ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ GELENEKSEL OLARAK ÜRETİLEN ŞALGAM SUYUNDAN LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN İZOLASYONU, TANIMLANMASI VE FENOLİK ASİT DEKARBOKSİLAZ ENZİM ÜRETEN SUŞLARIN SEÇİMİ Gözde OKCU GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi GELENEKSEL OLARAK ÜRETİLEN ŞALGAM SUYUNDAN LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN İZOLASYONU, TANIMLANMASI VE FENOLİK ASİT DEKARBOKSİLAZ ENZİM ÜRETEN SUŞLARIN SEÇİMİ Gözde OKCU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Kamuran AYHAN Bu tez çalışmasında Mersin de hem geleneksel hem de direkt olmak üzere iki farklı yöntemle şalgam suyu üretimi yapan firmalardan ve piyasadan sağlanan şalgam suyu örneklerinden laktik asit bakteri izolasyonu ve tanımlanması yapılmış olup bu suşların fenolik asit dekarboksilaz enzim üretme yetenekleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) tekniği kullanılarak incelenmiştir. Toplam 41 adet şalgam suyu örneğinden izole edilen 21 adet laktik asit bakterisi, 12 adet farklı biyokimyasal test ile tanımlanmıştır. Bunlardan 4 adedinin (%19,05) Leuconostoc mesenteroides, 6 adedinin (%28,57) Lactobacillus plantarum, 1 adedinin Lactobacillus helveticus Lactobacillus acidophilus, 1 adedinin Lactobacillus plantarum Lactobacillus acidophilus ve son olarak 1 adedinin de Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei olduğu belirlenmiştir. Araştırmada tanımlanan 21 adet izolatın, p-kumarik, kafeik, ferulik, o-kumarik, gallik ve sinapik asidi dekarboksile etme yetenekleri incelenmiş ve bu izolatlardan 1, 3, 5, 11, 12, 13 numaralı olanların fenolik dekarboksilaz enzim aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Bunlardan 5 adedinin hem p-kumarik asidi hem de kafeik asidi, 1 adedinin de sadece p-kumarik asidi dekarboksile edebildiği tespit edilmiştir. Ayrıca 1, 3, 5, 12 ve 13 numaralı izolatlar p- kumarik asidi dekarboksile ederek vinil türevi olan 4-vinilfenolü oluştururken, yine bu izolatlardan 3, 5, 12 ve 13 numaralı olanların ise kafeik asidi dekarboksile ederek vinil türevi olan 4-vinilkateşolü oluşturduğu belirlenmiştir. Diğer yandan, çalışmada tanımlanan hiçbir izolatın ferulik, o-kumarik, sinapik ve gallik asidi dekarboksile edemediği de saptanmıştır. Sonuç olarak, tez çalışmasında izole edilip tanımlanan ve fenolik asit dekarboksilaz aktivitesine sahip Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides/dextranicum 2 (3 ve 5 numaralı izolatlar) ile Lactobacillus plantarum un (12 ve 13 numaralı izolatlar), şalgam suyu üretiminde starter kültür olarak kullanılabilecekleri söylenebilir. Kasım 2011, 61 sayfa Anahtar Kelimeler: Laktik asit bakterileri, fenolik asit dekarboksilaz (PAD), şalgam, fenolik bileşikler, HPLC i

3 ABSTRACT Master Thesis IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM TRADITIONALLY PRODUCED ŞALGAM JUICE AND THE SELECTION OF THE STRAINS PRODUCING THE PHENOLIC ACID DECARBOXYLASE ENZYMES Gözde OKCU Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Kamuran AYHAN In this study, şalgam juice samples were taken from fermentation processes of two different şalgam juice production plants, which use both traditional and direct methods, in Mersin region. In addition, commercially available şalgam juice samples were obtained from the local markets. Lactic acid bacteria were isolated and identified from all those samples, and phenolic acid decarboxylase activity of LAB isolates were determined by High performance liquid chromarography (HPLC) method. Twenty one lactic acid bacteria isolated from 41 şalgam juice samples were identified by using 12 different biochemical tests. Four of these isolates (19,05%) were Leuconostoc mesenteroides, six of them (28,57%) were Lactobacillus plantarum, one of them was Lactobacillus helveticus Lactobacillus acidophilus, one of them was Lactobacillus plantarum Lactobacillus acidophilus and finally, one of them was Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei, according to biochemical tests. The ability of defined 21 isolates to decarboxylate p-coumaric, caffeic, ferulic, o-coumaric, gallic and sinapic acids was analysed. From these isolates, numbered as 1, 3, 5, 11, 12, 13 were determined to have phenolic acid decarboxylase activity. Five of them both reduced p-coumaric and caffeic acid, and isolate 11 metabolized only p-coumaric acid. Additionally, isolates numbered as 1, 3, 5, 12 and 13 produced 4-vinylphenol which was vinyl derivative of p- coumaric acid. 4-vinycatechol, a vinyl derivative of caffeic acid, was also identified in the growth medium of isolate 3, 5, 12 and 13. On the other hand, none of isolates defined in our study decarboxylated ferulic, o-coumaric, gallic and sinapic acids. In conclusion, our results suggest that Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides/dextranicum 2 (the isolates numbered as 3 and 5) and Lactobacillus plantarum (the isolates numbered as 12 and 13) should be taken into account for their potential use in şalgam juice production. November 2011, 61 pages Key Words: Lactic acid bacteria, phenolic acid decarboxylase (PAD), şalgam, phenolic compounds, HPLC ii

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans öğrenimim süresince bana çalışma olanağı sağlayan, araştırma konumun seçiminden son aşamaya kadar çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım, her konuda yakın ilgisini gördüğüm Sevgili Hocam Sayın Prof. Dr. Kamuran AYHAN a (Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü) teşekkürü bir borç bilirim. Fenolik madde analizinde deneyimlerinden faydalandığım Prof. Dr. Ender Sinan POYRAZOĞLU na (Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü), Çalışmam sırasında yardımlarını ve manevi desteğini gördüğüm değerli hocam Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünden Arş. Grv. Evrim GÜNEŞ ALTUNTAŞ a ve HPLC analizlerimin ön denemesini gerçekleştiren Uzman Kimyager Nilüfer VURAL a (Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü), Tez araştırmamda kullandığım şalgam suyu örneklerini almama izin veren ve şalgam suyu yapmama olanak sağlayan Serafressh Şalgam firmasından başta İşletme Müdürü (Gıda Mühendisi) Birnur YURT olmak üzere, şalgam suyu üretim ustası Halil ARSLAN a ve firma çalışanlarına, Ayrıca tez aşamam sırasında maddi manevi destekleri ve sevgileri ile her zaman yanımda olan, varlıkları ile bana güven veren, bugünlere gelmemde büyük emek sahibi olan canım Annem Göksel OKCU ya, canım Babam Hüseyin OKCU ya ve biricik Ablam Bengü OKCU ya, Bütün samimiyetimle teşekkürlerimi sunarım. Bu tez 12B nolu, Şalgam suyundan laktik asit bakterilerinin izolasyonu, tanımlanması ve fenolik asit dekarboksilaz enzim üreten suşların seçimi isimli Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesinin bir kısmıdır. Gözde OKCU Ankara, Kasım 2011 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMEL ve KAYNAK ARAŞTIRMASI Şalgam Suyu Şalgam suyu üretiminde kullanılan hammaddeler Şalgam suyu üretimi Laktik Asit Bakterileri ve Fermentasyonu Fenolik Bileşikler ve Antimikrobiyel Özellikleri Fenolik asit dekarboksilaz enzimi ve önemi MATERYAL ve METOT Materyal Metot Şalgam suyu örneklerinin ph değerleri Şalgam suyu örneklerinden laktik asit bakteri izolasyonu Laktik asit bakterilerinin tanımlanması Gram boyama Katalaz testi Oksidaz testi Hareket testi Glikozdan CO 2 üretimi Arjinin hidroliz testi Voges Proskauer testi Metil Red testi Karbonhidrat (Sakkaroz) fermentasyonu Farklı sıcaklıklarda gelişme testleri iv

6 Farklı ph larda gelişme testleri Farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme testleri Laktik asit bakterilerinin fenolik asit dekarboksilaz enzim aktivitelerinin belirlenmesi Hızlı test kiti kullanarak tanımlama ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Şalgam Suyu Örneklerinin ph Değerleri Şalgam Suyu Örneklerinden Laktik Asit Bakteri İzolasyonu Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlama Sonuçları Laktik Asit Bakterilerinin Fenolik Asit Dekarboksilaz Enzim Aktivite Sonuçları Hızlı Test Kiti Kullanılarak Yapılan Tanımlama Sonuçları SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER Ek 1 Araştırmada Kullanılan Besiyerleri Ek 2 Araştırmada Fenolik Asit Dekarboksilaz Enzim Aktivitesine Sahip Olduğu Belirlenen Laktik Asit Bakterilerine Ait HPLC Kromatogramları ÖZGEÇMİŞ v

7 SİMGELER DİZİNİ µl mikrolitre ABS absorbans B. Bacillus E. Escherichia g gram GA Gallik asit GRAS Genel olarak güvenli kabul edilen HPLC Yüksek performanslı sıvı kromatografisi kg kilogram Kob Koloni oluşturan birim L litre L. Lactobacillus LAB Laktik asit bakterileri Leu. Leuconostoc Log Logaritma mg miligram ml mililitre mm milimolar mm milimetre MRS deman, Ragosa Sharpe MR Metil red nm nanometre O. Oenococcus PAD Fenolik asit dekarboksilaz S. Staphylococcus subsp. Subspecies (alt tür, çoğul) spp. Species (tür, çoğul) TS Türk Standardı TSE Türk Standartları Enstitüsü VP Voges Proskauer vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Geleneksel yolla şalgam suyu üretimi... 9 Şekil numaralı izolatın dekarboksile ettiği p-kumarik asidin HPLC kromatogramı Şekil numaralı izolatın dekarboksile ettiği p-kumarik asidin farklı fermentasyon günlerine ait HPLC kromatogramı Şekil numaralı izolatın dekarboksile ettiği kafeik asidin HPLC kromatogramı Şekil numaralı izolatın dekarboksile ettiği kafeik asidin HPLC kromatogramı vii

9 1. GİRİŞ Laktik asit bakterilerinin (LAB) insan sağlığı üzerine pek çok yararının olduğu ve yıllardır fermente ürünlerin üretiminde güvenli kabul edilerek (GRAS-generally recognized as safe) kullanıldığı bilinmektedir (Bell vd. 2005, Tunail 2009, Altuntaş vd. 2010). Günümüzde tüketicilerin kimyasal katkı maddesi içermeyen, doğal ve sağlığı olumlu yönde etkileyen özelliklere sahip ürünlere karşı ilgisinin artmış olması LAB nin yapmış olduğu fermentasyon konusunda yapılan çalışmalara hız kazandırmıştır. Bu bağlamda, süt, et ve sebzelerden yapılan ürünlerde sıklıkla kullanılan LAB, özellikle bakteriyosin üretimi gibi metabolik özellikleri nedeniyle de dikkatleri üzerine çekmiştir (De Vuyst vd. 2004, Tunail 2009, Acuña vd. 2011). Kardiyovasküler hastalıkları ve kanseri önlediği için taze sebze ve meyve tüketimine olan ilgi her geçen gün artmış olup, Avrupa da 21 farklı ticari bitkisel fermentasyon ürünü arasından ekonomik anlamda en çok dikkat çekenleri zeytin, salatalık ile lahana turşusu ve meyve şaraplarıdır (Madigan vd. 2003, Dinçer vd. 2009). Ülkemizde ise Çukurova yöresinde yaygın olarak tüketilen Şalgam suyu mor havuçtan (Daucus carota var. L.) laktik asit fermentasyonu ile elde edilen ekşimsi bir içecek olup, sindirimi kolaylaştırıcı, ferahlatıcı, sindirim sisteminin ph sını düzenleyici ve vücudun bazı minerallerden daha fazla yararlanmasını sağlayıcı özellikleriyle dikkat çekmektedir (Canbaş ve Fenercioğlu 1984). Ayrıca şalgam suyu çeşitli amino asitler, fosfor, potasyum, kalsiyum ve diğer bazı mineraller ve suda çözünen vitaminler bakımından da zengin bir içecektir. Bunlara ek olarak şalgam suyu yapımında kullanılan temel hammaddelerden biri olan mor havuç antioksidan özellikte olan antosiyanin pigmentleri açısından çok zengindir. Mor havuçta fenolik asitlerden p-kumarik, kafeik ve ferulik asit bulunur. Kök kısmında ve konsantresinde ise en fazla olan fenolik bileşen klorojenik asittir (Kammerer vd. 2004). 1

10 Yapısal olarak büyük farklılıklarından dolayı bitkilerden ve bunlardan elde edilen ürünlerde bulunan binlerce farklı fenolik bileşik pek çok gıdanın tat ve aromasına katkıda bulunur. Bunlara ek olarak, bu bileşikler antioksidan aktiviteye sahip oldukları için serbest radikallerin neden olduğu reaksiyonları durdurarak veya engelleyerek kanser, kalp hastalığı ve akciğer hastalıkları gibi pek çok hastalıkların oluşumuna engel olurlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Tüketicilerin beslenme konusunda gittikçe bilinçlenmesi, doğal ve sağlığa faydalı ürünlere doğru olan eğilimlerinin artması dolayısıyla, LAB nin çiğ sebzelerin yerli mikroflorası olması ve fermente gıda ve içeceklerin fenolik bileşikler ve türevlerince zengin olması nedeniyle de bu konuda giderek artan bir ilgi söz konusudur ve daha fazla özgün araştırma yapılmaya başlanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında son yıllarda hem antioksidan özelliğinin yüksek olması hem de mineral ve vitamin içeriği nedeniyle sağlık açısından tüketilmesi önerilen fermente içeceklerden biri olan şalgam suyundan laktik asit bakteri izolasyonu, tanımlanması ve bu suşların fenolik asit dekarboksilaz enzim üretme yeteneklerinin Yüksek performanslı sıvı kromatografi (High Performance Liquid Chromotography) tekniği kullanılarak incelenmesi hedeflenmiştir. 2

11 2. KURAMSAL TEMEL ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1 Şalgam Suyu İnsan yaşamının dengeli bir şekilde sürdürülmesini sağlayan gıdalar, kökenleri ve işlenme biçimleri değişik, çeşitli ürünlerden oluşur. Bu ürünler arasında fermentasyona dayalı olanların önemli bir yeri vardır. Üretimi yöresel olarak sürdürülen pek çok fermentasyon ürünü olduğu bilinmektedir ve bunlardan biri de Adana ve çevresine özgü bir içecek olan şalgam suyudur (Canbaş ve Fenercioğlu 1984). Geleneksel olarak üretiminde bazı farklılıklar bulunsa da şalgam suyu yapımında mor havuç, turp, bulgur unu, ekşi hamur, tuz, su ve isteğe bağlı olarak kırmızı toz biber kullanılmaktadır (Erten vd. 2008, İncedayı vd. 2008). Türk standartlarında şalgam suyu; bulgur unu (setik), ekşi hamur, içilebilir su ve yemeklik tuzun karıştırılıp laktik asit fermentasyonuna tabi tutulduktan sonra elde edilen özütün, şalgam (Brassica rapa), mor havuç (Daucus carota) ve istenirse acı toz biber ilave edilerek hazırlanan karışımın tekrar laktik asit fermentasyonuna tabi tutulması ile elde edilen ve istendiğinde ısıl işlem ile dayanıklı hale getirilen ürün şeklinde tanımlanmaktadır. Çizelge 2.1 de farklı çalışmalardan elde edilen şalgam suyu bileşimine ait veriler ve TS Şalgam Suyu Standardında bildirilen değerler görülmektedir. 3

12 Çizelge 2.1 Şalgam suyunun bileşimi ve TS şalgam suyu standardında bildirilen değerler (Canbaş ve Deryaoğlu 1993, T.S.E. 2003, Tangüler 2010) Şalgam Suyunun Bileşimi Minimum Maksimum Ortalama TS Şalgam Suyu Standardı Toplam asitlik a (g/l) 5,94 8,91 7,11 > 6,0 ph 3,33 3,67 3,49 3,3-3,8 Laktik asit (g/l) 5,18 8,05 6,81 4,5-5,5 Uçar asit b (g/l) 0,57 1,16 0,89 0,7-1,2 Alkol (g/l) 1,32 6,41 3,64 bm Kuru madde (g/l) 22,9 29,2 26,0 > 25 Protein (g/l) 0,88 1,83 1,25 bm Kül (g/l) 14,6 20,65 17,25 < 15 NaCL (%) 1,37 1,97 1,63 < 2,0 Karbondioksit (g/l) 0,44 0,79 0,74 bm Renk indeksi (D 520 ) bm Antosiyanin c (mg/l) 88,3 134,6 114,1 bm a: Laktik asit cinsinden, b: Asetik asit cinsinden, c: Siyanidin-3-glikozid cinsinden, bm: Belirtilmemiş Şalgam suyu ile ilgili yapılan çalışmalar az sayıdadır. Bu konu ile ilgili olarak yapılan bir çalışmada Canbaş ve Fenercioğlu (1984), Adana piyasasından aldıkları şalgam sularının bazı kimyasal bileşimlerini belirlemiş ve bunların satış yerine göre değişebildiğini ve şalgam suyunun doğal olarak saklanmasının güç olduğunu bildirmişlerdir. Canbaş ve Deryaoğlu (1993) geleneksel yolla üretilen şalgam sularında toplam asit miktarlarının laktik asit cinsinden 6,95 8,19 g/l ve ph değerlerinin 3,40 3,48 arasında değiştiğini belirlemişlerdir. Şalgam suyu üretiminde kullanılan havuç boyutunun şalgam suyu kalitesine etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada laktik asit bakterileri, maya ve koliform grubu mikroorganizmaların sayılarının belirlenmesinin yanı sıra fermentasyon sürecinde antosiyanin ve toplam fenolik madde miktarları da belirlenmiştir (Utuş 2008). 4

13 Güneş (2008) yaptığı çalışmada şalgam suyu üretiminde kullanılan siyah havuç miktarının şalgam suyunun bileşimi üzerine etkisini incelediği araştırmasında siyah havuç konsantrasyonlarını %10, %12,5, %15, %17,5 ve %20 oranlarında kullanmıştır. Şalgam suyu üretiminde ilave edilen siyah havuç miktarı arttıkça toplam asitlik, kurumadde, kül, toplam antosiyanin, renk yoğunluğu ve renk indisinin de arttığını belirlemiştir. Denemede şalgam sularının mikrobiyolojik kontrolünde genel olarak LAB, toplam mezofil aerobik bakteri ve maya sayılarında en yüksek değerler fermentasyonun 4. gününde belirlenmiş olup bu sürenin bitiminden sonra sayılarda azalma gözlemlemiştir. Koliform bakteri sayısında fermentasyon süresince azalma olmuş ve fermentasyon sonunda ortamdan koliform bakterisi izole edilememiştir. Bunlara ek olarak yapılan duyusal değerlendirme sonucunda ise %17,5 oranında siyah havuç içeren şalgam suyu örneği en beğenilen örnek olmuştur. Yapılan bir diğer çalışmada mor havuç ve konsantresi, şalgam suyu, nar suyu ve nar ekşisi ürünlerinde aktioksidan aktivitesi tayini yapılmış ve bu ürünlerin fenolik madde profilleri belirlenmiştir. Bir adet şalgam suyu örneğinde toplam fenolik madde miktarı 1,052 mg GA/g olarak belirlenmiş olup kafeik ve p-kumarik asidin yanı sıra yüksek miktarda klorojenik asit tespit edilmiştir (Öztan 2006). Öztürk (2009) tarafından yapılan bir araştırmada Adana piyasasında satılan şalgam sularının kimyasal, fiziksel ve mikrobiyolojik bileşimleri belirlenmiş ve Türk Gıda Mevzuatına uygunlukları araştırılmıştır. Toplanan 20 adet şalgam suyu örneğinden 19 unun TS Şalgam Suyu Standardı ve Renklendiriciler ve Tatlandırıcılar Dışındaki Katkı Maddeleri Tebliği şartlarını tam olarak taşımadığı belirtilmiştir. Yapılan diğer bir çalışmada piyasadan temin edilen bozulmuş şalgam sularından 30 adet Candida crusei, 6 adet Candida pelliculosa ve 3 adet Candida lipolytica olmak üzere toplam 39 adet maya izole edilmiş ve bunların bozulma etmeni oldukları deneysel olarak gösterilmiştir (Özer 2009). Avcı (2008) tarafından yapılan çalışmada şalgam sularında bozulmaya neden olan mayaların inaktivasyonunda sonikasyonun bir alternatif olup olamayacağı test edilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, yüzeyde zar oluşturarak bozulmaya neden olan mayanın Candida inconspicua olduğu teşhis 5

14 edilmiştir. Araştırmacı elde ettiği bulgulara dayanarak sonikasyonun 50ºC gibi bir sıcaklık ile kombine olarak şalgam suyunda asit azalmasıyla bozulmaya neden olan mayaların inaktivasyonunda kullanılabileceği ileri sürülmüştür. Mete (2011) laboratuvar koşullarında geleneksel yöntemle üretilmiş şalgam suyundan fermentasyon süresince LAB izolasyonu gerçekleştirmiştir. İzole edilen 85 adet bakteriden biyokimyasal testler kullanarak 56 adedinin cins bazında LAB olduğunu saptamıştır. İzolatların aminoasit dekarboksilaz aktivitelerini modifiye dekarboksilaz besiyerinde araştırmış ve 53 adedinin tirozin ve arjinin dekarboksilaz aktivitesi gösterdiğini, iki adedinin sadece tirozin dekarboksilaz ve bir adedinin ise sadece arjinin dekarboksilaz aktivitesi gösterdiğini belirlemiştir. HPLC yöntemiyle izolatların MRS besiyerinde biyojen aminlerden daha çok tiramin ve agmatin, az miktarda da putresin ürettiklerini belirlemiştir Şalgam suyu üretiminde kullanılan hammaddeler Şalgam suyu, kırmızı renkli, bulanık, ekşi ve lezzetli bir içecek olup laktik asit fermentasyonu ile elde edilmektedir. Üretiminde siyah havuç, bulgur unu (setik), maya, kaya tuzu, şalgam ve su kullanılır. Şalgam her zaman bulunmaması ve özellikle maliyet üzerindeki etkisi nedeniyle, şalgam suyu yapımında çoğu kez kullanılmamaktadır (Canbaş ve Fenercioğlu 1984, Türker vd. 2004, Erten vd. 2008). Siyah havuç, Apiaceae (eski adı Umbelliferae) familyasından iki yıllık bir bitkidir ve bilimsel adı Daucus carota dır. Siyah havucun şalgam suyu üretiminde kullanılan temel hammadde olmasının sebebi şalgam suyuna kırmızı rengi veren antosiyaninlerce zengin olmasıdır. Dolayısıyla doğal gıda renklendiricilerine talep artışı nedeniyle her geçen gün üretimi artmaktadır (Kammerer vd. 2004, Erten vd. 2008) yılında dünyada yıllık havuç ve şalgam üretimi 21 milyon ton olarak bildirilmişken, 2005 yılında, dünya da 25 milyon tonu ve 2008 yılında 27 milyon tonu geçmiştir. Bunlara ek olarak, toplam havuç ve şalgam üretim miktarı Avrupa da ton ve Dünya da ton dur (Tangüler 2010). 6

15 β-karoten siyah havuçlarda temel pigmenttir ve miktarı % e kadar çıkabilir. Bilimsel olarak da kanıtlanmış faydalarının en önemli kaynağı mor havuca rengini veren antosiyanin pigmentinin antioksidan özelliğinden gelmekte olup siyanidin glikozidaz içerdiği temel antosiyanindir. Mazza ve Miniati (1993) taze mor havuçta antosiyanin içeriğinin 1750 mg/kg kadar olabileceğini rapor etmişlerdir. Türkiye de yetiştirilen siyah havuçlarda toplam şeker konsantrasyonu 5,12-6,45 g/100g dır. Öte yandan, siyah havuçta 142,3-159,6 g/kg arasında kuru madde, 7,0-13,8 g/kg arasında protein; mineral maddelerden ise demir, potasyum, fosfor, kalsiyum ve sodyum bulunmaktadır. Bunlara ek olarak siyah havuçta fenolik asitlerden p-kumarik, kafeik asit ve ferulik asit bulunmakta olup üç çeşit hidroksibenzoik asit türevide görülmüştür. Kök kısmında 657 mg/kg ve konsantresinde 5815 mg/kg olmak üzere klorojenik asit en baskın fenolik bileşendir (Kammerer vd. 2004). Şalgam (Brassica rapa L.) Curiciferae familyasının bir üyesi olup kalsiyum ve demir gibi mineral maddeler, A, B ve C grubu vitaminler yanında çözünür şekerlerden glikoz (1,41 g/100g), früktoz (1,10 g/100g) ve sükroz (0,206 g/100g) içermektedir. Bazı üreticiler şalgam suyu üretiminde bir hammadde olarak şalgamı kullanmamaktadırlar (Erten vd. 2008). Bulgur unu (setik), bulgura işlenmek üzere kaynatılmış ve kurutulmuş buğdayın dış kabukları ayrıldıktan sonra, kırma haline getirilmesi sırasında oluşan ve elek altında kalan kısmı olup kırma haline getirilen tanenin % 2-3 lük kısmını oluşturur. Bulgur ununda toplam şeker ve nişastanın miktarı sırasıyla 2,23-3,30 g/100g ve 4,45-5,84 g/100g arasında değişmektedir (Canbaş ve Fenercioğlu 1984). Öte yandan, protein miktarı 12,4-17,6 g/100g, kül miktarı 2,32-3,59 g/100g arasında olup, mineral maddelerden demir, potasyum, kalsiyum ve sodyum belirlenmiştir. Bulgur unu, hem geleneksel yöntemin birinci fermentasyonun da hem de direk yöntemde mikroorganizmalar için besin kaynağı olarak rol oynar (Deryaoğlu 1990, Tangüler 2010). Şalgam suyu yapımında maya olarak genellikle ekşi hamur kullanılır. Şalgam suyu üretiminde kullanılan ekşi hamur, gece boyunca oda sıcaklığında ekmek mayası 7

16 hamurunun fermentasyona bırakılması ile elde edilir (Canbaş ve Deryaoğlu 1993, Erten vd. 2008, Mete 2011). Tuz sofra tuzu niteliğindedir. Tuz denilince aksine bir belirtme yoksa sodyum ve klor iyonlarının birleşmesinden oluşan sodyum klorür anlaşılır. Şalgam suyu üretiminde kullanılan tuz, rafine edilmemiş kaya tuzudur. Su ise içilebilir nitelikte musluk suyudur (Canbaş ve Fenercioğlu 1984, Erten vd. 2008) Şalgam suyu üretimi Geleneksel Türk laktik asit fermente içeceği olan şalgam suyu ticari bir şekilde üretilmekte olup üretimi üzerine istatistiksel veriler elde edilememesine rağmen şalgam suyu üretimi ve tüketimine olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır (Erten vd. 2008). Şalgam suyu Adana, Hatay, Mersin, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ile bu illere bağlı ilçelerde tüketilmekle beraber en yaygın olduğu yöre Adana ve yakın ilçeleridir. Bu yörede açık olarak veya şişe ve plastik kaplar içerisinde tüketime sunulan şalgam suyunun üretimi ile ilgili standart bir üretim tekniği bulunmamakla birlikte, ticari olarak şalgam suyunun geleneksel (Şekil 2.1) ve direkt olmak üzere 2 ana üretim yöntemi vardır. Geleneksel yöntem iki aşamayı içermekte olup birinci aşama, birinci fermentasyon (hamur fermantasyonu) ve ikinci aşama ise ikinci fermentasyon (havuç veya esas fermentasyon) olarak adlandırılmaktadır. Birinci fermentasyon LAB nin ve mayaların zenginleştirilmesi için gerçekleştirilir. Bulgur unu, tuz, ekşi hamur ve su karıştırılıp 3-5 gün süresince oda sıcaklığında fermentasyona bırakılır. Daha sonra bulgur unu ve ekşi hamurun fermente olmuş karışımı 3-5 kez yeterli su ile ekstrakte edilir. Birinci fermentasyon sırasında asit içeriği önemli bir şekilde artar ve temel olarak LAB nin önemli aktivitelerinden dolayı ph önemli ölçüde düşer. Ekşi hamur florasını da içeren ekstrakt ana fermentasyonun başlamasına yardımcı olur. Birinci fermentasyondan elde edilen ekstraktlar temizlenmiş ve doğranmış siyah havuç, tuz, istenirse dilimlenmiş şalgam ve yeterli miktarda su, ikinci fermentasyon için tankta birleştirilir. Fermentasyon genellikle oda sıcaklığında (10 C-35 C arasında) 3-10 gün olarak gerçekleştirilir ve bu 8

17 süreçte renkli bileşikler (antosiyaninler) sıvıya geçer. Fermentasyon tamamlandığında kırmızı renkli ve ekşi lezzetli bir içecek elde edilmiş olur (Canbaş ve Fenercioğlu 1984, Canbaş ve Deryaoğlu 1993, Erten vd. 2008, Tangüler 2010). Şekil 2.1 Geleneksel yolla şalgam suyu üretimi (Tangüler 2010) Doğrudan üretim yönteminde ise, hamur fermentasyonu gerçekleştirilmez. Siyah havuçlar seçilir, ayıklanır ve küçük parçalar halinde kesilir. Daha sonra doğranmış siyah havuçlar, tuz, istenirse dilimlenmiş şalgam, ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) veya ekşi hamur ile yeterli miktarda su bir tank içerisinde karıştırılır ve oda sıcaklığında (10 C - 35 C) 3-10 gün fermentasyona bırakılır. Fermentasyonu takiben fermente sıvı tanktan uzaklaştırılır ve açık olarak veya hava almayan şişe ve plastik kaplarda piyasaya verilir (Erten vd. 2008). 2.2 Laktik Asit Bakterileri ve Fermentasyonu LAB morfolojik, metabolik ve fizyolojik karakteristikleriyle birleşmiş Gram pozitif bakterilerinin bir grubunu oluşturmaktadır. Bu grupta yer alan bakterilerin genel tanımı; 9

18 Gram pozitif, Sporolactobacillus inulinus hariç spor oluşturmayan, katalaz negatif, sitokroma sahip olmayan, aerobik olmayan ama aerotolerant, Pediococcus cinsi hariç yalnız tek düzlemde bölünen, asidi tolere edebilen, kuvvetli fermentatif olup, şeker fermentasyonu sırasında başlıca son ürün olarak laktik asit üreten, bazı istisnalar hariç hareketsiz, kok veya çubuk şeklinde bakterilerdir. LAB genellikle besin içeriği bakımından zengin olan ortamlarda, örneğin süt, et ve sebzelerde bulunmaktadırlar (Doyle vd. 2001, Madigan vd. 2003, Bell vd. 2005). Stiles ve Holzapfel (1997) tarafından yapılan çalışmalarda günümüzde gıda ile ilişkisi bulunan laktik asit bakterileri, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ve Weissella gibi cinslerin türlerini kapsamaktadır. Gıdalarda sadece gıda kaynaklı patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaları inhibe etmek ve/veya raf ömrünü uzatmak için kullanılan ve gıdanın duyusal özelliklerinde değişime sebep olmayan antogonistik kültürlere koruyucu kültürler denir. LAB uzun yıllardır gıda üretimlerinde starter ya da koruyucu kültür olarak kullanılan güvenilir bakterilerdir (Ayhan ve Coşansu 1998, Altuntaş vd. 2009). LAB nin insan sağlığı üzerine pek çok yararları olduğu uzun zamandır bilinmekte olup, son 20 yıldır LAB nin ve fermente süt ürünlerinin antikanserojen etkisi olduğu çeşitli çalışmalarla belirlenmiştir (Ayhan ve Akçelik 1992, Altuntaş vd. 2010). Hem hijyen hem de güvenlik noktalarına bakış açısından starter kültür olarak LAB nin veya bakteriyosinlerin kullanımı tavsiye edilir. LAB, ürünlerin hızlı asidifikasyonuna yol açarak, bozulma yapan ve patojen bakterilerin gelişimini inhibe etmektedir. Buna ek olarak fermente gıdalarda proses sırasında kimyasal ve biyolojik olarak meydana gelen hatta zehirlenmelere yol açabilen biyojen aminlerin oluşumunun engellenmesinde biyojen amin oluşturmayan starter kullanımının yararlı olduğu pek çok araştırmada deneysel olarak gösterilmiştir (O Keeffe ve Hill 1999). Ayhan vd. (1999) yaptıkları çalışmada Türk sucuklarının üretimi ve olgunlaştırılması sırasında tüm fermentasyon süresince oluşan biyojen amin miktarları üzerine 10

19 Lactobacillus sake, Pediococcus pentosaceus u içeren starter kültürün etkilerini araştırmışlardır. Starter kullanımının biyojen aminlerden tiramin oluşumunu etkilemediği ancak putresini inhibe ettiğini saptamışlardır. Özkaya (2001) tarafından yapılan çalışmada Türkiye'nin çeşitli yörelerinden sağlanmış olan 30 adet beyaz peynir örneğinden 85 adet LAB suşu izole edilmiştir. Bu bakterilerin starter kültür özelliklerini belirlemek amacıyla asit üretimleri, proteolitik aktiviteleri, antibakteriyel aktiviteleri, dekarboksilaz aktivite yetenekleri ve biyojen amin oluşturma düzeyleri incelenmiştir. Araştırmacı Joosten-Northold (JNM) besiyerini kullanarak dekarboksilaz aktivitelerini incelemiş ve izole edilen laktokok ve laktobasillerin tamamının histidin, tirozin, lisin, ornitin ve fenilalenini kullanamadıklarını buna karşın enterokokların 2 suş dışında sadece tirozini kullandıklarını saptamıştır. Laktik asit üretmeyi başlattıkları için laktik kültürler starter olarak adlandırılmış olup bu starterlerin bir kısmı mezofilik, bir kısmı da termofilik karakterlidir. Fermentasyon proseslerinde, starter kültür olarak dikkatli bir şekilde seçilmiş olan LAB suşlarının kullanılması, arzu edilen özelliklerin ortaya çıkarılmasında yardımcı olmuştur (De vuyst ve Leroy 2004). Bunlara ek olarak LAB, fermente et, sebze, meyve ve tahıl ürünlerinin üretim ve olgunlaştırılmasında önemli rol oynamaları nedeni ile gıda teknolojisinde büyük önem taşımaktadır (Çon ve Gökalp 2000, Tunail 2009). Süt ürünlerinde LAB starterlerinin büyük çoğunluğu rutin olarak kullanılmasına rağmen et ve bazı fermente gıdalar ile sebze fermentasyonlarında sadece birkaç kültür kullanılmaktadır. Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus brevis sebze sularının fermentasyonunda en sık kullanılan starter kültürler olup, örneğin domates suyunun duyusal ve sağlığa yararlı özelliklerini artırmak için Di Cagno vd. (2009) L. plantarum suşlarını kullanmışlardır. Şarap üretiminde Oenococcus oeni en önemli LAB dir ve starter kültür olarak kullanılır. Bunlara ek olarak L. plantarum salatalık, lahana ve zeytin gibi bitki kökenli gıda ürünlerinin fermentasyonunda ticari starter olarak kullanılmaktadır (Ruíz-Barba vd. 1994, Rodriguez vd. 2009). 11

20 Zeytin fermentasyonunda zeytinin doğal florasında bulunan LAB nin önemli bir rolü olduğu bilinmektedir. Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc pseudomesenteriodes veya P. pentosaceus gibi diğer LAB türleri de izole edilmelerine rağmen aslında L. plantarum ve Lactobacillus pentosus zeytin fermentasyonunda kullanılan starterler arasında asıl sorumlu türlerdir (Ruíz-Barba vd. 1994). Lahana turşusu fermentasyonu kaliteyi veya son ürünün güvenliğini etkileyen birçok fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik farklılıklar içerir. Literatür bilgilerine göre bu fermentasyonda temel olarak LAB den Leu. mesenteroides, L. brevis, P. pentosaceus ve L. plantarum un çalıştığı ifade edilmiş olsa da son çalışmalarda Leuconostoc citreum ve Lactobacillus paraplantarum da tespit edilmiştir (Plengvidhya vd. 2007). Salatalık fermentasyonunda L. plantarum, L. brevis, L. pentosus ve Leuconostoc spp. nin yer aldığı bulunmuştur. Leuconostoc ve Lactobacillus cinslerinin fermentasyonun ilk aşamasında baskın olduğu ifade edilmiş ve daha sonra Lactobacillus ve Pediococcus dominant cins olarak ortaya çıkmaktadır. Fermentasyonun son basamağında ise Pediococcus cinsine ait türler görülmüştür (Rodriguez vd. 2009). Şalgam suyunun hoşa giden ekşi tadını fermentasyon sonucu oluşan laktik asit vermektedir. Şalgam suyu gibi laktik asit fermentasyonu sonucu oluşan turşu, kefir, yoğurt gibi fermente ürünlerin en önemli özellikleri laktik asit içermeleridir. Laktik asit, bu ürünlerin dayanıklılığı ve tadı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir (Canbaş ve Deryaoğlu 1993, Tangüler 2010). Şalgam suyu fermentasyonunun bitiminde LAB nin sayısını Güneş (2008) 8,95 log kob/ml, Utuş (2008) 7,49 log kob/ml olarak belirlemişlerdir. Erginkaya ve Hammes (1992) tarafından yapılan araştırmada geleneksel yolla şalgam suyu üretilmiş ve elde edilen üründen Lactobacillus plantarum subsp. arabinosus, Lactobacillus fermentum ve L. brevis olmak üzere 3 farklı LAB izole edilerek tanımlanmıştır. Araştırıcılar şalgam suyu üretiminin standardize edilmesi için suşların starter kültür özelliklerinin irdelenmesi konusunda çalışmalar yapılması gerektiğini vurgulamışlardır. 12

21 2.3 Fenolik Bileşikler ve Antimikrobiyel Özellikleri Fenolik bileşik terimi, yapısında bir hidroksil grubu ile yer değiştiren benzen halkasına sahip olan yenilenebilir bitkilerde bulunan birkaç yüz molekül olarak tanımlanmaktadır. Aromatik halka yapılarıyla ilişkili olarak farklı antioksidan kapasitelerine sahiptirler (Campos vd. 2003, Manach vd. 2004). Fenolik bileşikler besinsel ve antioksidan özelliklere sahip olmalarına ek olarak lezzet, burukluk, renk gibi birden fazla duyusal gıda özelliklerini etkilemekte olup, bitki kökenli birçok gıda ürününün tadına ve aromasına katkıda bulunurlar. Fenolik bileşiklerin aromaya olan katkısı başlıca uçucu fenollerin varlığına bağlıdır ve bunlar yüksek alkollerin hidrolizinden üretilebilirler veya maya ve laktik asit bakterileri gibi mikroorganizmaların metabolizmaları sonucunda oluşabilirler. (Rodriguez vd. 2009). Aynı zamanda 4-vinilfenol ile 4-vinilguaiakol gibi formasyonları gıda katkıları olarak kabul edilmektedir ve aroma arttırıcı olarak onaylanmaktadırlar (Anonymous 2001). Kırmızı renkli meyve (çilek, vişne, ahududu) ve sebze (siyah havuç, kırmızı pancar) sularının cazip kırmızı rengini hammaddelerden geçen antosiyaninler vermekte olup, bunlar hem kalite hem de sağlık açısından önemli bileşiklerdir (Karadeniz ve Ekşi 1999). Meyveler, sebzeler ve çay gibi içecekler insan diyetinde yer alan fenolik bileşiklerin ana kaynağıdırlar. Batı dünyasında az bilinen siyah veya mor havucun Türkiye, Afganistan, Mısır, Pakistan, Hindistan ve uzak doğuda geleneksel tüketimi yaygındır. Ülkemizde Adana ve yöresinde tüketimi yaygın olan şalgam suyunun hammaddelerinden biri olan mor havucun kökünde 40 dan fazla fenolik bileşik tespit edilmiş olup, bunların çoğu p- kumarik, kafeik ve ferulik asit olarak belirlenmiştir. Kök kısmında ve konsantresinde ise en yüksek konsantrasyonda fenolik bileşik olarak klorojenik asit belirlenmiştir (Kammerer vd. 2004). Okcu vd. (2011) tarafından yapılan bir çalışmada 8 adet şalgam suyunun fenolik asit içeriği incelenmiştir. Şalgam suyu örneklerinde 8 farklı fenolik asit (p-kumarik, kafeik, ferulik, klorojenik, kateşin, epikateşin, protokateşuik ve trans-resveratrol) arasında en 13

22 fazla miktarda trans-resveratrole rastlanmış olup trans-resveratrol miktarının 12 mg/l ve 35 mg/l arasında değiştiği belirlenmiştir. Öztan (2006) starter kültür kullanarak üretilen 1 adet şalgam suyu örneğinde toplam fenolik miktarını 1,052 mg GA/g olarak belirlemiş olup kafeik ve p-kumarik asidin yanı sıra yüksek miktarda klorojenik asit tespit etmiştir. Özkan vd. (2005) mor havuç konsantrelerindeki antosiyaninlerin ısıl stabilitelerini incelemişlerdir. Utuş (2008) şalgam suyu üretiminde kullanılan havuç boyutunun şalgam suyu kalitesine etkilerini araştırarak fermentasyon süresince antosiyanin ve toplam fenolik madde miktarlarını belirlemiştir. Güneş (2008) şalgam suyunda fermentasyon süresi boyunca siyah havuç miktarına bağlı olarak fenolik bileşiklerin miktarının arttığını belirlemiştir. Son yıllarda patojenlere dirençliliğin artması, tüketicinin bilinçlenmesiyle daha az kimyasal koruyucu içeren gıdalara ilgi artmıştır ve hatta daha doğal beslenme alışkanlıklarının geliştirilmeye çalışılması nedeniyle yeni etkin antimikrobiyel ürünlerin kullanımı konusundaki çalışmalar hız kazanmıştır (Baydar vd. 2004). Fenolik bileşiklerin antimikrobiyel etkisi, hücresel iki farklı yapı olan hücre duvarı ve sitoplazmik membranda meydana gelen değişikliklere bağlı olarak açıklanmaktadır. Muhtemelen bu değişiklikler hücre zarının zarar görmesi şeklinde gerçekleşmektedir. (Ruíz-Barba vd. 1990). Yapılan bir çalışmada Lactobacillus plantarum suşlarına karşı 10 adet şarap fenolik bileşiğinin antimikrobiyel etkisi incelenmiş ve inhibisyonun: kateşin=gallik asit < gallat epikateşin=salisilik asit < metil gallat=kafeik asit < ferulik asit=triptofol < p-kumarik asit şeklinde arttığını rapor etmişlerdir (Landate vd. 2007). Ruíz-Barba vd. (1990) L. plantarum ile zeytinden elde edilen fenolik bileşikler arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Araştırmacılar yeşil zeytinden ekstrakte edilen oleuropeinin, fermente yeşil zeytin salamurasından izole edilen L. plantarum suşlarına karşı bakterisidal etkisi olduğunu belirlemişlerdir. 14

23 Theobald vd. (2007) yeşil çayda bulunan fenolik asitlerin (özellikle epigallokateşin galat) konsantrasyona bağlı olarak Oenococcus oeni nin gelişimini inhibe ettiğini saptamışlardır. Velioğlu (2007) yaptığı çalışmada yeşil çay ekstraktlarının Staphylococcus aureus ve Bacillus cereus üzerinde antibakteriyel etki gösterdiğini belirlemiştir. Şarapta Lactobacillus hilgardii gelişimi şarap bozulmasının bir sebebi olarak tanımlanmış olup, Campos vd. (2003) tarafından yapılan çalışmada L. hilgardii nin gelişimi üzerine p-kumarik asit güçlü bir inhibitör etki gösterirken kafeik ve ferulik asit olumlu etkiler sergilemiştir. Garci-Ruiz vd. (2008) yaptıkları çalışmada şarapta bulunan farklı sınıflardaki fenolik bileşiklerin inaktivasyon etkisini şarap izolatı olan L. hilgardii ve Pediococcus pentosaceus e karşı denemişlerdir. Fenolik bileşiklerin sadece bakteriyel inaktivasyona sebep olmadığı aynı zamanda hücre ölümünü gerçekleştirdiğini ortaya koymuşlardır. Baysal ve Harsa (2008) piyasadan satın aldıkları şalgam suyuna Escherichia coli, S. aureus, B. cereus ve Listeria innocua nın farklı konsantrasyonda canlı kültürlerini inoküle ederek buzdolabı sıcaklığında inkübe etmişler ve bu patojenlerin gelişimlerini izlemişlerdir. Deneme sonuçlarına göre şalgam suyunda bahsi geçen bakterilerin hemen hemen tamamının 24 saat sonunda inhibe olduğunu sadece L. innocua nın 24 saatlik inkübasyonun bitiminde 2,6 log CFU/g ve 48 saat sonra ise 2,7 log CFU/g düzeyinde canlılığını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Araştırıcılar L. innocua nın laktik asit varlığı ve tuza rağmen canlı kalmasının gıda güvenliği açısından çok önemli olduğunu ve özellikle stres ve asit adapte suşlar konusunda da çalışmalar yapılması gerektiğini vurgulamışlardır. Genellikle fermente gıdaların tüketilmesinden dolayı oluşan gıda zehirlenmesi vakalarında biyojen aminler de yer almaktadır, buna ek olarak putresin ve kadaverin gibi biyojen aminler karsinojenik nitrozaminlerin öncü bileşikleri olarak tanımlanırlar. Alberto vd. (2007) tarafından şarapta yapılan bir araştırmada protokateşuik, vanilik ve kafeik asit gibi fenolik asitlerin L. hilgardii nin gelişimini teşvik ederek agmatinden putresin oluşumunu engellediği ifade edilmiştir. Çok yakın bir tarihte Garcı a-ruiz vd. 15

24 (2008) tarafından yapılan bir çalışmada şarapta yaygın olarak kullanılan SO 2 ye alternatif yeni antimikrobiyel madde olarak fenolik ekstraktların kullanılabileceği önerilmektedir Fenolik asit dekarboksilaz enzimi ve önemi Fenolik dekarboksilazı üreten suşların gıdalarda aroma oluşumu veya fermente yiyecek ve içeceklerin organoleptik kalitelerinin kontrolünde kullanılabildikleri bilinmektedir. Birçok sebze fermentasyonunda laktik starter olarak kullanılan Lactobacillus plantarum p-kumarik ve ferulik asidi 4-vinil türevlerine dekarboksile edebilmiştir. Yapılan analizler iki farklı fenolik dekarboksilaz enziminin varlığına işaret etmiştir, fakat bu konu tam olarak açıklığa kavuşturulamadığından dolayı L. plantarum kültürünün indüklediği p-kumarik asit üzerinden saflaştırılmaya odaklanılmıştır (Cavin vd. 1997). LAB dışında kalan bakteriler arasında ise sadece iki fenolik asit dekarboksilaz saflaştırılmış ve bunlar Pseudomonas fluorescens ın ferulik asit dekarboksilazı ve Bacillus pumilus un ferulik ile p-kumarik asit dekarboksilazıdır. Bunlara ek olarak Van Beek ve Priest (2000) viski fermentasyonundan izole edilen çeşitli Lactobacillus suşlarında benzer fenolik dekarboksilaz enzim (PAD veya PDC) genlerinin dizilişini açıklığa kavuşturmuştur. Son yıllarda mikroorganizmaların tanımlanması ve aktivitelerinin analiz edilebilmesi amacıyla moleküler uygulamaların kullanımına ve geliştirilmesine olan ilgi artmış olup bu uygulamalar özellikle fermentasyonda yer alan ve probiyotik olarak pazarlanan LAB nin tanımlanması için giderek daha fazla kullanılmaya başlanmıştır. Bu moleküler uygulamaların birçoğu 16S ribozomal sekanslarına veya PCR (Polymerase chain reaction) tekniklerine dayanmaktadır (De Vos vd. 2007). De las Rivas vd. (2009) yaptıkları çalışmada 85 adet LAB de pdc (pada) yi kodlayan genin varlığını araştırmışlar ve laboratuvar ortamında uçucu fenollerin üretimi ile LAB suşlarındaki pdc geni arasındaki ilişkiyi ortaya koymuşlardır. Buna göre; şarapta uçucu fenollerin üretim potansiyellerine karar verebilmek için moleküler metot olarak LAB suşlarında pdc geninin saptanmasını önermişlerdir. PCR analizi, pdc proteinine karşılık 16

25 gelen 321 bp amplikonunu Lactobacillus brevis, L. plantarum ve Pediococcus pentosaceus türlerine ait olan suşların verdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca çalışmada, L. plantarum a ait bir suşun üç hidroksisinnamik asidi vinilfenol ve vinilkateşol türevlerine dekarboksile edebildiği kanıtlanmış olup bunların etil türevleri olan etilfenol ve etilkateşole indirgendikleri de belirlenmiştir. Bunlara ek olarak Lactobacillus brevis ve P. pentosaceus suşlarının p-kumarik ve kafeik asidi tamamen dekarboksile ettikleri saptanmıştır. Çeşitli Lactobacillus suşlarında PAD ı kodlayan genin ortaya çıkarılmasından sonra Couto vd. (2006) 35 adet şarap laktik asit bakterilerinin sıvı besiyerinde ilgili fenoliklerden (p-kumarik ve ferulik asit) uçucu fenol üretebilme yeteneklerini araştırmışlardır. Araştırma sonuçlarına göre şarapta uçucu fenol üretebilen LAB suşlarının önceden tanımlanmasında pdc DNA fragmentinin amplifikasyonunun kolay, hızlı ve kullanışlı bir yol olduğu ortaya konulmuştur. LAB ve fenolikler arasındaki ilişki iki şekilde düşünülebilir: LAB, fenolleri daha az kompleks fenolik metabolitlere indirgeyebilir ve bakteriyel gelişme ve metabolizması bu fenoliklerinden veya diğer mikroorganizmalar tarafından üretilen fenolik metabolitlerden etkilenebilirler. Bu iki etkileşim içinde fenolik bileşiklerin konsantrasyonu kritik gibi görünmektedir. Bakteri bu konsantrasyonu tolere edebilir hatta metabolize edebilir ve/veya düşük fenolik konsantrasyonlar bakterinin gelişimini teşvik edebilir ya da yüksek konsantrasyonlarda fenolik bileşiklerin varlığı bakterileri inhibe edebilir (Stead 1993). Rozes vd. (2003) şarap üretiminde 50 mg/l veya daha fazla fenolik bileşiğin O. oeni nin gelişimini teşvik ettiğini bulmuşlardır. Hidroksisinnamik asit ve esterlerinin LAB nin gelişimi üzerine stimüle edici etkisinin olduğu gösterilmekle birlikte (Herna ndez vd. 2007) buna karşıt olarak, yüksek konsantrasyonlarının bakteri hücresine toksik etki yapabildiği de ifade edilmektedir (Reguant vd. 2000). Diğer bir araştırma grubu ise bazı hidroksisinnamik asitlerin, şarapta bozulma yapan Lactobacillus collinoides ve L. brevis, E. coli, S. aureus, Bacillus cereus gibi bakteriler 17

26 ve bazı mayalar gibi çeşitli mikroorganizmaların gelişimini inhibe edebildiğini ortaya koymuşlardır (Herald ve Davidson 1983). Couto vd. (2006) yaptıkları çalışmada LAB nin p-kumarik ve ferulik asitten uçucu fenol oluşturma kapasitesini gaz kromatografisiyle incelemişler ve 13 adet suşun p-kumarik asitten uçucu fenol üretebildiğini, bunlardan sadece üçünün ise 4-etilfenol ürettiğini ortaya koymuşlardır. On adet suş sadece 4-vinilfenol oluşturabilmiştir. L. brevis ve L. plantarum un tek bir suşu p-kumarik ve ferulik asit türevlerini üretebilmiştir. L. collinoides in bir suşunun kuvvetli bir 4-etilfenol üreticisi olduğu görülmüştür. Diğer Lactobacillus türleri (L. mali, L. sake ve L. viridescens) yüksek konsantrasyonlar da 4- vinilfenol meydana getirmişlerdir. L. hilgardii suşları dekarboksilasyon aktivitesi göstermemiştir. Araştırmada 8 adet Pediokok suşundan yedisi p-kumarik asitten 4- vinilfenol üretebilmiştir. Pediococcus acidilactici ve Pediococcus damnosus unda 4- vinilfenol üretebildiği görülmüştür. Çalışılan iki O. oeni suşu p-kumarik asit türevlerini oluşturamadığı ve test edilen Leuconostoc mesenteroides de uçucu fenol üreticisi olmadığı anlaşılmıştır. Bunlara ek olarak, Avrupa ve Amerika daki güçlü kamuoyu baskısı, şirketleri gerçekleştirdikleri proseslerle çevre arasındaki etkileşimin farkındalığına zorlamaktadır. Çeşitli gıda endüstrileri tarafından üretilen atıkların uzaklaştırılması, biyolojik arıtımları açısından zorluklara neden olan fenolik bileşiklerin varlığı ciddi bir çevre sorunu teşkil etmektedir. Gıda yan ürünlerinde yüksek düzeyde bulunan fenolik bileşiklerin yeniden değerlendirilebilmesi için laktik asit bakterilerinin kullanılmasıyla ilgili bazı öneriler vardır. LAB, kapasiteleriyle oksijen baskısını, redoks potansiyelini ve ph yı azaltır, zeytin atıklarında bulunan fenolik bileşiklerin biyolojik dönüşümüne umut verici yeni bir yaklaşım sunar (Arvanitoyannis ve Kassaveti 2007). Genellikle zeytin endüstrisi atık iki madde üretmekte olup bunlar katı maddeler ile zeytin fabrikası atık suyu (olive mill wastewater-karasu, OMW) dur. En karışık bitki atıklarından biri olan OMW nin ekolojik problemi, öncelikle OMW yi toksik yapan ve biyolojik parçalanmaya dirençli kılan fenolik bileşiklerin varlığıdır. Kachouri ve Hamdi (2004) yaptıkları çalışmada, zeytin endüstrisi atık suyunu Lactobacillus plantarum ile 18

27 fermente ederek hem toksik olan hem de biyolojik olarak parçalanamayan oleuropein, p-hidroksifenilasetik, vanilik, ferulik ve tirozol gibi fenolik bileşiklerin miktarında azalma sağladıklarını açıklamışlardır. Şarap üretiminden çıkan atıkların uzaklaştırılması şarap imalatçıları açısından uzun zamandan beri bir problemdir. Toplamda şarap üretiminin %20 sinden fazlası atıktır ve bu ciddi çevre problemleri teşkil edecek binlerce tona karşılık gelir. p-kumarik asit şarap distile atık suyunun fenolik fraksiyonunu temsil eden bir bileşiktir (Arvanitoyannis vd. 2006). L. plantarum PAD faaliyetiyle p-kumarik asidi vinil fenole dekarboksile edebilir. Bu nedenle L. plantarum un gelişimi veya saflaştırılmış L. plantarum PAD ın kullanımı, p-kumarik asit solüsyonunda bu fenolik bileşiği daha az toksik türevi olan vinilfenole dönüştürebilecektir. Bu bileşik yeni kokulu kimyasalların biyoteknolojik üretiminde değerli bir arabulucudur ve aynı zamanda gıdalarda aroma artırıcı olarak kabul edilir (Anonymous 2001). 19

28 3. MATERYAL VE METOT 3.1 Materyal Çalışmada laktik asit bakterilerinin izolasyonu için şalgam suyu örnekleri Mersin de şalgam suyu üretimi yapan farklı 2 firmadan (A ve B) sağlanmıştır. A firması direkt yöntemle şalgam suyu üretimi yaparken B firması geleneksel yolla şalgam suyu üretimi yapmaktadır. Örnekler laboratuvarda incelemeye alınıncaya kadar steril örnek kaplarında, 4 C de depolanmış ve ardından kuru buzla korunarak Mersin den Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Gıda Mikrobiyolojisi laboratuvarına ulaştırılmıştır. Araştırmada tanımlanan suşların fenolik asit dekarboksilaz enzim aktiviteleri HPLC yöntemi ile Prof. Dr. Ender POYRAZOĞLU nun laboratuvarında yürütülmüştür. Çalışmada kontrol suş olarak kullanılan Lactobacillus plantarum 11B suşu Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Öğretim Üyesi Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK ten temin edilmiştir. 3.2 Metot Şalgam suyu örneklerinin ph değerleri Firmalardan ve piyasadan sağlanan şalgam suyu örneklerinin ph değerleri Knick 510 (Germany) tipi ph metre kullanılarak belirlenmiştir Şalgam suyu örneklerinden laktik asit bakteri izolasyonu Fermentasyon süresince düzenli aralıklarla A firmasından 21, B firmasından 16 adet örnek ile piyasadan sağlanan 4 adet şalgam suyu örneği (C, D, E ve F) kuru buzla korunarak laboratuvara getirilmiştir (Çizelge 3.1). Oda sıcaklığında çözündürülen toplam 41 adet şalgam suyu örneğinden, otoklavda 121 o C de 15 dakika sterilize edilen 5 ml lik MRS Broth (De Man Rogosa Sharpe, Merck) içeren tüplere 2,5 ml olacak şekilde ekim yapılmıştır. Tüpler 30 o C de 24 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştır. 20

29 İnkübasyon sonunda gelişme olan tüplerden steril MRS Agara (Merck) öze yardımıyla sürme yapılmış ve petriler aynı sıcaklıkta inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonra petriler incelenmiş ve gelişme olan petrilerden tek koloni alınarak MRS Broth besiyerine ekim yapılmıştır. Gelişme olan tüplerden alınan örneklerin saflık kontrolleri aynı sıcaklık ve sürede MRS agar besiyerinde 2 kez tekrarlanmış ve ardından izole edilen 21 adet suş morfolojik tanımlama testleri yapılıncaya kadar saklanmak amacıyla % 20 lik steril gliserol içeren ependorf tüplerine (800 μl aktif kültür μl gliserol) aktarılmış ve -18 C de muhafaza edilmiştir (Harrigan ve McCance 1990). Çizelge 3.1 Şalgam suyu örneklerinden izole edilen suşların izolat numaraları ve temin edildikleri firmalar İzolat İzolat Alındığı Firma Numaraları Numaraları Alındığı Firma 1 A (Fermentasyon 11. gün) 12 C 2 A (Fermentasyon 12. gün) 13 C 3 A (Fermentasyon 13. gün) 14 C 4 A (Fermentasyon 14. gün) 15 C 5 A (Fermentasyon 1. gün) 16 D 6 A (Fermentasyon 3. gün) 17 D 7 A (Fermentasyon 4. gün) 18 D 8 A (Fermentasyon 5. gün) 19 D 9 A (Fermentasyon 6. gün) 20 E 10 A Maya Suyu 21 F 11 B (Fermentasyon 1. gün) 22 Kontrol suş (L. plantarum) Laktik asit bakterilerinin tanımlanması İzolatların biyokimyasal özellikleri öncelikle gram boyama, oksidaz ve katalaz testine göre belirlenmiştir. Daha sonra hareket, glikozdan CO2 gazı üretimi, arjinin hidrolizi, Voges Proskauer, metil red, karbonhidrat (sakkaroz) fermentasyonu, farklı sıcaklık, ph ve tuz konsantrasyonunda gibi fenotipik gelişme özelliklere göre bakılmıştır (Harrigan ve McCance 1990, Temiz 2000, Carr vd. 2002, Halkman 2005) Gram boyama Çalışmada gerçekleştirilen Gram boyama Temiz (2000) e göre yapılmıştır. Gram variable etkiden sakınmak için bakterilerin saatlik kültürleri kullanılmıştır. 21