıştır. Alg türü olarak Nannochloropsis sp., 5-8x10 6 hücre/ml kullanılmıştır. Alg girişi, yeşil su tekniği gereğince rotifer verilmesinin kesilmesiyle birlikte 25. günde sona ermiştir. Bu dönem süresince alg kullanımının avantajları olarak başta rotiferin doğrudan beslenmesi sayesinde besin madde içeriğinin yüksek oranda kalması, 24 saat aydınlatma nedeniyle metabolitlerin ortamdan uzaklaştırılması, ph optimizasyonu ve O 2 üretimi sayılabilir (Cahu, 1998). Denemede larval üretimin ilk 20 gününde yeşil su üretim tekniği kullanılmıştır. Alg türü olarak kullanılan Nannochloropsis sp. başta olmak üzere Isochrysis galbana ve Tetraselmis suesica türleri Sparidae üyelerinin ve diğer bir çok türün larval kültür çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. (Kolios et al., 1997; Martinez et al., 1999; Riberio et al., 1999; Lazo et al., 2000; Fernandez et al., 2001, Suzer, 2003, Boglione et al., 2003). Bu durum, yapılan araştırmada kullanılan alg türünün ve yetiştirme tekniğinin diğer deniz balıkları larva üretim teknikleri ile benzerlik göstermesi açısından önemlidir.

43 57 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) larval gelişimi ve bu süreçte meydana gelen başlıca sindirim enzimlerinden tripsin, kimotripsin, pepsin, amilaz ve lipaz spesifik enzim aktivitesindeki değişimleri incelenmiştir. Deniz balıkları larva kültüründe kaliteli larva üretiminin temelini kaliteli yumurta temini oluşturmaktadır (Kolios, 1997). Bu amaçla 3:1 erkek/dişi oranında stoklanan anaçların ağırlıkları erkek bireyler için 1352±88.6 gr dişi bireyler için 1546±46.4 gr olarak tespit edilmiştir. Anaçlardan yumurtalar doğal üreme periyodu olan Ekim- Aralık aylarında, C arasında herhangi bir hormon müdahalesi yapılmadan doğal yollarla elde edilmiştir. Anaçların biyolojik özellikleri ve yumurta eldesine ilişkin veriler Micale et al. (1996) ve Papandroulakis et al. (2004) ile benzer özellikler göstermektedir. Bununla birlikte, elde edilen yumurtaların çapı ±25.25 µm, yağ damlasının çapı ise ±16.24 µm olarak tespit edilmiştir. İnkübasyon süresince deniz suyu sıcaklığı C arasında değişmiş, ortalama 22.3±0.6 C olarak kaydedilmiştir. Bu sıcaklık aralığında saat arasında süren inkübasyon sonrasında yumurtalar çatlayarak larvalar çıkmıştır. Yumurtaların açılım oranı %75 80 arasında değişmiştir. Elde edilen bu değerler Marangos (1995), Boglione et al. (2003) ve Papandroulakis et al. (2004) ile yakın benzerlikler göstermektedir. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının larva kültürüne ait çalışmalar oldukça azdır. Franicevic (1989) ve Marangos (1993) yaptıkları çalışmada bu türün deneysel düzeyde larva üretimini

44 mu/mg protein Gün Şekil 4.5. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen amilaz enzim aktivitesi değişimi.

45 U/mg protein Gün Şekil 4.4. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen amilaz enzim aktivitesi değişimi Lipaz (E.C ): Trigliseridlerin ve yağların sindiriminde görev alan lipaz enzimi ilk olarak ağız açılımından sonra 4. günde görülmeye başlamış ve 79.34±16.2 mu/mg protein -1 olarak ölçülmüştür. 20. güne kadar lipaz spesifik aktivitesi kademeli olarak artış göstermiş ve 20. günde en yüksek düzeyine yükselmiştir (189.41±22.6 mu/mg protein -1 ). Bugünden itibaren yavaş bir hızla azalma eğilimi göstermiş, mikropartikül toz yem girişi ile birlikte aktivitede bir artış izlenmiştir. Denemenin sonuna kadar lipazın spesifik aktivitesi dalgalı bir şekilde değişim göstermiş ve deneme sonunda spesifik aktivitesi 147.7±13.9 mu/mg protein -1 tespit edilmiştir.

46 54 mu/mg protein Gün Şekil 4.3. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen pepsin enzim aktivitesi değişimi Amilaz (E.C ): Karbonhidratların sindiriminde rol oynayan amilaz enzimi açılım sonrasında ilk olarak 2. günde 1.66±0.7 U/mg protein -1 olarak tespit edilmiştir. Bu aktivite larvanın gelişimine bağlı olarak ilk bir hafta bayunca artış göstermiştir. Amilazın spesifik aktivitesi 10 güne kadar dereceli olarak artış göstermektedir. Daha sonrasında 22. güne kadar hafif bir azalış göstermiştir. Bu süreden itibaren değişim başlamış ve denemenin sonuna kadar devam etmiş. Amilaz spesifik aktivitesi 10. günde pik yapmış ve 6.41±1.2 U/mg protein -1 değerine ulaşmıştır. Pepsin aktivitesine benzer şekilde, mikropartikül toz yemin girilmesine bağlı olarak spesifik aktivite 35. günde 3.13±1.1 U/mg seviyesine yükselmiş, ancak deneme sonuna kadar azalarak sürmüştür. Denemenin sona erdiği 45. gündeki spesifik aktivite 2.93±0.9 U/mg olarak tespit edilmiştir.

47 53 mu/mg protein Gün Şekil 4.2. Sivriburun karagöz larvalarında tespit edilen tripsin enzim aktivitesi değişimi Pepsin (E.C ): Sindirim sisteminin ve özellikle midenin oluşmasından sonra sentezlenmeye başlayan pepsin, ilk olarak 30. günde iz düzeyde ±71.2 mu/mg protein -1 olarak tespit edilmiştir. İlk tespitin ardından artan sıklıklarla izlenen aktivitede, 32. ve 33. günde yapılan ölçümlerde ilk kez net olarak tespit edilmiş ve enzimin spesifik aktivitesi sırasıyla ±426.3 ve ±416.8 mu/mg protein -1 olarak saptanmıştır. Bu günden itibaren artarak devam eden aktivite özellikle mikropartikül yemin girilmesinden 40. günde yapılan ilk ölçümde en yüksek değerine ulaşmıştır (6538.2±725.3 mu/mg protein -1 ). Denemenin sona erdiği 45. güne kadar az oranda azalmalar görülmüş ve deneme sonunda ±664.7 mu/mg protein -1 olarak tespit edilmiştir.

48 52 damlasının çapı 0.04±0.03 mm, ağırlığı ise 0.778±0.01 mg olarak tespit edilmiştir. 9. günde ise hava kesesi oranı %100 e ulaşmıştır. 11. gün larva hala şeffaf görünümde yüzgeç kaidelerinde dallanmalar oluşmuştur. 14. gün larvanın boyu 4.34±0.32 mm, eni 0.96±0.08 mm, ağırlığı ise 1.92±0.08 mg olarak saptanmıştır. Kuyruğun üst lobu yukarıya doğru kıvrılmaya başlamış. 19. gün kuyruğun alt lobu gelişmeye devam etmiştir. 21. gün larvanın boyu 5.44±0.15 mm, eni 1.18±0.04 mm, ağırlığı ise 11.44±1.15 mg. 28. gün larvanın boyu 7.44±0.70 mm, eni 1.67±0.26 mm, ağırlığı ise 14.26±2.32 mg olarak ölçülmüştür. 35. gün larvanın boyu 9.04±0.07 mm, eni 2.37±0.33 mm, ağırlığı ise 55.86±2.46 mg dır. 45. günde larvanın boyu 13.55±0.49 mm, eni 3.93±0.39 mm ağırlığı ise ±86.18 mg olarak ölçülmüştür. 25. güne kadar larvanın yaşama oranı %25 30, 25. günden sonra %85 98 civarında tespit edilmiştir Enzim Analizleri Tripsin (E.C ): Pankreastan salgılanan proteolitik enzimlerden olan tripsin aktivitesi larva yumurtadan çıktığı anda başlamış ve 8.82±1.3 mu/mg protein -1, olarak tespit edilmiştir. Takip eden günlerde ağzın açılmaya başladığı 3. günde ekzojenik beslemeyle birlikte hızlı bir artış eğilimi göstermiştir. Triptik aktivite larvanın gelişimine bağlı olarak 25. güne kadar kademeli olarak artış göstermiş, 25. günden 30. güne kadar düşüşe geçmiştir. Bu dönemden itibaren denemenin sonuna kadar spesifik tripsin aktivitesi düşüşe geçmiştir. En yüksek tripsin enzim aktivitesi 25. günde ±16.6 mu/mg protein -1 olarak ölçülmüştür.

49 51 performansları ve ortam koşulları göz önüne alınarak besleme protokolü ve bakım prosesleri oluşturulmuştur. Larvaların gelişim verileri incelendiğinde yumurtadan çıktığı ilk gün larvanın ortalama total boyu 2.80±0.07 mm, total eni 0.95±0.04 mm, vitellüs boyu 1.04±0.04 mm, vitellüs eni 0.78±0.04 mm ve yağ damlasının çapı 0.22±0.02 mm, ağırlığı ise 0.587±0.02 mg olarak ölçülmüştür. 2. gün yüzgeç diplerinde siyahlaşma başlamıştır. Larvanın besin kesesi 5. günde tükenmiş, yağ damlasının tamamen emilimi ise 8. günde 3.10±0.10 mm total boyda iken gerçekleşmiştir. Total boy (mm) Gün Ağırlık (mg) Şekil 4.1. Sivriburun karagöz larvalarının total boy (kesiksiz çizgi) ve ağırlık (kesikli çizgi) gelişimi. Yapılan çalışmada besin keseli larvanın, ağzını açtığı 3. güne kadar larva tankına herhangi bir aydınlatma yapılmamıştır. Ağzın açılmasıyla 80 lüx şiddetle 24 saat aydınlatma uygulanmıştır. 7. günde yapılan ölçümde larvanın boyu 3.02±0.10 mm, eni 0.65±0.10 mm, yağ

50 50 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Anaç Yönetimi ve Yumurta İnkübasyonu Anaçlar su sıcaklığının C arasında değişim gösterdiği dönemde yumurta bırakmışlardır. Yumurtlama Ekim 2004 te başlamış Ocak 2005 e kadar devam etmiştir. Yumurtlamanın akşam 17:00 22:00 saatleri arasında olduğu tespit edilmiştir. Yumurtaların döllenme oranı %95 98 oranında tespit edilmiştir. İnkübasyon süresince deniz suyu sıcaklığı C arasında değişmiş, ortalama 22.3±0.6 C olarak kaydedilmiştir. Bu sıcaklık aralığında saat arasında süren inkübasyon sonrasında yumurtalar çatlayarak larvalar çıkmıştır. Yumurtaların açılım oranı %75 80 arasında değişmiştir. Sivriburun karagöz yumurtalarının çapı ±25.25µm ve yağ damlasının çapı ±16.24µm olarak tespit edilmiştir. Larval üretim boyunca ph arasında, su sıcaklığı günlere bağlı olarak ortalama 22.5 ±1.7 C, çözünmüş oksijen düzeyi mg/lt arasında değişim göstermiştir. Nitrat, nitrit amonyum ve amonyak gibi azotlu bileşikler lethal dozun altında tespit edilmiştir Larval gelişim Sivriburun karagöz larva üretiminde günler arasında sağlanan fizikokimyasal parametreler ve su koşulları (sıcaklık, tuzluluk, ışık yoğunluğu, debi ve aydınlanma süresi) ile verilen alg miktarı ve türü, canlı ve mikro partikül yemlerin günlere bağlı oransal değişimi çizelge 3.2. de belirtildiği gibi uygulanmaya çalışılmıştır. Denemenin başından itibaren günlük olarak yapılan meristik ölçümlerden elde edilen veriler hemen değerlendirilmiş ve tanktaki larvaların dağılımları,

51 49 Spektrofotometri cihazında 595 nm dalga boyunda değer ölçülür ve Lambert&Mill yasası gereğince oranlama yapılarak spesifik enzim aktivitesi tespit edilir İstatistik Denemeler 3 kez tekrar edilmiş ve veriler ortalamanın standart sapması (S.D.) olarak gösterilmiştir. Varyanslar arasındaki homojenite Levene testi ile test edilmiştir. Verilerin istatiksel olarak değerlendirilmesinde SPSS 11.0 ve Microsoft Excel 2003 yazılımlarından yararlanılmıştır.

52 Protein: Her enzimin özgül spesifik aktivitesini sayısal olarak tanımlamak üzere spektrofotometre cihazından okunan göreceli değerlerin, homojenatta bulunan protein değeri ile oranlanması düşünülmüştür. Bu bağlamda, Bradford tarafından 1976 yılında yapılan çalışmada kullanılan Bradford yöntemi ile elde edilen protein miktarı spektrofotometre cihazından okunan değer ile oranlanarak her enzimin kendine özgü spesifik aktivitesi mu/mg protein -1 olarak tespit edilmiştir. Bradford yönteminde substrat olarak sığır serum albümini kullanılmıştır. Kullanılan Reaktifler 100 mg Coomassie Blue G ml 95% ethanol 100 ml 85% (w/v) Fosforik asit Prosedür Sırasıyla 0, 2, 4, 6, 10, 15 and 20 µl BSA (1 mg/ml) substratı küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G 250, 50 ml 95% ethanol içinde100 ml 85% (w/v) fosforik asit eklenerek Bradford solüsyonu hazırlanır. 20 µl ölçümü yapılacak örnekten konulur, üzerine 40 µl Bradford solusyonu ilave edilir ve 200 µl ye kadar su eklenir.

53 47 LİPAZ Versaw, M, ph 7.0, KPO 4 Buffer 2 ml Substrat (Naphtyl caprylate) Quartz küvette 10 dakika 37 C de inkubasyon 0.05 ml Lipaz solüsyonu Spektrofotometre 490 nm 10 dakika PROTEİN Bradford, , 2, 4, 6, 10, 15 ve 20 µl BSA küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G- 250, 50 ml %95 ethanol 100 ml %85 (w/v) fosforik asit ekle, solusyon oluşturulur. 20 µl örnek+40 µl Bradford solusyonu 200 µl kadar su eklenir. Spektrofotometre 595 nm 5 dakika Şekil 3.8. Lipaz enzim aktivitesi analiz yöntemi

54 46 AMİLAZ Metais ve Bieth., M, ph 6.9, NaPO 4 Buffer 1 gr Substrat (Çözünür Nişasta) Quartz küvette 3 dakika 25 C de inkubasyon 0.5 ml Amilaz solüsyonu Spektrofotometre 540 nm 5 dakika PROTEİN Bradford, , 2, 4, 6, 10, 15 ve 20 µl BSA küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G- 250, 50 ml %95 ethanol 100 ml %85 (w/v) fosforik asit ekle, solusyon oluşturulur. 20 µl örnek+40 µl Bradford solusyonu 200 µl kadar su eklenir. Spektrofotometre 595 nm 5 dakika Şekil 3.7. Amilaz enzim aktivitesi analiz yöntemi

55 Amilaz: Uluslararası Enzim Komisyonunca (E.C ) olarak kodlanan ve karbonhidratların sindiriminde rol oynayan enzimlerden biridir. Amilaz enzim aktivitesinin izlenebilmesi amacıyla Metais and Bieth (1968) tarafından yapılan çalışmada kullanılan analiz yöntemi ve substrat madde olarak çözünür nişasta kullanılmıştır. Amilaz enzim aktivitesi analiz yöntemi şekil 3.7 de basamaklar halinde sunulmuştur Lipaz: Uluslararası Enzim Komisyonunca (E.C ) olarak kodlanan ve lipidlerin sindiriminde rol oynayan enzimlerden biridir. Lipaz enzim aktivitesinin izlenebilmesi amacıyla Versaw tarafından 1986 yılında yapılan çalışmada kullanılan analiz yöntemi ve substrat madde olarak Naphtyl caprylate kullanılmıştır. Lipaz enzim aktivitesi analiz yöntemi şekil 3.8 de basamaklar halinde sunulmuştur.

56 44 PEPSİN Worthington, 1982 Quartz küvette 5 dakika 37 C de inkubasyon 500 µl Substrat(Sığır hemoglobini ) 10 dak. sonra 1 ml TCA eklenir, reaksiyon durur. 4000xg 6 dak. homojenizasyon Spektrofotometre 280 nm 5 dakika PROTEİN Bradford, , 2, 4, 6, 10, 15 ve 20 µl BSA küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G- 250, 50 ml %95 ethanol 100 ml %85 (w/v) fosforik asit ekle, solusyon oluşturulur. 20 µl örnek+40 µl Bradford solusyonu 200 µl kadar su eklenir. Spektrofotometre 595 nm 5 dakika Şekil 3.6. Pepsin enzim aktivitesi analiz yöntemi

57 43 TRİPSİN Tseng ve diğ., mm, ph 7.5, Tris HCl Buffer 3 ml Substrat (BAPNA) Quartz küvette 5 dakika 25 C de inkubasyon 0.2 ml Tripsin solüsyonu Spektrofotometre 253 nm 5 dakika PROTEİN Bradford, , 2, 4, 6, 10, 15 ve 20 µl BSA küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G- 250, 50 ml %95 ethanol 100 ml %85 (w/v) fosforik asit ekle, solusyon oluşturulur. 20 µl örnek+40 µl Bradford solusyonu 200 µl ye kadar su eklenir. Spektrofotometre 595 nm 5 dakika Şekil 3.5. Tripsin enzim aktivitesi analiz yöntemi

58 42 Tripsin enzim aktivitesi analiz yöntemi şekil 3.5 te basamaklar halinde sunulmuştur Pepsin: Uluslararası Enzim Komisyonunca (E.C ) olarak kodlanan ve proteinlerin sindiriminde rol oynayan enzimlerden biridir. Pepsin enzim aktivitesinin izlenebilmesi amacıyla yine Worthington (1982) tarafından yapılan çalışmada kullanılan analiz yönteminin Zambonino Infante ve Cahu (1994a) tarafından yeniden düzenlenen şekli ve substrat madde olarak sığır hemoglobini kullanılmıştır. Pepsin enzim aktivitesi analiz yöntemi şekil 3.6 da basamaklar halinde sunulmuştur.

59 Enzim Analizleri Üretimi yapılan sivriburun karagöz larvalarının sindirim enzimi aktivitelerini izleyebilmek için denemenin başından itibaren larvalardan ilk 5 gün süresince her gün, daha sonra ise her 5 günde bir adet örnekleme yapılmıştır. Larvaların sabah ilk yem girişi yapılmadan önce, genellikle aynı derinlikten alınması sağlanmıştır. Alınan larvalar genellikle homojenizatör yardımıyla 15000xg devir, 4 C de 30 dakika süre ile homojenize (1/5:homojenat/soğuk saf su) edilmiş ve elde edilen homejanata 50 mm, ph 7.5, Tris HCl ile glycerol eklenerek enzim analizleri yapılıncaya dek 20 C de saklanmıştır. Her enzim kendine özgü spesifik aktivite tayin yöntemleri ile tespit edilmiş ve spektrofotometre (Jenway 6300-Visible Spectrophotometer) cihazı yardımıyla enzim aktiviteleri ölçülmüştür Tripsin: Uluslararası Enzim Komisyonunca (E.C ) olarak kodlanan Tripsin enzimi genellikle proteinlerin sindiriminde kullanılmaktadır. Tripsin enzim aktivitesinin izlenebilmesi amacıyla Tseng et al. tarafından 1982 yılında yaptıkları çalışmada kullanılan analiz yöntemi ve substrat madde olarak Na-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) kullanılmıştır.

60 *** 1 (A 0 ) *** 1 (A 0 ) *** 1 (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+1 (A 1 ) (Ao)+1 (A 1 ) (Ao)+1.5 (A 1 ) Proton (Ao)+1.5 (A 1 ) µ (Ao)+1.5 (A 1 ) %10-12 C.A (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) Proton (A 1 ) µ (A 1 ) %8-10 C.A. * : %70 S + %30 L Type Ao : Artemia nauplii ** : %50 S + %50 L Type A 1 : Artemia metanauplii (Zenginleştirilmiş) *** : %100 L Type C.A. : Canlı Ağırlık

61 39 Çizelge 3.2. Sivriburun karagöz Larva Üretim Protokolü Yaş (Gün) Sıcaklık ( C) Tuzluluk ( ) Debi (ml/sn) Işık Yoğ. (lüx) Işık Süresi (Saat) Alg Yoğ. hücre/ml Rotifer (adet/ml) Artemia (adet/ml) x * * * * * ** ** ** ** *** *** *** *** *** *** *** 0.5 (Ao) *** 0.5 (Ao) *** 0.5 (Ao) *** 0.5 (Ao) *** 0.5 (Ao) Mikropartikül Yem

62 38 Denemelerde kullanılması planlanan siviriburun karagöz larva üretim protokolü çizelge halinde sunulmuştur (Çizelge 3.2).

63 37 Mide oluşumunun ardından ve Artemianın azaltılmaya başladığı günlerde tanklara ilk kez mikropartikül yem girilmesi hedeflenmiş ve denemelerde mikropartikül yem olarak INVE firmasının Proton sınıfı mikropartikül yemlerin kullanılması düşünülmüştür (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1. Denemelerde kullanılan Proton mikropartikül yemin besin madde içeriği (INVE Catalogue). Bileşen Miktar Protein (%) 58 Yağ (%) 14 Kül (%) 12 Nitrojensiz Öz Madde (%) 9 Nem (%) 7 Selüloz (%) 1 Fosfor (%) 1.4 A vitamini (IU/kg) D3 vitamini (IU/kg) E vitamini (mg/kg) 700 C vitamini (mg/kg) 2000 Σω3 HUFA (mg/kg) 30 DHA/EPA 2 Antioksidanlar Ethoxyquine Larva tanklarında su yüzeyinde biriken yağın alınması için yüzey temizleyicileri kullanılmıştır. Denemeler sırasında sıcaklık cıvalı termometre, ışık şiddeti lüksmetre ve tuzluluk ölçümleri de refraktometre ile yapılmıştır.

64 36 Larvada ağız açılımı gözlendikten sonra larval beslemeye S- type olarak adlandırılan Brachionus rotindiformis ve L-type olarak adlandırılan Brachionus plicatilis türü rotiferle başlanılması planlanmıştır. Başlangıç aşamasında 3. gün için %70 S-type+%30 L- type, 8. gün için %50 S-type+%50 L-type ve 12. günden itibaren sadece L-type rotifer girişi planlanmıştır. Rotifer yoğunluğunun 6 adet/ml olması hedeflenmiştir. Rotiferin ardından canlı yem olarak Artemia nauplii ile devam edilmesi düşünülmüştür. AF artemialar yumurtadan çıktıktan hemen sonra 18. günden itibaren ve ilerleyen günlerde larva gelişimine bağlı olarak zenginleştirildikten sonra metanauplii olarak 22. günden itibaren verilmesi hedeflenmiştir. Rotifer ve artemiaların zenginleştirilmesinde INVE firmasının Selco ürünleri kullanılmıştır. Larval dönem boyunca tanklara uygulanması planlanan larva üretim protokolü Çizelge 3.2 de gösterilmiştir. Şekil Denemelerde kullanılan A-Rotifer ve B-Artemia

65 Larval Üretim ve Deneme Düzeni Denemede 5m³ lük iç çeperleri siyah, zemini gri renkte dairesel yapıda polyester tanklar kullanılmıştır. Şekil. 3.3 Denemede kullanılan larva tankları İnkübatörlerden alınan larvalar 80 adet/litre olarak tanklara stoklanmıştır. Larva üretimi kapalı sistemde yeşil su tekniği kullanılarak yapılmıştır. Larva üretim tanklarına günlere bağlı olarak farklı su değişim oranları uygulanmıştır. İlk günden 8. güne kadar 360 lt/saat, 8. günden 12. güne kadar 450 lt/saat, 12. günden 15. güne kadar 540 lt/saat, 15. günden 20. güne kadar 720 lt/saat, 20. günden 25. güne kadar 1080 lt/saat, 25. günden sonra 1620 lt/saat su girişi uygulaması yapılmıştır. Alg türü olarak Nannochloropsis sp., 5 8x10 6 hücre/ml kullanılmıştır. Denemelerde 25. güne kadar 24 saat aydınlatma yapılması daha sonra 16 saat aydınlık/8 saat karanlık rejiminin uygulanması düşünülmüştür.

66 34 Şekil 3.2. Yumurtaların inkübe edildiği 200 litrelik inkübatörler. Canlı yumurta miktarı tespit edildikten sonra yumurtalar 200 litre hacmindeki 250µm göz açıklığına sahip silindir konik yapıdaki inkübatörlere ortalama 3000 adet/lt olacak şekilde stoklanmıştır. İnkübatörlere saatte %113 su değişimi uygulanmıştır. Yumurtalar inkübasyon süresince karanlıkta tutulmuştur. İnkübatörlerdeki yumurtaların bir araya toplanmamaları ve homojen dağılımı sağlayabilmek amacıyla orta şiddette havalandırma uygulanmıştır. Yumurtalar açılıncaya kadar günlük olarak inkübatörlerdeki havalandırmalar durdurularak dipteki ölü yumurtalar flushing yöntemiyle alınmış ve miktarları tespit edilmiştir. Buna bağlı olarak yumurtaların açılım oranları saptanmıştır. Yumurtaların tamamı açıldıktan sonra havalandırması ve suyu kapatılıp prelarvaların yüzeyde toplanması sağlanmıştır. Yüzeyden toplanan prelarvalar aynı sıcaklıktaki larval yetiştirme tanklarına aktarılmıştır.

67 33 Anaçlardan yumurta doğal üreme periyodu olan Ekim-Ocak ayları süresince doğal fotoperiyod ve ºC sıcaklık uygulanarak hormon yapılmadan alınmıştır. Anaçların beslenmesinde yumurta kalitesini arttırmak amacıyla taze yaş yem olarak sübye (Sepia officinalis), kalamar (Loligo vulgaris), ahtapot (Octopus vulgaris) ve karides (Paneaus sp.) kullanılmıştır. Buna ilaveten yüksek oranda doymamış yağ asitleri içeren işletmenin özel olarak hazırlamış olduğu yem kullanılmıştır. Anaçlara besleme gün boyunca aldıkları kadar yapılmıştır Yumurta Temini ve İnkübasyonu Anaçların bıraktığı ve pelajik yapıda olan sivriburun karagöz yumurtaları tankların tahliye borusundan geçerek çıkışlara yerleştirilen 300µ luk göz açıklığına sahip kollektörlere alınmıştır. Bu kollektörler 60 lt lik kovaların içine yerleştirilmiştir. Bu kollektörler yumurtlama dönemi boyunca tank çıkışında tutulmuş ve 2 saatte bir temizliği yapılmıştır. Yumurtanın gelip gelmediği gün içerisinde 15 dakikada bir kontrol edilmiştir. Anaç tanklarından kollektöre toplanan yumurtalar daha sonra 30 lt hacminde, yerden 100 cm yükseklikte, ayaklı, şeffaf, silindir konik bir ayırıcıya alınmıştır. Burada 5 dakika kadar bekletilmiş ve ölü-canlı ayırımı yapılmıştır.

68 32 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Anaç Yönetimi Çalışma, Kasım 2004 Şubat 2005 tarihleri arasında İzmir ili, Aliağa ilçesi Yenişakran Beldesi İskele mevkiinde bulunan Akuvatur Şirketler grubuna bağlı Teknomar Su Ürünleri A.Ş. kuluçkahane tesisinde yürütülmüştür. Çalışmalarda kullanılan anaç balıklar işletmeye gelmeden önce Çeşme civarında paraketa ile yakalanarak kültür koşullarına adaptasyonu sağlanmıştır. Anaç balıklar, hacmi 18 m³ olan gri renkli silindir şeklindeki polyester tanka ortalama 7 8 kg/ m³ olarak stoklanmıştır. Tanka su değişimi %10 olarak ayarlanmıştır. Deniz suyu 100 µ luk kum filtresinden, U.V. filtreden ve biyolojik filtreden geçtikten sonra ısıtılarak tanka verilmiştir. Anaçlar 3:1 erkek (1352±88.6 gr)/dişi (1546±46.4 gr) oranında tutulmuşlardır. Şekil 3.1. Denemede kullanılan anaç tankları.

69 31 Kozarić et al. (2006) sarpa (Sarpa salpa) türünün sindirim sistemi ve enzimlerinin tanımlanmasına yönelik yaptıkları çalışmada bağırsak emici tüylerinin gelişimi ile birlikte intestinal enzim aktivitesinin tespit edildiğini belirtmiş, bu dönemde düşük olan acid fosfataz aktivitesinin mide oluşumu ile birlikte artışa geçtiğini vurgulamıştır. Önceki açıklamalarda da belirtildiği gibi, sivriburun karagöz balığının alternatif tür kapsamında özellikle son yıllarda ciddi şekilde değerlendirmeye alınan bir tür olması nedeniyle türe ait belirleyici çalışmaların sayısında artış gözlenmiştir. Ancak larval gelişim süresince sindirim enzimleri ontogenisi üzerine tanımlayıcı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bununla birlikte, özellikle juvenil ergin bireylerde yem alımının sindirm enzimleri aktivitesi üzerine Tramati et al. (2005) tarafından bir çalışma yürütülmüştür. Yapılan çalışmada eşit sayıda juvenil ve yetişkin balıklar kafesten işletmeye getirilmeden 3 saat önce %42 protein, %21 yağ içeren ticari yemle beslenmiştir. Sonuçta, midedeki asidik protaz (ph ) ve selüloz baskın iken sindirim sisteminin diğer bölgelerinde nötr ve alkalin protazlar (ph ), ά-amilaz daha fazla miktarda çıkmıştır. Yetişkin sivriburunlar juvenillerle benzer enzimatik oluşum göstermişler fakat oranlar yetişkinlerde daha fazla çıkmıştır. Juvenil ve yetişkin balıklardaki sindirim sistemndeki α-amilaz, selüloz ve lipaz (triglyceride lipazı) aktivitesi karşılaştırıldığında bu oranların yetişkin balıklarda daha fazla olduğu bildirilmiştir.

70 30 Sparidae üyesi alternatif türlerden olan sargos (Diplodus sargus) larva kültüründe açılım sonrası 44. güne kadar olan larval dönemde acid ve alkaline protease ile birlikte amilaz ve lipaz enzimlerinin ontogenik gelişimleri SDS-PAGE yöntemiyle tanımlanmıştır. İncelenen bütün sindirim enzimlerinin ağız açılımı ile birlikte aktif oldukları tespit edilmiş, ontogenik gelişim profillerinin mide oluşumu gibi metamorfoz dönemindeki organel gelişimlerinden ve sövraj sırasındaki canlı yem-mikropartikül tıoz yem değişiminden önemli derecede etkilendikleri bildirilmiştir. Moyano et al. (2005) Sparidae üyesi alternatif türlerden kırmızı bantlı mercan (Pagrus auriga) türü üzerinde sürdürdükleri çalışmada larval gelişim (0 40 gün) periyodunda 3. gün ağız açılımını belirtmişler. Tripsin aktivitesinde ilk 25 günlük periyotta artış, ardından azalma izlemişlerdir. Kimotripsin aktivitesi de benzer bir profil sergilemiştir. Fonksiyonel mide oluşumuna bağlı acid protease aktivitesi 30. günden itibaren artış göstermiştir. Suzer et al. (2006) kırma mercan (Pagellus erythrinus) larval gelişim (0 40 gün) süresince başlıca sindirim enzimlerinin ontogenik gelişimlerini incelemiştir. Larvalarda ağız açılımı 3. gün gözlenmiş ve eksojen besin alımına bağlı olarak tripsin ve kimotripsin aktivitesi ilk kez tespit edilmiştir. Bunun yanında, amilaz ve lipaz aktivitesi sırasıyla 2 ve 4. günlerde saptanmıştır. Kırma mercan larvalarında metamorfoz 20. günden itibaren başlamış ve fonksiyonel mide oluşumu ve pepsin aktivitesi ilk olarak 25. günde tespit edilmiştir.

71 29 artış gözlenmiş, buna bağlı olarak sitosolik enzimlerden leucine-alanin peptidaz enzim aktivitesinde bir azalma tespit edilmiştir. Yapılan bir çalışmada eşkine (Sciaenops ocellatus) larvalarında tripsin, amilaz ve lipaz enzimlerinin ontogenik gelişimleri incelenmiştir. Larvaları 2 gruba ayırmış, ilk grubu sadece canlı yemle beslerken diğer grubu canlı yem ile mikropartikül yem kombinasyonu ile beslemiştir. Her 2 grupta da yaşama oranı ve larval gelişim açısından önemli farklılıklar tespit edilmemiştir. Tripsin, amilaz ve lipaz enzimleri ağız açılımından hemen sonra tespit edilmiş ve 3. günde pik noktasına ulaşmış, izleyen günlerde giderek azalmıştır. Canlı yem ile beslenen gruplardaki sindirim enzimlerinin aktivitesi mikropartikül kombinasyonu ile beslenen gruba göre daha düşük bulunmuştur. (Lazo et al., 2000) Kim et al. (2001) özellikle Uzak Doğuda kültürü yapılmaya başlanan Polynemidae familyasına ait (Polydactylus sexfilis) ve Carangidae familyasına ait (Caranx melampygus) larvaları üzerinde yaptıkları çalışmada günler arasındaki sindirim enzim aktivitelerini incelemiş ve her 2 tür içinde enzim gelişim modelinin aynı olduğunu bildirmiş. Amilaz aktivitesinin ilk günlerde arttığını sonrasında ise azalma eğilimine girdiğini belirtmiştir. Serine proteaz, kollogenaz, lipaz ve alkalin fosfataz aktivitesinin arttığını, larval gelişimin ikinci yarısından itibaren çok keskin bir artış gösterdiğini vurgulamıştır. Bununla birlikte, aspartik protease ve chitinaz aktivitesinin larval gelişimin ilk döneminde çok düşük, ikinci yarısından itibaren metamorfoza kadar sürekli arttığını belirtmiştir.

72 28 gelişimlerini incelemişlerdir. İncelenen enzimlerin aktivitelerindeki önemli değişimlerin larval periyodun ilk günlerinde ya da metamorfozun sonunda meydana geldiği belirtilmiştir. Özellikle asit ve alkalin proteaz aktiviteleri larval dönemin ilk günlerinde tespit edilirken, 9 günlük larvalarda asit proteaz aktivitesi, total proteaz aktivitesinin %10 luk dilimini kapsarken bu oran 33 günlük larvalarda %75 olarak bulunmuştur. Bunun yanı sıra maksimum lipaz aktivitesi pankreasın geliştiği günlerde (6 10 günler) ve metamorfoz sonrasında ölçülmüş, lipid rezervlerinin bu günlerde değerlendirilmesi ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Alkalin fosfataz aktivitesinde günler arasında bir düşüş gözlenirken bu oran 20. günden sonra hızla artmış ve bu artış bağırsak mukozasında bulunan enterositlerin gelişimi ile ilintili bulunmuştur. Sonuç olarak, bu türün sindirim enzim aktivitesinin gelişimin diğer yassı balık türlerindeki gelişim ile benzer olduğu bildirilmiştir. Ribeiro et al. tarafından aynı yıl (1999), yine aynı tür (Solea senegalensis) üzerinde yapılan çalışmada, larvaların ilk bir aylık dönem boyunca bazı pankreatik ve intestinal sindirim enzimlerinin aktivitesi incelenmiştir. 21. güne kadar yapılan ölçümlerde tüm vücut homojenatı kullanılırken bu günden sonraki analizlerde segmental homojenat kullanılmıştır. Denemenin günler arasında pankreatik ve intestinal sindirim enzimlerindeki aktivite diğer türlerde olduğu gibi bir model izlemiş, ilk 10 günlük sürede gözlenen artışı ve sonrasında azalma izlemiştir. 21 ile 27. günler alkalin fosfataz aktivitesinde bağırsak mukozasındaki enterositlerin gelişimine paralel olarak ani bir

73 27 olan aktivitelerini incelemiştir. Mikropartikül yem girişinden sonra larvaların amilaz aktivitesinde az bir artış gözlenmiş, bu artışın mikropartikül yem içeriğindeki %12 nişasta oranından kaynakladığı vurgulanmıştır. Mikropartikül yem girişinden sonra intestinal enzimlerin aktivitesindeki artış dikkat çekici bulunmuştur. Sonuç olarak, 20. günden önceki mikropartikül yem girilmesine dayanan sövraj uygulamalarının larval gelişimi ve buna bağlı olarak sindirim prosesinin gelişimini (pankreatik salgı fonksiyonları) durdurduğunu ya da yavaşlattığını bildirmiştir. Baglole et al. (1998) alternatif tür kapsamında değerlendiren yassı balıklar üzerine de son yıllarda enzim aktivitesine bağlı çalışmalar yoğunlaşmıştır. Dil balığı (Pseudopleuronectes americanus) ve sarıkuyruk (Seriola sp.) larvalarındaki sindirim enzimleri aktivitesindeki değişimleri incelemiştir. Çalışmada 3 farklı grupta canlı yem, 15. günden itibaren mikropartikül yem kullanılmış, son grup aç bırakılmıştır. Yapılan enzim analizlerinde alkalin fosfataz, dipeptidil peptidaz IV, aminopeptidaz N ve esteraz aktivitesi her 2 tür içinde açılım sonrası 3. günden itibaren gözlenmiş ve morfolojik değişimlere paralel olarak aktiviteleri artmıştır. Aç bırakılan dil balığı larvalarında hiçbir enzim aktivitesi gözlenmezken, sarıkuyruk larvalarında aminopeptidaz M ve esteraz aktivitesinde azalmalar tespit edilmiş, asit fosfataz aktivitesi izlenememiştir. Mikropartikül yem girişinin enzimatik aktivite üzerindeki etkisi larvalarda gözlenen ölümler nedeniyle saptanamamıştır. Martinez et al. (1999) Senegal dil balığı (Solea senegalensis) larvalarındaki pankreatik ve intestinal sindirim enzimlerinin ontogenik

74 26 (Pagellus erythrinus), fangri (Pagrus pagrus), mandagöz mercan (Pagellus bogaraveo), kupez (Boops boops) ve ısparoz (Diplodus annularis) balıklarının sindirim enzimlerinden α-amilaz aktivitesini incelemiştir. Sonuç olarak, α-amilaz aktivitesinin türlere bağlı beslenme alışkanlıklarına göre faklılık gösterdiğini ve ph ve sıcaklık faktörlerinin bu değişiklikte önemli bir rol oynadığını belirtmiştir. Levrek (Dicentrarchus labrax) larvaları ile Zambonino Infante and Cahu (1994) tarafından yapılan bir çalışmada, 25. günü tamamlayan larvalara farklı besin içeriğine sahip 2 farklı mikropartikül yem, kontrol grubundaki larvalara ise Artemia verilmiştir. Deneme 46. günde tamamlanmış ve bu sürede pepsin ve bazı pankreatik sindirim (Tripsin ve amilaz) enzimlerinin aktiviteleri incelenmiştir. Deneme sonunda, mikropartikül yem verilen gruplarda daha düşük bir gelişim gözlenmiş, larvalardaki tripsin aktivitesi yemlerin amino asit içeriğiyle birlikte artış göstermiştir. Pepsin aktivitesi ilk kez olarak 24. günde tespit edilmiş, mikropartikül yem verilen gruplarda daha yüksek bulunmuştur. Levrek larvalarının sindirim enzimleri ontogenisinin tanımlamasıyla birlikte bu türe ait yeni yaklaşımlar da ortaya atılmıştır. Bu konulardan biri de larvaların olabildiğince erken mikropartikül toz yeme alıştırılmasıdır. Bu kapsamda, Cahu and Zambonino Infante 1994 yılında yaptıkları diğer çalışmada levrek (Dicentrarchus labrax) larvalarını ağız açıldıktan 10, 15, 20 ve 25. günlerden itibaren mikropartikül, kontrol grubunu ise Artemia ile beslemiş ve larvaların pankreatik (Tripsin ve amilaz) ve intestinal (Alkalin fosfataz, leucineamino peptidaz, γ glutamil transpeptidaz) sindirim enzimleri üzerine

75 25 Larvanın ilk gelişim aşamalarındaki fizyoloji ve besin çalışmaları larva kültüründe sindirim enzimi aktivitesi ve buna bağlı olarak beslenme protokollerinin hazırlanması oldukça önem kazanmaktadır (Diaz et al., 1997; Zambonino Infante and Cahu, 2001). Akuakültür alanında, sindirim enzimleri ile ilgili yapılan çalışmalara bakıldığında daha çok levrek ve çipura türleri üzerinde yoğunlaştığı görülür. Kuşkusuz bu türlerin son 20 yıl içinde yoğun üretiminin yapıldığı göz önünde bulundurulursa bunun nedeni daha iyi anlaşılacaktır. Öte yandan alternatif tür kapsamında değerlendirilen türlerin kültüre alınma çalışmaları için yürütülen öncelikli çalışmaların konusu sindirim enzimleri aktivitesi olmaktadır. Bununla birlikte, sivriburun karagöz alternatif türler kapsamında üretim yelpazesine yeni giren bir tür olduğu için bugüne kadar larval dönemi kapsayan sindirim enzimleri ontogenisi üzerine herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Akdeniz ülkelerinde sıklıkla kültürü yapılan diğer bir Sparidae üyesi olan çipura (Sparus aurata) larvaları ile ilgili Moyano et al. (1996) tarafından yapılan bir çalışmada larvalar yumurtadan çıktıktan sonra 30. güne kadar sindirim enzim aktivitelerini incelemiştir. SDS- PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) yöntemi kullanılan çalışmada, proteaz, α-amilaz ve asit ve alkalin fosfataz aktivitelerinin 15. günden sonra arttığı, bu türdeki proteazların serine grubuna ait olduğunu belirtilmiştir. Ayrıca, eksojen besin alımının sindirim enzim aktivitesini önemli ölçüde yönlendirdiği bildirilmiştir. Aynı şekilde, Fernandez et al. (2001) bu yöntemi kullanarak yaptıkları bir çalışmada 5 farklı Sparidae üyesinde mercan

76 24 proteinlerini sindirir ve bunun sonucunda kendi kendini tahrip eder. Bu proenzimlerin aktivasyonu sadece sindirim kanalı içinde gerçekleşmektedir (Trevor Palmer, 1985; Tekman ve Öner, 1994; Gözükara,1997; Sterchi and Stöcker, 1999). Telefoncu, 1997a,b; Kocabıyık, (1997).Teknolojinin ilerlemesine bağlı olarak 1990 lı yıllardan sonra enzimler sadece tıp alanında değil biyoteknolojinin her alanında kullanılarak önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Özellikle akuakültür alanında yeni alanların oluşmasıyla birlikte enzimoloji, genetik ve histoloji gibi konular doğrudan akuakültürdeki çalışmaların içine girmiştir. Doğada var olan su ürünlerinin yanı sıra kültürü sıklıkla yapılmakta olan çipura ve levrek balıklarına ait pek çok çalışma bu dönemde yapılmıştır. Son yıllarda alternatif türlerin gündeme gelmesiyle birlikte bu biyoteknolojik alanların ana konularını yeni türler oluşturmuştur. Avrupa ve Akdeniz de deniz balıkları kültürü genellikle çipura ve levrek üzerine yoğunlaşmış durumdadır. Üretimdeki artışa bağlı olarak tüketimin aynı oranda olmaması, akuakültür sektörüne hareket kazandırabilmek amacı ile alternatif türlerin üretimini gündeme getirmiştir. Bu bağlamda sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) özellikle son yıllarda akuakültür sektöründe alternatif türler arasında değerlendirilen, ekonomik değeri yüksek bir Sparidae ailesi üyesidir (Marangos, 1995; Boglione et al., 2003; Papandroulakis et al., 2004). Son yıllarda kültürü yapılan türlerde larval dönem boyunca sindirim enzimlerinin gelişimi üzerine yapılan yayınlar artmaktadır.

77 23 Çok sayıda protein molekülü ile birlikte bazı enzimler inaktif şekilde ve bir enzimin öncül molekülü olarak sentezlenmektedir. Bunun ardından, bu proteinde bulunan bir ya da daha çok peptid bağının koparılması sonucunda enzim aktif hale geçmektedir. Aktif protein molekülünün enzim olduğu koşulda, bu enzimin inaktif öncül şekline Proenzim ya da proteolitik enzimlerde olduğu gibi enzimin inaktif öncül şekline Zimojen Granülleri denilmektedir (Trevor Palmer, 1985; Gözükara,1997; Sterchi and Stöcker, 1999). Proteinleri parçalayan sindirim enzimleri başlangıçta pankreas ve mideden bir proenzim şeklinde sentezlenmektedir. Bu proenzimler bir ya da daha çok peptid bağının koparılması ya da belli uzunlukta bir peptid kısmının asıl zincirden uzaklaştırılması ile aktif hale gelirler. Çizelge 2.2. Pankreas ve Mideden Proenzim Halinde Sentezlenen Başlıca Proteolitik Enzimler. Proenzimler Sentezlendiği Yer Aktif Enzim Tripsinojen Pankreas Tripsin Kimotripsinojen Pankreas Kimotripsin Pepsinojen Mide Pepsin Prokarboksipeptidaz Pankreas Karboksipeptidaz Proelestaz Pankreas Elestaz İnaktif olarak sentezlenen sindirim enzimleri mide ve bağırsaklarda aktivite gösterirler. Sindirim enzimleri kendilerini korumak için bu enzimleri inaktif formda ve bir proenzim halinde sentezlemektedir. Aksi halde, bu enzimler sentezledikleri hücrenin

78 22 bağlı olarak lineer bir şeklide artmaktadır. Bunun nedeni de enzim moleküllerinin birbirinden bağımsız halde çalışmasıdır. Bu nedenle ortamda ne kadar çok enzim molekülü aktivite gösteriyorsa reaksiyonda o denli hızlı gerçekleşecektir Substrat Konsantrasyonu: Enzim substratı ile birlikte ES kompleksini yaptıktan sonra substrat parçalanarak ayrılmakta ve enzim yeniden serbest hale geçmektedir. Bu noktada enzim molekülünün yeniden bir substrat bulması ve reaksiyona girmesi için belirli bir zaman gerekecektir. Ortamdaki substrat konsantrasyonu arttıkça serbest enzim daha sık çarpışmalar yapacak ve en kısa sürede substratla daha sık birleşerek reaksiyona girecektir. Enzim miktarının sabit olduğu ortamlarda reaksiyonun hızı substrat yoğunluğuna bağlı olarak artmaktadır Zaman: Bir enzim reaksiyonun hızı belirli bir zamanda üretilen ürünün miktarı ile belirlenmektedir. Genellikle enzim aktivite tayinlerinde tespit süresi 5 dakika olarak belirlenmiştir. Bu zamanın aşılması durumunda ortamın ph derecesinde değişimler olabileceği gibi bazı durumlarda ürünün ortamda birikmesine bağlı olarak enzimin denatüre olması söz konusu olacaktır Diğer iyon ve kimyasal maddelerin etkisi: Özellikle sindirim enzimlerinde olduğu gibi inaktif şeklinde sentezlenen enzimlerin aktif konuma geçebilmeleri için bir takım iyon ya da enzimlerle reaksiyona girmesi gerekmektedir. Enzimatik reaksiyonlar sırasında ortamda serbest halde ağır metal iyonlarının bulunması aktivite hızını azaltır ve enzim üzerinde inhibitör (engelleyici) etkisi gösterir.

79 21 Standart koşullar altında ve 25 C de, 1 µmol substratı 1 dakika içinde ürüne dönüştüren enzim miktarı 1 ünite olarak kabul edilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar her koşulda aynı verimlilikte gerçekleşmez. Özellikle enzimlerin protein molekülünden oluştukları düşünüldüğünde ortam parametrelerinin etkisi açıkça ortaya çıkmaktadır Sıcaklık: Enzimlerin en iyi çalışabileceği optimal sıcaklıklar C dolayındadır. Enzimler protein yapısında moleküller oldukları için öncelikle ortam sıcaklığından büyük ölçüde etkilenirler. Daha yüksek ve daha düşük sıcaklıklarda reaksiyonun hızını azaltır ve yüksek sıcaklıklarda protein yapı denatüre olur ve enzimlerin yapısı bozulur. Düşük sıcaklıklar enzimin yapısını bozmaz ancak inaktif duruma geçmesine neden olur. Enzim preparatlarının çok düşük sıcaklıklarda (-80 ile -20 C arası) saklanmasının temel nedeni budur ph: Enzimlerin reaksiyon hızı ortamın farklı hidrojen iyonu konsantrasyonuna bağlı olarak değişmektedir. Enzimin en fazla aktivite gösterdiği optimum ph derecesinin her iki yanında (asidik ya da bazik ortamlarda) enzim reaksiyonu yavaşlamaktadır. Bu nedenle enzim preparatları hazırlanırken bu ph derecesini sabit tutabilmek için ortama bazı tampon çözeltiler konulmaktadır. Örneğin tripsin ve kimotripsin enzimleri ph=8 11, amilaz ph= , lipaz ph=7 ve pepsin ph= derecesinde çalışmaktadır Enzim Konsantrasyonu: Enzim reaksiyonunun hızı, enzimin substratına doygun olduğu koşullarda enzim konsantrasyonuna

80 Transferazlar: Bazı grupların bir bileşikten diğerine aktarılmasını katalizleyen enzimler bu gruba dahildir. Metil, açil, amino, glikozil ya da fosfat gibi spesifik bir grubun bir maddeden diğerine transferini katalizleyen enzimleridir. Örnek: Glukokinaz Hidrolazlar: Genellikle C-O, C-N, C-C ve bazı diğer bağların hidrolitik reaksiyonlarını katalizleyen enzimler bu gruba dahildir. Örnek: Tripsin, kimotripsin, lipaz Liyazlar: Herhangi bir organik moleküldeki grupların (C- O, C-N, C-C) hidrolitik olmayarak eliminasyon yoluyla ayrılmasını katalizleyen enzimler bu gruba dahildir. Örnek: Piruvat dekarboksilaz, karbonik anhidraz İzomerazlar: Substratın molekül içi geometrik değişikliklerini ya da yapısal olarak yeniden düzenlemeyi katalizleyen enzimler bu gruba dahildir. Örnek: D-glukoz-6-fosfat ketol izomeraz, D-gliseraldehid-3-fosfat ketol-izomeraz Ligazlar: ATP ya da diğer bir nükleozittrifosfattaki bir pirofosfat bağının hidrolizi yardımıyla iki molekülü birbirine bağlayarak sentez gerçekleştiren enzimler bu gruba dahildir. Örnek: Asparagin sentetaz, asetil-coa karboksilaz Enzimlerin Aktivitesini Etkileyen Faktörler Enzim aktivitesi tanımlanırken protein miktarından çok biyolojik sistemde gösterdiği aktivite miktarından söz edilmektedir. Enzimler biyolojik sistemlerde genellikle çok küçük miktarda bulunur ve reaksiyona girer.

81 19 b) Enzimler katalizledikleri reaksiyona göre isimlendirilir ve sınıflandırılır. Bu nedenle herhangi bir enzim, katalizlediği reaksiyon tüm ayrıntılarıyla bilininceye kadar sistematik olarak isimlendirilemez. c) Enzim Komisyonunun (E.C.) belirlediği temel ilkeler dikkate alınarak yapılan bir isimlendirme, reaksiyonun geri dönüşlü olduğu deneysel olarak gösterilmiş olsa bile, bütün enzim sınıflarında, reaksiyonun sadece dikkate alınan yönünü ifade eder. Buna karşılık enzimlerin önerilen isimleri genellikle ilgili reaksiyonların canlı ortamdaki yönlerini göz önüne almaktadır. Dinçkaya, (1997b) yılındaki Enzim Komisyonu raporuna göre enzimler katalizledikleri reaksiyon tipine göre 6 ana gruba ayrılmış ve bu gruplarda yer alan her enzim E.C. olarak kısaltılmış ve 4 rakamdan oluşan bir kod numarasıyla tanımlanmıştır. E.C. numarasının kapsadığı dört rakamdan birincisi o enzimin 6 ana gruptan hangisinde yer aldığını, ikinci rakam alt grubu, üçüncü rakam alt-alt grubu ve dördüncü rakam ise o enzimin alt-alt gruptaki seri numarasını ifade etmektedir. Örneğin Tripsin enziminin kod numarası E.C , amilaz enziminin kod numarası E.C ve lipaz enziminin kod numarası ise E.C tür. Enzimler genelde 6 ana gruba ayrılmaktaır Oksidoredüktazlar: Genellikle biyolojik oksidoredüksiyon (redoks) reaksiyonlarının katalizleyen enzimler bu gruba dahildir. Katalizledikleri indirgenme reaksiyonlarında akseptör olarak oksijeni kullanan bu sınıftaki enzimler oksidaz olarak adlandırılır. Örnek: Laktat dehidrogenaz (LDH).

82 18 yapısında bulunmaları nedeniyle metabolik olayların enzimler tarafından çok kolay ve hızlı biçimde gerçekleşebilmesi için organizmalar açısından hayati önem taşıyan bileşiklerdir. En yaygın olarak bilinen bazı koenzimlere NAD (Nikotinamid adenin dinükleotid), FAD (Flavin adenin dinükleotid) ve NADP (Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat) gibi hidrojen taşıyan moleküller örnek olarak verilebilir. Ayrıca, Ca +2, Mg +2, Zn +2, K+, Na +, Cu +2 ve Fe +2 gibi metal iyonları pek çok enzimde kofaktör olarak görev almaktadır. Trevor Palmer, 1985; Uslan, (1997). Enzim, koenzimi ya da kofaktörü ile birlikte ve katalitik açıdan tamamen aktif durumda ise enzimin bu haline Holoenzim adı verilmektedir. Ayrıca, kofaktörün ve koenzimin enzimden ayrılması sonucu enzimin aktivitesini yitirip inaktif konuma geçmesi sonrasında sadece protein kısımdan oluşan inaktif şekline ise Apoenzim denilmektedir İnaktif Protein(Apoenzim)+Kofaktör Enzim Holoenzim Metal İyonu Aktif protein Organik Molekül (Koenzim) Uluslararası Enzim Komisyonunun çalışmaları doğrultusunda enzimlerin adlandırılmasında üç temel ilke dikkate alınmıştır. Bunlar; a) Enzim isimleri sonuna az eki alır. Bu ilke sadece tek bir reaksiyonu katalizleyen enzimler için geçerli kabul edilmiş olup birden çok enzimi içeren sistemlere uyarlanamaz.

83 17 6. Enzimler biyolojik katalizör oldukları için girdikleri tepkimelerden değişmeden çıkmakta ve aynı reaksiyonu tekrar tekrar katalizlemektedir. Sürekli kullanıma bağlı olarak bozulan enzimler parçalanmakta ve ilgili hücre tarafından yeniden sentezlenmektedir. 7. Enzimatik reaksiyonlar belirli bir düzen içinde gerçekleşmektedir. Herhangi bir reaksiyon sonucu oluşan ürün, bir sonraki reaksiyonun substratı olabilmektedir. Örneğin amilaz enzimi ile parçalana nişastadan ürün olarak maltoz oluşmakta ve maltaz enziminin substratını oluşturmaktadır. 8. Enzimler aktif ya da inaktif olarak bulunabilirler. İnaktif konumdaki enzim adlandırılırken katalizlediği reaksiyonun sonuna jen ekini alır. Tripsinojen, kimotripsinojen ve pepsinojen örnek olarak verilebilir. Enzim aktif konumda ise katalizlediği reaksiyonun sonuna az eki alır. Lipaz, amilaz, proteaz, aminopeptidaz örnek olarak verilebilir (Trevor Palmer, 1985; Gözükara, 1997) Enzimlerin Yapısı ve Sınıflandırılması Dinçkaya (1997b). Bazı durumlarda enzimler aktivite gösterebilmeleri için hem koenzime hem de kofaktöre gereksinim duyar ve enzime gevşek ya da kovalent olarak sıkı bağlanmıştır. Enzim yüzeyine sıkıca bağlanmış ve protein yapısında olmayan bu gruplara prostetik grup denilmektedir. Enzimlerin aktivite göstermeleri için gereksinim duydukları kompleks organik moleküllere Koenzim, protein yapısında olmayan genellikle metal iyonlarının meydana getirdiği yan gruplarına ise Kofaktör denilmektedir. Vitaminler koenzimlerin yapısını oluşturmaktadırlar. Bu bağlamda vitaminler, koenzimin

84 16 Şekil 2.6. Substrat-Enzim mekanizması (Gözükara, 1997). 2. Organizmada yaşamsal faaliyetlerin sürdürülmesi için gerçekleşen reaksiyon sayısı kadar enzim çeşidi bulunmakta ve her enzim belirli bir reaksiyonu katalizlemektedir. 3. Enzimler genellikle tersinir reaksiyonlara katılır yani reaksiyonlar çift yönlü çalışmaktadır. Ancak sindirim enzimleri bu kuralın dışında kalmaktadır. Çünkü oluşan ürünün hemen organizma tarafından enerji olarak kullanılmak üzere değerlendirilmesi ve çoğunlulukla sindirim enzimlerinin inaktif şekilde sentezlendikten sonra başka bir tepkime ile aktif hale geçmesi bu kuralı bozmaktadır. 4. Belirli bir apoenzim çeşidi belirli bir koenzim ya da kofaktör ile birlikte çalışmaktadır. Ancak bir Koenzim ve kofaktör, birden fazla enzimle çalışabilmektedir. Bu nedenle var olan enzim sayısı ve çeşidi, kofaktör ve koenzim sayısından daha fazladır. 5. Enzimler düşük enerji ve ısı kullanarak çok hızlı çalışırlar. Örneğin karbonik anhidraz C enzimi bir dakika içinde , amilaz enzimi ve kimotripsin enzimi ise molekülü ürüne çevirmektedir.

85 15 enzimin substratı olmakta ve bu karşılıklı etkileşimler hücre metabolizmasının düzenlenmesinde etkin rol oynamaktadır (Trevor Palmer, 1985; Karlson, 1992, Gözükara, 1997). Enzimlerin genel özellikleri ve çalışma mekanizmaları sekiz temel madde içinde tanımlanabilir. 1. Enzimlerin etki ettiği maddelere substrat adı verilmektedir. Enzim-substrat ilişkisi o enzimin spesifitesini oluşturur ve E. Fisher tarafından anahtar-kilit mekanizması esas alınarak tanımlanmıştır. Yalnız belirli bir anahtarın kilide uyduğu gibi substrat ta sadece belirli bir enzimin aktif merkezine uymaktadır. Enzim molekülünde aktif bölge adı verilen özel bir bölüm yani reaksiyon merkezi bulunur. Enzim, ilgili substratına geçici olarak bu aktif bölgeden bağlanır ve enzim-substrat bileşiği meydana gelir. Enzimler substrata dış yüzeyinden etki eder ve bunun ardından substrat parçalanarak bir ya da iki ürüne dönüşür. Şekil 2.4. te Substrat-Enzim mekanizması gösterilmiştir. S + E SE (A+B) + E S: Substrat E: Enzim A+B: Ürün

86 14 E N E R J İ Reaksiyona girecek olan moleküller Enzim olmadığında aktivasyon enerjisi Enzim varlığında aktivasyon enerjisi Reaksiyon sonucu oluşan ürün R E A K S İ Y O N Şekil 2.5. Enzimlerin genel çalışma prensibi (Gözükara, 1997) Enzimlerin Özellikleri Enzimlerin aktivite göstermeleri için hücre içinde bulunmaları gerekmez. Enzimler canlı hücreler tarafından biyolojik koşullarda sentez edilmektedir. Enzimler oldukça özel yapı kazanmış ve genellikle büyük protein molekülleridir. Proteinlerdeki amino asitlerin primer dizilişi genler tarafından belirlenen düzende gerçekleşmektedir. Enzim yapısında bulunan amino asitlerin özel dizilişi, enzimin belirli bir spesifite ve kuarterner yapı kazanmasında büyük rol oynar. Dolayısıyla enzimler intermedier metabolizmasını oluşturan binlerce kimyasal reaksiyonu yöneten moleküllerdir. Enzimler bir ya da daha çok substratı etkilerken aktivite göstermek için bazen koenzime, bazen de kofaktöre gereksinim duymaktadır. Bir enzimin ürünü, diğer bir

87 13 kalmazlar ve yer değiştirerek avlanırlar. Genellikle larvalar planktonik organizmalarla, yavru ve ergin bireyler ise nektonik organizmalarla beslenirler. Mollusca. Crustacea, Decapod, Policet ve kemikli balıklar tercih edilen besinlerdir ( Hernandez, 2001) Enzimler Canlıya zarar vermeyecek şekilde, biyolojik sistemlerdeki reaksiyonların uygun koşullarda gerçekleşmesini sağlayan protein yapısındaki biyokatalizörlere Enzim adı verilmektedir. Bilindiği gibi katalizör, kimyasal tepkimeye girerek tepkimeyi hızlandıran ve tepkime sonunda hiçbir değişikliğe uğramadan çıkan maddedir (Dinçkaya, 1997b). Yaşamsal faaliyetlerin canlı organizmalarda sürdürülebilmesi için yüzlerce metabolik reaksiyonun gerçekleşmesi gerekmekte ve bu kimyasal tepkimelerin çoğu hücre içinde oluşmaktadır. Tepkimeler sırasında açığa çıkacak yüksek ısı proteinlerin yapısını bozacağı için organizmaya da zarar verecektir. Hücredeki bu kimyasal tepkimelerin canlıya zarar vermeyecek koşullarda, düşük enerji kullanımıyla ve vücut ısısında gerçekleşebilmesi ancak enzimlerin varlığı ile mümkündür (Trevor Palmer, 1985; Gözükara, 1997).

88 12 Doğal üreme periyodu Eylül-Kasım ayları olan sivriburun karagöz anaçlarından bu periyodlar dışında da yumurta almak mümkündür. Özellikle günümüzde yoğun olarak üretimi yapılan çipura ve levrek larva yetiştiriciliğinde mevsim dışı yumurtlatma tekniği ile bütün yıl boyunca yumurta almak mümkündür. Fotoperiyod ve su sıcaklığında yapılan maniplasyonlar neticesinde kuluçkahanenin üretim stratejisine bağlı olarak istenilen zamanda yumurta alınabilir. Bunun yanı sıra, üretim periyodu sırasında yumurtlamanın her hangi bir nedenle kesintiye uğraması ya da sezon sonunda daha fazla yumurta elde etmek için hormon müdahalesi yapılabilir. Sivriburun karagöz anaçlarına ait HCG hormon uygulaması ile yapılan bir çalışmada 900 IU/kg dozda başarılı sonuçlar alınmıştır (Georgiou and Stephanou, 1998). Sivriburun karagöz balıkları genellikle günün ilk ve son saatlerin de yoğun olarak avlanan balıklardır. Daha büyük bireyler geceleri de avlanırlar. Besin zincirinin en yüksek halkasında yer alırlar. Erken yaşam dönemlerinde kıyısal bölgelerde dağılım gösteren sivriburun karagözlerin bolluğu besin zincirinin alt sıralarındaki besin kaynaklarının bolluğu ile ilişkilidir. Besin kaynaklarının bolluğu üzerinde; ortamın tuzluluğu, akıntı rejimi, sıcaklığı ve kimyasal kirlilik etkilidir. Doğada sivriburun karagöz larvaları zooplankton ile beslenirler. Yetiştiricilik koşullarında ise kompoze besinlere kolayca adapte edilebilirler. Kompoze besinlerin kullanılması durumunda da yüksek gelişim oranına sahiptir. Daha önce boy-ağırlık gelişimleri kısa sürede artış göstermektedir. Omnivor bir türdür sürü olarak avlanırlar. Genellikle kayalık bölgelerde bulunmalarına rağmen bir bölgede sabit

89 11 karşılaştırma yapıldığında bu derinliklerde yazın daha bol olarak bulunduğu tespit edilmiştir. Yazın m arasında dağılım gösteren sivriburun karagöz balıkları, kışın marasındaki derinliklerde dağılım gösterir. Kısmi yumurtlama özelliği gösterirler. Yıllık olarak ağırlığının %5 25 i arasında yumurta verirler. Gonad ağırlığının en fazla artış gösterdiği dönem Ağustos ayı ortaları olup Ekim ayında pik yaparlar. Daha sonra yumurtasını bıraktığı için indeks düşüşe geçer (Marangos, 1998). Nekto-bentik bir tür olan siviriburun karagöz ilk gelişim aşamasında mm iken pelajik olup daha sonra bentik tür olarak habitatını değiştirir. Bu aşamada sert zeminde avlanırlar C arasındaki sıcaklıklarda yaşamını sürdürebilir. Optimum sıcaklık aralığı ise C dir arasındaki tuzluluklarda dağılım gösterir. NH 3 seviyesinin mg/lt ninüzerine çıktığı durumlarda mortalite gözlenir(tunesi, Vacchi and Mori 1996) Üreme Özellikleri Hermafrodit bir tür olan sivriburun karagöz anaçlarından 3 yaşında yumurta ve sperm almak mümkündür. Bunun yanında, yumurtlama mevsimi bölgelere göre değişmekle beraber Akdenizde Eylül-Kasım aylarında yumurta bırakırlar. Kısmi yumurtlama özelliği gösterirler (Michale et al., 1996). Çizelge 2.1. Sivriburun karagöz balığının yumurtlama periyodu. Ock Şbt Mrt Nsn Mys Hzrn Tmz Ağs Eyl Ekm Ksm Arlk

90 10 Şekil 2.4. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının dağılım alanları. Bununla birlikte, yayılım gösterdiği okyanuslar; Atlantik okyanusunun kuzeybatısı, kuzeydoğusu, güneybatısı, güneydoğusu, doğu bölgesinin merkezi, batı bölgesinin merkezinde bulunur (Georgiou and Stephanou, D., 1998). Sivriburun karagöz demersal bir balık olup yaz aylarında genellikle kumluk ve kayalık özellik gösteren, m derinliğe sahip yerlerde dağılım gösterirler. Juveniller ise genellikle posidonia yataklarının bulunduğu bölgelerde dağılım gösterir. Larvalar metamorfoza kadar diğer sparid türlerinde oluğu gibi kıyısal bölgelerde bulunurlar. Metamorfozu geçiren larvalar daha derin sulara göç ederler (Marangos, 1998). Özellikle bütün mevsimlerde m arasındaki derinliklerde yoğun olarak bulunurlar. Genellikle bu derinlikte 186 mm den daha büyük balıklara rastlanmaz, daha çok 0 2 grubu genç bireylere rastlanır ( mm). Ancak mevsimler arasında bir

91 9 Şekil 2.3. Karagöz, sivriburun karagöz ve sargos balıklarının karşılaştırmalı morfolojisi ( Sivriburun karagöz Kuzey Amerika da Cape Hatteras tan Florida nın kuzeyine kadar, Güney Amerika da Venezuella kıyılarından Arjantin kıyılarına kadar olan bölgede dağılım gösterir. Batı Atlantik Okyanusunda İngiltere Adalarından Angola, Azore, Madeira, Kanarya ve Cape Verde Adaları kıyılarına kadar olan bölgede ve Akdeniz ile Adriyatik Denizinde doğal olarak bulunur (Georgiou and Stephanou, D., 1998). Amerika Birleşik Devletleri, Arjantin, Brezilya, Cape Verde, Cezayir, Fransa, Fransız Guanası, Guatamala, Güney Kıbrıs Rum Kesimi, Hırvatistan, Honduras, İngiltere, İspanya, İsrail, İtalya, Kolombiya, Kostarika, Kuzey Kıbrıs Türk Kesimi, Lübnan, Meksika, Mısır, Monakao, Nikaragua, Panama, Portekiz, Senegal, Sırbistan, Slovenya, Suriye, Tunus, Türkiye, Uruguay, Venezuella ve Yunanistan kıyılarında doğal olarak yayılım gösterirler.

92 8 Altta 2 4, üstte 3 5 solungaç dikeni vardır. Linea lateralde pul bulunur. Dorsal yüzgeç D XI-XII+23 16, Anal yüzgeç A III olarak formülüze edilir. Enseden operkulum gerisine doğru enine uzanan siyah kalın bir bant yer alır. Son dorsal yüzgeç ışınından sonra küçük bir koyu leke vardır. Diplodus vulgaris Enseden solungaç gerisine kadar uzanan siyah kalın bir bant yer almaz. Kuyruk sapında siyah kalın bir leke bulunur ve yanal çizgideki pul sayısı arasındadır. Diplodus sargus Altta 9 12, üstte 6 9 solungaç dikeni vardır. Linea lateralde pul bulunur. Dorsal yüzgeç D XI-XII+12 15, Anal yüzgeç A III olarak formülüze edilir. Dorsalden ventrale doğru uzanan adet siyah bant yer alır. Enseden operkulum gerisine doğru enine uzanan siyah kalın bir bant yer almaz. Son dorsal yüzgeç ışınından sonra küçük bir koyu leke yer alır. Diplodus sargus Kuyruk sapında siyah koyu bir leke bulunur. Yanal çizgideki pul sayısı arasındadır. Altta 14 17, üstte 9 11 solungaç dikeni vardır. Linae lateralde pul bulunur. Dorsal yüzgeç D XI-XII+11 12, Anal yüzgeç A III olarak formülüze edilir. Dorsalde ventrale doğru uzanan adet siyah bant yer alır. Enseden operkulum gerisine doğru enine uzanan siyah kalın bir bant yer almaz. Son dorsal yüzgeç ışınından sonra küçük bir koyu leke yer almaz. Lithognathus mormyrus (Loy et al., 2000)

93 7 adet çok solgun dikey çizgi ile birlikte 5 7 adet parlak çizgiler bulunmaktadır. Karnı beyaz olup kuyruk sapında halka şeklinde bir bant vardır. Baş kısmı daha koyu renklidir. Boyu 60 cm kadar uzayabilir. Genellikle cm arasındaki bireylere rastlanır. Ağırlığı 2 kg a ulaşabilir (Boglione et al., 2003) Karşılaştırmalı Morfolojisi Sparidae familyasının bir üyesi olan Sivruburun karagöz balıkları özellikle aynı aileye ait karagöz (Diplodus vulgaris), sargos ve mırmır (Lithognathus mormyrus) balıkları ile karıştırılır. Bu türlerde dorsal bölgede yer alan enine kalın ve ince çizgiler ve bununla birlikte kuyruk sapındaki siyah leke bu üç türün kendi arasında karıştırılmasına neden olur. Ancak bu türlerde ağız yapısı, vücut şekli ve karakteristik olarak bulunan bant ve lekeler dışında bir takım morfolojik özelliklerde bu türlerin ayrılmasını daha kolaylaştırır (Şekil 2.3.). Bu türlerin birbirinden ayrılması için aşağıdaki tayin yöntemi kullanılabilir. Maliform dişler yeterince gelişmemiştir. D. Puntazzo Maliform özellik gösteren dişler iyi gelişmemiştir. Altta 7 11, üstte 5 7 solungaç dikeni vardır. Linea lateralde pul bulunur. Dorsal yüzgeç D XI+12 15, anal yüzgeç A III olarak formülüze edilir arasında dorsalde ventrale doğru siyah bantlar yer alır. Kuyruk sapında küçük koyu leke vardır. D.puntazzo Enseden solungaç gerisine kadar uzanan siyah kalın düz bir bant yer alır. Diplodus vulgaris

94 6 yüzmesinde görev alan anal yüzgeç 3 diken ışın ve 13 adet yumuşak ışından oluşur. A III olarak formülüze edilir. İkinci diken ışın diğerlerinden uzundur. Kaudal yüzgeç çatallıdır ve homoserk özellik gösterir. Tamamı yumuşak ışınlardan oluşur. Ortadaki kaudal yüzgeç ışınlarının uzunluğu kenardaki kaudal yüzgeç ışınlarının uzunluğunun % ı kadardır. Yüzgeçler esmerdir. Esmer olan renk dorsalde ventrale doğru açılır. Şekil 2.2. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının morfometrik tanımlamaları ve yüzgeç formülleri ( Sivriburun karagözün linae laterail kavisli bir yapıya sahip olup ve tamdır ve kuyruk sapından başlar, suboperculumun kaidesinde son bulur. Bütün vücut sık pullarla kaplı olup arasında değişen sayıda pul bulunur ve bu pullar Cycloid tiptedir. Erginlerde yüzgeçlere doğru yanaklar pullu fakat preoperkulum çıplaktır. Solungaçlardaki diken sayısı 7-11 dir. Renkleri genelde gümişi gri olmakla beraber 6 7

95 5 Sivriburun karagözü, bu familyanın diğer üyelerinden ayıran en belirgin özelliği kesici dişlerin ileri doğru uzaması ve sivri bir ağız yapısına sahip olmasıdır. Gövdesi yanlardan basık, oval, ağız ve yüz sivridir. Çeneler protraktil, dudaklar ince, her çene üzerinde 8 adet prodif kesici öne doğru eğik kahverengimsi diş bulunmaktadır. Sivriburun karagözün başı küçük, gözleri normal büyükülüktedir. Derisi gümüşi-beyazdan altın sarısına kadar değişir. Ağız terminal konumludur ve küçüktür. Alt çenesi oldukça güçlüdür. (Boglione et al., 2003) Morfolojisi Sırt kısmı yüksek olup tüm balıklarda olduğu gibi gelişmiş yüzgeçlerinin de avantajı ile çok hareketli ve yüksek manevra kabiliyetine sahip bir balıktır. Bu özellik sparidae familyasının tüm üyelerinde görülür. Denge sağlamada, yavaşlamada ve kısmen yer değiştirmede ventral yüzgeçler kullanılır. Pektoral yüzgeç baştan uzundur. Pektoral yüzgeçler yer değiştirmede ve denge sağlamada kullanılır, ileriye doğru hareket, dönme ve ani duruşlarda fren görevi görürler. Pektoral yüzgeç kaidesi hizasından başlar ve pelvik yüzgecin kuyruğa doğru sonlandığı hizada son bulur. Uzun bir dorsal yüzgece sahiptir. Balığın dengeli yüzmesine yardımcı olur, ani yön değiştirmede de kullanılır ve D XI olarak formülüze edilir. Dorsal yüzgecin ilk iki diken ışını kısadır. Dördüncü diken ışın bütün diken ışınlardan daha uzundur ve yaklaşık olarak göz çapının katı uzunluktadır. Yumuşak ışınlar yaklaşık olarak pektoral yüzgecin bittiği hizadan başlarlar ve son diken ışından daha uzundurlar. Balığın dengeli

96 4 2. LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ 2.1. Sivriburun Karagöz (Diplodus puntazzo, Cetti, 1777) Balığının Biyolojik Özellikleri Sivriburun Karagöz balığının sistematiği aşağıdaki gibidir; Regnum: Animale Subregnum: Metazoa Phylum: Chordata Subphylum: Vertabrata Superclassis: Gnathostamata Classis: Osteichtyes Ordo: Perciformes Subordo: Percoidei Familya: Sparidae Genus: Diplodus Species: Diplodus puntazzo Cetti, 1777 şeklindedir. Şekil 2.1. Sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) balığının genel görünüşü. (