T. C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T. C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PROBİYOTİK BAKTERİ İZOLASYONU VE KÜLTÜRÜ YAPILAN BALIK TÜRLERİNİN BAĞIŞIKLIK SİSTEMLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİSİNİN TESPİTİ ÜZERİNE BİR ÇALIŞMA Mahmut KAYA Danışman: Prof. Dr. Öznur DİLER YÜKSEK LİSANS TEZİ SU ÜRÜNLERİ YETİŞTİRİCİLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA -2009

2 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... iii ABSTRACT... iv ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERi Probiyotiklerin Tanımı ve Kullanım Alanları Probotiklerin Etki Mekanizmaları Probiyotik Bakteri İzolasyonu ve Seçimi Probiyotik Kullanımında Güvenlik Farklı Alanlarda Probiyotik Uygulamaları İnsan Sağlığında Probiyotik Uygulamaları Bitkisel Üretimde Probiyotik Uygulamaları Hayvansal Üretimde Probiyotik Uygulamaları Gıda Endüstrisinde Probiyotik Uygulamaları Su Ürünlerinde Probiyotik Uygulamaları Patojenlerin Yayılımının Engellenmesi Probiyotiklerin Bağışıklık Sistemine Etkisi Probiyotiklerin Sindirim ve Yem Değerlendirmeye Etkisi Probiyotiklerin Deformasyon ve Mortaliteye Etkisi Probiyotiklerin Su Kalitesi Üzerine Etkisi Su Ürünleri Yetiştiriciliğinde Kullanılan Probiyotikler Balıklarda Bağışıklık Sistemi Bağışıklıkta Rol Alan organlar Spesifik Olmayan Bağışıklık Sisteminin Elemanları Balıklarda Bağışıklığı Etkileyen Faktörler...33 i

3 3.MATERYAL ve YÖNTEM Probiyotik Bakterilerin Kültür Ortamından İzolasyonu İnvitro Antagonizm Testi Deneme Modeli, Balıklar, Ortam ve Su Kalitesi Parametreleri Probiyotik Bakterinin Uygulanması Örnekleme Sıklığı Serum Lizozim Aktivitesi Hematokrit Sayısı Formül Lökosit Tespiti (Periferik Yayma) Ağırlık Artışına Etkisi İstatistiksel Analiz ARAŞTIRMA BULGULARI İnvitro Antagonizm Testi İzole Edilen Probiyotik Bakteri Respiratory Burst Aktivitesi ve NBT (+) Hücre Sayısı Serum Lizozim Aktivitesi Hematokrit Miktarı Formül Lökosit Miktarı (Yayma Preparat Sonuçları) Büyüme Parametrelerine Etkisi TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR...59 ÖZGEÇMİŞ...70 ii

4 ÖZET Yüksek Lisans Tezi PROBİYOTİK BAKTERİ İZOLASYONU VE KÜLTÜRÜ YAPILAN BALIK TÜRLERİNİN BAĞIŞIKLIK SİSTEMLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİSİNİN TESPİTİ ÜZERİNE BİR ÇALIŞMA Mahmut KAYA Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalı Jüri: Prof. Dr. Öznur DİLER (Danışman) Doç. Dr. Ayşegül KUBİLAY Yard. Doç. Dr. Seval Bahadır KOCA Bu çalışma Çipura (Sparus aurata) ve Deniz Levreği nin (Dicentrarchus labrax) bağışıklık sistemlerini güçlendirecek probiyotik bakteri izolasyonunu amaçlamaktadır. Bu araştırma için, deniz suyu, balık mukusu ve bağırsaklarından deniz levreği ve çipura için önemli bir patojen olan Vibrio anguillarum a karşı antagonistik etkisi test edilecek 22 suş izole edilmiştir. Deniz suyundan yapılan izolatta V. anguillarum a karşı antagostik etki tespit edilmiş, bu izolatın bağışıklık sistemine etkisi araştırılmıştır. Besleme denemesi için 20 gramlık 100 çipura ve deniz levreği 6x10 6 CFU g-1 bakteri içeren ticari yemle toprak havuzdaki ağ kafeslerde 28 gün boyunca beslenmiştir. Resirküle denemede 4 gramlık 25 çipura ve deniz levreği 6x10 7 CFU g-1 bakteri içeren solüsyon ilave edilmiş resirküle akvaryumlara konulmuştur. Benzer özellikteki kontrol gruplarında ise bakterisiz ticari yem ve bakterisiz resirküle sistem uygulanmıştır. Deneme süresince 1, 7, 14, 21 ve 28. günlerde örneklemeler yapılmıştır. Balıklardan alınan kan örneklerinde NBT (+) hücreler, Lizozim aktivitesi, Hematokrit değeri, Formül lokosit değerleri incelenmiştir. Probiyotik bakterinin yeme ilave edildiği balık gruplarında levrek balığının 14. gündeki hematokrit miktarı ve çipura balığının 14. gündeki formül lokosit sayısı kontrol grubuna göre istatistiki açıdan önemli bulunmuştur. NBT (+) hücre sayısı ve serum lizozim miktarında yeme probiyotik ilave edilen gruplarda kontrol grubu ve suya probiyotik ilave edilen gruplara göre farklılıklar tespit edilmiş ancak bu fark istatistiki açıdan önemli bulunmamıştır. Ayrıca deneme sonundaki balık ağırlıkları da tespit edilip probiyotik bakterinin ağırlık artışına etkisi de incelenmiş; probiyotik bakterinin etkisi belirlenmiş, fakat bu fark istatistiki olarak önemsiz bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Probiyotik, İmmün sistem, Bakteri izolasyonu, Antagonistik etki, Çipura (Sparus aurata), Deniz Levreği (Dicentrarchus labrax) 2009, 70 sayfa iii

5 ABSTRACT M.Sc. Thesis A STUDY ON ISOLATION OF PROBIOTIC BACTERIA AND DETERMINATION OF THE EFFECTS ON IMMUN SYSTEM IN CULTURED FISH SPECIES Mahmut KAYA Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Aquaculture Sciences Department Thesis Committee: Prof. Dr. Öznur DİLER (Supervisor) Assoc. Prof. Dr. Ayşegül KUBİLAY Asst. Prof. Dr. Seval Bahadır KOCA In this study, it was aimed to isolate of the probiotic bacteria that strengthen of immune systems of European Seabass (Dicentrarchus labrax) and Gilthead Seabream (Sparus aurata). For this research, 22 isolates obtained from sea water, fish intestine and fish mucus, have been tested for it s ability to interfere with Vibrio anguillarum that is important pathogen of seabass and seabream. One isolate that was taken from sea water showed an antagonistic effect against Vibrio anguillarum. This bacteria has been investigated about the effect on the immune system. For the feeding trial, a group of 20 gr 100 gilthead seabreams and european seabass were placed in net cages in soil pond. The bacterial cells (6x10 6 CFU g-1 ) were mixed in commercial dry fish feed for 28 days. For the resirculate trial, a group of 4 gr 25 gilthead seabreams and european seabass were placed into a resirculate aquarium supplemented 6x10 7 CFU g-1 of this isolate for 28 days. Control groups that have similar characteristics received the non-supplemented commercial diet and rearing water. Samples were taken in 1, 7, 14, 21, 28 days for all of groups during the experiment. Nitroblue tetra zolium (NBT) and lysozime activity, hematocrit and leucocyte values were examined in blood samples that were taken from fish. On the groups of probiotics supplemented in fish diet, hematocrit values of seabass and leucocyte values of seabream statically significant than control groups samples on 14th days of research. In the groups of probiotics bacteria supplemented in fish diet, NBT (+) and lysozyme activity higher than other gruops. But this difference wasn t statically signaficant. Moreover, fish weight were determined at the end of the experiment and the affect of probiotic bacteria on increase of weight was investigated. The affect of probiotic bacteria on the increase of fish weight was detected but this effect was not statistically significant. Key Words: Probiotics. Immune system, Isolation of bacteria, Antagonistic effect, Gilthead Seabream (Sparus aurata), European Seabass (Dicentrarchus labrax) 2009, 70 pages iv

6 ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca beni destekleyen ve böyle önemli bir konuda beni yönlendirerek akademisyenlik hayatım için önemli bir çalışma yapmama vesile olan danışman hocam Prof. Dr. Öznur DİLER e teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarımda benden desteğini eksik etmeyen Doç. Dr. Ayegül KUBİLAY, Doç. Dr. İbrahim DİLER, Su Ürünleri Müh. Seçil EKİCİ ve Nevzat KAYNAK a da teşekkür ederim. Çalışmalarımda saha çalışmaları yapmam için yardımcı olan Yasin TOSUN a ( TC Ziraat Bankası A.Ş. Milas Şubesi), Cengiz ÖNDER e (Kılıç Balık A.Ş. Bafa Adaptasyon tesisi işletme Müdürü) ve işletmesini açan İçme köyünden Ali GEZEN e de teşekkür ederim. Ülkemizdeki bilimsel faaliyetlerin öncüsü ve her zaman bilim insanının yanında olan Türkiye Bilim Teknik Araştırma Enstitütü Kurumu (TUBİTAK) na yüksek lisans öğrenimim boyunca Yurt içi Yüksek Lisans bursu tahsis ederek bana maddi destek sağladığı için teşekkür etmeyi borç bilirim. Bu tez çalışması Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimince (SDÜ-BAP) 1645-YL-08 proje numarası ile desteklenmiştir. Tüm eğitim hayatım boyunca bana destek veren ve her zaman yanımda olan aileme de bu vesile ile bir kez daha şükranlarımı sunuyorum. Mahmut KAYA ISPARTA, 2009 v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Jel elektroforezinde probiyotik adayı suşların toksisitesinin belirlenmesi. 9 Şekil 2.2. Bir mikrobiyal örneğin gösterdiği karakteristiğe göre sınıflandırılması 16 Şekil 2.3. Sima -Aji (Çizgili Jack) larvalarında Pseudomonas undina probiyotik suşunun mortalite üzerine etkisi. 17 Şekil 2.4. Çeşitli canlılarda bağışıklık sistemi.. 25 Şekil 2.5. Balıklarda bağışıklık sistemi bariyerleri 25 Şekil 2.6. Balıklarda immun sistemin çalışma şeması Şekil 2.7. Komplement aktivasyonu.. 30 Şekil 2.8. C-Reaktif proteinlerinin serum içerindeki miktarlarının değişimi.. 31 Şekil 2.9. Fagositoz'un gerçekleşmesi 33 Şekil Balıklarda immun sistemi etkileyen faktörler. 34 Şekil 3.1. Resirküle deneme modeli ve kullanılan balıklar 36 Şekil 4.1. Çukur difuzyon agar testi Şekil 4.2. Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması Şekil 4.3. Levrek balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması.. 42 Şekil X de NBT hücreleri ve çekirdekleri.. 43 Şekil X büyütmede bir alanda tespit edilen NBT + hücreler.. 43 Şekil 4.6. Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması.. 44 Şekil 4.7. Çipura balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması Şekil 4.8. Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun serum lizozim miktarlarının karşılaştırılması 45 Şekil 4.9. Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun serum lizozim miktarlarının karşılaştırılması 45 Şekil Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması 46 Şekil Levrek balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması. 46 Şekil Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması 47 vi

8 Şekil Çipura balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması 47 Şekil Levrek balıklarında probiyotiğin suya ilavesinin lökosit hücre tiplerinin dağılımı üzerine etkisi Şekil Levrek balıklarında probiyotik bakterinin balık yemine ilavesinin lökosit sayılarına etkisinin karşılaştırlması.. 49 Şekil Çipura balıklarında aday probiyotik bakterinin yeme ilavesinde oluşan lökosit hücre sayılarının karşılaştırılması. 50 Şekil Çipura balıklarında probiyotik bakterinin suya ilavesinin lokosit hücre tiplerinin dağılım üzerine etkisi 51 Şekil May Grünwald- Giemsa boyamada tespit edilen kan hücreleri Şekil Gruplar arasındaki ortalama ağırlık kazancının karşılaştırılması. 53 Şekil: Gruplar arasındaki spesifik büyüme oranının karşılaştırılması vii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. İnsan besinlerinde uygulanan probiyotik bakteriler 14 Çizelge 2.2. Probiyotik bakterilerin bazı balıkların sindirim sisteminde dayanıklılık süreleri, izole edildiği ortamlar ve antagonizm gösterdiği patojenler Çizelge 4.1. Kullanılan bakterinin geleneksel yöntemlerle elde edilen test sonuçları.. 40 Çizelge 4.2. Apı 20E test sonuçları 41 Çizelge 4.3. Levrek balıklarında yapılan denemede örnekleme günlerinde uygulama gruplarındaki NBT(+) hücre ortalamaları.. 41 Çizelge 4.4. Çipura balıklarında probiyotik bakteri uygulamasının NBT (+) hücre sayısına etkisi 42 Çizelge 4.5. Çipura ve Levrek Balıklarında probiyotik ilavesi sonucu oluşan Serum Lizozim miktarları Çizelge 4.6. Levrek balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin hematokrit miktarları üzerine etkisi.. 46 Çizelge 4.7. Çipura balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin hematokrit miktarları üzerine etkisi.. 47 Çizelge 4.8. Levrek balıklarında probiyotik bakterinin suya ilave edilmesinin lokosit hücre tiplerinin sayısına etkisi 48 Çizelge 4.9. Levrek balıklarında probiyotik bakterinin yeme ilavesinin lökosit hücre tipleri üzerine etkisi.. 49 Çizelge Çipura balıklarında probiyotik bakterinin yeme ilavesi sonucunu gruplar arasında lökosit hücre tiplerine etkisi 50 Çizelge Çipura balıklarında probiyotik bakterinin suya ilavesinin lökosit hücre tiplerinin sayısı üzerine etkisi.. 51 Çizelge 4.12.Çipura balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin büyüme parametrelerine etkisi. 52 Çizelge Levrek balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin büyüme parametrelerine etkisi. 53 viii

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CFU (KOB) Koloni Oluşturan Birim CPE CRP DNA EPC FAO FCR HIRRV IHNV IPNV LPS NBT PBS PCR RES RNA SJNNV TSA TSB UV VCCS VHN YAV Öldürücü Etki C-Reaktif Proteinleri Deoksiribonükleik asit Epitelyumioma Papillosuma Cyprini Dünya Gıda Örgütü Yem Dönüşüm Oranı Hirame Rhabdovırus Infeksiyöz Hematopaetic Nekrozis Virüs Infeksiyöz Pankreatik Nekrozis Virüs Lipopolisakkarit Nitroblue Tetra Zolium Fosfat tampon çözeltisi Polimeraz zincir reaksiyonu Retikuloendothelial Sistem Ribonükleik asit Strippet Jack Nervous Nekrozis Virüs Triptik Soy Agar Triptik Soy Broth Ultra violet Omurga Eğriliği Sendromu Viral Hemorojik Septisemi Sarıkuyruk Asites Vırus ix

11 1. GİRİŞ Dünyadaki hızlı nüfus artışına paralel olarak artan besin ihtiyacının karşılanmasında en önemli alternatiflerden biri su ürünleridir. Su ürünleri üretimi, tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de son yıllarda artış göstermektedir. Fakat bu artış artan talebi tam olarak karşılayamamaktadır. Dünyadaki ve Türkiye deki su ürünleri üretimine bakacak olursak; 2006 yılı için dünyadaki toplam su ürünleri üretimi 143 milyon ton iken, yetiştiricilik yoluyla elde edilen üretim 31 milyon 590 bin iç sularda, 20 milyon 060 bin ton denizlerde olmak üzere toplam 51 milyon 650 bin tondur ( Anonim; 2007). Türkiye deki 2006 yılı toplam su ürünleri üretimi ise 662 bin tondur. Bu üretimin 129 bin tonu yetiştiricilik yoluyla 553 bin tonu da avcılıktan elde edilmektedir. Yetiştiricilikten elde edilen miktarın % 44 ünü iç su balıkları (Alabalık: % 43.50, Sazan: % 0.50), % 56 sını deniz balıkları (Levrek: % 29.8, Çipura: % 22.1, Diğer: % 4.1) oluşturmaktadır (Anonim, 2008). FAO nun 2006 Su Ürünleri istatistikleri incelendiği zaman dikkati çeken önemli bir nokta da su ürünleri yetiştiriciliğinin ekonomiye katkısıdır. Dünyada 1 kg balığın ortalama fiyatı 1.52 USD/kg olurken ülkemizde ortalama 4.27 USD/kg olmaktadır (Anonim, 2007). Ülkemizin 2006 su ürünleri ihracat rakamı 177 milyon 418 bin USD ile toplam ihracatımızın % 0,2 sini oluşturmaktadır. (Anonim, 2007) Üç tarafı denizlerle çevrili ülkemizde su ürünleri ihracatımızın toplam ihracat içindeki payının daha fazla olması beklenmektedir. Ayrıca ülkemizdeki su ürünleri tüketim rakamları incelendiği zaman dünya ortalamasının çok altında olduğu görülecektir. Bunun en önemli nedeni maliyetlerin fazla olmasıdır. Özellikle yem ve ilaç fiyatlarının yüksek olması bu rakamların oluşmasında önemlidir. Ülkemizde su ürünleri ihracatı ve tüketimini artırmanın en önemli yolu düşük maliyetli, etkili ve güvenli yetiştiricilik yapmaktan geçmektedir. Bu sebeple çeşitli yem katkı maddelerinin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu yem katkı maddelerinden biri de faydalı mikro organizmalar olan probiyotiklerdir. Deniz balıklarının larva yetiştiriciliğinde balık sağlığının iyileştirilmesi için alglerle birlikte bakteri kullanımı da tercih edilir (Maeda, 1999). Larval dönemde balıkların 1

12 sindirim (Timmermans, 1987) ve bağışıklık sistemleri (Vadstein, 1997) yeterince gelişmediği için savunmasız bulunmaktadırlar. Ayrıca bu dönemlerde balıklara aşılama da yapılamamaktadır. Bu yüzden bu dönemde en iyi korunma yöntemi probiyotik uygulamasıdır. Probiyotiklerin etkisi temelde; sucul çevredeki patojenleri önleme, akuakültürde su kalitesinin uygun hale gelmesine yardım ederek balık sağlını koruma; canlı besin fonksiyonu sağlama ve bağışıklık sistemini uyarma olmak üzere dört şekilde gerçekleşir (Maeda, 1999). Suyun dezenfeksiyonu ve antibiyotik kullanımları da zararlı mikro organizmalardan korunmak için kalıcı bir çözüm değildir. Çünkü bu uygulamalardan sonra oluşan boşlukta tekrar hangi bakterilerin üreyeceği bilinemez. (Maeda, 1999).Ayrıca bir bakterinin diğer bakterilere antagonistik etkisinin varlığı o bakterinin virüslere karşı da önleyici bir mekanizma olarak çalışabileceğini göstermektedir. Bacillus cinsi bakterilerin birçok virusun yayılmasını engellediği bildirilmiştir (Maeda, 1999). Daha önce yapılan benzer bir çok çalışmada probiyotiklerin bağışıklık sistemi ve büyüme üzerinde olumlu etkilerinden söz edilmektedir ( Kim ve Austin, 2006; Rollo vd., 2006; Yanbo ve Zirong, 2005) ve çeşitli hastalıklardan korunma da da etkili olduğu bildirilmiştir (Aubin vd., 2005; Chabrillon vd., 2005; Brunt ve Austin, 2005; Chythanya vd., 2002). Gatesoupe (1999), probiyotiklerin faydalı olabilmeleri için verilecek canlının bulunduğu ortamdan izole edilmeleri gerektiğini bildirmiştir. Bu çalışma kapsamında yetiştiricilik ortamından probiyotik bakteriler izole edilerek onların hem patojenler hem de balık sağlığı üzerinde etkisinin tespit edilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışma sonunda su ürünleri sektöründe kullanılabilecek potansiyel probiyotik organizmaların ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. 2

13 2. KAYNAK ÖZETLERi 2.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Kullanım Alanları Probiyotikler, bağırsaklardaki mikroflorayı düzenleyen, bağırsak mikrobiyal dengesini değiştirerek konakçı hayvanlara yararlı etkiler oluşturan canlı mikrobiyal yem katkı maddeleridir (Fuller, 1989). Probiyotiklerin kullanım alanı oldukça fazladır. Probiyotik bakteri kullanımının faydaları; - Küçükbaş, büyükbaş ve kanatlı hayvanlarda probiyotik yem katkı maddesi verimi artırır. - İçerdiği mikroorganizmalarla topraktan besinlerin verimli kullanımını sağlar. Bitki büyümesini hızlandırır. Gübre tüketimini azaltır. - Tatlı ve tuzlu su balık yetiştiriciliğinde verimlilik artışı sağlar. Sudaki atıkları dönüştürüp balıkların organik atıklardan zehirlenmesini engeller. Aynı büyüklükteki havuzda daha fazla balık yetiştirilmesine imkân tanır. - Hayvan atıklarından veya gübre çukurlarından gelen rahatsız edici kokuları keser. Atıkların fermentasyonunu sağlayarak gübre değerini artırır. -Çeşitli tarım ve hayvancılık uygulamaları için nitrifikasyon sağlayıcı mikroorganizmalar içerir. Yeryüzündeki tüm canlılar çeşitli mikroorganizmalarla iç içe yaşamaktadır. İnsan nüfusu 6 milyar iken mikroorganizma populasyonu 100 trilyondur. Bu nedenle mikroorganizmaların insan yaşamında çok önemli etkisi vardır. Mikroorganizma kullanımı şarap, bira, peynir, yoğurt, ekmek, turşu v.b. besinlerin üretimine kadar her yerde mevcuttur. Mikroorganizmalar ile insan sağlığı arasındaki bağlantıya kılavuzluk eden hipotez ilk kez bu yüzyılda Rus bilim adamı Ellie Metchnikoff tarafından ileri sürülmüştür. Bu hipoteze göre normal bağırsak florası bugün probiyotikler olarak tanımlanan yararlı mikroorganizmalar tarafından etkilenebilmektedir (Doillet ve Langdon, 1994). Probiyotiklerin kullanımı sonucu insan ve hayvanların bağırsak florası düzenlenebilmekte ve bağırsak problemleri azaltılarak canlıların gelişimi hızlandırılabilmektedir. Ayrıca antibiyotik kullanımı sonucu zarar gören canlının 3

14 mikro florasını düzenleyerek yeniden yapılandırmaktadır. İnsan ve hayvanların beslenmesinde yararlı sindirim bakterileri kullanılarak etkileri incelenmiştir. Özellikle Lactobacillus acidophilus un karasal hayvanların bağırsaklarında patojenik mikroorganizmaların enfeksiyon oluşturmasını önlediği ve kontrol ettiği bildirilmiştir (Douillet ve Langdon, 1994) Probotiklerin Etki Mekanizmaları Probiyotiklerin etki mekanizmalarının açıklanması için halen bir çok araştırma yapılmaktadır. Bu araştırmalar etki mekanizmasındaki en önemli etkenin bakterinin türü, suşu, verilen canlının türü, kullanım zamanı ve kullanım koşullarına bağlı olduğunu göstermiştir (Hooper, 1990; Jones ve Tomas, 1987). Özellikle Gram (-) patojen olan E.coli, Staphylacoccus, Salmonella, Pseudomanas gibi bakteriler ve vibrio türleri ile laktik asit bakterileri arasında antagonistik ilişki varlığı bildirilmiştir (Hooper, 1989; Vanbelle vd., 1990; Aytuğ vd., 1989). Yararlı mikroorganizmalar bağırsak epitelinde ve mukozasında zararlı mikro organizmaların aşırı yoğunlaşmasını önleyerek besin emiliminin artmasına yardımcı olur. Özellikle laktik asit bakterilerini ürettikleri organik asit sayesinde ortam ph sı düşer ve bazik ortamlarda yaşayan birçok patojen bakteri türünün yaşamı engellenir (Fuller, 1986; Hooper, 1989; Hooper, 1990; Lyons, 1987). Ayrıca probiyotik birçok bakteri hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üretimi ile zararlı birçok mikro organizmanın gelişimini de engeller. Probiyotik bakteriler hem yetiştiricilik ortamında hem de mukozada toksik amonyak ve amin üretimini de engelleyerek ortamlarda toksik amin ve amonyak birikimini de önlemektedirler (Hooper, 1989; Hooper, 1990; Vanbelle vd., 1989). Probiyotik bakterilerin immunostimulant etkiye sahip oldukları da bildirilmiştir. Probiyotikler, fagositik hücreleri aktive eder, lenfosit aktivitesini artırır ve antijen spesifik T hücrelerinin aktive olmasını sağlar (Fuller, 1986; Hooper, 1989; Hooper, 1990; Vanbelle vd., 1989). 4

15 Mikro organizmalar sindirim için gerekli olan lipaz, amilaz, proteaz ve sellulaz gibi enzimleri üretebilirler. Bu enzimlerin üretimi özellikle sindirim sistemi tam olarak gelişmemiş genç bireylerde iyi bir simbiyotik etki oluşturur (Hooper, 1989; Hooper, 1990; Vanbelle vd., 1989). Ayrıca mikroorganizmalar vitamin üretimleri ile de sindirim sistemine önemli katkılar sağlamaktadırlar (Hooper, 1989; Hooper, 1990). 2.3.Probiyotik Bakteri İzolasyonu ve Seçimi Probiyotik bakteri izolasyonunda en önemli nokta seçilecek probiyotik bakterinin niteliklerinin belirlenmesidir. Bu yüzden bir bakteriyi probiyotik olarak kullanmadan önce o bakteri ile ilgili birçok çalışma yapılmalıdır. Bunlardan bazıları: İnvitro antagonizm testi, sindirim sistemine tutunma testi, asit ve safra tuzlarına direnç testi, antibiyotiklere direnç testi, virulens testi, zararlı toksin içerip içermediğini belirlemek için yapılacak protein DNA analizi, eğer ısı ve basınç işlemine tabi tutulacaksa son üründeki yaşama oranı ve değişik ortam koşullarına direnç testleri, canlı metabolizmasında canlı kalabilme ve reizolasyon testi ve kullanım alanının gerektirdiği diğer testlerdir (Chabrillon vd., 2006). Probiyotikler sindirim sisteminde epitel yapıdaki mukoz yüzeyine tutunmalı ve burada kolonize olmalıdırlar. Çünkü bağırsak mukozasına tutunma kabiliyeti probiyotik bakteriler için en önemli seçim kriterlerinden biridir (Fuller 1997; Blum vd. 1999; Ouwehand vd. 1999; Suskoviç vd. 2000; Tuomola vd. 2000; O Sullivan 2001; Tuomola vd. 2001; Ouwehand vd. 2001; Vaughan vd. 2002; Rikkinen vd. 2003). Seçilen probiyotik bakteriler sindirim sisteminin üst bölgelerinden geçerken yüksek sayılarda canlı kalabilmeli, midedeki yoğun asidik ortama ve ince bağırsaklardaki safra tuzlarına, lizozim gibi enzimlere, sindirim sırasında oluşan toksik maddelere ve oksijene dayanıklı olmalıdır (Ouwehand vd. 1999; Rogelj vd. 2002; Kalantzopuulos 1997; Blum vd. 1999; Mattila- Sandholm vd a; Shortt 1999; Kailasapathy ve Chin 2000; Kimoto vd. 2000; Erkkila 2001; Lourens-Hatting and Viljoen 2001; 5

16 Ouwehand vd. 2001; Ouwehand vd. 2002; Vaughan vd. 2002; Zavaglia vd. 2002; Itsaranuwat vd. 2003; Oyetayo ve Oyetayo 2005). Seçilen probiyotik bakteriler fajlara dirençli olmalı, hangi canlıda kullanılacaksa o canlının yaşadığı koşulun doğal bir üyesi olmalı, antibiyotiklere dirençli olmalı ve gerektiğinde antibiyotiklerle birlikte kullanılabilmeli, patojen olmamalı, patojenleri engelleme kabiliyetine sahip olmalı, bakteriyosin oluşturabilmeli ve bağışıklık sistemini uyarabilmelidir (Klaenhammer 1998, Dunne vd. 1999; Klaenhammer ve Kullen 1999; Tuomola vd. 2001; Mattila-Sandholm vd. 2002; Rönka vd. 2003; Avonts ve ark,. 2004; Hoesl ve Altwein, 2005). Klaenhammer ve Kullen (1999), probiyotik bakteri seçiminde aşağıdaki noktalara vurgu yapmışlardır. 1. Hedef türle aynı ortamda doğal olarak bulunmalı 2. Toksik ve Patojenik etki göstermemeli 3. Toplu üretime ve depolamaya uygunluk: uygun sıcaklık, konsantrasyon, donma, dehidrasyon, depolama ve dağıtım kolaylığı 4. Yüksek populasyon seviyelerinde canlı kalabilmeli (tercihen ) 5. Kültür hazırlanma sürecinde istenilen özellikler korunabilmeli 6. Gıdalarda veya fermentasyon işlemlerinde kullanıldığında arzu edilen organoleptik (duyusal) özellikleri taşıması veya istenmeyen özellikler taşımamalı 7. Genetik açıdan stabil, uysal olmalı; mutasyonlara sebep olmamalı 8. In vivo şartlarda, hedef bölgede canlılıklarını devam ettirebilmeli, çoğalabilmeli ve metabolik aktivitelerini gerçekleştirebilme yetenekleri yüksek olmalı 9. Safraya ve aside dayanıklı olmalı 10. Normal mikroflorada aynı veya yakın türlerle yarışmacı özelliklere sahip olmalı, mikrofloranın ürettiği asit, bakteriyosin (mikro organizmalar tarafından üretilen ve diğer bakterilerin üremelerini inhibe eden bileşikler) ve diğer antimikrobiyallare karşı dayanıklı olmalı 11. Tutunma ve kolonileşme yetenekleri klinik olarak doğrulanmış bir veya daha çok sağlık yararları ( ör: laktoz toleransı) bulunmalı 12. Patojenik/karyojenik bakterilere karşı antagonistik etkisi olmalı 6

17 13. Antimikrobiyal madde üretme yeteneği (bakteriyosinler, hidrojen peroksit, organik asitler veya diğer inhibe edici bileşikler) olmalı 14. Bağışıklığı uyarıcı etkiler 15. Antikarsinojenik (kanseri durdurucu) etkiye sahip olma 16. Biyoaktif bileşikler üretebilme yetenekleri ( enzimler, vasinler, peptidler) bulunmalıdır (Klaenhammer and Kullen, 1999) 2.4. Probiyotik Kullanımında Güvenlik Faydalı bakteriyel probiyotiklerin kullanımı yetiştiricilikte bakteriyel patojenlere karşı antibiyotiklere alternatif bir uygulamadır. Sayısız bakteri yetiştiricilikte probiyotik olarak kullanılmaktadır. Ancak doğru probiyotik balıkta veya karideste ya da doğal ortamında bulunan bakterilerdir. Probiyotikler patojenlerle besinsel olarak rekabete girerek onların gelişmelerini sınırlandırırlar (Decamp, 2006). Karasal hayvanlarda ve su ürünleri yetiştiriciliğinde probiyotikler dokulardan, atık sudan ya da fermente ürünlerden elde edilir. Ayrıca birçok da seçim yöntemi kullanılır. Temelde probiyotikler yetiştiricilik ortamından, performanslarına göre seçilir (Moriarty, 2006). Yetiştiricilikle uğraşanlar probiyotik seçimi ve üretilmesi ile eş zamanlı olarak onların balık ve diğer mikroorganizmalar açısından güvenliği ve performanslarını da çalışırlar. Ancak su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılan probiyotiklerin insan sağlığına etkileri konusunda çalışma yapılmamıştır. Bazı probiyotikler balıklar için faydalı olurken insanlar ve/veya sucul çevredeki diğer canlılara karşı patojen olabilirler (Decamp, 2006). Probiyotik olarak seçilen suşun doğru tanımlamasını yaptıktan sonra onun yetiştiricilik organizmaları için patojen olup olmadığına veya risk içeren bakteriler grubuna dahil olup olmadığına bakılmalıdır. Örneğin canlı yem üretiminde faydası olmasına rağmen Cytophaga larval balık yetiştiriciliğinde risklidir ve Amerikan Biyolojik Güvenlik Birimi tarafından riskliler listesine alınmıştır. Risk kategorisine 7

18 probiyotik olarak kullanılan Enterococcus, Streptococcus, Bacillus anthracis, Aeromona ve Enterobacter gibi bakteriler de dahildir. Enterococcus türleri peynirler, sucuk ve sosis gibi gıdaların olgunlaşmasında ve aromasında önemlidir. Aynı zamanda probiyotik olarak da kullanılır. Bacteriaemia ve Endocarditis gibi Enterococların rol oynadığı hastalıklardan dolayı güvenlikleri sorgulanmaktadır. Örneğin Kuzey Batı İspanya da Kalkan Balığı yetiştiriciliğinde Enterococcus bazı mortalitelere sebep olur (Moriarty, 2006). Birçok bakteri antibiyotiklere karşı direnç gösterir. Bazı bakteriler de de genetik mutasyonlara uğrayarak antibiyotiklere karşı dirençli olurlar. Bu antibiyotiklere dirençlilik insan veya diğer canlılar için patojen olan organizmalara da nakledilebilmektedir. Örneğin 2003 yılında Gevers ve arkadaşları antibiyotiğe dirençli Lactobacillus lardaki direnç genini laboratuarda Lactoctococcus lactis subs. lactis ve Enterococcus faecium a nakletmeyi başarmışlardır (Gevers vd., 2003) Bacillus cinsi bakteriler sadece atık suda, toprakta, denizde ve tatlı suda bulunmaz aynı zamanda kabuklu, balık ve insan bağırsak mukozasında da bulunur. Bazı bacillus türleri riskli bakteriler grubundadır. Örneğin B.cereus gıdaların bozulması için enterotoksin ve emetik toksin üretirler. Bu yüzden PCR ve Jel elekroforezinde toksin üretimleri test edilmelidir (Şekil 2.1). Probiyotik ürünler hem üretim hem de depolama esnasında kontaminasyonlardan uzak tutulmalıdır. 8

19 Şekil 2.1. Jel elektroforezinde probiyotik adayı suşların toksisitesinin belirlenmesi. 4 ve 6 nolu bantlar toksik genleri gösteriyor. 3 ve 5 nolu sütunlarda da aday probiyotiklerde bu genin olmadığı görülüyor (Bacillus sp) 2.5. Farklı Alanlarda Probiyotik Uygulamaları İnsan Sağlığında Probiyotik Uygulamaları 1974 yılında yayınlanan bir makalede fermente süt ürünleri tüketiminin kolesterol düşürücü etkisi olduğunun bildirilmesinden sonra probiyotik bakterilerin bu konudaki etkileri incelenmeye başlanmış, Lactobacillus acidophilus ve Enterococcus faecium suşlarının kullanıldığı bilimsel bir çalışma sonucunda farelerin ve domuzların serum kolesterol seviyelerini düşürdüğü belirlenmiştir (Parker, 1974). Probiyotiklerin serum kolesterol seviyesini düşürme mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber konu ile ilgili son muhtemel mekanizma, probiyotiklerin safra tuzlarını hidrolize ederek kolesterol seviyesine etki ettiği hipotezidir. Sonuçta etki tek bir mekanizmaya bağlı değildir. (Parker, 1974). 9

20 İnsanın temel gıdasını oluşturan süt ürünlerinin sindiriminde β-galaktoz enziminin azlığı veya bulunmaması nedeniyle laktoz sindirimi yapılamamakta ve sonuçta bağırsak krampları gibi sorunlar ortaya çıkmaktadır. Lactobacillus acidophilus ve Bifidobacterium gibi probiyotik bakterilerin mikrobiyal faaliyetleri sonucunda süt ürünlerindeki laktoz miktarı azaldığı ve β-galaktoz enzimi bulunduğu için laktoza hassasiyeti olan kişiler için uygun hale gelmektedir (Kailasapathy ve Chin 2000; Lourens-Hatting ve Viljoen 2001) Probiyotik bakterilerin peptik, ülser, reflü, mide yanmaları, mide kanseri gibi üst sindirim sistemi hastalıklarının önlenmesinde de etkili olduğu bildirilmiştir. Bifidobacter ve L. Acidophilus un mide asidi içinde canlı kalarak Peptik ülsere neden olan Helicobacter pylori nin çoğalmasını engelediği bildirilmiştir. H.pylori nin neden olduğu hastalık vakalarında bu bakterilerin azlığı dikkat çekmektedir (Brassart ve Schiffrin 1997; Sanders 1999; Kailasapathy ve Chin 2000) Japonya da çocuklar diyare benzeri hastalıklara karsı yüksek sayıda Bifidobakter içeren süt ürünleri tüketerek korunmaktadırlar. L.acidophilus ve Bifidobakterler, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica ve Clostridium perfringens gibi patojen bakterilerin gelismesi üzerine antagonistik etkiye sahiptirler. Bifidobacterium bifidum özellikle 2-6 yaş aralığındaki çocuklarda Rotavirüslerin sebep olduğu ölümcül diyarelerin tedavisinde etkili olmaktadır. Probiyotik bakterilerin E.coli, Salmonella, ve Shigella nın neden olduğu diyareleri de önlediği bildirilmektedir (Kailasapathy ve Chin 2000; Zubillaga vd. 2001) Deney hayvanlarıyla yapılan çalışmalarda L. acidophilus ve Bifidobacterium cinsi bakterilerin prokanserojenlerin aktivasyonunda rol alan enzimleri ve tümör oluşum riskini önemli oranda azalttığı tespit edilmiştir (Stanton vd., 2001). İnsanlarda yapılan bir çalışmada L.acidophilus un çeşitli prokanserojen maddelerin kanserojene dönüşümünde etkili olan bakteriyel enzimleri azalttığı tespit edilmiştir (Kailasapathy ve Chin, 2000). Probiyotikler sınırlı da olsa insanlarda bağışıklık sistemini de uyarmaktadır. Probiyotiklerin bağırsak epiteline tutunarak koloni oluşturmaları IgA üretiminde 10

21 etkilidir. Bu yüzden insanlarda probiyotiklerin bağışıklık sistemine etkisi bağırsaklardaki tutunma süresine bağlıdır. L.acidophilus un ve Bifidobakterilerin kullanımından sonra IgA seviyelerinin yükseldiği ve Ratovirüslere karşı spesifik immünitenin arttığı saptanmıştır (Gibson vd. 1997; Fukushima vd. 1998; Zubillaga vd. 2001; Isolauri vd. 2004) Bitkisel Üretimde Probiyotik Uygulamaları Özellikle organik tarımın giderek yaygınlaştığı günümüzde pestisit ve gübre kullanımını azaltmak için probiyotik uygulamalarına başlanmıştır. Bu şekilde daha güvenli ve doğal ürünlerin üretilmesi hedeflenmektedir. Doğal üretimin, enerji çarkının temelinde bulunan bitkilerin doğal yöntemlerle üretilmesi ile yaygınlaşacağı ve tam olarak gerçekleştirilebileceği düşünülürse bitkisel üretimde probiyotik uygulamasının önemi daha iyi kavranmış olur (Tosun vd., 2002). Bitkisel üretimde probiyotik olarak daha çok Bacillus cinsi bakteriler kullanılmaktadır. Bu bakteriler sayesinde topraktaki organik çözülme daha hızlı olmakta ve bitkilerin besinlere ulaşımları kolaylaşmaktadır. Ayrıca çeşitli bakteriler ve kurtlar da bitki zararlılarının engellenmesi konusunda başarılı sonuçlar vermektedir (Boyraz vd., 2006) Hayvansal Üretimde Probiyotik Uygulamaları Besin maddesi yetersizlikleri ve dengesizlikleri, susuzluk, olumsuz çevresel etmenler (düşük ve yüksek ısı, nem, amonyak fazlalığı, birim alanda fazla hayvan bulunması gibi) gerekli temizlik şartlarının sağlanamaması, taşıma, hastalıklar, antibiyotik tedavileri, aşılamalar, canlılar için başlıca stres faktörleridir. Stres altında bulunan hayvanlarda sindirim hareketleri düzensiz hale gelir ve sindirim kanalındaki salgılar azalır. Stres etkisiyle kortikosteroid hormon salgısının artmasının sonucu olarak müsin (glikoz ve protein tabiatında sümüksel madde) maddesinin salgılanması da önemli ölçüde düşer. Bu durumda normal koşullarda hayvanda hastalık oluşturma yeteneği olmayan potansiyel hastalık yapıcı mikroorganizmalar (E.coli, 11

22 Staphylococlar, Corynobacteriumlar vs.) ile normal bağırsak mikroflorası arasındaki denge bozulur. Potansiyel patojenik mikroorganizmalar hızla çoğalıp hedef hücreler için yarışmaya girerler. Kalın bağırsaklarda ve ince barsağın son bölümlerinde yerleşebilen potansiyel patojen mikroorganizmalar ince bağırsak epitel hücrelerine yerleşmeye başlarlar. Sonuçta metabolik yetersizlik oluşarak yemden yararlanma düşer ve hayvanın performansı olumsuz yönde etkilenir. Probiyotiklerin yem ve su ile verilmesi sonucunda ise bağırsaktaki yararlı mikroorganizma sayısı artarken, potansiyel patojen mikroorganizma sayısı azalır. Bağırsak mikroflora dengesi yeniden kurularak hayvanın verim düzeyinde artış gözlenir (Food-Info, 1999). Büyükbaş hayvan yetiştiriciliğinde probiyotik bakteriler buzağı döneminde sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle süt içerisine katılarak canlıya verildiği zaman etkisinin olduğu bildirilmiştir (Bechman ve ark, 1974). Yapılan çalışmalarda probiyotik ilavesinin buzağı büyümesinde kontrol gruba göre % 17 daha fazla artırdığı saptanmıştır (Bechman vd., 1974). Gill ve arkadaşları (1987) yapmış oldukları çalışmada danalarda kullanılan probiyotiğin kontrol gruba göre yemden yararlanma ve canlı ağırlık artışını önemli derece artırdığını saptamışlardır. Yapılan çalışmalarda büyükbaş hayvan yetiştiriciliğinde probiyotikler ile antibiyotikler de karşılaştırılmış ve denemeler de aralarındaki fark istatistiki olarak önemli bulunmamıştır. Araştırmacılar buzağı büyütme aşamasında probiyotiklerin antibiyotiklerin yerini alacağının düşünülemeyeceğini bildirmişlerdir (Gutzwiller ve Wyss, 1990). Ancak özellikle buzağıların ishal vakalarının neticesinde antibiyotik kullanımı ile bozulan bağırsak mikroflorasının yeniden düzenlenmesinde probiyotik bakteri kullanımının etkisi olduğu bildirilmiştir (Beeman, 1985, Fuller, 1986). Büyükbaş hayvan yetiştiriciliğinde en çok mortalite buzağı döneminde görülmektedir ve mortalitelerin en önemli sebebi sindirim sistemi bozukluklarıdır. Bu yüzden sindirim sistemini düzenleyici bakterilerin mortaliteyi de azaltacağı düşünülmektedir (Vanbelle vd., 1989). Roth ve arkadaşlarının (1990) yaptığı çalışmada probiyotik verilen grupta kontrol grubuna göre mortalitenin önemli ölçüde azaldığı bildirilmiştir. 12

23 Gıda Endüstrisinde Probiyotik Uygulamaları Gıdalarda probiyotik varlığı ve probiyotik kullanmanın gerekliğini probiyotikler hakkında ilk çalışmaları yapan Ellie Metchnikoff tarafından 1908 yılında ortaya atılmıştır. Metchnikoff buna kanıt olarak da orta Asya da süt ürünleri tüketen insanların uzun ömürlü olmalarını göstermiştir. Günümüzde artık gıdalar salt besleyicilik yönünün yanı sıra çeşitli fonksiyonlar da içermektedir. Bunlar oligosakkaritler, seker alkolleri, peptitler ve proteinler, prebiyotik ve probiyotikler, antioksidanlar, diyet lifler, kolinler, glikozitler ve isoprenoidler, fitokimyasallar ve çoklu doymamıs yag asitlerini kapsamaktadır (Açkurt vd., 1999; Çakır, 2005). Bu tip gıdalara fonksiyonel gıdalara denilmektedir. Yani bir gıdaya Probiyotik ilavesi ile o gıda da fonksiyonel olmaktadır. Fonsiyonel Gıda kavramı özellikle Japonya da büyük önem kazanmıştır. Avrupa da probiyotik ilaveli süt ürünleri en aktif fonksiyonel gıdalardır (Stanton vd. 2001; Mattila- Sandholm vd. 2002). Fonksiyonel gıdalar üzerine yapılan çalışmalar probiyotik ilaveli süt ürünleri üzerinde yoğunlaşmıştır. Günümüzde probiyotik ilaveli süt ürünleri bio ön eki ile piyasada rahatlıkla pazar bulabilmektedir (Biodrikns, Biokys, Biogurt gibi ). Özellikle yoğurt içeren ürünlerde Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri uzun yıllardır güvenle kullanılmaktadır (Çizelge 2.1). Probiyotik bakterilerin insana taşınmasında taşıyıcı araç olarak kullanılmak veya kullanımlarını artırmak için bir çok gıda ürünü geliştirilme aşamasındadır. Bu ürünlerin bir çoğunun süt orijinli olup, taze süt ürünleri, fermente süt ürünleri, dondurma, cottage peyniri, süt tozu, süt tatlıları gibi çeşitli gıdaları içerdiği belirtilmektedir (Charteris vd. 1997; Vinderola vd. 2000; Lourens-Hatting ve Viljoen 2001; Sodini vd. 2002). 13

24 Çizelge 2.1. İnsan besinlerinde uygulanan probiyotik bakteriler (Hoesl ve Altwein, 2005; Penner vd. 2005) Lactobacillus türleri Bifidobacterium türleri Diger L. casei B. bifidum S ac. boulardii L. rhamnosus B. breve S tr. thermophilus L. acidophilus B. i n f a n t i s Ped. acidilacti L. bulgaricus B. Lactis Leu. diacetylactis L. fermentum B. longum E nt. faecium L. gasseri B. adolescent O. formigenes L. johnsonii Bac. subtilis L. lactis Lac. lactis L. Paracasei L. plantarum L. reuteri L. salivarius L. brevis Su Ürünlerinde Probiyotik Uygulamaları Su ürünleri yetiştiriciliğinde probiyotikler; özellikle üretimi arttırmak, sudaki patojenlerin engellenmesi ve su kalitesinin iyileştirilmesi amacıyla kullanılmaktadır Patojenlerin Yayılımının Engellenmesi Balık sağlığı mikrobiyal istilalara karşı kendi bünyelerindeki direnç mekanizmasına birinci dereceden bağlıdır. Bundan dolayı sucul çevrede bulunan mikroorganizmalar balıkların büyümesinde doğrudan etkilidirler (Maeda,1999). Sucul ortamda mililitrede bir milyondan fazla mikroorganizma bulunur; ürettikleri ve yaydıkları maddeler ile birbirlerinin yaşamları üzerinde etkiye sahiptirler. Bu nedenle yetiştiricilik suyuna düşük dozlarda organik maddele ilavesi hem balık larvalarının yaşama oranlarını artırır hem de organik maddeleri besin olarak kullanan faydalı mikroorganizmaların gelişmesini sağlar (Maeda, 1999). Yengeç ve karides larva yetiştiriciliğinde algler ana canlı yem kaynağı olarak kullanılır. Ancak alglerle birlikte bazı mikro organizmalar da ortamda bulunursa 14

25 yaşama oranı görünür derecede artar. Bu yüzden balık sağlığının iyileştirilmesi için alglerle birlikte bakteri kullanımı da tercih edilir (Maeda, 1999). Bu mikrobiyal toplulukların etkisi; patojenleri önleyerek, çevre şartlarının uygun hale gelmesine yardım ederek, balık sağlını koruyarak ve canlı besin fonksiyonu sağlayarak gerçekleşir (Maeda, 1999). Sudaki virüs ve zararlı bakterileri tespit ederek onları uzaklaştırmak yetiştiricilikle uğraşan kişilerin temel hedefidir. Bunun için suyun filtre edilmesi, sodyum klorit ilavesi, ozonlama, UV sterilizasyonu ve yapay antibiyotikler bulunduran yemler kullanma yetiştiricilikte düzenleyici metotların yaygın olanlarıdır. Bu metotlar her ne kadar etkili olsa da patojenleri uzaklaştırmak için çözüm olmamaktadır. Özellikle uzun süreli çözüm şansı hemen hemen hiç yoktur. Örneğin eğer Kanamycin antibiyotiği suya ilave edilirse iki günlüğüne bakteri sayısı azalır, fakat sonra bakteri sayısı eski seviyesine gelecektir. Deniz suyu; filtrasyon, UV ve ozonlama ile sterile edildikten sonra da aynı durum görülebilir; bu uygulamalardan sonra bakteri populasyonu çok hızlı çoğalır. Çünkü bakteriyel populasyonlar arasındaki antagonizm azaltılmış olur. Daha da önemlisi hiç kimse yukarda sayılan uygulamalardan sonra oluşan boşlukta tekrar hangi bakterilerin üreyeceğini bilemez (Maeda, 1999). Bu nedenle yukarda sayılan uygulamalardan sonra ortama yararlı bakteri ilavesi zararlı baktari ve virüslerin gelişimini sınırlandırcaktır yılında Güney Amerika da karides yetiştiriciliğinde ortaya çıkan sorundan sonra yetiştiricilik tekrar eski haline gelememiştir. Yetiştiricilik çevrelerinde sürekli hastalıklar artmakta ve bunlara yönelik farklı tedavi yöntemleri bulunamamaktadır. Çünkü bazı hastalıkların tedavisinde kullanılan antibiyotiklere karşı bakterilerde direnç gelişimi olmakta ve uygulanan tedavi yöntemleri gitgide etkinliğini kaybetmektedir. Bu olguların farkına varılmasından sonra bakterilerin antagonistik özelliklerinden faydalanma yoluna gidildi. Bu yüzden belirli patojen mikroorganizmalara yönelik antagonizm gösteren spesifik bakteriler öne çıkmaya başladı. Mikroplar arasındaki antagonizm doğal olarak sucul çevrede hangi mikropların ölmesi veya azaltılması gerektiği yönünde bir görüş ortaya çıkardı. Bu biyolojik veya biyokontrol olarak bilinen metot yetiştiricilik alanında çoktan beri 15

26 uygulanmaya başladı (Şekil 2.2). Örneğin patojenik böcekleri oral yolla etkileyerek sonunda onları öldüren ünlü bakteri Bacillus thuringiensis, Avrupa ve Kuzey Amerika da binlerce ton kullanımı ile şu an yaygın olarak uygulanabilmektedir. Bu olumlu sonuçlar biyokontrol aracı olarak patojen organizmaların elimine edilmesi için kullanılan virüs, mantar ve protozoanlarla ilgili ileri çalışmalarına öncülük etmiştir (Maeda, 1999). Şekil 2.2. Bir mikrobiyal örneğin gösterdiği karakteristiğe göre sınıflandırılması (Moriarty, ) Salmonları etkileyen İnfeksiyöz Hematopaietik Nekrozis Virüs (IHNV), İnfeksiyöz Pankreatik Nekrozis virüs (IPNV), Pisi Balığını (Pleuronectes platessa) etkileyen Hirame Rhabdovirüs (HIRRV), Sarıkuyrukları (Seriola dumerili) etkileyen Yellow Tail Ascites Virüs (Sarıkuyruk Asites Virus, YAV), uzakdoğuda Sushi ve Shashimi yapımında kullanılan Sima-Aji,Çizgili Jacklari, (Caranx delicatissimus) etkileyen Striped Jack Nervous Nekrozis Virüs (SJNNV), Çipuraları (Sparus aurata) etkileyen İridovirüs; Penaus karidesleri, P.monodon, P.japonicus un hemen hemen hepsi Bacula ve benzeri virüslerle enfekte olmuşlardır ve bu virüsler yetiştiricilik sistemlerini önemli ölçüde etkilemişlerdir. Örneğin Tayvan da P.monodon üretimi 16

27 1987 de 90 bin tondan 1988 de 30 bin tona, 1989 da 20 bin tona gerilemiş ve hala iyileştirilememiştir (Maeda, 1999a). Virüsler su yoluyla enfekte balıktan diğerine geçebilme yeteneğine sahiptir. Eğer anti virüs bakteri su çevresinde daha baskın ise balık populasyonları arasındaki virüs geçişleri büyük yayılımlar için belki bastırılabilecektir. Bu sebeple anti virüs bakterilerin larva üretimi yapan pratik aquakültür çevrelerinde uygulanabilirliği daha yüksek olmaktadır. Bir görüşe göre, diğer bakterinin üremesini durdurma yeteneğine sahip olan bakteri balık virüslerinin üremesini de durdurur. Bu fikirden hareketle deniz suyundaki anti virüs bakterinin ortaya çıkarılması için ilk basamak anti bakteriyel aktiviteyi düzenlemek olmalıdır. Bu üretimde anti viral aktiviteyi doğrudan belirlemekten daha kolaydır. Örneğin UKM-124 bakteriyel suşu, Pseudoalteromonas undina, epitelyumioma papillosum cyprini (EPC) hücresindeki öldürücü etkinin ortaya çıkmasını durdurması ve 2-3 gün ertelemesi P.undina deneysel çalışmalarında fark edilmiş kontrol çalışmasıyla karşılaştırılmıştır. Böylece güçlü antibakteriyel aktivite gösteren bu suş virüslerin üremelerini de durdurabilmiştir. Bakteriyel suş UKM-124 Pseudomonas undina, balık larvalarını SJNNV, Baculo benzeri virüs ve İridovirüs ile enfekte olmaktan korumuştur (Şekil 2.3.). Bu yararlı suş Penaus karides ve Çipura larva yetiştirilen suya yaklaşık 10 6 cfu/ml konsantrasyonunda eklendiğinde larva yaşama oranı bakterisiz olana göre çok daha yüksektir. (Maeda,1999) Şekil 2.3. Sima Aji (Çizgili Jack) larvalarında Pseudomonas undina probiyotik suşunun mortalite üzerine etkisi (Maeda, 1999) 17

28 Deniz suyunda virüsler enfekte balıktan henüz hastalığa maruz kalmamış balığa yayılırlar. Buna rağmen probiyotik bakteri balıklar arasında virüslerin göçünü engelleyebilir. Ayrıca eğer balık bu probiyotik bakteri ile beslenirse balığın bağışıklık sistemi daha güçlü hale gelebilir. Birçok raporda omurgalıların bağışıklık sisteminin bakteri ile geliştirildiği gösterilmiştir. Benzer yararlı etkiler ve özellikler ile probiyotik bakteri kesinlikle yetiştiricilikte viral hastalıkların yayılmasından balıkları korumada aşırı derecede etkili olmuştur (Maeda, 1999). Chabrillon ve arkadaşlarının 2005 yılında çipuralardan izole edilen probiyotik organizmaların Listonella anguillarum un önlenmesi konusunda yaptıkları çalışmada; çipuraların deri, solungaç ve bağırsak mukuslarında yerleşmiş olan 4 tane suş üzerinde çalışılmıştır. Bunların L. Anguillarum a karşı etkileri incelemişlerdir. Mukusa tutunma özelliği bütün izolatlarda %7 daha fazla olduğu tespit edilmiştir. 3 suşun patojenlere karşı antagonistik etkisi gözlenmiştir. Bu suşların L. anguillarum un balık mukusuna tutunması üzerine etkisi de incelenmiş ve yalnızca iki adet suşun balığın mukusuna L. anguillarum un tutunmasını önemli ölçüde azalttığı belirlenmiştir. Bu şekilde bir suş seçilerek oral yolla invivo probiyotik potansiyeli test edilmiştir. Daha sonra L. anguillarum ile eprüvasyon yapılmıştır. Besleme denemeleri için 50 adet balık alınmış ve ticari balık yemine liyofilize edilmiş bakteri 10 8 cfu/gr olacak şekilde eklenmiştir. Uygulama 15 gün devam etmiştir. Diğer deney grubunda ise hiçbir şey eklenmemiş ticari yem verilmiş ve eprivasyondan sonra balıklarda mortalite; diyete probiyotik ilave edilmiş olan grupta kontrol gruba oranla daha düşük bulunmuştur Probiyotiklerin Bağışıklık Sistemine Etkisi Kim ve Austin (2006), doğuştan gelen savunma sisteminin probiyotiklerle desteklenmesi konusunda yaptıkları çalışmada; sağlıklı Gökkuşağı Alabalıklarının (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) bağırsaklarından izole edilen Carnobacterium maltaromaticum ve Carnobacterium divergens probiyotik olarak denenmiş; Aeromonas salmonicida ve Yersinia ruckeri ye karşı yapılan direnç testlerinde başarı göstermiştir. Böylece Alabalıklar bu bakterileri 10 7 hücre/ml içeren yemlerle 18

29 beslenmişler ve yukarıda sayılan patojenlerin virülens suşları ile test edilmişlerdir. Her iki bakteri de uygulamadan 3 hafta sonra midede bulunmuştur. Bu kültürler balıklarda humoral (salgısal) ve hücresel bağışıklık sistemini güçlendirmişlerdir. Özellikle Carnobacterium maltaromaticum içeren yemlerle beslenen balıklarda ön böbreklerdeki makrofajların fagositik aktivitelerinde büyük oranda artış olmuştur. Bununla birlikte Carnobacterium divergens içeren yemle beslenenlerde de serum lizozim aktivitesi ve Respiratory burst aktivitesi (Super oksit anyon aktivitesi) yükselmiştir. Bağırsak mukusunun lizozim aktivitesinde her iki probiyotikle beslenen balıklarda da istatistiki olarak kontrol gruba oranla yüksek farklar bulunmuştur. Brunt ve Austin in (2005) alabalıklarda Lactococcus ve Streptococcus in önlenmesi konusunda yaptıkları çalışmada; Gökkuşağı Alabalıklar ve Sazanların sindirim kanalından 125 bakteri suşu izole edilmiş ve bu suşların Lactococcus garviae ve Streptococcus inae ye karşı balık yemine ilave etme suretiyle etkileri araştırılmıştır. Probiyotik olarak belirlenen Aeromonas sobria ortalama ağırlıkları 20 gr olan Gökkuşağı alabalıklarının yemine 5x10 7 hücre/gr dozunda 14 gün süre ile verildi. Lactococcus garviae ve Streptococcus inae ile kas içi enjeksiyon ile yapılan eprüvasyonda kontrol grubu balıklarında % arasında ölüm görülürken; probiyotikli balıklarda ölüm oranı sadece %0 6 arasında gerçekleşmiştir. Bu çalışmada probiyotik etki ile birlikte balıklarda lökosit sayıları, fagositik ve respiratory burst aktivitenin de arttığı bildirilmiştir Probiyotiklerin Sindirim ve Yem Değerlendirmeye Etkisi Yanbo ve Zirong (2005) probiyotiklerin sazan balıklarının (Cyprinus carpio) büyüme performansı ve sindirim enzim aktiviteleri üzerinde yaptıkları bir çalışmada probiyotiklerin balıkların proteaz, lipaz ve amilaz üretimi üzerine etkilerini incelemişlerdir. Yetiştiricilik ortamından Bacillus ve Photobacterium izole edilmiştir. Fotosentetik bakteriler ve bacilluslar liyofilize edilerek 1 kg yeme 1 gr ilave edilerek karıştırılmıştır. 60 gün sonra probiyotik eklenmiş ve eklenmemiş diyetlerle beslenen balıklar incelenmiş ve probiyotik ilave edilenlerde yem değerlendirme ve büyüme 19

30 oranı önemli ölçüde yüksek çıkmıştır. Sindirim enzimlerinin aktivitesi açısından da önemli farklar bulunmuştur. Proteaz aktivitesi Bacillus ilave edilenlerde ve karışık olanlarda kontrole ve fotosentetik bakterilere göre daha yüksek çıkmıştır. Yine amilaz ve lipaz etkisi de mix probiyotik ilave edilenlerde kontrole göre yüksek bulunmuştur. Sonuçta bu çalışmalarda probiyotiklerin sindirim ve enzim aktivitesini artırdığı ve Yem Dönüşüm oranını (Food Conversation Ratio, FCR) azalttığı belirlenmiştir. Bu amaçla probiyotik uygulamanın iyi sonuç verdiği tespit edildi. Bununla birlikte farklı probiyotik formları farklı etkiler göstermiş ancak karma probiyotik uygulamasının en iyi sonucu verdiği ortaya çıkmıştır Probiyotiklerin Deformasyon ve Mortaliteye Etkisi Aubin ve arkadaşlarının 2005 yılında alternatif tedavi yöntemlerinini sınırlı olduğu Alabalıklarda omurga eğriliği sendromundan, Vertebral Column Compression Syndrome (VCCS), korunmada probiyotik kullanımı konusunda yaptıkları çalışmada; iki probiyotik suş kullanımının Florfenikol kullanımı ile karşılaştırılması yapılmıştır. Antibiyotik, laktik asit bakterisi (Pediococcus acidilactici) ve bir maya (Saccharomyces cerevisiae var. Boulardii) yemlere ilave edilmiş ve hiçbir şey ilave edilmeyen kontrol yemi ile karşılaştırılmıştır. Antibiyotik, tedavinin ilk haftasında bileşimindeki toksisiteden dolayı biraz mortaliteye sebep olmuştur. Bununla birlikte antibiyotik uygulaması VCCS ye duyarlılığı %3 e düşürmüştür. Kontrol grupta balıkların % 13 ü hastalıktan etkilenmiştir. Pediococcus uygulaması da antibiyotik kadar etkili olmuştur. Fakat yaşama oranında herhangi bir zıt etki göstermeden 5 ay boyunca uygulanmıştır. Çünkü VCCS nin sınırlandırılması için Pediococcus un sadece ilk yemlemeden itibaren 20 gün kullanılması yeterli bulunmamıştır. Uzun süreli probiyotik uygulaması VCCS sendromundan sonra korunma için etkili gibi görünmüş fakat büyük çaplı yetiştiricilik işletmelerinde probiyotik uygulamasının yanı sıra korunma yöntemlerine de sıkı sıkıya uyulmasının gerektiği belirlenmiştir. Maeda (1999), UKM-124 bakteriyel suşu, Pseudoalteromonas undina, kullanmış ve güçlü antibakteriyel aktivite gösteren bu suş virüslerin üremelerini de durdurabilmiştir. Bakteriyel suş UKM-124 Pseudomonas undina, balık larvalarını 20

31 Sima-Aji Nervous Nekrozis Vırus (SJNNV), Baculo benzeri virüs ve İridovirüs ile enfekte olmaktan korumuştur. Bu yararlı suş Penaus karides ve Çipura larva yetiştirilen suya yaklaşık 10 6 cfu/ml konsantrasyonunda eklendiğinde larva yaşama oranı bakterisiz olana göre çok daha yüksek bulunmuştur. Hatta Sima-Aji larvalarında bakterisiz grupta % 100 mortalite olurken probiyotik ilaveli grupta mortalite % 60 civarında gerçekleşmiştir (Maeda,1999) Probiyotiklerin Su Kalitesi Üzerine Etkisi Su ürünlerinde probiyotik kullanımı konusundaki araştırmalar çevre dostu yetiştiricilik fikrinin benimsenmesinden sonra artmıştır. Probiyotik canlıların yemlerine katılan ve onların sağlıklarını iyileştiren mikroorganizmalar olarak bilinir. Balık ve kabukluların bağırsak mikroflorası çevreye çok bağlıdır. Çünkü birçok mikrop besinler ve su yoluyla barsağa geçer. Bazı ticari ürünler doğrudan probiyotik gibi üretimi iyileştirici olarak üretilir ve onlara probiyotik ilave etmeye gerek yoktur. Probiyotik uygulamalarının temelinde balığın mikroflorasını düzenleme amacı vardır. Diğer taraftan biyokontrol veya biyo remedetion (Su kalitesini iyileştirici) terimleri de probiyotikler için kullanılır. Bununla birlikte balıklarda ilk denenen probiyotikler karasal hayvanlar için hazırlanmış ürünlerdi (Gatesoupe, 1999). Probiyotik verilmeden önce onun sucul ortamda yaşayıp yaşamayacağı konusu belirlenmelidir. Bunun için su ürünleri için kullanılacak probiyotikler sucul çevrelerden izole edilmelidir. Bu mikroplar Vibrio, Pseudomonas, Enteromonas, Laktik asit bakterileri özellikle Bacillus spp. ve mayalardır (Gatesoupe, 1999). Konakçılarının sağlıklarını iyileştiren mikro organizmaların üç karakteristiği vardır. Bunlar; 1. Laboratuar koşullarında onların antogonistik etkileri test edilmelidir. 2. Aday probiyotiklerin koloni oluşturabilme yetenekleri test edilir. 3. Konakçılarında bazı hastalıklara karşı direnç oluşturması için bazı bakteri suşlarına karşı eprüvasyon yapılır. 21

32 Probiyotiklerden; patojenlerle besin veya ortama tutunma konusunda rekabet ve bağışıklık sistemini güçlendirmek gibi çok önemli görevler etkiler beklenir (Gatesoupe, 1999). Sucul canlılar probiyotiklerin kullanımı, hazırlama için gerekli ön çalışmaları ve gelişim aşamaları bakımından çok farklıdırlar. İnsanlar ve karasal canlılar embriyonik gelişimlerini bir kese içinde geçirirler. Birçok balık ve karides türünde larval dönem ve erken başkalaşım dönemleri dış çevrede gerçekleşir. Bu larvalar mikrobiyal faaliyetlerden çok etkilenirler. Çünkü ilk yemlemenin yapıldığı dönemlerde sindirim sistemleri (Timmermans, 1987) ve bağışıklık sistemleri yeterince gelişmemiştir (Vadstein, 1997). Bu yüzden probiyotik uygulamaları larval safhada daha çok tercih edilir. Ayrıca çok küçük balıkların bağışıklık sistemleri yeterince gelişmediği ve aşılama yapılamaması nedeniyle erken dönemlerdeki probiyotik uygulamaları patojenlere karşı larvayı koruma konusunda daha etkili olur. Gram negatif fakültatif anaeroplar balık ve karideslerde sindirim sistemlerinde baskın durumdadırlar. Bazı tropik otçul balıkların sindirim kanalının sonunda yararlı anaerobik bakteriler de bulunabilir (Clements, 1997). Vibrio ve Pseudomonas kabuklularda (Moriarty, 1990), deniz balıklarında (Sakata, 1990) ve midyelerde (Prieur vd., 1990) baskın cinstirler. Aeromonas, Plesimonas ve Enterobactericidae familyası tatlı su balıklarında baskındır (Sakata 1990). Sucul organizmalara probiyotiklerin etkisi karasal hayvanlara etkisinden daha fazladır. Sucul canlılar poikloterm oldukları için onların vücutlarındaki mikrobiyal konsantrasyon sıcaklıkla değişir (Lesel, 1990). Tuzluluk değişimleri mikrop yoğunluğunu artırır (Hamid vd., 1978; Sakata vd., 1980; Ring ve Strim, 1994) ve deniz balıkları vucutlarının su kaybını önlemek için devamlı su içerler. Bu devamlı su alma çevredeki maddelerin etkisini artırır. Özellikle midye, karides larvaları ve canlı yemler gibi süzerek beslenen canlılara dikkat edilmelidir. Bu etki özellikle mide engellerinin olmadığı larval dönemde önemlidir. Bununla birlikte sucul canlıların bağırsak mikroflorası yem ve sudan gelen mikro organizmalarla hızlı bir şekilde değişir. Midyelerde vucutlarındaki mikoflora deniz suyundakine ve 22

33 sedimenttekine çok benzerdir (Sugita vd., 1981; Priuer vd., 1990). Benzer tip bakteriler Penaus japonicus un sindirim kanalı ile deniz suyu arasında da bulunmuştur. Fakat mikroflora yem yoluyla da geçebilmektedir (Moriarty 1990). Larval ve juvenil balıklarda yemin etkisi net bir şekilde gösterilmiştir (Tanasomwang ve Muroga, 1989; Ring vd., 1995). Özellikle ilk yemleme esnasında canlı yemlerle verilen bakterilerin etkisi oldukça yüksektir (Munro vd., 1993; Bergh vd., 1994). Taoka ve arkadaşları (2006) tarafından Paralichthys olivaceus yetiştiriciliğinde resirküle sistemlerde probiyotiklerin büyüme, stres toleransı ve spesifik olmayan bağışıklık sistemi üzerine etkisi üzerine yapılan bir çalışmada ticari probiyotikler yeme ve suya ilave edildiklerinde özellikle su kalitesi parametrelerinden ph, Amonyum azotu, Nitrat azotu ve Fosfatın kontrol gruba göre probiyotik ilaveli yemle beslenenlerde daha az olduğu görülmüştür Su Ürünleri Yetiştiriciliğinde Kullanılan Probiyotikler Su Ürünleri yetiştiriciliğinde probiyotiklerle alakalı dünyada bir çok çalışma yapılmıştır. Çalışmalar sonucunda potansiyel probiyotik bakteriler tespit edilmiş ve su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılmaya başlanmıştır (Çizelge 2.2). Bir çok bakteri karıştırılarak probiyotik ürünler elde edilmiş ve kullanılmaya başlanmıştır. Ancak su ürünlerinde çoğunlukla kullanılan probiyotik ürünler kanatlılar ve diğer hayvansal üretim için hazırlanan probiyotiklerdir. Primalac, Bactocell gibi en çok kullanılan ürünler birden çok bakteri içermektedirler ve hayvansal üretim için hazırlanmışlardır. 23

34 Çizelge 2.2. Probiyotik bakterilerin bazı balıkların sindirim sisteminde dayanıklılık süreleri, izole edildiği ortamlar ve antagonizm gösterdiği patojenler T.e: minimum dayanıklık tespit edilemedi (Gatesoupe, 1999) Probiyotik Tür (Konakçı) Minimum Dayanıklılık Süresi Bağırsak florası bakterileri Scoptalmus maximus 7 gün (15 o C) Aeromonas media Crassostrea gigas 2 gün (20 o C) Aeromonas sp. S. maximus 14 gün (15-20 o C) Bacillus sp. Penaus monodon T.e. Carnobacterium divergens Gadus morhua T.e. Ca. divergens G.morhua 9 gün (8 o C) Ca. divergens Salmo salar T.e. Carnobacterium sp. Onchorhyncus mykiss 4 gün (11 o C) Carnobacterium sp. s.maximus T.e. Lactobacillus sp. Paralictius olivaceus T.e. Vibrio alginolyticus S.salar 21 gün (15 o C) Vibrio pelagius S.maximus 14 gün (17-20 o C) Vibrio sp. S.maximus T.e. Debaryomyces hansenii O.mykiss 30 gün (15 o C) Rhadotorula glutinis O.mykiss 65 gün (8 o C) Probiyotik Konakçı Patojen Tatlı su bakterileri Bağırsak florası Aeromonas Tatlı su bakterileri Salmonid işletmesi IHNV Deniz bakterileri Omurgasizlar Vibrio spp. Deniz bakterileri Yosunlar Edwardsiella, pastorella, Aeromonas, Vibrio, Yersinia, Deniz bakterileri Scoptalmus maximus Aeromonas, Vibrio, Pasteurella Deniz bakterileri Genel IHNV Aeromonas media Deniz suyu Aeromonas, Vibrio, Yersinia Alteromonas sp. Pecten maximus Pasteurella, Vibrio Carnobacterium divergens Salmo salar Vibrio spp., Aeromonas sp. Lactococcus lactis Branchious plicatilis V.anguillarum Lactobacillus sp. Paralictious olivaceus Aeromonas, Pasteurella, Vibrio Pseudomonas fluorescens Salmo trutta A. salmonicidae V. alginolyticus Karides işletmeleri Aeromonas, Vibrio, Yersinia Vibrio spp. Deniz ortamı V. parahaemolyticus Vibrio spp. Karides işletmeleri IHNV, OMV 24

35 2.6. Balıklarda Bağışıklık Sistemi Balıklar en eski omurgalı hayvanlardır ve omurgasız canlılarla omurgalı canlılar arasında bir geçiş oluştururlar (Şekil 2.4). Şekil 2.4. Çeşitli canlılarda bağışıklık sistemi (Anderson, 1992) Balıkların spesifik olmayan bağışıklık sistemleri geliştiği gibi humoral ve hücresel bağışıklık gibi spesifik bağışıklıkları da gelişmiştir. Ancak memeli bağışıklık sisteminden farklı olarak kemik iliği ve lenf modülü bulunmamaktadır. Balıklardaki en önemli lenfoid organlar; ön böbrek, timus va dalaktır (Şekil 2.5). Şekil 2.5. Balıklarda bağışıklık sistemi bariyerleri (Dalmo vd., 1997) 25

36 Memelilerdekinin aksine balıklarda bağışıklık sisteminin en önemli kısmını spesifik olmayan bağışıklık oluşturur. Çünkü balıklar spesifik bağışıklığın gelişmesini engelleyen kısa yaşam süresine sahiptirler, soğuk su şartlarında yaşamaktadırlar ve yaşadıkları ortamdan kaynaklanan çok çeşitli hastalık riskleri ile karşı karşıya kalmaktadırlar. Bunun neticesinde kompleks savunma sistemleri gelişememektedir. Bu yüzden balıklarda savunma sisteminde ilk olarak spesifik olmayan savunma elemanları rol alır. Patojen canlı ile ilk temasa geçtiği anda spesifik olmayan immun cevap oluşur. Eğer patojen spesifik olmayan savunma engelini aşarsa hastalık oluşur ve spesifik immun hafıza gelişmeye başlar. Aynı patojenle tekrar temas durumunda bu sefer hem spesifik olmayan hem de spesifik immun sistem çalışmaktadır (Şekil 2.6). Balıklarda spesifik immun sistemin gelişmesi diğer omurgalı hayvanlardaki gibi hızlı olmamaktadır. Şekil 2.6. Balıklarda immun sistemin çalışma şeması (Roitt vd., 1989) Bağışıklıkta Rol Alan organlar Deri ve Mukus Balıklarda spesifik olmayan bağışıklık sisteminin ilk bariyerleri deri ve mukustur. Çünkü balığın patojenlerle karşılaşma anında ilk temas yüzeyi bu bölgeler olmaktadır. Bu yüzden bağışıklıkta ilk ve en önemli savunma deri ve mukus 26

37 aracılığıyla yapılmaktadır. Deri ve mukus immun sistemdeki doğal bariyerler olup tüm patojen organizmalara karşı savunma yapmaktadırlar. Derinin bütünlüğünün korunması savunma açısından çok önemlidir. Balıklarda deri epidermis, dermis ve hipodermis olarak üç ana katmandan oluşur ve oldukça dayanıklıdır. Ayrıca birçok balıkta bulunan derinin dış yüzeyini kaplayan pullar derinin fiziksel veya kimyasal etkilerle tahrip olmasını ve mikroorganizmaların tutunmalarını da engeller. Deri üzerindeki mukus sayesinde savunma görevini yapmaktadır. Mukus, glikoproteinler, proteoglukanlar ve proteinlerden oluşmaktadır. Mukus, mukus salgılayan Goblet hücreleri tarafından sürekli salgılanmakta ve balığa zararlı olabilecek organizmaların tutunarak yoğunlaşmalarını engellemektedir. Mukus salgılama işlemi enfeksiyon veya deride meydana gelen fiziksel ve kimyasal tahribatlar sonucunda artar (Santos ve Hall, 1990; Yang ve Albright, 1994; Nielsen, 1995). Lizozim ve diğer bakteriyosinlerin de mukus içinde var olduğu bildirilmiştir (Ourth, 1980; Fletcher ve White, 1973). Lizozim ile bakterilerin hücre duvarlarında bulunan mukopeptitler parçalanarak hücre bütünlüğü dağıtılır. Ayrıca mukusun ph seviyesi ve içerdiği proteolitik enzimlerden dolayı içeriğinde mikro organizmaların yaşaması uygun değildir. Komplementler de mikraorganizmaların zararlarından korunmak için deri mukusu içindeki önemli aktivatörlerdendir. Bununla birlikte mukus içinde fagositozis yapan hücreler de tespit edilmiştir. Asbakk ve Dalmo nun 1997 yılında deneysel ortamda yapmış oldukları çalışmada Salmonların mukusunda mikro organizmaları öldüren hücrelerin aktif olduklarını bildirilmiştir. Böbrek Böbrek kemikli balıklardaki en önemli kan yapan organdır. Böbrek ön ve arka böbrek olmak üzere ayrılır. Arka böbrek daha çok salgı fonksiyonu görür. Böbrek morfolojisi kemikli balıkların bir çoğunda farklılık gösterir. Ancak içeriğinde temel olarak farklı gelişme çağındaki kan hücreleri, endotel hücreler ve salgı hücreleri bulunmaktadır. Bazı araştırmacılar melanin, ceroit ve lipofuskin pigmenti içeren melano-makrofaj ların da böbrekte bulunduğunu rapor etmişlerdir (Elis, Munroe ve Roberts, 1976; Press, Dannevig ve Landsverk, 1994). 27

38 Dalak Kemikli balıklarda dalak hemotopoesis in en yoğun olduğu alan olarak kabul edilir. Dalakta büyük ve yaşlı kan hücreleri temizlenir, antijenler azaltılır ve antikor üretimi yapılır (Dalmo, 1997). Dalağın spesifik ve spesifik olmayan savunma mekanizmasındaki rolü ön böbrekten sonra ikinci derecede önemlidir. Dalak içindeki elipsoid hücreler yaşlı hücreleri, patojenleri ve protein yapısındaki antijenleri daha küçük parçalara ayırırlar (Harraez ve Zapata, 1986; Dalmo vd., 1995). Dalak temel olarak kan hücreleri endotel hücreler, retikular hücreler, makrofajlar ve melano-makrofajlardan oluşur (Kita ve Itazawa, 1994; Findlay ve Tatner, 1994). Karaciğer Balıkların bağışıklık sisteminde karaciğerin küçük bir rolü olduğu kabul edilmiştir. Karaciğerin balıklarda Retikuloendothelial sistemde (RES) rolü olduğu araştırmacıların raporlarına yansısa bile deri, dalak ve böbrek kadar savunma sisteminde önemli rol üstlenmezler. Alabalıklarda yapılan çalışmada enjeksiyondan sonra glikoproteinlerin karaciğer hücreleri tarafından parçalandığı tespit edilmiştir (Kindberg, Dannevig, Andersen ve Berg, 1991). Yine yapılan çalışmalarda bakteriyel lipopolisakkaritlerin (LPS) de karaciğer hücrelerince yok edildiği bildirilmiştir (Dalmo ve Bogwald, 1996). Ayrıca karaciğerden izole edilen hücrelerin Nitroblue tetrazoilum (NBT) boyasını da indirgediği ve böylece NBT ye duyarlı olan fagositik hücreleri de içerdiği tespit edilmiştir (Demers ve Bayne, 1994). Bağırsak (İntestinal Kanal) Bağırsaklar ve sindirim sistemi özellikle aside dayanıklı mikroorganizmaların engellenmesinde rol oynar. Çünkü solungaç ve mide engelini aşan bakterilerin bağırsaklardaki yoğun mukus tabakası ve çeşitli enzimler ile kolonize olmaları ve çoğalmaları engellenir. Bağırsaklarda salgılanan salgı içinde bulunan bazı antibakteriyaller (lizozim, immunoglobulinler, özellikle IgA) ve enzimler bakterilerin tutunmasının engellenmesinde önemli rol oynarlar. Memelilerde bağırsaklarda Peyer Plağından (Apendis) köken alan lenfokinler ve makrofajlar bulunmaktadır. Ancak 28

39 kemikli balıklarda M- hücreleri ve Peyer Plağı bulunmamaktadır. Yoğun bağırsak mukusu ve makrofajlar ile patojen mikro organizmalar bağırsakta parçalanmaktadır. Özellikle ön bağırsakta küçük çaplı moleküller absorbe olduğu için absorbsiyon esnasında patojen organizmalar da yıkıma uğramaktadır. Ancak bazı antijenler ve mikroorganizmaların zararlı toksinleri bağırsaklardaki absorbsiyon neticesinde dolaşım sistemine geçmektedir. Bağırsaklardan geçen zararlı makro moleküller dalak ve böbreklerde süzülerek parçalanmaktadır. Ancak bağırsaklardan dolaşım sistemine geçen yoğun mikroorganizma ve onların toksinleri hematopoetik organları (dalak, böbrek, karaciğer) etkilemektedir (Dalmo ve Bogwald, 1996; Mclean, 1987; Mclean ve Donaldson; 1990; Davine, Parmentier ve Timmermans; 1982) Spesifik Olmayan Bağışıklık Sisteminin Elemanları A.Humoral elemanlar Spesifik olmayan savunma sisteminde ilk tepkiyi serum, bağırsak, deri ve mukusta bulunan; lizozim, complement, antikor, tripsin, interferon ve diğer litik elemanlar vermektedir. Bu elemanlar patojenlerin çoğalarak kolonize olmalarını engellerler (Alexander ve Ingram, 1992). Lizozim Lizozim enzim etkisinde bazik bir proteindir. Lizozim fagositik hücreler tarafından üretilir. Özellikle Gram (+) hücrelerin hücre duvarındaki peptidoglukan tabakasını parçalayarak etkisini gösterir. Gram negatif hücrelerde peptidoglukan tabakası membran tarafından korunduğundan doğrudan etki edemez. Ancak komplementlerle birlikte Gram (-) hücrelere de etki eder. Lizozim yanı sıra fagositozis in aktive edilmesini de sağlar. Lizozim, deri, solungaç, bağırsak gibi mukozal yüzeylerde oldukça fazla bulunur. Ayrıca ön böbrek gibi lökositçe zengin dokularda da lizozim miktarı yüksek çıkmıştır. Lizozim yüksek sıcaklık ve asidik koşullarda aktive olabilirken; alkali koşullarda aktive olamaz. Lizozim yumurtada yüksek miktarda bulunmuştur. Bu nedenle anneden geçen bağışıklığı göstermesi açısından önemlidir ve spesifik bağışıklığın hiç oluşmadığı dönemde canlılar için iyi bir korunma sağlar. Ayrıca yapılan çalışmalarda bazı patojenlerin vertikal bulaşmalarını da engellemiştir. 29

40 Komplement Komplementler bakteriyel enfeksiyonlarda bakterilerin fagosite olmaları için makrofajlarla buluşturan serum proteinleridir. Komplemanlar mikro organizmalar üzerinde doğrudan parçalayıcı etkiye sahiptirler ayrıca antikor antijen birleşmesinde antikora bağlanarak fagositozu kolaylaştırılar. Komplementlerin aktivasyonu, nonspesifik olarak mikrobiyal hücrelerin duvarında bulanan polisakkartilerle etkileşimle; spesifik olarak da bakterilerin hücre duvarları eritilirken salınan bileşiklerle fagositik hücrelerin göçleri yönlendirilir ve bakteri ile fagositik hücrelerin tutunmaları kolaylaştırılarak gerçekleşir (Şekil 7) (Yano, 1996). Komplement aktivasyonu sırasında zararlı mikro organizmalar yok edilirken yakın dokularda zarar görebilmektedir. Bu yüzden konakçı hücrelerin zarar görmemesi için konakçı savunma sistemi sürekli olarak komplement aktivasyonunu denetlemektedir. Komplementlerin virusidal etkiye de sahip oldukları yapılan araştırmalarda kanıtlanmıştır. IPN ve IHN ye karşı etkisi tespit edilmiştir. Ayrıca Gökkuşağı alabalıklarında yapılan çalışmalarda komplementlerin Criptobia parazitini de lyse ettiği bildirilmiştir (Sakai, 1992). Şekil 2.7. Komplement aktivasyonu A: Non-spesifik immunite (doğrudan bakterisidal aktivite) B: Spesifik immunite için antikor ve antijen birleşmesini sağlama (Hücre ve makrofajı işaretleyerek birleşmelerini sağlama) 30

41 İnterferonlar Genellikle bakteri, mantar ve virüs enfeksiyonlarında antikor salgılanmasından önce salgılanarak mikro organizmaların üremelerini durdurucu etkiye sahip proteinlerdir. İnterferon aktivitesi ile ilgili raporlar eskilere dayanmaktadır yılında Gravell ve Malsberger; 1990 yılında Ingram; 1992 yılında Alexander ve Ingram ve daha sonraları balıklarda interferonların varlığı hakkında raporlar bildirmişlerdir. Interferonlar alabalıklarda IPN ve Hiramerhabdovırus e karşı inhibe edici bir etki göstermişlerdir (Rogel-Gaillard, Chilmonczhy ve Kinkelin, 1993; Murakami, Tamai ve Shirahata, 1995). İnterferonlar non spesifik immun sistemin önemli bir elemanıdır ve etkisini doğrudan gösterir. Önemli bir nokta da interferonlar her ne kadar nonspesifik immun sistemin elemanı olsa da her patojene özel üretilirler ve sadece üretildikleri organizmada etkili olurlar. İnterferon oluşumunu tetikleyen en önemli faktör virusun hücreye girmesinden sonra çoğalmaya başlarken ortaya çıkan çift katlı RNA dır. İnterferonlar virusun repliksayonu esnasında RNA çoğaltımını bloke ederek üremeyi engeller. İnterferonlar aynı anda bir çok viruse karşı etkili olabilmektedirler. α, β ve γ olmak üzere 3 türü olan interferonların yüksek sıcaklıkta oluşmadığı tespit edilmiştir. IPN, IHN ve VHS ye karşı etkinliği kanıtlanmıştır. C-Reaktif Proteinleri (CRP) C-Reaktif proteinleri Streptococcus pneumaniae kapsülünde bulunan C polisakkaritine bağlanma özelliği gösterdiğinden bu ismi almıştır. Normal serum içerinde bulunmaktadır ancak enfeksiyon esnasında büyük artış göstermektedir (Şekil 2.8). C-Reaktif proteinleri komplementlerle birlikte antijene bağlanarak fagositozu kolaylaştırırlar. Şekil 2.8. C-Reaktif proteinlerinin serum içerindeki miktarlarının değişimi 31

42 Balıklarda C- Reaktif proteinleri ön böbrekte bulunmuştur. C- Reakif proteinleri Fagositozla birlikte Respiratory Burst aktivitesinde de önemli rol oynar. CRP üretimi yüksek sıcaklıkta en üst seviyeye çıkmaktadır. Transferin Transferin karacaiğer tarafından sentezlenmektedir. Demir bağlayıcı bir glikoprotein olan transferin bakterilerdeki demiri oksitleyip bağlayarak üremelerini durdurur. Konakçı kanındaki Transferin miktarı patojenin durmunu belirlemede önemli rol oynar. Çünkü transferin miktarı enfeksiyon sırasında artmaktadır. Transferin glikoproteini incelenen tüm balıklarda tespit edilmiştir. Diğer Humoral Elemanlar Lektinler (Doğal aglutininler) balıklarda mukusta, safrada ve serumda bulunurlar. Bakteriler tarafından salınan bileşiklerin ve ekzotoksinlerin nötralizasyonunda önemli rol oynarlar. Proteinleri ve karbonhidratları bağlayabildikleri bildirilmiştir. İmmun cevabı başlatmak ve düzenlemek için sitokinlere ihtiyaç duyulur. Balık türlerinin mukus veya serumlarında hemolignin, proteinaz,α2 makroglobülin, kitinaz, α-presipitin, caeruloplasmin ve metallothionein gibi maddeler içerir. Bu maddeler de balık patojenlerine karşı non_spesifik immun sistem mekanizmasında rol alabilir. B. Hücresel Elemanlar: Balıklarda non-spesifik hücresel savunma sisteminde Granülositler, monositler/makrofajlar anahtar rol oynamaktadır (Dalmo ve ark, 1997). Bununla birlikte balıklarda memilerde bulunan doğal öldürücü hücrelere benzer (killer cell) sitotoksik hücreler de bulunmaktadır. Patojenlere karşı ilk tepkiyi epitel hücreleri vermektedir. Araştırmacılar epitel hücrelerinde bazı tip makrofajların buılunduğunu bildirmişlerdir. 32

43 Fagositoz Spesifik olmayan hücresel savunma sisteminin en önemli elemanıdır. Bu sistemde yabancı mikrorganizmalar fagositik hücreler tarafından hücre içine alınarak yok edilir (Şekil 2.9). Şekil 2.9. Fagositoz un gerçekleşmesi (Roitt vd., 1988) Balıklarda Bağışıklığı Etkileyen Faktörler Balıklarda bağışıklık sistemini etkileyen faktörleri beş ana başlık altında toplayabilirz: Çevresel faktörler, besinsel faktörler, stresörler, bağışıklığı etkileyen mikro nutrientler ve immonomodulatorler (Şekil 2.10). Çevresel faktörler içinde bağışıklığı en çok etkileyen faktör sıcaklıktır. Balıklar poikloterm canlılar olduğu için sıcaklık değişimlerinden oldukça etkilenmektedirler. Düşük sıcaklıkta metabolizma hızının düşmesiyle birlikte bağışıklık sisteminin etkinliği de azalmaktadır. Yüksek sıcaklık enzim faaliyetlerini etkilediği ve stres meydana getirdiği için bağışıklık üzerinde baskılayıcı bir etki oluşturmaktadır. Ayrıca antijen hazırlığı ve aktivitesi ile hücresel savunma doğrudan sıcaklığa bağlıdır. Lenfositlerin hücre duvarında bulunan lipit tabakası ve yağ asitleri sıcaklıktan etkilenerek enzimlere karşı dirençsiz hale gelmektedir. Fotoperyot ve mevsimler de bağışıklık üzerinde doğrudan etkilidir. Çünkü balılardaki fizyolojik aktiviteler fotoperiyota göre belirlenmekte ve mevsimsel faktörler fizyoloji üzerinde 33

44 önemli etki yapmaktadır. Enzimler ve hormonların salgılanmasında fotoperyot ve mevsimsel faktörler 1. derecede önemlidir. Kontaminasyonlar bağışıklık sisteminin uyarılması açısından çok önemlidir. Ancak yoğun kontaminasyon durumunda bağışıklık sistemi baskılanır ve mortalite oluşur. Bağışıklığın oluşmasında besinlerin de çok önemli rolü vardır. Çünkü yeterli ve dengeli beslenmeyen balıklarda immun yanıtın oluşması zordur. Balık iyi bir kondüsyona sahip olmalı, esansiyel proteinler ve yağ asitleri ile beslenmelidir. Balığın gelişimi için en uygun besin parametrelerine sahip rasyonlar hazırlanarak besleme yapılmalıdır. Mikro nutrientler yemlere destekleyici olarak katıldığı zaman bir çok vucut fonksiyonunun düzeltilmesi için önemlidir. Vitamin, Mineral ve antioksidant takviyesi bağışıklık sistemini doğrudan etkilemektedir. Karotenoidlerin yokluğunda pigmentasyon azalmakta ve strese sebep olmaktadır. Kirleticiler ve ağır metaler bağışıklık sistemini baskılamaktadır. Ağır metalerin antibiyotikler gibi bağışıklık üzerinde baskılayıcı etkisi tespit edilmiştir. Adjuvanlar ve Glukanlar tek başlarına immunojenik etkiye sahip olmayıp aşılar ile birlikte kullanıldıkları zaman etkinliklerini artırırlar. Taşıma, handling, stok yoğunluğu gibi stres faktörleri bağışıklığın baskılanmasında en önemli etkenlerden dir. Çünkü hastalıkların oluşmasında ilk basamak stresdir. Stres meydana geldiği zaman fizyolojik fonksiyonlar bozulmakta ve organizmanın yönetimi güçleşmektedir. Stres altında enzim salgılama işlemi kontrol edilememekte, hücresel ve humoral immunite cevap verememektedir. Şekil Balıklarda immun sistemi etkileyen faktörler (Verlhac ve 1999) Gabaudan, 34

45 3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Probiyotik Bakterilerin Kültür Ortamından İzolasyonu Probiyotik bakteri izolasyonu için Irianto ve Austin in (2006) bildirdiği gibi deniz suyu (Salih Adası mevkiindeki ağ kafesler - Milas/Muğla), bağırsaklar, mukus ve solungaçlardan ekimler yapıldı. Ekimler genel % 2 tuz ilaveli genel besi yerine (Tryptic Soy Agar, TSA) yapılıp saflaştırma işlemi uygulandı. Besiyerlerinden pasajlar yapılarak saflaştırılan koloniler patojenlere karşı antagonistik etkisini tespit etmek amacıyla soğuk ortama alındı. 3.2 İnvitro Antagonizm Testi Saflaştırma işlemi tamamlanan bakterilerin Vibrio anguillarum a karşı antagonistik etkileri Çukur Diffüzyon Agar Testi ile belirlendi (Chythanya vd., 2002; Vaseeharan ve Ramasamy; 2003). Bu yöntemde V. anguillarum suşları % 2 tuz içeren 4 ml. Tryptic Soy Broth (TSB) içinde 22 C de 48 saat inkübe edildi. Test ortamı için tuzlu TSA hazırlandı. Besi yeri döküm sıcaklığına gelince 20 µl/10 ml bakteri/besiyeri oranında V. anguillarum ilave edildi. Besi yeri petri kaplarına döküldü ve katılaşması için bırakıldı. Donan besiyerinde 3 mm çapında çukurlar oluşturuldu. Bu çukurlara seçilen bakterilerden 10 µl doldurulup 22 C 24 saat inkübe edildi. Çukurlar etrafında oluşan şeffaf zonlar tespit edilerek bakterinin V.anguillarum a karşı antagonistik etkisi belirlendi Deneme Modeli, Balıklar, Ortam ve Su Kalitesi Parametreleri Kılıç Balık Bafa Kuluçkahanesinden 75 adet 4 gr levrek ve 75 adet 4 gr çipura alındı. Alınan balıklar cam akvaryumlara her akvaryuma 25 adet olmak üzere yerleştirildi. Deneme iki paralelli olarak düzenlendi. Bu tarihten itibaren balıklara günde 3 öğün olmak üzere vücut ağırlıklarının % 3 ü oranında yemleme yapıldı. Kullanılan 1,5 mm. çapındaki yem Kılıç Balık kuluçkahanesinden temin edildi. Balıkların yerleştirildiği akvaryumlardaki su sıcaklığı 24 o C, tuzluluk %o 16 ve ph 7,5-8 olarak belirlendi. Kullanılan akvaryumlar 70x30x40 cm ebatlarında olup 70 lt su 35

46 almaktadır. Bu denemede probiyotik suya ilave edilerek kullanılacağı için resirküle bir sistem kuruldu. Profesyonel akvaryum pompası ile su devamlı sirküle edilip filtrasyonu yapıldı (Şekil 3.2.). ÇİPURA LEVREK Şekil 3.1. Resirküle deneme modeli ve kullanılan balıklar. Probiyotik bakterinin yeme ilavesinin balıkların bağışıklık sistemine etkisini tespit etmek amacıyla Muğla ili Milas ilçesi İçme köyünde bir işletmeye 1,5x1,5x1,5m ebatlarında 4 kafes kuruldu. Bu kafeslere 100 er adet 20± 2 gr levrek ve 20± 2 gr çipura stoklandı. Bu kafeslere yerleştirilen balıklara günde 2 öğün olmak üzere vücut ağırlıklarının % 3 ü oranında yemleme yapıldı. Kullanılan 3 mm boyutlarındaki yem deneme yapılan işletmeden temin edildi. İşletmenin su özellikleri; sıcaklık 20 C, tuzluluk %o 16 ve oksijen değeri 9 ppm olarak tespit edildi Probiyotik Bakterinin Uygulanması Denemede uygulanacak bakteri yoğunluğunu ayarlamak için Tuzlu TSB de 22 C de üretilen bakteriler 4 o C 6000 rpm hızda 20 dakika santrifüj edilerek çökmesi sağlandı (Ghosh vd., 2007). Supernatant PBS içine alındı. PBS ile sulandırılıp homojenize edildikten sonra McFarland (No: 2) referanslarına göre 6x10 8 CFU/ml (McFarland 2) olarak ayarlandı. Oluşan süspansiyon 100 gr yeme 1 ml olacak şekilde % 1 sıvı yağ ilavesi ile karıştırıldı. Yemdeki son bakteri konsantrasyonu 36

47 6x10 6 CFU/gr olacak şekilde belirlendi. Deneysel yemler 7 günlük stoklar halinde 2000 gr olarak hazırlanıp balıklara verilmeye başlandı. Resirküle sistemde balıkların bağışıklık sistemine etkisini tespit etmek için suya ilave edilecek bakteriler McFarland (No: 2) referanslarına göre tespit edildi. 6x10 8 CFU/ml olarak tespit edilen bakteri süspansiyonundan 10 ml alınıp 100 ml yetiştiricilik suyuyla karıştırılarak resirküle sisteme 10 gün arayla verildi (Taoke vd., 2006) Örnekleme Sıklığı Örneklemeler uygulamanın başında, 7., 14., 21., ve 28. günlerde yapıldı. Her gruptan 5 adet balık alındı. Fenoksietanol ile anestezi edildikten sonra kuyruk sapları kesilerek kan alındı. Alınan kan örnekleri hemen incelemeye tabi tutuldu. 28. Gün sonunda kalan balıkların ağırlıkları tespit edilerek büyüme ve yem değerlendirmeye etkisine bakıldı Respiratory Burst Aktivitesi Süper oksit anyon oluşumu olarak da bilinen bu işlemin belirlenmesi için Nitro Blue Tetrazolum (NBT) boyası ile oluşan reaksiyon dikkate alınır. NBT kanda bulunan nötrofilleri boyar ve onların sayıları tespit edilir. Denemede 50 mikrolitre kan her balıktan alındı. Lameller üzerine konup içine ıslak pamuk konulmuş petri kutuları içinde 25 o C de 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra kan Fosfat Buffer Saline (PBS) ile üç kez yıkandı. Yıkama sonunda 50 µl NBT boyası lam üzerine kondu ve yıkanmış lameller üzerine kapatıldı. Bu şekilde 30 dakika 25 o C de inkübe edildi. İnkübasyondan sonra preparatlar kurumadan 40x büyütmede incelendi. Her preparatta 5 farklı alandaki hücre sayıları tespit edildi (Anderson vd., 1992) Serum Lizozim Aktivitesi Serum lizozim aktivitesi için Fenoksietanol ile anestezi edilen balıklardan kuyruk saplarının kesilerek kan alındı. Eppendorf tüplere yaklaşık 0,2 ml alınan kan +4 o C de 1 gece inkübe edildi. Ertesi gün soğutmalı santrifüj cihazında 4 o C de

48 rpm de 15 dakika santrifüj edildi. Sonra kanın serum kısmı otomatik pipet yardımıyla başka eppendorflara alındı. ph ı 6,5 a ayarlanmış PBS (Fosfat Buffer Saline) hazırlandı. ph, ph kâğıtları ile ölçüldü. Hazırlanan solusyona 10 ml için 2 mg Micrococcus lysodeikticus (Sigma, M 3770, ATCC No: 4698) eklendi ve iyice karıştırıldı. 50 mikrolitre serum ile 3ml M lysodeikticus solüsyonu karıştırılıp Shimadzu (UV ) spektrofotometrede 540 nm de 0,5. ve 4,5. dakikada ışık absorbsiyonu ölçüldü. Absorbanstaki her 0,001 lik değer 1 Unit lizozim olarak değerlendirildi (Engstad vd., 1992) Hematokrit Sayısı Hematokrit değerini bulmak için mikro hematokrit yöntemi kullanıldı. Mikro hematokrit tüplerinin 3/4 ü kanla doldurulduktan sonra tüpün bir ucu ateşle kapatılarak devir/dakikada 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonunda kanın katı kısmı ile serum kısmı oranlanarak yüzde olarak hematokrit değeri bulundu (Blaxhall ve Daisley, 1973) Formül Lökosit Tespiti (Periferik Yayma) Lam üzerine alınan 1 damla kan lamel aracılığıyla lamın tüm yüzeyine yayıldı. Kanlı preparat oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Kuruduktan sonra önce May-Grünwald boyasıyla 5 dakika boyandı. Distile su ile yıkandıktan sonra 20 dakika Giemsa boyasına maruz bırakıldı. Sonra tekrar distile su ile yıkanıp kurumaya bırakıldı. Kuruduktan sonra 100x büyütmede immersiyon yağı ile 100 adet lökosit hücresi sayıldı ve Lenfosit, Nötrofil ve Monosit sayıları kaydedildi. Böylece lökosit hücrelerinin yüzde oranları belirlendi (Şahan ve Cengizler, 2002) Ağırlık Artışına Etkisi Deneme sonunda probiyotik verilen gruplar ile kontrol grubu arasındaki büyüme farkını bulmak ve probiyotiğin ağırlık artışına etkisini tespit etmek için balıkların son ağırlıkları tartıldı. Böylece Ağırlık Kazancı (3.1), Spesifik Büyüme Oranı (3.2) hesaplandı. Bu amaç için; balıkların ilk ağırlıkları, son ağırlıkları ve deneme gün 38

49 sayısı kayıt edilerek istatistiki hesaplamalar ve formülasyonlar yapıldı (Yanboo ve Zirong, 2005). Ağırlık Kazancı = Ws Wi (3.1) Spesifik Büyüme Oranı = 100[(lnWs lnwi)/t] (3.2) Ws: Deneme Sonu ağırlığı Wi: Deneme Başı ağırlığı t: Deneme Süresi İstatistiksel Analiz Elde edilen değerler JMP (SAS Institute Inc., 2002) programında One-Way ANOVA ve Tukey s HSD Testi (Ming, 2002) kullanılarak analiz edildi. 39

50 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. İnvitro Antagonizm Testi Yapılan bakteri izolasyonları sonrasında bakterilerin V. anguillarum patojen suşlarına karşı antagonistik etkisine bakılmıştır. Deniz suyundan yapılan izolatta 24 saat sonunda V.anguillarum un 3 patojen suşuna karşı antagonistik etki tespit edilmiştir. Oluşan şeffaf zonlar antagonistik etkinin varlığını göstermektedir (Şekil 4.1). Şekil 4.1. Çukur difuzyon agar testinde probiyotik izolatlar ile E22, V3 ve T17 V. anguillarum suşlarına potansiyel probiyotik bakterinin antagonizmi 4.2. İzole Edilen Probiyotik Bakteri Probiyotik bakteri Muğla ili Bodrum ilçesi Güvercinlik Beldesi Salih Adası mevkiindeki balık çiftliğinden izole edilmiştir. Sudan yapılan izolatta bakteri V. anguillarum a karşı antagonistik etki göstermiştir. Bunun sonunda gerekli biyokimyasal testler yapılarak bakterinin cins teşhisi yapılmıştır. Vibrio sp. olduğu tespit edilmiştir (Tanrıkul vd., 2004). İzole edilen bakteri aşağıdaki özellikleri içermektedir (Çizelge 4.1, 4.2). Çizelge 4.1. Kullanılan bakterinin geleneksel yöntemlerle elde edilen test sonuçları Gram Hareket Katalaz Sitokrom Şekil Vibriostat O/F Boyama Oksidaz (O/129) - Aktif hareketli + + Uzun Çubuk

51 Çizelge 4.2. Apı 20E test sonuçları ONP ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IDN VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY AR Respiratory Burst Aktivitesi ve NBT (+) Hücre Sayısı Probiyotik bakterinin yeme ilave edilmesi sonucunda Levrek balıklarında NBT (+) hücre değerleri 11,4 ile 14,92 arasında değişmiş; ancak en yüksek değer 14 ve 21. günlerde probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir ( 14,92 ve 14,28) (Çizelge 4.3. ve Şekil 4.2.). Çipura balıklarında yapılan yem denemesinde ise NBT (+) hücre sayısı değerleri 10,48-14,00 arasında değişmiş ve en yüksek değerler 14. Günde (14,00) ve 7. Günde (12,92) probiyotik içeren gruplarda tespit edilirken en düşük değer 7. günde kontrol grubunda (10,48) belirlenmiştir (Çizelge 4.4. ve Şekil 4.6. ). Levrek balıklarında yetiştiricilik suyuna probiyotik ilave edilmesi sonucunda en yüksek NBT (+) hücre değerleri 21. (15,76) ve 28. (16,08) günlerde tespit edilmiştir (Çizelge 4.3 ve Şekil 4.2.). Çipura balıklarında bakterinin suya ilavesi sonucunda ise en yüksek değer 28. günde (14,20) tespit edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Şekil 4.7.). Ancak bu nispi yükselmeler istatistiki açıdan önemsiz bulunmuştur (P>0.05). Seçilen probiyotik bakteri Çipura ve Levrek Balıklarında hem yem hem de yetiştiricilik suyuna uygulandığı zaman NBT (+) hücre sayısına istatistiki açıdan önemli bir etki etmediği belirlenmiştir (P>0,05). Çizelge 4.3. Levrek balıklarında yapılan denemede örnekleme günlerinde uygulama gruplarındaki NBT(+) hücre ortalamaları (Ortalama ± Standart hata) UYGULAMA YEM SU Günler/ Uygulama PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 13 ± 1,09 a 11,44 ± 1,09 a 14,16 ± 0,98 a 14,80 ± 1,39 a 7 13,32 ± 1,09 a 12,44 ± 1,09 a 12,12 ± 0,98 a 12,92 ± 1,39 a 14 14,92 ± 1,09 a 13,76 ± 1,09 a 15,22 ± 0,98 a 15,00 ± 1,39 a 21 14,28 ± 1,09 a 12,08 ± 1,09 a 13,06 ± 0,98 a 15,76 ± 1,39 a 28 11,4 ± 1,09 a 12,72 ± 1,09 a 14,76 ± 0,98 a 16,08 ± 1,39 a 41

52 Şekil 4.2. Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması Şekil 4.3. Levrek balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması Çizelge 4.4. Çipura balıklarında probiyotik bakteri uygulamasının NBT (+) hücre sayısına etkisi UYGULAMA YEM SU PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 11,4±0,96a 10,72±0,96a 10,88±0,84a 10,6±1,18a 7 12,92±0,96a 10,48±0,96a 13,06±0,84a 11,32±1,18a 14 14,00±0,96a 12,12±0,96a 12,64±0,84a 10,88±1,18a 21 12,64±0,96a 10,84±0,96a 12,06±0,84a 12,00±1,18a 28 11,28±0,96a 12,40±0,96a 14,2±0,84a 13,4±1,18a 42

53 Şekil X de NBT hücreleri ve çekirdekleri Şekil X büyütmede bir alanda tespit edilen NBT + hücreler (Mor renkte) 43

54 Şekil 4.6. Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması Şekil 4.7. Çipura balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun NBT (+) hücre sayılarının karşılaştırılması 4.4. Serum Lizozim Aktivitesi Probiyotik bakterinin serum lizozimi aktivitesine etkisini anlamak için kafeslerdeki balıklar kullanılmıştır. Resirküle denemedeki balıkların küçük oluşu ve lizozim aktivitesinin tespitine yetecek kan alınamaması sebebiyle sadece aday probiyotiğin yeme ilavesinde kullanılan balıklardan kan alınmıştır. Elde edilen sonuçlar Tukey s HSD ve Student t testleri kullanılarak analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5 de verilmiştir. Çipura balıklarında lizozim aktivitesi 60,40 ile 74,50 Unit/ml arasında değişmiştir. En yüksek değer 1. günde probiyotik içeren grupta en düşük değer ise 21. günde kontrol grubunda tespit edilmiştir. Levrek balıklarında ise lizozim değerleri 65,40 ile 77,77 Unit/ml arasında değişmiş olup en yüksek değer

55 günde kontrol grubunda en düşük değer ise 1. günde probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir Çizelge 4.5. ve Şekil 4.8. ve Şekil 4.9.). Ancak gruplar arasındaki bu farklar istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.5.). Çizelge 4.5. Çipura ve Levrek balıklarında probiyotik ilavesi sonucu oluşan Serum Lizozim miktarları BALIK LEVREK ÇİPURA Günler/Uygulama PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 65,40 ± 3,28 a 65,90 ± 3,28 a 74,50±3,47a 62,90±3,47a 7 69,20 ± 3,28 a 72,77 ± 3,28 a 64,20±3,47a 67,80±3,47a 14 66,10 ± 3,28 a 67,80 ± 3,28 a 66,80±3,47a 61,70±3,47a 21 66,10 ± 3,28 a 66,40 ± 3,28 a 70,20±3,47a 60,40±3,47a 28 64,90 ± 3,28 a 77,77 ± 3,28 a 66,40±3,47a 68,00±3,47a Şekil 4.8. Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun serum lizozim miktarlarının karşılaştırılması Şekil 4.9. Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun serum lizozim miktarlarının karşılaştırılması 45

56 4.5. Hematokrit Miktarı Yapılan örneklemeler sonucunda gruplar arasındaki hematokrit ortalamalarının 38,60 ile 47,40 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Probiyotiğin levrek balıklarında suya ilave edilmesi sonucunda en yüksek değer 43,20 ile 1. günde probiyotikli grupta; en düşük değer ise 38,60 ile 21. günde yine probiyotikli grupta tespit edilmiştir (Çizelge 4.6. Şekil 4.11.). Probiyotiğin levrek balıklarının yemine ilavesinde de en yüksek değer 1. günde probiyotik içeren grupta (45,60) ; en düşük değerse 14. (40,20) günde kontrol grubunda tespit edilmiştir (Çizelge 4.6. Şekil 4.10.). Çizelge 4.6. Levrek balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin hematokrit miktarları üzerine etkisi UYGULAMA YEM SU Günler/Uygulama PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 45,60 ± 1,86 a 40,60 ± 1,86 b 43,20 ± 2,01 a 40,00 ± 2,01 a 7 40,40 ± 1,86 a 44,00 ± 1,86 a 39,40 ± 2,01 a 42,00 ± 2,01 a 14 47,40 ± 1,86 a 40,20 ± 1,86 b 42,60 ± 2,01 a 38,80 ± 2,01 a 21 45,00 ± 1,86 a 43,20 ± 1,86 a 38,60 ± 2,01 a 42,80 ± 2,01 a 28 44,40 ± 1,86 a 42,20 ± 1,86 a 40,00 ± 2,01 a 40,80 ± 2,01 a Şekil Levrek balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması Şekil Levrek balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması 46

57 Çipura balıklarında yapılan çalışmada probiyotiğin yeme ilave edildiği denemede en yüksek hematokrit değeri (43,80) 1. günde kontrol grubunda; en düşük değer ise 1. günde probiyotik içeren gruplarda tespit edilmiştir (Çizelge 4.7. Şekil 4.12.). Yine Çipura balıklarında probiyotiğin suya ilave edildiği çalışmada en yüksek hemarokrit değeri (45,20) 1. günde probiyotik içeren grupta; en düşük değer ise (40,40) 28. gün kontrol grubunda tespit edilmiştir (Çizelge 4.7. Şekil 4.13.). Çizelge 4.7. Çipura balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin hematokrit miktarları üzerine etkisi UYGULAMA YEM SU PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 41,25±2,25a 43,80±2,25a 45,20±1,80a 44,20±1,80a 7 43,60±2,25a 43,60±2,25a 45,00±1,80a 43,20±1,80a 14 42,00±2,25a 43,40±2,25a 42,20±1,80a 40,60±1,80a 21 42,40±2,25a 44,80±2,25a 41,20±1,80a 43,40±1,80a 28 42,20±2,25a 42,00±2,25a 43,40±1,80a 40,40±1,80a Şekil Çipura balıklarında yeme probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması Şekil Çipura balıklarında suya probiyotik ilave edilen gruplar ile kontrol grubunun hematokrit miktarlarının karşılaştırılması 47

58 4.6. Formül Lökosit Miktarı (Yayma Preparat Sonuçları) Levrek balıklarında probiyotik bakteri yetiştiricilik suyuna ilave edildiği zaman monosit hücre ortalaması 5,40± 0,86 ile 8,00± 0,86 arasında değişmiştir. En yüksek değerler 14. Günde probiyotik uygulanan grupta tespit edilmiştir (Çizelge 4.8, Şekil 4.14). En düşük değerler 7. ve 14. günlerde kontrol grubunda tespit edilmiş olup bu nispi farklılıklar istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (P>0,05) Yetiştiricilik suyuna probiyotik ilave edilen gruplarda nötrofil değerleri 9,80±1,00 ile 11,20±1,00 arasında değişmiştir. En yüksek ortalamalar probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir. Lenfosit ortalamaları 81,60 ± 1,28 ile 84,80 ± 1,28 arasında değişmiştir. En yüksek değerler tüm günlerde kontrol grubunda tespit edilmiştir (Çizelge 4.8, Şekil 4.14). Çizelge 4.8. Levrek balıklarında probiyotik bakterinin suya ilave edilmesinin lokosit hücre tiplerinin sayısına etkisi Hücre MONOSİT NÖTROFİL LENFOSİT Uygulama PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 7,00± 0,86 a 8,00± 0,86 a 11,20± 1,00 a 10,20± 1,00 a 81,80± 1,28 a 81,80± 1,28 a 7 7,20± 0,86 a 5,40± 0,86 a 10,60± 1,00 a 9,80± 1,00 a 82,20± 1,28 a 84,80± 1,28 a 14 8,00± 0,86 a 5,80± 0,86 a 11,00± 1,00 a 11,00± 1,00 a 82,00± 1,28 a 83,20± 1,28 a 21 7,00± 0,86 a 7,40± 0,86 a 11,40± 1,00 a 10,60± 1,00 a 81,60± 1,28 a 82,00± 1,28 a 28 6,20± 0,86 a 7,20± 0,86 a 11,20± 1,00 a 10,00± 1,00 a 82,60± 1,28 a 82,80± 1,28 a Hücre Sayısı (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0, MONOSİT PROBİYOTİK MONOSİT KONTROL NÖTROFİL PROBİYOTİK NÖTROFİL KONTROL LENFOSİT PROBİYOTİK LENFOSİT KONTROL Günler Şekil Levrek balıklarında probiyotiğin suya ilavesinin lökosit hücre tiplerinin dağılımı üzerine etkisi 48

59 Levrek Balıklarında probiyotiğin yeme ilavesinde Monosit miktarları 4,80± 0,87 ile 8,00± 0,87 arasında değişmiştir. En yüksek değer 14. günde probiyotik içeren grupta ve 1. günde kontrol grubunda oluşmuştur (Çizelge 4.9 ve Şekil 4.15). Genel ortalamanın probiyotik içeren grupta yüksek olmasına rağmen bu fark istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (P>0.05). Probiyotiğin yeme ilave edildiği gruptaki nötrofil ortalamaları da 10,20± 1,09 ile 13,00± 1,09 arasında değişmiş ve en yüksek değer 14. ve 21. günlerde probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir. En düşük değerler kontrol grupta 1. ve 14. günlerde tespit edilmiştir (Çizelge 4.9, Şekil 4.15). Lenfosit ortalamalarına bakıldığı zaman değerlerin 79,00± 1,17 ile 83,20± 1,17 arasında değiştiği ve en yüksek değerlerin kontrol grubu balıklarında tespit edildiği görüşmüştür. Ancak bu fark istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (P>0,05). Çizelge 4.9. Levrek balıklarında probiyotik bakterinin yeme ilavesinin lökosit hücre tipleri üzerine etkisi Hücre MONOSİT NÖTROFİL LENFOSİT Uygulama Günler PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 7,00 ± 0,87 a 8,00± 0,87 a 11,20± 1,09 a 10,20± 1,09 a 81,80± 1,17a 81,80± 1,17a 7 6,60± 0,87 a 4,80± 0,87 a 11,80± 1,09 a 12,00± 1,09 a 81,60± 1,17a 83,20± 1,17a 14 8,00± 0,87 a 5,80± 0,87 a 13,00± 1,09 a 11,00± 1,09 a 79,00± 1,17a 83,20± 1,17a 21 7,20± 0,87 a 6,00± 0,87 a 11,20± 1,09 a 11,80± 1,09 a 81,60± 1,17a 82,20± 1,17a 28 4,80± 0,87 a 6,80± 0,87 a 13,00± 1,09 a 12,20± 1,09 a 82,20± 1,17a 81,00± 1,17a Hücre Sayısı (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0, Günler MONOSİT PROBİYOTİK MONOSİT KONTROL NÖTROFİL PROBİYOTİK NÖTROFİL KONTROL LENFOSİT PROBİYOTİK LENFOSİT KONTROL Şekil Levrek balıklarında probiyotik bakterinin balık yemine ilavesinin lökosit sayılarına etkisinin karşılaştırlması 49

60 Çipura balıklarında probiyotik yeme ilave edildiği zaman monosit miktarları 3,20±1,0 ile 9,20±1,0 arasında gerçekleşmiştir. En yüksek değerler 1. günde probiyotik içeren ve kontrol grubunda tespit edilirken en düşük değerler 7. günde kontrol grubunda ve 28.günde probiyotik içeren gruptaki balıklarda tespit edilmiştir. Monosit hücreleri bakımından yüksek olan bu fark istatistiki açıdan önemli bulunmuştur (P<0,05). Nötrofil sayılarına bakıldığı zaman değerlerin 10,20± 1,11 ile 13,80± 1,11 arasında değiştiği tespit edilmiş ve en yüksek değerler 14. ve 28. günlerde probiyotik içeren gruplarda gözlenmiştir. Nötrofil sayıları açısından oluşan bu fark istatistiki olark önemli bulunmamıştır. Lenfosit ortalamaları 79,00±1,36 ile 84,60±1,36 arasında değişmiş ve en yüksek değerler kontrol gruba balıklarında tespit edilmiştir. Günler arasındaki lenfosit değerleri istatistiki açıdan önemli bulunmazken; kontrol grubu ile probiyotik verilen grup arasındaki genel ortalamalar istatistiki açıdan önemli çıkmıştır (Çizelge 4.10, Şekil 4.16). Çizelge Çipura balıklarında probiyotik bakterinin yeme ilavesi sonucunu gruplar arasında lökosit hücre tiplerine etkisi Hücre MONOSİT NÖTROFİL LENFOSİT Günler / uygulama PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 9,20±1,0a 8,60±1,0ab 11,80± 1,11a 10,20± 1,11a 79,00±1,36a 81,20±1,36a 7 6,40±1,0abc 3,20±1,0c 11,80± 1,11a 12,20± 1,11a 81,80±1,36a 84,60±1,36a 14 7,20±1,0abc 5,80±1,0abc 13,60± 1,11a 10,20± 1,11a 79,20±1,36a 84,00±1,36a 21 7,00±1,0abc 5,60±1,0abc 11,20± 1,11a 12,60± 1,11a 81,80±1,36a 81,80±1,36a 28 4,00±1,0bc 7,20±1,0abc 13,80± 1,11a 11,40± 1,11a 82,20±1,36a 81,40±1,36a Hücre sayısı (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0, MONOSİT PROBİYOTİK MONOSİT KONTROL NÖTROFİL PROBİYOTİK NÖTROFİL KONTROL LENFOSİT PROBİYOTİK LENFOSİT KONTROL Günler Şekil Çipura balıklarında aday probiyotik bakterinin yeme ilavesinde oluşan lökosit hücre sayılarının karşılaştırılması 50

61 Çipura balıklarında probiyotiğin yetiştiricilik suyuna ilave edilerek etkisine bakıldığı zaman Monosit miktarlarının gruplardaki ortalama değerleri 5,00± 0,99 ile 9,20± 0,99 hücre/100 arasında değişmiştir. En yüksek değerler 1. günde probiyotik içeren grupta ve kontrol grubu balıklarında görülürken en düşük değerler 7. günde kontrol grubunda ve 28. günde probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir. Gruplar arasındaki fark istatstiki olarak önemli bulunmamıştır. Gruplar arası nötrofil sayıları incelendiği zaman değerlerin 8,80± 1,0 ile 12,60± 1,0 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Probiyotik grubunda nötrofil sayıları günlere göre istikrarlı bir seyir izlerken; kontrol grubu değerleri günlere göre dalgalanmalar göstermiştir. Ancak bu farklılıklar hem günlerin karşılaştırılmasında hem de gruplar arasında önemli bulunmamıştır. Gruplar arası lenfosit sayıları 80,80 ± 1,47 ile 83,20± 1,47 arasında değişmiştir. İki grup içindeki değerlerin de ortalamaya yakın çıktığı gözlenmiş ve istatistiki olarak önemli fark bulunmamıştır (Çizelge 4.11 ve Şekil 4.17). Çizelge Çipura balıklarında probiyotik bakterinin suya ilavesinin lökosit hücre tiplerinin sayısı üzerine etkisi Hücre MONOSİT NÖTROFİL LENFOSİT Uygulama Günler PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL PROBİYOTİK KONTROL 1 9,20± 0,99a 8,80± 0,99a 10,00 ± 1,0a 10,20± 1,0a 80,80 ± 1,47a 81,00± 1,47a 7 7,40± 0,99a 5,00± 0,99a 10,00± 1,0a 12,20± 1,0a 82,60± 1,47a 82,80± 1,47a 14 7,20± 0,99a 8,00± 0,99a 10,80± 1,0a 8,80± 1,0a 82,00± 1,47a 83,20± 1,47a 21 7,00± 0,99a 6,40± 0,99a 11,20± 1,0a 12,60± 1,0a 81,80± 1,47a 81,00± 1,47a 28 5,60± 0,99a 7,20± 0,99a 11,80± 1,0a 9,60± 1,0a 82,60± 1,47a 83,20± 1,47a Hücre Sayısı (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0, Günler MONOSİT PROBİYOTİK MONOSİT KONTROL NÖTROFİL PROBİYOTİK NÖTROFİL KONTROL LENFOSİT PROBİYOTİK LENFOSİT KONTROL Şekil Çipura balıklarında probiyotik bakterinin suya ilavesinin lokosit hücre tiplerinin dağılım üzerine etkisi 51

62 Şekil May Grünwald- Giemsa boyamada tespit edilen kan hücreleri E: Eritrosit, L: Lenfosit, N: Nötrofil, B: Boya kalıntısı 4.7. Büyüme Parametrelerine Etkisi Yapılan tartımlar sonucunda probiyotiğin su yoluyla uygulanmasıyla ilgili çalışmada levrek balıklarının ağırlıkları 7,5 ile 11 gram arasında değişmektedir. En yüksek ortalama probiyotik ilave edilen grupta bulunmuştur (Çizelge 4.13.). Ayrıca deneme sonunda ağırlık kazancı ve spesifik büyüme oranına da bakılmış en yüksek değerler yine probiyotik içeren grupta tespit edilmiştir. Levrek balıklarında probiyotiğin yeme ilave edilmesiyle yapılan çalışma sonunda yüksek değerler yine probiyotikle beslenen grupta tespit edilmiştir (Çizelge 4.13.). Çipura balıklarında da 28. gün sonunda büyüme parametrelerinde yüksek değerler probiyotikli grupta tespit edilmiştir (Çizelge 4.12.). Ancak yapılan istatistiki analizler sonucunda bu nispi farklılıkların önemsiz çıktığı tespit edilmiştir (P>0,05). Çizelge Çipura balıklarında probiyotik bakteri ilavesinin büyüme parametrelerine etkisi Çipura YEM SU Kontrol PROBİYOTİK Kontrol PROBİYOTİK Başlangıç Ağırlığı (gr) 20±2,0a 20±2,0a 4±0,5a 4±0,5a 28.gün Ağırlığı (gr) 29,55±0,73a 29,95±0,73a 8,35±0,38a 8,6±0,38a Ağırlık Kazancı 9,55±3,35a 9,95±3,22a 4,35±1,55a 4,67±1,31a Spesifik Büyüme Oranı 1,37±0,41a 1,42±0,38a 2,60±0,46a 2,70±0,52a 52

63 Çizelge Levrek balıklarında parametrelerine etkisi probiyotik bakteri ilavesinin büyüme Levrek YEM SU Kontrol PROBİYOTİK Kontrol PROBİYOTİK Başlangıç Ağırlığı (gr) 20±2,0a 20±2,0a 4±0,5a 4±0,5a 28.gün Ağırlığı (gr) 30,55±0,74a 31,40±0,74a 9,00±0,39a 9,25±0,39a Ağırlık Kazancı 10,55±3,14a 11,4±3,55a 5,00±1,00a 5,25±1,42a Spesifik Büyüme Oranı 1,49±0,36a 1,59±0,39a 2,88±0,39a 2,96±0,55a Şekil Gruplar arasındaki ortalama ağırlık kazancının karşılaştırılması Şekil: Gruplar arasındaki spesifik büyüme oranının karşılaştırılması 53

64 5.TARTIŞMA VE SONUÇ Bu tez çalışmasında probiyotik bakterinin levrek ve çipura balıklarının bağışıklık sistemi üzerine etkisi araştırılmıştır. Başlangıçta tez çalışmasının levrek ve alabalıkta yapılması planlanmış ancak izolasyon çalışmaları neticesinde tatlı suda probiyotik potansiyeli olan izolatın tespit edilememesiyle çipura ya yönlenilmiştir. Çalışmada probiyotiğin etkisinin tespiti için 2 farklı deneme modeli oluşturulmuştur. Enjeksiyon yapılamayacak kadar küçük olan balıklara (4 gr) akvaryum ortamında, kapalı devre sistemde yetiştiricilik suyuna aday probiyotik bakteri ilave edilerek etkisi tespit edilmeye çalışılmıştır. Toprak havuzdaki balıklara da (20 gr.) yemlerine probiyotik bakteri ilave edilmiş ve etkisi araştırılmıştır. Böylece probiyotik bakterinin hem kapalı devre yetiştiricilik sistemindeki hem de yeme ilave edildiği zaman etkisi karşılaştırılabilmiştir. Sucul canlılar poikloterm oldukları için onların vücutlarındaki mikrobiyal konsantrasyon sıcaklık ve tuzlulukla değişir (Lesel, 1990). Tuzluluk değişimleri mikrop yoğunluğunu artırır (Hamid vd., 1978; Sakata vd., 1980; Ring ve Strim, 1994) ve deniz balıkları vucutlarının su kaybını önlemek için devamlı su içerler. Bu devamlı su alma çevredeki maddelerin etkisini artırır. Bu etki özellikle mide engellerinin olmadığı larval dönemde önemlidir. Bununla birlikte sucul canlıların bağırsak mikroflorası yem ve sudan gelen mikro organizmalarla hızlı bir şekilde değişir (Sugita vd., 1981; Priuer vd., 1990). Fakat mikroflora yem yoluyla da geçebilmektedir (Moriarty 1990). Larval ve juvenil balıklarda yemin etkisi net bir şekilde gösterilmiştir (Tanasomwang ve Muroga, 1989; Ring vd., 1995). Özellikle ilk yemleme esnasında canlı yemlerle verilen bakterilerin etkisi oldukça yüksektir (Munro vd., 1993; Bergh vd., 1994). Taoka ve arkadaşları (2006), (Paralichthys olivaceus yetiştiriciliğinde resirküle sistemlerde probiyotiklerin büyüme, stres toleransı ve spesifik olmayan bağışıklık sistemi üzerine etkisi üzerine yapılan bir çalışmada ticari probiyotikler yeme ve suya ilave edildiklerinde özellikle su kalitesi parametrelerinden ph, Amonyum azotu, Nitrat azotu ve Fosfatın kontrol gruba göre probiyotik ilaveli yemle beslenenlerde 54

65 daha az olduğunu tespit etmişlerdir. Bu çalışma mikrobiyal aktivitenin sucul canlılar için en çok yem ve su ile değiştiği için probiyotik bakteri yem ve suya ilave edilerek yapılmıştır. Su ürünlerinde probiyotik kullanımıyla ilgili çalışmalar daha çok dil, kalkan ve tatlı su balıkları üzerinde yoğunlaşmıştır. Oysaki kültür balıkçılığı üzerindeki payı çok yüksek olan levrek ve çipura yetiştiriciliğinde probiyotik kullanımı ile ilgili yeterli çalışma tespit edilemememiştir. Ayrıca probiyotik kullanımı ile ilgili çalışmalar daha çok lisanslı probiyotik ürünlerin etkisinin tespiti veya lisanslı olup hayvancılığın diğer alanlarında kullanılan ürünlerin su ürünleri yetiştiriciliğindeki etkisinin tespiti üzerine yoğunlaşmıştır (Öztürk, 2007). Su ürünlerine özgü probiyotik izolasyonları yeterli seviyeye gelmemiştir. Bilindiği gibi probiyotiğin etkili olmasındaki en temel noktalardan biri yetiştiriciliği yapılan türle aynı ortamdan izole edilmesidir (Gatesoupe, 1999). Bu çalışmada probiyotik bakteri ağ kafeslerin bulunduğu deniz suyundan izole edilmiştir. İzole edilen bakterinin V. anguillarum un üç farklı patojen suşuna karşı antagonistik etkisi tespit edilmiştir. Bakterinin bir bakteriye karşı antagonistik etki göstermesi o bakterinin diğer patojenlere karşı da antogonistik etki gösterebilme potansiyalinin olduğunu ortaya çıkarmaktadır (Maeda, 1999). Bu sebeple antagonizm gösteren bu bakteri potansiyel probiyotik olarak seçilmiştir. Probiyotik bakterinin teşhis çalışmalarına geçilmiş ve yapılan geleneksel ve biyokimyasal testler sonucunda Vibrio sp. olduğu tespit edilmiştir. Aynı cinsteki bakterilerin birbirlerine karşı antagonistik etki gösterdiği yapılan çalışmalarda bildirilmiştir. Yine aynı araştırmacı bazı Vibrio türlerinin V. parahaemolyticus, Aeromonas, Yersinia gibi önemli balık patojenlerine karşı da probiyotik olarak kullanıldığını belirtmiştir. Hatta bazı vibrio türlerinin IHNV ve OMV gibi karidesler için büyük mortaliteler oluşturan virüslere karşı da antagonistik etki gösterdiği ifade edilmiştir (Gatesoupe, 1999). 55

66 Rosales ve arkadaşlarının (2006), yapmış oldukları bir çalışmada ısı ile inaktif edilmiş Vibrionaceae familyasına ait 2 adet probiyotik suşun çipuraların bağışıklık sistemine etkisine bakmışlar; serum peroksidaz, komplement aktivitesi, sitotoksik aktivite, fagositik aktivite üzerine önemli etkisi görülürken; respiratory burst aktivite (NBT (+) hücre aktivitesi) üzerinde önemli bir etki tespit edilememiştir (Rosales vd., 2006). Kim ve Austin (2006) in yapmış oldukalrı çalışmada probiyotik olarak Carnobacterium maltomariticum denenmiş; respiratory burst, lizozim aktivitesi, makrofajların fagositik aktivitesinde istatistiki açıdan önemli sonuçlar elde edilmiştir (Kim ve Austin, 2006). Bu çalışmada levrek balıklarının yemine probiyotik ilavesinde NBT (+) hücre ortalamaları probiyotik ilaveli yemle beslenenlerde yüksek bulunmuştur. Levrek balıklarının suyuna probiyotik ilave edildiği zaman NBT (+) hücre sayıları haftalar arasında dalgalanma göstermiş ancak yüksek ortalamalar genelde kontrol grubu balıklarında görülmüştür. Çipura balıklarının yemine probiyotik ilavesinde de yüksek ortalamalar yine probiyotikli grupta tespit edilmiştir. Çipura balıklarının suyuna probiyotik ilavesinde ortalamalar her iki grupta birbirine çok yakın çıkmıştır. Bu sonuca göre her iki balık türünde de probiyotik bakterinin yeme ilavesi NBT(+) hücre sayılarında artışa neden olmuştur, ancak bu farklılıklar istatistiki açıdan önemli bulunmamıştır. Brunt ve Austin (2005), alabalıklarda lactococ ve streptococ un önlenmesi için probiyotik olarak Aeromonas sobria denemişler; probiyotik bakterinin mortaliteyi azaltmasının yanı sıra respiratory burst, serum lizozim aktivitesi, fagositik aktivite ve lokosit sayılarını da artırdığını tespit etmişlerdir (Brunt ve Austin, 2005). Bu çalışmada yemlerine probiyotik bakteri ilave edilen çipura ve levrek balıklarının kan serumlarındaki lizozim aktivitesi incelenmiş; sonuçlar levrek balıklarında düzensiz çıkarken, çipura balıklarında her iki grupta da ortalamalar yakın çıkmıştır. Serum lizozim aktivitesi miktarları deneme gruplarında istatistiki olarak önemli bir fark oluşturmamıştır. 56

67 Bu çalışmada levrek ve çipura balıklarında hematokrit miktarları üzerine probiyotik bakterinin önemli bir etkisi olmamıştır. Hematokrit miktarı bağışıklık sistemi göstergesi olması yanı sıra daha çok sudaki oksijenle ilgili olarak değişebilmektedir. Çünkü kan hücrelerinin yoğun kısımı eritrositler oluşturmaktadır. Eritrosit yoğunluğu da oksijen miktarı ile ters orantılı olarak vucut tarafından artırılmaktadır. Bu yüzden hematokrit miktarlarındaki aşırı artışlar bağışıklık sistemi göstergesi olmayabilir. Çalışma kapsamında deneme gruplarındaki lokosit hücre tiplerinin değişimleri de incelenmiş; genelde probiyotik içeren gruplarda lenfosit oranı düşük çıkarken monosit ve nötrofil oranları yüksek bulunmuştur. Hatta çipura balıklarının yemine probiyotik ilave edildiği denemede kontrol ile probiyotik grubu arasındaki fark istatistiki açıdan da önemli çıkmıştır. Monosit sayısı denemede araştırlan lokosit tipleri içinde en az miktarda bulunmaktadır. Bu yüzden olası küçük değişimler istatistiki açıdan önem taşımaktadır. Kırmızı (Pagrus major) ve siyah çipura (Acanthopagrus schlegeli) balıklarında yapılan denemelerde, larva ve yavru dönemindeki balıkların bağırsak florasının, yetiştirme suyunun ve diyetlerin mikroflorası ile ilişkili olarak değişim gösterdiği tespit edilmiştir (Muroga vd., 1987). Akvaryum ortamında resirküle sitemdeki balıklar dışarıdan doğrudan mikro organizma istilasına maruz değildir. Sadece yem kaynaklı kontaminasyonlar oluşabilmektedir. Ayrıca resirküle sitemin en riskli yönü olan su kalitesinin bozulması balıklara zarar vermektedir. Bu nedenle resirküle sitemde aday bakteri suya ilave edilmiş ve hem su kalitesini düzenleme potansiyeli hem de suda oluşabilecek zararlı bakteri ve mantarla karşı antagonistik etki sağlaması amaçlanmıştır. Toprak havuzdaki balıklara resirküle sistem uygulama imkanı olmamaktadır. Bu nedenle probiyotik bakteri balıkların yemlerine ilave edilerek tatbik edilmiştir. Bunda da amaç sindirim sistemi aracılığıyla oluşabilecek kontaminasyonları önlemek ve büyüme parametrelerine etkisini tespit etmektir. Yetiştiricilik ortamından izole edilen Photobacterium ve Bacillus cinsi bakteriler sazan balıklarında yem değerlendirme ve enzim üretimlerine etkisi açısından denenmiş; probiyotik ilaveli gruplarda yem değerlendirme ve sindirim enzimleri 57

68 aktivitesi kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Özellikle bu iki bakterinin birlikte uygulandığu grupta en iyi sonuç alınmıştır (Yanbo ve Zirong, 2005). Yapılan bazı çalışmalarda da probiyotik bakterinin büyüme oranları üzerinde önemli bir etki oluşturmadığı tespit edilmiştir. Gruplur arasındaki farlılığın önemli olmamasının nedeni olarak deneme periyodunun kısalığı (9 hafta) ve yemleme miktarının azlığı olarak gösterilmiştir (Nikoskelainen vd., 2001). Öztürk (2007) ün levrek balıklarında kafeste 6 ay boyunca yaptığı çalışmada da spesifik büyüme oranı faklı bulunmuş ancak fark istatistiki olarak önemsiz çıkmıştır. Bunun sebebi olarak da denemenin ticari bir işletmede yapılması nedeniyle balıkların periyodik manipülasyonlara tabi tutulması ve kontrolun laboratuvar şartlarındaki gibi tam yapılamaması olarak gösterilmiştir. Bu çalışmada probiyotik bakteri balıklarda spesifik büyüme oranı ve yem değerlendirmeye pozitifi etki etki etmiş ancak bu etki istatistiki olarak önemli bulunmamıştır. Deneme süresinin kısa olması (4 hafta) bunda en temel neden olarak ortaya çıkmaktadır. Bu çalışma ülkemizde bu konuda ilk yapılan çalışmalardan olması açısından önem taşımaktadır. Probiyotik konusu su ürünleri sektöründe diğer hayvansal üretimlere göre daha yeni yer bulmaya başlamıştır. Bu yüzden sektörde hala diğer hayvansal üretimler için tasarlanan probiyotik ürünler kullanılmaktadır ve onların su ürünleri konusunda etkisi ile ilgili yeterli bilimsel çalışma bulunmamaktadır. Bu yüzden yetiştiricilerimiz bu ürünleri rastgele kullanmaktadırlar. Bu sebeple sektörümüze özgü probiyotik ürünlerin kazandırılması önemlidir. Bu çalışma bu konuda çalışmak isteyen araştırmacılara yol gösterici olacaktır. 58

69 6. KAYNAKLAR Açkurt, F., Biringen G. ve Löker M., Sağlıklı beslenmede özel fizyolojik etki gösteren gıdaların yeri. Üretimden Tüketime Diyet Gıdalar Sempozyumu, İstanbul. Alexander J.B., Ingram G.A Noncellular nonspesific defence mechanism of fish, Annual Review of Fish Diseases, 2, Amaro C., Biosca E.G., Esteve C., Fouz B., Toranzo A.E. (1992) Comparative study of phenotypic and virulence properties in Vibrio vulnificus biotypes 1 and 2 obtained from an european eel farm experiencing mortalities, Diseases of Aquatic Organisms 13, Anderson, P.D., Moritomo, T., Grooth, R., Neutrophil, glass-adherent, nitroblue tetrazolium assay gives early indication of immunization effectivenes in rainbow trout. Veterinary Immunology and Immunopathology, 30, Anonim, The State of Food and Agriculture. FAO, 26p., Rome. Anonim, Su Ürünleri, Türkiye İstatistik Kurumu (TÜİK) Haber Bülteni, Sayı: 122 Asbakk, K., Dalmo, R.A Uptake of particles by fish epidermal cells in vitro. Journal of Marine Biotechnology, 6, Aubin J., Gatesoupe F. J., Labbe L., Lebrun L., Trial of probiotics to prevent the vertebral column compression syndrome in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture Research, 36, Austin B, Austin DA., Microbiological examination of fish and shellfish. Chichester: Ellis Horwood Avonts, L., Uytven E.V. and De Vuyst L., Cell growth and bacteriocin production of probiotic Lactobacillus strains in different media. International Dairy Journal, 14 (11), Aytuğ C.N., Alaçam E., Görgül S., Sığır hastalıkları TÜM-VET Hayvancılık Hizmetleri yayını No: 1 İstanbul Bechman T.C., Chambers J.V. Cunningham M.D., Influence of Lactobacillus acidophilus on performance of young dairy calves. Journal of Dairy Science Supplement 1, Beeman K., The effect of Lactobacillus spp. on convalescing calves. Agri- Practise, 6,

70 Bengmark, S., Ecological control of the gastrointestinal tract: The role of probiotic flora. Gut, 42, 2 7. Bergh, O., Naas, K.E., Harboe, T., Shift in the intestinal microflora of Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus, larvae during first feeding. Canadian Journal of Fish Aquatic Sciences, 51, Blaxhall, P.C., Daisley, K.W., Routine Haematological methods for use with fish blood. Journal of Fish Biology, 5, Blum, S., Reniero R., Schiffrin E.J., Crittenden R., Mattila- Sandholm T., Ouwehand A.C., Salminen S., vonwright A., Saarela M., Saxelin M., Collins K., Morelli L., Adhesion studies for probiotics: need for validation and refinement. Trends Food Sciences Technology, 10, Boyraz, T., Kaymak, S., Baştaş, K.K, Elma Kara Lekesi Hastalığı (Venturia inaequalis (Cke) Wint.) karşı bazı bitki aktivatörlerinin tek başlarına ve fungisit kombinasyonları ile etkileri. Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 20 (39), 1-6. Brassart, D. and Schiffrin E.J., The use of probiotics to reinforce mucosal defence mechanism. Trends Food Sciences Technology, 8, Brunt J., Austin B., Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases, 28, Chabrillon M, Arijo S., Daz-Rosales P., Balebona M. C., Morinigo M. A., Interference of Listonella anguillarum with potential probiotic microorganisms isolated from farmed gilthead seabream (Sparus aurata, L.). Aquaculture Research, 37, Charteris, W.P., Kelly P.M., Morelli L. and Collins J.K., Selective detection, enumeration and identification of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in mixed bacterial populations. International Journal of Food Microbiology, 35, Chythanya R., Karunasagar I., Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture, 208, Clements, K.D., Fermentation and gastrointestinal microorganisms in fishes. In: Mackie, R.I., Withe, B.A., Isaacson, R.E. Eds., Gastrointestinal Microbiology, Vol. 1, Gastrointestinal Ecosystems and Fermentations. Chapman & Hall Microbiology Series, International Thomson Publishing, New York, pp Çakır, İ., Fonksiyonel Gıdalar ve Probiyotikler. 4. Gıda Mühendisligi Kongresi, Ankara. 60

71 Dalmo R.A., Begwald, J., Ingebrightsen, K., Seljelid, R The imunomodulatory effect of laminaran (β (1,3)-D-glucan) on Atlantic salmon, Salmo salar L., anterior kidney leucocytes after intraperitoneal, peroral an peranal administration. Journal of Fish Diseases, 19, Dalmo R.A., Ingebrigtsen K. and Boegwald J Non-specific defence mechanisms in fish with particular reference to the reticuloendothelial system. Journal of Fish Diseases. 20, Dalmo, R.A., Ingebrigtsen, K., Bogwald, J., Horsberg, T.E., Seljelid, R., Accumulation of imunomodulatory laminaran (β (1,3)-D-glucan) in the spleen and kidney of Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases, 18, Dalmo, R.A., McQueen leifson, R., Bogwald, J., Microspheres as antigen carriers: studies on intestinal absorption and tissue localization of polysytrene microspheres in Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases, 18, Davina, J.H.M., Permantier, H.K., Timmermans, L.P.M., Effect of oral administration of Vibrio bacterin on the intestine of cyprinoid fish. Developmental and Comperative Immunology Supplement, 2, Demers, N.E. ve Bayne C.J., Plasma proteins of rainbow trout (Onchorhynchus mykiss): immediate response to stres. In: Models for environmental Toxicology, Biomarkers, Immunostimulants, Vol. 1 (edited by J.S. Stolen and NJ.). Doillet, P.A., Langdon, C.J., Use of a probiotic for the culture of larvae of pacific oyster (Crassostrea gigas Thunberg). Aquaculture, 119, Dopazo C.P., Lemos M.L., Lodeiros C., Bolinches J., Barja J.L. & ToranzoA.E., Inhibitory activity of antibiotic-producing marine bacteria against fish pathogens. Journal of Applied Bacteriology, 65, Dunne, C., Murphy L., Flynn S., O Mahony L., O Halloran S., Feeney M., Morrisey D., Thornton G., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., Quigley E.M.M., O Sullivan G., Shanahan F. and Collins K., Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Antonie van Leeuwenhoek, 76, Ellis, A.E., Munroe, A.L.S., Roberts, R.J., Defence mechanisms in fish. A study of the phagocytic system and fate of inteperitoneally injected particulate material in plaice (Pleuronectes platessa L.) Journal of Fish Biology, 8,

72 Engstad, R.E., Robertsen, B., Frivold, E., Yeast glucan induces increase in lysozyme and complement-mediated haemolytic activity in Atlantic salmon blood. Reprinted from Fish and Shellfish Immunology, 2, Erkkila, S., Bioprotective and Probiotic Meat Starter Cultures or the Fermantation of Dry Sausages. Phd. Thesis. University of Helsinki Department of Food Technology, Helsinki. Finland. Findlay, C., Tatner, M.F., A comparative study of T and B lymphocytes in rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) following their separation by nylon wool adherence and lectin aglutination techniques. Comperative Haemotology International, 4, Fletcher, T.C., White A Metabolic and immunological effects of endotoxin in the plaice Pleuronectes platessa L. Journal of Fish Biology, 31 (Supplement A), Food - Info, İnternet Sitesi Erişim tarihi: Fukushima,Y., Kawata Y., Hara H., Terada A. and Mitsuoka T., Effect of probiotic formula on intestinal immunoglobulin A production in healthy children. International Journal of Food Microbiology, 42, Fuller R., A Review: Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 66: Fuller, R., Indroduction. Probiotics 2, Application and Practical Aspects, Ed: R. Fuller. Chapman and Hall, England, 1-9. Gatesoupe, F.J., The use of probiotics in aquaculture: Review, Aquaculture, 180, Gibson, G.R., Saavedra J.M., Macfarlane S. and Macfarlane G.T., Probiotics and Intestinal Infections. Probiotics 2, Application and Practical Aspects, Ed: R. Fuller. Chapman and Hall, England, Gill D.R., Smith R.A., Ball R.L., The effect of probiotics feding on health and performance of newly arrived socker calves. Animal Science Research Report, Gournier-Chateau, N., Larpent, J.P., Castellanos, I., Larpent, J.L., Les Probiotiques en Alimentation Animale et Humaine. Technique et Documentation Lavoisier, Paris, 192 pp. Gravell M., Malsberger, R.S., A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas). Annuals of the New York Academy of Sciences, 126,

73 Gutzwiller A., Wyss U., Effect of lactic acid bacteria ( Streptococcus faecium M74) on the fattening performance and healt of veal calves. Nutrition Abstract Review, 66:536. Hamid, A., Sakata, T., Kakimoto, D., Microflora in the alimentary tract of grey mullet: 2. A comparison of the mullet intestinal microflora in fresh and sea water. Bulletin Japan Association Sciences of Fish, 44, Herraez, M.P. Zapata A.G., Structure and function of the melano-macrophage centres of the goldfish Carassius auratus. Veterinary Immunology and Immunopathology, 12, Hoesl, C.E. and Altwein J.E., The probiotic approach: An alternative treatment option in urology. European Urology, 47, Hooper P., The role of probiotics (intestinal inoculants) in production animals. In: Healty Animals Safe Foods Healty Mans. World Association of Veterinary Food Hygienists 10.th International Symposium in Stockholm. 2-7 July Hooper P., Probiotics: Intestinal inoculants FAO production animals. Probiotics in the nutrition of animals. Sbornik Prednasek, Nowember 1990, Bruno. Ingram G.A Substences involved in the natural resistance of fish to infectiona review. Journal of Fish Biology, 16, Irianto A, Austin B., Use of probiotics to control furunculosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases, 25, Isolauri, E., Salminen S. and Ouwehand A.C., Probiotics. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology, 18 (2), Itsaranuwat, P., Al- Haddad K.S. and Robinson R.K., The potential therapeutic benefits of consuming health-promoting fermented dairy products: A brief update. International Journal of Dairy Technology, 56 (4), Jones, C.D., Tomas C.N., The maintace of strain specificity and bile tolerance when producing stable bacteria. In: Biotechnology in the Food Industry. Alltech Technical Publications, Kentucky, USA, Kailasapathy, K. and Chin J., Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium supplement Immunolgy Cell Biology, 78 (1), Kalantzopouulos, G., Fermented products with probiotic qualities. Anaerobe, 3,

74 Kim D. H., Austin B., Innate immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) induced by probiotics. Fish & Shellfish Immunology, 21, Kimoto, H., Ohmomo S., Nomura M., Kobayashi M. and Okamoto T., In vitro studies on probiotic properties of lactococci. Milchwissenschaft, 55 (5), Kindberg, G.M., Dannevig, B.H., Andersen, K.-J., Berg, T. (1991): Intracellular transport of ovalbumin after in vivo endocytosis in rainbow trout liver. Fish Physiology and Biochemistry 9, Kita, J., Itazawa, Y., Scanning electron microscope study of rainbow trout spleen with reference to the role of the reticular meshwork in the erythrocyte release. Japanese Journal of Ichthyology, 41, Klaenhammer, T.R. and Kullen M.J., Selection and design probiotics. International Journal of Food Microbiology, 50, Klaenhammer, T.R., Functional activities of Lactobacillus probiotics: Genetic mandate. International Dairy Journal, 8, Lesel, R., Thermal effect on bacterial flora in the gut of rainbow trout and African catfish. In: Le sel, R. Ed., Microbiology in Poecilotherms, pp Lourens-Hattingh, A. and Viljoen B.C., Yoghurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal, 11, Lunden, T., Lilius, E-M., Bylund, G., Respiratory burst activity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) phagocytes is modulated by antimicrobial drugs. Aquaculture, 207, Lyons T.P., The role of biological tools in the food industry. In: Biotechnology in the Food Industry, Alltech Technical Publications, Kentucky, Maeda M., Microbial Processes in Aquaculture. Society for the Biological Creation and Enhancement of the Aquatic Environment (Biocreate), Japan, 1999, v pp., ISBN Mattila- Sandholm, T., Myllarinen P., Critenden R., Mogensen G., Fonden R. And Saarela M., Technological challenges for future probitic foods. International Dairy Journal, 12, Mattila-Sandholm, T., Matto J. and Saarela, M., 1999 a. Lactic acid bacteria with health claims- interactions and interference with gastrointestinal flora. International Dairy Journal, 9,

75 Mclean E., Intact protein absorption in teleosts. Ph.D. thesis, Universty of Bradford Postgraduate School of Studies in Biomedical Sciences, Bradford Mclean E., Donaldson E.M., Absorption of bioactive proteins by the gastrointestinal tract of fish: A review. Journal of Aquatic Animal Health 2, Metchnikoff, E., The Prolongation of Life. Optimistic Studies. William Heinemann, London. Metchnikoff, E., The Nature of Man. Studies in Optimistic Philosophy. William Heinemann, London. Ming, D.X., Biometry and Experimental Design, 2nd ed. Agriculture of China Press, Beijing. Moriarty, D.J.W., Interactions of microorganisms and aquatic animals, particularly the nutritional role of the gut flora. In: Le sel, R. Ed.., Microbiology in Poecilotherms, pp Munro, P.D., Birkbeck, T.H., Barbour, A., Influence of rate of bacterial colonisation of the gut of turbot larvae on larval survival. In: Reinertsen, H. Murakami, H., Tamai, T., Shairata, S., Immortalization of fish lymphocytes and fish interferon gene. Fish Pathology, 30, Muroga, K., Hıgashi, M., Keitoku, H., The isolation of intestinal microflora of farmed red sea bream (Pagrus major) and black sea bream (Acanthopagrus schlegeli) at larval and juvenile stages. Aquaculture, 88, Nikoskelainen S., Salminen S., Bylund G. and Ouwehand A.C., Characterization of the properties of human and dairy-derived probiotics for prevention of infectious diseases in fish. Applied and Environmental Microbiology, 67, Nilsen, F., Description of Trichodina hippoglossis spp. from farmed Atlantic halibut larvae Hippoglossus hippoglossus. Diseases of Aquatic Organisms, 21, O Sullivan, D.J., Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. Agricultural Food Chemistry, 49 (4), Ourth D.D., Secretory IgM, lysozyme and lymphocytes in the skin mucus of the channel catfish, Ictalurus punctatus. Developmental and Comperative Immunology, 4,

76 Ouwehand, A.C., Kirjavainen P.V., Grönlund M.M., Isolauri E. and Salminen S.J., Adhesion of probiotic micro-organisms to intestinal mucus. International Dairy Journal, 9, Ouwehand, A.C., Salminen S. and Isolauri, E., Probiotics: An overview of benefical effects. Antonie van Leeuwenhoek, 82, Ouwehand, A.C., Tuomola E.M., Tolkko S. and Salminen S., Assessment of adhesion properties of novel probiotic strains to human intestinal mucus. International Journal of Food Microbiology, 64, Oyetayo, V.O. and Oyetayo F.L., Potential of probiotics as biotherapeutic agents targeting the innate immune system. African Journal of Biotechnology, 4 (2), Öztürk, F. Y., Levrek balıklarında (Dicentrarchus labrax) probiyotik olarak Lactobacillus rhamnosus kullanılmasının rerformans üzerine etkisi, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi, 76 sayfa, ANKARA Parker, R.B., Probiotics. The other half of the antibiotics story. Animal Nutritional Health, 29, 4 8. Penner, R., Fedorak R.N. and Madsen K.L., Probiotics and nutraceuticals: nonmedicinal treatments of gastrointestinal diseases. Current Opinion in Pharmacology, 5 (6), Press, C.McL., Dannevig, B.H., Landsverk, T., Immun and enzyme histochemical phenotypes of of lymphoid and nonlymphoid cells within the spleen and head kidney of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish and Shellfish Immunology, 4, Prieur, D., Me vel, G., Nicolas, J.L., Plusquellec, A., Vigneulle, M., Interactions between bivalve molluscs and bacteria in the marine environment. Oceanografic Marine Biology, Annual Review, 28, Rikkinen, M., Westermarck E., Salminen S. and Ouwehand A.C., Absence of host specifity for in vitro adhesion of probiotic lactic acid bacteria to intestinal mucus. Veterinary Microbiology, 97, Ring, E., Strom, E., Microflora of Arctic charr, Salvelinus alpinus L..: Gastrointestinal microflora of free-living fish and effect of diet and salinity on intestinal microflora. Aquaculture Fish Management, 25, Ringo, E., Strom, E., Tabachek, J.A., Intestinal microflora of salmonids: a review. Aquaculture Research, 26,

77 Rogelj, I., Bogovic B.M., Majhenic A.C. and Stjkovic A., The survival and persistence of Lactobacillus acidophilus LF221 in different ecosystems. International Journal of Food Microbiology., 76, Roitt I., Brostoff J. and Male D Immunologie Fondamentale et Appliquée. 2nd edition. MEDSI/ McGRAW-HILL Eds. Rollo A., Sulpizio R., Nardi M., Silvi S., Orpianesi C., Caggiano M., Cresci A., Carnevali O., Live microbial feed supplement in aquaculture for improvement of stress tolerance. Fish Physiology and Biochemestry, 32, Roth F.X., Kirchgessner M:., Nutritive effect of toyocerin. 2. Calf Fattening Nutrition Abstract Rewiev, 60:536. Rosales P. D., Salinas I., Rodrıguez A., Cuesta A., Chabrillon M., Balebona, M. C., Morinigo M. A., Esteban, A., Meseguer, J Gilthead seabream (Sparus aurata L.) innate immune response after dietary administration of heatinactivated potential probiotics. Fish & Shellfish Immunology, 20, Rönka, E., Malinen E., Saarela M., Rinta- Koski M., Aarnikunnas J. and Palva A., Probiotic and milk technological properties of Lactobacillus brevis. International Journal of Food Microbiology, 83 (1), Sakai, D.K Repertoire of complement in immunological defence mechanisms of fish. Annual review of Fish Diseases, 2, Sakata, T., Microflora in the digestive tract of fish and shell-fish. In: Le sel, R. Ed.., Microbiology in Poecilotherms, pp Sakata, T., Okabayashi, J., Kakimoto, D., Variations in the intestinal microflora of Tilapia reared in fresh and sea water. Bulletin of the Japanese Societyof Fisheries Oceanography, 46, Sanders, M.E., Probiotics. Food Technology, 53 (11), Shortt, C., The probiotic century: Historical and current perpectives. Trends Food Sciences Technology, 10, Sodini, I., Lucas A., Oliveira M.N., Remeuf F. and Corrieu G., Effect of milk base starter culture on acidification, texture, and probiotic cell counts in fermented milk processing. Journal of Dairy Sciences, 85 (10), Stanton, C., Gardiner G., Meehan H., Collins K., Fitzgerald G., Lynch P.B. and Ross R.P., Market potential for probiotics. American Journal of Clinical Nutrition, 73 (2 Supplement),

78 Stewart, C.S., Microorganisms in hindgut fermentors. In: Mackie, R.I., Withe, B.A., Isaacson, R.E. Eds.., Gastrointestinal Microbiology, Vol. 2, Gastrointestinal Microbes and Host Interactions. Chapman and Hall Microbiology Series, International Thomson Publishing, New York, pp Sugita, H., Tanaami, H., Kobashi, T., Deguchi, Y., Bacterial flora of coastal bivalves. Bulletin of the Japanese Society of Fisheries Oceonagraphy, 47, Suskovic J., Kos B., Matosic S. and Besendorfer V., The effect of bile salts on survival and morphology of a potential probiotic strain Lactobacillus acidophilus M 92. World Journal of Microbiology Biotechnology, 16, Şahan, A., Cengizler, İ., Seyhan Nehri (Adana kent içi bölgesi) inde yaşayan benekli siraz (Capoeta barroisi Lortet, 1894) ve kızılgöz (Rutilus rutilus Linnaeus, 1758) de bazı hematolojik parametrelerin belirlenmesi. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 26: Tanasomwang, V., Muroga, K., Intestinal microflora of rockfish Sebastes schlegeli, tiger puffer Takifugu rubripes and red grouper Epinephelus akaara at their larval and juvenile stages. Nippon Suisan Gakkaishi, 55, Tanrıkul, T. T., Çağırgan, H., Tokşen, E., Levrek lerden (Dicentrarchus labrax L., 1758) İzole Edilen Vibrio Türlerinin API 20E Yöntemiyle İdentifikasyonu. Ege Üniversitesi Su Ürünleri Dergisi, 21, Taoka Y., Maeda H., Jo J.Y., Jeon M.J., Baı S.C., Lee W.J., Yuge K., Koshıo S., Growth, stress tolerance and non-specific immune response of Japanese flounder Paralichthys olivaceus to probiotics in a closed recirculating system. Fisheries Sciences, 72, Timmermans, L.P.M., Early development and differentiation in fish. Sarsia, 72, Tosun, N., Ergün, A., Bitkisel Üretimde ve Tarımsal Savaşımda Yeni Bir Yaklaşım Olarak Bitki Aktivatörlerinin Rolü. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Yayın No: 109 TUTEK/TYUAP Tarımsal Araştırma Yayın ve Koordinasyonu 2002 yılı Tarla Bitkileri Grubu Birliği Alışveriş Toplantıları Bildirileri, s Tuomola, E., Crittenden R., Playne M., Isolauri E. and Salminen S., Quality assurance criteria for probiotic bacteria. American Journal of Clinical Nutrition, 73 (Supplement),

79 Tuomola, E.M., Ouwehand A.C. and Salminen S., Chemical physical and enzymatic pre-treatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoproteins. International Journal of Food Microbiology, 60, Vadstein, O., The use of immunostimulation in marine larviculture: possibilities and challenges. Aquaculture, 155, Vanbelle M., Teller E., Focant M., Probiotics in Animal Nutrition: A Review. Publication: United de Biochimie de la Nutrition, Louvain- la- Neuve No: 55,59. Vanbelle M., Teller E., Focant M., Probiotics in Animal Nutrition: A review. Archives of Animal Nutrition, 40: Vaseeharan, B., Ramasamy, P., Control of athogenic Vibrio spp. by Bacillus substilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaus monodon. Letter in Applied Microbiology, 36, Vaughan, E.E., de Vries M.C., Zoetendal E.G., Ben- Amor K., Akkerman A.D.L. and De Vos W.M., The Intestinal LABs Antonie van Leeuwenhoek, 82, Vinderola, C.G., Bailo N. and Reinheimer J.A., Survival of probiotic microflora in Argentinian yoghurts during refrigerated storage. Food Researches International, 33, Yanbo W., Zirong X., Effect of probiotics for common carp (Cyprinus carpio) based on growth performance and digestive enzyme activities. Animal Feed and Technology, 2005, Yang, C.Z. ve Albrihgt, L.J., Anti-phtoplankton theraphy of finfish: the mukolitic agent L-cysteine ethyl ester protects coho salmon Onchorhyncus kisutch againts the harmful phytoplankter Chaetoceros concavicornis. Disease of Aquatics Organisms, 20, Zavaglia, A.G., Kociubinski G., Perez P., Disalvo E. and Antoni G., Effect of bile on the lipid composition and surface properties of bifidobactaria. Journal of Applied Microbiology, 93, Zubillaga, M., Weill R., Postaire E., Goldman C., Caro R. and Boccio J., Effect of probiotics and functional foods and their use in different diseases. Nutrition Research, 21,

80 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı :Mahmut KAYA Dogum Yeri ve Yılı: Şarkışla, 1983 Medeni Hali Yabancı Dili : Bekar : İngilizce Egitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Sivas Anadolu İletişim Meslek Lisesi Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi Yüksek Lisans : SDÜ Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Yetiştiriciliğinde devam ediyor Çalıstıgı Kurum/Kurumlar ve Yıl: TC Ziraat Bankası AŞ. Zirai Krediler Halen Yayınları (SCI ve diger makaleler) Kaya, M., Diler, Ö., 2007 Ticari probiyotik Bactocell 'in gökkuşağı alabalıklarının (Onchorynchus mykiss) bağışıklık sistemleri ve büyümeleri üzerine etkisi. XIV. Ulusal Su ürünleri Sempozyumu 4-7 Eylül, Muğla. 70