T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PEYNİRDEN İZOLE EDİLEN YÜKSEK SEVİYEDE AMİNOGLİKOZİD DİRENÇLİ (YSAD) ENTEROKOKLARDA VİRÜLENS FAKTÖRLERİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Degnide Ephrem ADIFON Danışman Prof. Dr. Yasin TUNCER YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA

2 2018 [Degnide Ephrem ADIFON]

3

4

5 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... ii ABSTRACT... iii TEŞEKKÜR... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Enterokokların Genel Özelikleri Ekoloji ve Epidemiyoloji Enterokokların Fonksiyonel Özellikleri Gıdalarda Enterokoklar Enterokokların Patojenitesi Virülens Faktörler Jelatinaz Hücre duvarı adhezinleri Ekstraselüler yüzey proteini Seks feromonları Kollojen bağlayan protein Agregasyon proteini Sitolizin (Hemolizin) Hiyaluronidaz MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bakteriler ve besiyeri Yöntem Genomik DNA izolasyonu Agaroz jel elektroforezi Enterococcus spp. izolatlarının 16S rdna dizi analizi ile tür düzeyinde tanısı Jelatinaz aktivitesi Hemolitik aktivite Enterokok suşlarında virülens faktörlerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Enterokok suşlarından Genomik DNA İzolasyonu Enterococcus spp. İzolatlarının 16S rdna Dizi Analizi ile Tür Düzeyinde Tanısı Jelatinaz Aktivitesi Hemolitik Aktivite Enterokok Suşlarında Virülens Faktörlerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Belirlenmesi SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ i

6 ÖZET Yüksek Lisans Tezi PEYNİRDEN İZOLE EDİLEN YÜKSEK SEVİYEDE AMİNOGLİKOZİD DİRENÇLİ (YSAD) ENTEROKOKLARDA VİRÜLENS FAKTÖRLERİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Degnide Ephrem ADIFON Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Yasin TUNCER Bu çalışmada, önceden peynir örneklerinden izole edilmiş 54 yüksek-seviyede aminoglikozid dirençli (YSAD) enterokok suşunda (25 E. faecalis, 15 E. faecium, 12 E. durans ve 2 E. gallinarum) jelatinaz (gele), hücre duvarı adhezinleri (efaafm, efaafs), seks feromonları (cdp, cob, ccf, cad), kollojen bağalayan protein (ace, acm), agregasyon maddesi (agg), sitolizin (cylm, cylb, cyla), hiyaluronidaz (hyl) ve hücre duvarı ile ilişkili proteini (espfm, espfs) kodlayan virülens faktör genlerinin varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile araştırıldı. Ayrıca jelatinaz ve hemolitik aktivite özellikleri fenotipik olarak test edildi. Bu suşların jelatinaz ve hemolitik aktiviteleri fenotipik yötemlerle incelendi. PCR sonuçları, E. faecium RS32.2 hariç tüm suşlarda en az bir virülens genin tespit edildiğini gösterdi. YSAD enterokok suşlarında en sık tespit edilen virülens genler ccf (48/54, % 88.89), efaafs (46/54, % 85.19), acm (42/54, % 77.78), gele (32/54, % 59.2), cpd (28/54, % 51.85), espfs (27/54, % 50) ve ace (20/54, % 37.04) dir. efaafm, cob, agg, cyla, hyl, cylb ve espfm genleri sırasıyla YSAD enterokok suşlarının % (11/54), % 9.26 (5/54), % 9.26 (5/54), % 9.26 (5/54), % 5.56 (3/54), % 3.70 (2/54) ve % 1.85 (1/54) inde tespit edildi. Enterokok suşlarının hiçbirinin cad ve cylm geni içermerdiği gösterilmiştir. Hemolitik aktivite test sonuçları, % (26/54), % (25/54) ve % 5.55 (3/54) suşun sırasıyla α, γ ve β hemolitik olduğunu göstermiştir. Sadece 3 YSAD suşunun jelatinaz ürettiği belirlenmiştir. Bu sonuç 30 YSAD enterokok suşunun sessiz gele geni içerdiğini göstermiştir. Sonuç olarak, peynir örneklerinden izole edilen YSAD enterokok suşlarında yüksek oranda virülens faktör kodlayan gen tespit edilmesi tüketici sağlığı için endişe uyandırıcıdır. Anahtar Kelimeler: Enterococcus, peynir, aminoglikozid direnci, virülens faktör genleri, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) 2018, 65 sayfa ii

7 ABSTRACT M.Sc. Thesis INVESTIGATION OF VIRULENCE FACTORS IN HIGH-LEVEL AMINOGLYCOSIDE RESISTANT (HLAR) ENTEROCOCCI ISOLATED FROM CHEESE Degnide Ephrem ADIFON Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Yasin TUNCER In this study, 54 high-level aminoglycoside resistant (HLAR) enterococci (25 E. faecalis, 15 E. faecium, 12 E. durans and 2 E. gallinarum) previously isolated from cheese samples were investigated by polymerase chain reaction (PCR) for presence of virulence factor genes encoding gelatinase (gele), cell wall adhesin (efaafm, efaafs), sex pheromones (cpd, cob, ccf, cad), collagen-binding protein (ace, acm), aggregation substance (agg), cytolysin (cylm, cylb, cyla), hyaluronidase (hyl) and cell wall-associated protein (espfm, espfs). In addition, gelatinase and haemolytic activities of strains were also investigated by phenotypic methods. PCR results showed that at least one virulence gene was detected in all strains, except for E. faecium RS32.2. Most frequently detected virulence genes in HLAR enterococci strains were ccf (48/54, 88.89%), efaafs (46/54, 85.19%), acm (42/54, 77.78%), gele (32/54, 59.26%), cpd (28/54, 51.85%), espfs (27/54, 50%) and ace (20/54, 37.04%). The efaafm, cob, agg, cyla, hyl, cylb and espfm genes were detected in 20.37% (11/54), 9.26% (5/54), 9.26% (5/54), 9.26% (5/54), 5.56% (3/54), 3.70% (2/54) and 1.85% (1/54) of HLAR enterococci strains, respectively. None of the strains carried the cad and cylm genes. Haemolytic activity test result showed that % (26/54), % (25/54) and 5.55 % (3/54) of strains were found α, γ and β haemolytic, respectively. It has been determined that only three HLAR strains produce gelatinase. This result showed that 30 HLAR enterococci strains contain silent gele gene. In conclusion, high incidence of virulence factors encoding gene detection in HLAR enterococci strains isolated from cheese samples is a concern for consumer health. Keywords: : Enterococcus, cheese, aminoglycoside resistance, virulence factor genes, polymerase chain reaction (PCR) 2018, 65 pages iii

8 TEŞEKKÜR Bana bu konuda çalışma imkanı sunan ve tez çalışmamın her aşamasında yardım ve desteğinden yararlandığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Yasin TUNCER e; Laboratuarda çalışmam boyunca yardımlarını eksik etmeyen sayın Dr. Didem AKPINAR KANKAYA, Meltem YALÇIN, Rahime ÖZDEMİR, Hüseyin ÖZTÜRK ve Burak GENİŞ e Bana destek veren sayın Doç. Dr. Banu ÖZDEN TUNCER e 5085-YL1-17 No` lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na; Yüksek Lisansımın gerçekleşmesinde maddi destek sağlayan Benin Bursları Ulusal Müdürlüğü ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) a; Hayatım boyunca maddi ve manevi destekleriyle beni yalnız bırakmayan, her zaman yanımda olan sevgili ailem ve arkadaşlarıma; Süleyman Demirel Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümünde görev yapan bütün personel ve öğrencilere; Teşekkürü bir borç bilirim Degnide Ephrem ADIFON ISPARTA, 2018 iv

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 4.1. YSAD Enterococus izolatlarının genomik DNA örneklerinin agaroz gel elektroforez görüntüsü Şekil 4.2. Enterococcus spp. izolatlarının 16S rdna PZR amplikonları Şekil 4.3. E. RG22.4 (9), E. faecalis RS25.1(10), E. faecalis RS25.2 (11) ve E. faecalis RS25.3 (12) suşlarının jelatinaz aktiviteleri Şekil 4.4. Enterococcus suşlarında gele Geninin PZR amplifikasyonu Şekil 4.5. Enterococcus suşlarında efaafm geninin PZR amplifikasyonu Şekil 4.6. Enterococcus suşlarında ccf geninin PZR amplifikasyon Şekil 4.7. Enterococcus suşlarında cpd geninin PZR amplifikasyonu Şekil 4.8. Enterococcus suşlarında cob geninin PZR amplifikasyonu Şekil 4.9. Enterococcus suşlarında espfs geninin PZR amplifikasyonu Şekil Enterococcus suşlarında agg geninin PZR amplifikasyonu Şekil Enterococcus suşlarında ace geninin PZR amplifikasyonu Şekil Enterococcus suşlarında acm geninin PZR amplifikasyonu Şekil Enterococcus suşlarında cylb geninin PZR amplifikasyonu v

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Enterococcus cinsi üyesi türler ve alt türler... 4 Çizelge 3.1. çalışmada kullanılan YSAD Enterococcus izolatları ve aminoglikozid direnç profilleri Çizelge 3.2. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PRZ karışımı Çizelge 3.3. enterokok suşlarında aranan virülens faktörleri kodlayan genler ve faktör üretimindeki Rolleri Çizelge 3.4. YSAD Enterococcus izolatlarında virülens faktörlerin belirlenmesinde kullanılan primerler Çizelge 4.1. Enterococcus suşlarının jelatinaz aktiviteleri Çizelge 4.2. Enterococcus suşlarının hemolitik aktivitele sonuçları Çizelge 4.3. Enterococcus suşlarında virülens faktörlerin varlığı vi

11 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Ace Adhezin Kollojen Agg Agregasyon Proteini bç Baz Çifti Cyl Sitolizin Dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asit EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit EfaA Adhezin Benzeri Endokarditis Antijeni Esp Ekstraselüler Yüzey Proteini g Gram Hyl Hiyaluronidaz kda Kilo dalton LAB Laktik Asit Bakterileri mg Miligram ml Mililitre mm Milimolar MRS de Man Rogosa Sharpe PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu SDS Sodyum Dodesil Sülfat UV Ultra Viyole YSAD Yüksek Seviyede Aminoglikozid Dirençli µg Mikrogram µl Mikrolitre α Alfa β Beta Ɣ Gama % Yüzde vii

12 1. GİRİŞ Enterokoklar, insan ve hayvan bağırsak florasında doğal olarak bulunan ve aynı zamanda ham gıda maddelerinden ve çeşitli geleneksel fermente gıdalardan sıklıkla izole edilen homofermentatif laktik asit bakterileridir. Enterokoklar proteoliz, lipoliz ve sitrat yıkımı yetenekleri ile bazı fermente gıdaların olgunlaşmasında önemli rol oynamaktadırlar. Ayrıca Listeria monocytogenes gibi gıdalarda bulunan patojenlere karşı güçlü antibakteriyel etkiye sahip olmalarından dolayı süt, peynir ve benzeri ürünlerin korunmasında ciddi bir potansiyele sahiptirler. Enterokok türlerinin insanlar için zararsız olduğuna inanılmasından ve bakteriyosin üretim yeteneklerinden dolayı bu bakteriler yirmi yılı aşkın süredir gıda endüstrisinde probiyotik veya starter kültür olarak kullanılmaktadır (Foulquie Moreno vd., 2006). Enterokoklar yüksek ph, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu gibi olumsuz çevresel koşullar altında yaşayabilmeleri nedeniyle fermentasyon sırasında kullanıma uygun bakterilerdir. Enterokoklar peynir, sosis, sucuk, deniz ürünleri, kırmızı et ve kanatlı etleri gibi başta hayvansal gıdalar olmak üzere, su ve bitkilerden de yaygın olarak izole edilmektedirler. Yapılan çalışmalar hayvansal gıdalardan sıklıkla izole edilen enterokok türlerinin Enterococcus faecalis, E. faecium ve E. durans olduğunu göstermiştir. Hayvansal gıdalardan izole edilen enterokok türleri arasında E. faecalis ve E. faecium türlerinin görülme sıklığının diğer türlere nazaran daha yüksek olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Son yıllarda, enterokoklar, nozokomiyal (hastane kaynaklı) enfeksiyonlarda artan rolleri nedeniyle tıbbi bakteriyolojide büyük ilgi görmüştür. Güvenli gıdaların üretilmesinde kullanılan suşlar arasındaki farklılıklar ve enterokokların gen transferi yolu ile antibiyotik direnç ve virülens faktörleri kazanma potansiyelleri olabilmektedir. Enterokoklar özellikle endokardit, bakteriyemi, idrar yolları, merkezi sinir sistemi, karın içi ve pelvik enfeksiyonlara neden olmaktadırlar. E. faecalis ve E. faecium kaynaklı enfeksiyonlar, Dünya genelinde en sık karşılaşılan klinik enfeksiyonlar arasında 1

13 yer almaktadır. E. durans, E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. raffinosus kaynaklı enfeksiyonların ise görülme sıklığının daha düşük olduğu belirtilmektedir. Son yıllarda gıda kaynaklı enterokoklarda gözlenen artan antibiyotik direnci ve yaygın virülens faktör içermeleri tüketici sağlığı açısından endişe uyandırıcıdır. Bu nedenle starter ya da probiyotik olarak kullanılacak enterokok suşlarında klinik açıdan önem arz eden antibiyotiklere direnç ve virülens faktörleri determine eden genlerin bulunmaması gerekmekte ve bu özellikler açısından suşların kesin tanısının yapılması önerilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında geleneksel peynir örneklerinden izole edilen yüksek seviyede aminoglikozid dirençli (YSAD) 25 E. faecalis, 15 E. faecium, 12 E. durans ve 2 E. gallinarum olmak üzere toplam 54 Enterococcus suşunda virülens faktörlerin fenotipik ve genotipik yöntemler ile araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda YSAD suşlarında jelatinaz ve hemolitik aktivite fenotipik, virülens faktörleri determine eden genlerin varlığı ise genotipik olarak araştırılmıştır. YSAD Enterococcus suşlarında virülens faktörlerin genetik determinantlarının araştırıldığı denemelerde jelatinaz (gele), hücre duvarı adhezinleri (efaafm, efaafs), ekstraselüler yüzey proteini (espfm, espfs), seks feromonları (cdp, cob, ccf, cad), kollojen bağlayan protein (ace, acm), agregasyon maddesi (agg), sitolizin (cylm, cylb, cyla) ve hiyaluronidaz (hyl) genlerinin varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile belirlenmiştir. 2

14 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Enterokokların Genel Özellikleri Laktik asit bakterileri (LAB) olarak bilinen mikroorganizma grubuna dahil olan enterokoklar katalaz negatif (bazı türlerde pseudo katalaz aktivite gözlenebilir) fakültatif anaerob, Gram pozitif koklardır. Sıvı besi ortamlarında kültüre edilen enterokokların mikroskobik görüntüleri tekli, ikili ya da kısa zincirler halindedir. Mikroskobik olarak streptokok türlerinden ayırt edilmeleri zordur. Bazen Gram pozitif kokobasil şeklinde görülebilirler. Enterokoklar α veya β hemolitik aktivite gösterebilirler. Düşük su aktivitesi, yüksek ısı gibi çevresel koşullara, bazı antiseptiklere dirençli olmaları ve cansız yüzeylerde uzun süre yaşayabilmeleri nedeniyle, hastane enfeksiyonları açısından büyük önem taşımaktadırlar (Ruoff vd., 1990; Çelik ve Alhan 2008). *1984 yılı öncesinde, Streptococcus cinsi içinde yer alan ve Lancefield serolojik D grubu kokların bazılarından oluşan bu cins, fekal streptokok grubunu ifade etmekteydi. Streptococus faecalis ve Str. faecium türleri ile birlikte Str. faecalis subsp. liquefaciens, Str. faecalis subsp. zymogenes ve Str. faecium subsp. casseliflavus alt türlerini de içermekte olan bu grup, 1984 yılında Schleifer ve Kilpper-Bälz (1984) tarafından Enterococcus cinsi olarak ayrılmıştır. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology adlı kitapta Str. faecalis, Str. faecium, Str. avium ve Str. gallinarum türlerine yer verilmiş ve enterokokların cins isminin Enterococcus olarak önerildiğine değinilmiştir. 1984' den sonra yapılan çalışmalarla Str. faecalis ve Str. faecium türlerinin isimleri E. faecalis ve E. faecium şeklinde değiştirilerek Enterococcus cinsi adı altında toplanmışlardır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar ile Enterococccus cinsi üyesi tür ve alt tür sayının 57 olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 1.1). Enterokoklar hemen her zaman, her yerde bulunabilen mikroorganizmalardır. Süt ürünlerinde ve diğer gıdalarda da yüksek oranlarda bulunabilen bu bakterilerin, bakteriyosin üretimi, probiyotik karakteri, süt endüstrisinde kullanılabilirlikleri gibi önemli biyoteknolojik özellikleri olduğu halde, onların 3

15 gıda kaynaklı patojenler olarak görülüp görülmeyeceği üzerine fikir birliği bulunmamaktadır (Schleifer ve Kilpper-Bälz, 1984). Çizelge 1.1 Enterococcus cinsi üyesi türler ve alt türler No Tür Adı Kaynak 1 Enterococcus avium Collins vd., Enterococcus casseliflavus Collins vd., Enterococcus durans Collins vd., Enterococcus malodoratus Collins vd., Enterococcus gallinarum Collins vd., Enterococcus faecalis Schleifer vd., Enterococcus faecium Schleifer vd., Enterococcus hirae Collins vd., Enterococcus mundtii Collins vd., Enterococcus pseudoavium Collins vd., Enterococcus raffinosus Collins vd., Enterococcus solitarius Collins vd., Enterococcus cecorum Williams vd., Enterococcus dispar Collins vd., Enterococcus seriolicida Kusuda vd., Enterococcus sulfureus Collins vd., Enterococcus saccharolyticus Collins vd., Enterococcus flavescens Pompei vd., Enterococcus columbae Devriese vd., Enterococcus asini De Vaux vd., Enterococcus villorum Vancanneyt vd., Enterococcus haemoperoxidus Švec vd., Enterococcus moraviensis Švec vd., Enterococcus ratti Teixeira vd., Enterococcus porcinus Teixeira vd., Enterococcus gilvus Tyrrell vd., Enterococcus pallens Tyrrell vd., Enterococcus canis De Graef vd., Enterococcus phoeniculicola Law-Brown vd., Enterococcus hermanniensis Koort vd., Enterococcus saccharominimus Vancanneyt vd., Enterococcus italicus Fortina vd., Enterococcus aquimarinus Švec vd., 2005 (a) 34 Enterococcus devriesei Švec vd., 2005 (b) 35 Enterococcus canintestini Naser vd., Enterococcus caccae Carvalho vd., Enterococcus silesiacus Švec vd., Enterococcus termitis Švec vd., Enterococcus camelliae Sukontasing vd., Enterococcus thailandicus Tanasupawat vd., Enterococcus viikkiensis Rahkila vd.,

16 Çizelge 1.1 Enterococcus cinsi üyesi türler türler ve alt türler (Devam) No Tür Adı Kaynak 42 Enterococcus lactis Morandi vd., Enterococcus ureasiticus Sistek vd., Enterococcus rivorum Niemi vd., Enterococcus plantarum Švec vd., Enterococcus quebecensis Sistek vd., Enterococcus alcedinis Frolkov vd., Enterococcus ureilyticus Sedláček vd., Enterococcus lemanii Cotta vd., Enterococcus diestrammenae Kim vd., Enterococcus eurekensis Cotta vd., Enterococcus rotai Sedláček vd., E. saccharolyticus subsp. saccharolyticus Chen vd., E. saccharolyticus subsp. taiwanensis Chen vd., Enterococcus olivae Lucena-Padrós vd., Enterococcus xiangfangensis Li vd., Enterococcus bulliens Kadri vd., 2016 E. faecalis insan ve hayvan dışkısında bulunan fekal orijinli bir türdür. Ancak bu bakterilere insan ve memeli hayvanların dışkısı dışında toprak, su, bitki ve böcek gibi birçok çevrede de rastlanmaktadır. Bu nedenle gıdalarda enterokokların bulunması, gıdanın dışkı ile doğrudan kontamine olduğu ve Salmonella ve Listeria gibi diğer enterik patojenlerin de bu gıda maddelerinde bulunabileceği anlamına gelmez. E. faecalis 'in bazı türlerinin bitkilerde de yaygın olarak bulunması bu bakterilerin sanitasyon indikatörü olarak değerini büyük ölçüde azaltmaktadır. Ancak E. faecalis in fekal veya fekal olmayan türlerini biyokimyasal testlerle (Litmus milk besiyerindeki reaksiyonları melizitoz ve melibiyoz broth da oluşturduğu fermentasyon tipleri) ayırmanın mümkün olduğu bilinmektedir. E. faecium a yaban domuzlarında daha fazla rastlanır. E. gallinarum ise tavukların bağırsak florasında bulunur. Ancak diğer türlerin doğadaki dağılımı hakkında pek fazla bilgi yoktur. E. faecalis, E. faecium ve E. durans hariç diğer türlerin sanitasyon açısından fekal indikatör olarak önemi çok azdır (Clewell vd., 2002). Gram negatif bakterilere kıyasla, beslenme gereksinimleri daha seçicidir. Geliştirildikleri besiyerinde daha fazla üreme faktörüne gereksinim duymaları sebebiyle de diğer pek çok Gram pozitif bakteriden ayrılırlar. Örneğin, 5

17 gelişebilmeleri için B vitaminleri ve bazı temel aminoasitler açısından pek çok Gram pozitif bakteriden çok daha fazla oranda besin maddesine ihtiyaç duyarlar. Belirli türlerin üreme faktörü olarak bazı spesifik aminoasitlere gereksinim duymalarından dolayı bu spesifik aminoasitlerin nicel olarak belirlenmesinde test organizması olarak kullanılmaktadırlar (Clewell vd., 2002). Geniş bir ph aralığında ve pek çok patojen bakterinin gelişemediği alkali ph da (ph 9.6) gelişebilen enterokoklar düşük O/R potansiyelindeki (Eh) ortamlarda da çok iyi gelişirler. Sodyum azid, safra tuzu ve sodyum klorüre dayanıklıdırlar. Enterococcus cinsine ait tüm türler % 40 safra tuzu ve % 3 NaCl içeren besiyerlerinde gelişebilirken, E. faecalis ve E. faecium türleri tuza daha dirençli olup % 6.5 tuz konsantrasyonunda gelişebilirler. Enterokoklar termodurik bakterilerdir, süte uygulanan pastörizasyon işlemi ile elimine edilemezler. Donma ve kurutmaya karşı Escherichia coli ye kıyasla daha dayanıklıdırlar. Bütün türleri eskülini hidroliz eder ve 1,3,5-trimetil-tetrazolyum klorürü (TCC) indirgerler. E. casseliflavus ve E. mundtii türleri sarı pigment oluştururken, E. avium ve E. malodoratus türleri de H 2 S oluştururlar. E. casseliflavus ve E. gallinarum türleri ise menakuinon üretirler. Diğer yandan enterokoklar birçok karbonhidratı fermentatif olarak kullanırlar. E. faecalis ve E. faecium karbonhidratlardan fermentasyon yoluyla başlıca ürün olarak laktik asit ürettiklerinden, çeşitli peynirlerin üretiminde starter kültür olarak kullanılabilirler. Örneğin Cheddar peyniri, yumuşak İtalyan peyniri ve bazı İsviçre peynirlerinin yapımında asit, tat ve aroma oluşumu için kullanılmaktadır. Enterokoklardan özellikle süt endüstrisinde laktik starter olarak yararlanıldığından bu dalda sanitasyon indikatörü olarak bir önemleri yoktur. Ancak E. faecalis subsp. liquefaciens in patojen özellik gösterebileceği bildirilmektedir. E. faecalis subsp. liquefaciens, E. faecalis gibi hemolitik değildir. En önemli özelliği jelatini sıvılaştırmasıdır. Laktik asit üretme ve sütü pıhtılaştırma yeteneğinde olan bu bakteri sütü pıhtılaştırdıktan sonra peptonize eder. E. faecalis subsp. zymogenes de patojen özellik gösterir. Farklı olarak jelatini sıvılaştırabilir veya sıvılaştıramaz ve hemolize neden olur (Boussouar vd., 2017). 6

18 Enterokoklar insan dışkısında genellikle E. coli ' den daha az sayıda bulunur ve suda iyi üreyemezler. Diğer taraftan suda koliformlardan daha uzun süre canlılıklarını koruyabilmektedirler. Bu özellikler, enterokokların sular için fekal kontaminasyon indikatörü olarak değerini belirli ölçüde de olsa artırmıştır. Ancak daha doğru sonuç elde edebilmek için klasik enterokokların koliform bakteri veya toplam bakteri sayısı ile birlikte verilmesinin uygun olacağı tartışılmaktadır. Klasik enterokoklar gıda endüstrisinde kullanılan ısıtma, kurutma, dondurma gibi işlemler ile temizlik ve dezenfeksiyon maddelerine karşı nispeten dirençlidirler. Bu nedenle işlem görmüş gıdalar özellikle de dondurulmuş gıdalar için koliform bakterilere kıyasla daha iyi bir sanitasyon ve/veya fekal kontaminasyon indikatörü olma özelliğine sahiptirler. Bir gıdada bulunan enterokok sayısının yorumlanması o gıdaya uygulanan işlemle yakından ilişkilidir. Düşük enterokok sayım sonuçları işlem görmemiş gıdalar için önemsiz kabul edilirken dondurulmuş, pişirilmiş veya işlem görmüş diğer bazı gıdalarda önemli olabilir. Süt işletmelerinde sıklıkla rastlanıldığı gibi yetersiz sanitasyon uygulamaları nedeni ile enterokoklar, işletmelerde alet ve ekipmanların yüzeylerinde yerleşik flora haline gelerek buralardan sürekli olarak gıdalara bulaşabilirler. Ancak işlenmiş ürünlerdeki enterokok varlığı, bu üründe her zaman için enterik patojen varlığını göstermeyebilir. Çünkü enterokoklar, enterik patojenlere kıyasla uygulanan işlemlere karşı daha dirençlidirler (Boussouar vd., 2017) Ekoloji ve Epidemiyoloji Enterokok türlerinin kökenleri; çevreye, hayvana ve insan kaynaklarına göre değişim göstermektedir. Enterokoklar hem insanların hem de hayvanların mikroflorasının önemli bir parçasıdırlar. Dolayısıyla bu kaynaklardaki dağılımları da büyük bir benzerlik göstermektedir. E. faecium ve E. faecalis insan gastrointestinal sistemindeki en yaygın bakteri türleridir. Bunun yanında E. faecium hayvansal kaynaklıyken, E. mundtii ve E. casseliflavus bitkisel kaynaklıdır (Klein, 2003). İnsan dışkısında yer alan E. faecalis türü bakterilerin sayısı gram başına civarında değişim gösterirken E. faecium türü bakterilerin sayısı civarındadır. E. faecium ve E. faecalis'in izolasyonu 7

19 hayvanlarda, insan dışkılarına kıyasla daha az yaygındır (Franz vd., 1999). Enterokok ekolojisi ve epidemiyolojisi üzerine yapılan çalışmalarda, E. faecalis ve E. faecium' un peynir, balık, sosis, kıyılmış sığır eti ve domuz etinden düzenli olarak izole edildiği bildirilmiştir (Klein, 2003; Foulquie Moreno vd., 2006). Sosis ve peynir gibi hayvansal kaynaklı gıdalardan, ısıtma sürecinde bile hayatta kalmayı başardıklarından dolayı, enterokok türlerinin bulaşma potansiyeli vardır. Birleşik Krallık ta yapılan bir çalışmada, kentsel kanalizasyonlardan alınan numunelerde ve domuz gübresi kullanılan tarım alanlarından elde edilen mahsul örneklerinde enterokok bulunma ihtimali % 100 olarak bulunmuştur. Sonradan, hayvansal gübrelerin uygulanmadığı mahsüllerde bu oran % 33 oranına düşürülmüştür. E. faecalis dominant tür olmak üzere enterokokların klinik izolatları, çevreden ve diğer insan kaynaklarından elde edilenlere kıyasla daha düşük bir çeşitlilik göstermektedir (Kuhn vd., 2003). Bu az çeşitliliğin nedeni, bu türle ilişkisi olan virülens faktörlere bağlı olabilir. Danimarka da yapılan bir çalışmada, hastaneye kaldırılan hastalarda E. faecalis görülme oranı % 57 iken sağlıklı bireylerde bu oranın sadece % arasında seyretmesine dayanarak enterokok türlerinin fırsatçı patojenler olduğu gerçeğinin altı çizilmiştir (Mutnick vd., 2003). Hastaneye yatırılan hastaların yüksek enterokok oranına maruz kalmalarının sebebi sadece virülens özelikle değil; aynı zamanda hastanenin kendisinin de bir rezervuar görevi görmesidir. Bu durum, Birleşik Krallık' ta Sağlık Bakanlığı için hazırlanan bir raporda enterokokların hasta çevresinde birkaç gün hayatta kalabileceği ve bulaşabileceğinin altı özellikle çizilerek açıklanmıştır (Brown vd., 2006) Enterokokların Fonksiyonel Özellikleri Enterokoklar, süt ürünlerinin üretiminde starter olarak kullanılabilme ve probiyotik karakterleri gibi önemli biyoteknolojik özelliklere sahiptirler. E. faecalis SF68 probiyotik olarak kullanılan ve üzerinde en fazla çalışılan suş olup, çocuklarda görülen diyarenin önlenmesinde etkili olduğu öne sürülmüştür (Dağdemir vd., 2006). Aynı zamanda E. faecalis SF68'in yetişkinlerde diyare septomlarının süresini kısalttığı ve dışkılama zamanını düzenlediği belirlenmiştir (Buydens vd., 1996). E. faecium ve S. thermophilus kullanılarak 8

20 üretilen probiyotik ürünün, kolesterol seviyesini kısa dönemde azalttığı, ancak uzun dönemde LDL kolesterol seviyesinin azalmasında etkili olmadığı tespit edilmiştir (Dağdemir vd., 2006). Diğer bir çalışmada Lb. jugurti ile E. faecium CRL 183 birlikte kullanılmasıyla üretilen soya sütünün in vitro da kolesterol miktarını % 43 oranında azalttığı belirlenmiştir (Rossi vd., 1999). Gardiner vd. (1999), Çedar peyniri üretiminde probiyotik olarak E. faecium PR88 suşunu kullandıkları çalışmada, kısa bağırsak sendromunun önemli ölçüde azaldığını ve peynirin duyusal özelliklerine de katkıda bulunduğunu belirtmişlerdir. Muguerza vd. (2006), çiğ sütten izole etikleri E. faecelis suşlarını kullanarak üretmiş oldukları fermente sütlerde, bu suşların potansiyel ACE inhibitorü aktivitesine sahip peptit oluşumunu sağladığını ve dolayısıyla antihipertansif bir etki gösterdiklerini bildirmişlerdir. Özellikle hastalık oluşturan etmenlerin kodlandığı genler ile antibiyotiklere karşı direnç oluşturan genlerin gastrointestinal sistemdeki diğer bakterilere transfer olma olasılığı endişelerin artmasına neden olmuştur (Franz vd., 1999) Gıdalarda Enterokoklar Entertokokların varlığı; Comté, Mozzarella veya Akdeniz ülkelerindeki çeşitli geleneksel peynirlerde veya sebze ve sosis gibi fermente ürünler dahil olmak üzere birçok gıdada tespit edilebilmektedir. Bu varlığın her zaman dışkı kaynaklı kirlilikten kaynaklanmadığı kanıtlanmıştır (Mundt, 1986). İlerlemiş teknolojik işlemlerle birlikte enterokokların pastörizasyon sıcaklıklarına dirençleri, farklı substratlara ve düşük/yüksek sıcaklık, düşük ph ya da aşırı tuzluluk oranı gibi kültür koşullarına uyum sağlama özellikleri onların çiğ yiyecek temelli süt, et gibi gıdalardaki varlıklarını kanıtlamaktadır. Bu gıdaların duyusal özelliklerine olan katkıları ve bakteriyosin üretme yetenekleri, enterokokların biyoteknoloji uygulamaları için önemli özelliklerdendir (López- Diaz vd., 1995; Akpınar Kankaya vd., 2017). 9

21 2.5. Enterokokların Patojenitesi Enterokokların bakteriyosin üretimi, probiyotik karakteri ve süt ürünlerinin üretiminde kulanılabilirligi gibi önemli biyoteknolojik özellikleri olmasına ragmen, enterokoklar kromozomları üzerinde kodlanan genler vasıtasıyla birçok antibiyotige karşı direnç gösterirler. Antibiyotiklere karşı gösterdikleri direnç enterokokların patojenitesini açıklamak için tek basına yeterli değildir. Genel olarak enterokokların patojenitesi suşa spesifik olup, izolasyon kaynağına da bağlıdır. Yapılan araştırmalar E. faecalis' in E. faecium' dan, klinik olarak izole edilen susların ise gıdalardan izole edilen suşlardan daha fazla virülens faktörler içerdiğini göstermiştir (Eaton ve Gasson, 2002). 2.6 Virülens Faktörler Bakteriyel patojenlerin virülens genleri kromozom ya da plazmidler ve bakteriyofajlar gibi ekstrakromozomal elementler üzerinde kodlanabilir. Virülens faktörler çoğunlukla multifaktöriyeldir ve patojenite adaları olarak adlandırılan ve genom üzerinde farklı bölgelerde kümelenmiş olan virülens genler ile düzenlenmektedir. Patojenite adalarının virülens genlerin yatay transferinden sorumlu olmaları nedeniyle patojen bakterilerin evriminde plazmidler, bakteriyofajlar ve transpozonlar kadar öneme sahiptir (Hacker ve Kaper, 2000; Tendolkar vd., 2003). Enterococcus suşlarında patojenite adaları ilk kez 1980 yılında nozokomiyal salgına neden olan E. faecalis te tanımlanmıştır. % G+C oranı % 32.2 ve büyüklüğü 150 kb civarında olan bu patojenite adası virülans genlerinin yanı sıra transpozonlar, transkripsiyonel regülatör genler ve proteinleri kodlayan genlerin yer aldığı 129 ORF (Open Reading Frame: Açık Okuma Kalıbı) bölgesine de sahiptir. Bu patojenite adasının tanımlanmasından iki yıl sonra, E. faecium suşlarında da E. faecalis ten farklılık gösteren başka bir patojenite adası daha tanımlanmıştır (Şentürk vd., 2017). 10

22 En yüksek virülens faktör içeren enterokoklar klinik enterokok izolatlardan sonra gıda kaynaklı enterokok izolatlardır (Busani vd., 2004; Ben Omar vd., 2004). Enterokok türlerinin virülansını normal yaşam alanı olan gastrointestinal sistemi kolonileştirme kabiliyeti, trombospondin, laktoferrin ve vitronektin de dahil olmak üzere bir dizi hücre dışı matris proteinine yapışma kabiliyeti ve idrar yolu epiteline, ağız boşluğu epitelyumuna ve insan embriyosunun böbrek hücrelerine yapışma kabiliyeti olmak üzere bir çok faktör belirler (Boussouar vd, 2017). Jelatinaz (gele), hücre duvarı adhezinleri (efaafm, efaafs), ekstraselüler yüzey protein (espfm, espfs), seks feromonları (cpd, cob, ccf, cad), kollogen bağlayan protein (ace, acm), agregasyon proteini (agg), sitolizin (cylm, cylb, cyla) ve hiyaluronidaz (hyl) enterokok türlerinde karşılaşılan başlıca virülens faktörlerdir (Akpınar Kanyaka vd., 2017; Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017) Jelatinaz Jelatinaz enziminin varlığı enterokoklarda ilk kez 1964 de E. faecalis suşlarında gösterilmiştir (Upadhyaya vd., 2009). Jelatin ekstraselüler çinko bağımlı moleküler ağırlığı yaklaşık 30 kda olan metaloendopeptidazdır. Bu enzim jelatin, elastin, kollajen, fibrinojen, kazein, hemoglobin, insülin gibi bazı biyoaktif peptitleri hidrolize edebilme yeteneğindedir. Jelatinaz kromozom üzerinde yer alan gele geni tarafından kodlanmaktadır. gele geni fsra, fsrb, fsrc genlerini içeren fsr lokusu tarafından düzenlenen FsrB transmembran proteini tarafından kontrol edilmektedir. fsrabc gen kümesi düzenleyici protein FsrA, feromon taşıyıcı GBAP (FsrB) ve histidin kinaz FsrC yi kodlamaktadır. fsr lokusunda meydana gelen delesyonlar gele geni içeren ancak jelatinaz üretemeyen mutantların oluşmasına neden olmaktadır. fsra, fsrb veya fsrc geninde meydana gelen mutasyonlar biyofilm sentezinde % azalma göstermektedir (Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). 11

23 Hücre duvarı adhezinleri Hücre duvarı adhezin EfaA, serum tarafından indüklenebilen bir yüzey proteinidir ve oral streptokokal adhezinlerle homoloji göstermektedir. Patojenitedeki rolü tam olarak açıklanmamakla beraber, enterokokal hücrelerin biyotik ve abiyotik yüzeylere tutunmada ve biyofilm oluşumunda gerekli olduğu tahmin edilmektedir. EfaA nın genetik determinantlarının E. faecalis ve E. faecium da benzer sıklıkta bulundukları saptanmıştır (Eaton ve Gasson, 2001) Ekstraselüler yüzey proteini Enterokokal yüzey proteini (Esp), ilk olarak gentamisin dirençli bir E. faecalis izolatında tanımlanmıştır. Enterokokal yüzey proteini yüksek moleküler ağırlığına sahip olup, 153 kb büyüklüğündeki bir patojenite adasında yer alan esp geninde kodlanır ve konjugasyonla enterokok izolatları arasında aktarılabilir (Akgül, 2014). Hücre dışı yüzey proteinin görevi abiyotik yüzeylere tutunma ve biyofilm üretimi olmakla beraber, esp konjugasyon sıklığındaki artıştan da sorumludur (Şentürk, 2017) Seks feromonları Seks feromonları, E. faecalis de sinyal veren peptitler gibi fonksiyonu olan, kromozomal genler tarafından kodlanan (cpd, cob, ccf, cad), küçük, hidrofobik peptitler olup, 7-8 amino asit uzunluğundadır (Inoğlu, 2012; Yüksel vd., 2012; Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). Seks feromonları E. faecalis te sinyal peptitleri olarak görev alırlar ve plazmid DNA nın konjugasyonunun kontrol ederler. seks feromon sistemleri tarafından E. faecalis te belirli konjugatif plazmidlerin transfer sıklığı birkaç kat arttırılır. Alıcı suş, içermediği plazmide uygun seks feromonunu ortama salgıladığında, verici suş, alıcı ve verici arasındaki sıkı teması sağlayan agregasyon faktörü üretir. Enterokoklarda seks feromonlarının üretimi virülens genlerin ve antibiyotik direncinin feromon yanıt veren konjugatif plazmidler aracılığı ile diğer enterokok suşlarına yayılmasını yaygınlaştırır (Inoğlu, 2012; Yüksel, 2012). 12

24 Kollogen bağlayan protein Dokulardaki kolonizasyon MSCRAMM (matriks moleküllerini tanıyan mikrobiyal yüzey komponentleri) olarak adlandırılan ekstraselüler matriksteki spesifik proteinlerin etkileşimleri ile gerçekleşir. E. faecalis V583 ve E. faecium TX0016 suşlarının genomlarında sırasıyla 17 ve 15 MSCRAMM proteinlerinin varlığı tanımlanmıştır. Yedi enterokokal MSCRAMM proteini detaylı olarak karakterize edilmiştir. Bunlar, ace (E. faecalis kollojen bağlayıcı adhezin), Fss1, Fss2 ve Fss3 (E. faecalis yüzey proteinleri), Acm (E. faecium kollojen bağlayıcı adhezin), Scm (E. faecium ikinci kollojen bağlayıcı adhesin) ve EcbA (E. faecium kollojen bağlayıcı protein A) dır (Rich vd., 1999; Sava vd., 2010). Ace, kommensal ve patojenik E. faecalis izolatlarında yaygın olarak bulunmakta ve insanlarda enfeksiyon esnasında ifade edilmektedir. Enfeksiyona uğrayan kişi tarafından Ace lere karşı antibadi üretiminin Ace lerin hücre dışı matriks proteinlere tutunmasını engellediği, in vitro denemeler ile ispat edilmiştir. Anti- Ace antikorları ile yapılan incelemede endokardit hasta serum örneklerinin % 90 ında Ace üretiminin gerçekleştiği belirlenmiştir. ace geninin in vivo ifadesini düzenleyebilen konak faktörleri henüz tanımlanmamıştır (Tendolkar vd., 2003; Sava vd., 2010). E. faecalis de bulunan Ace ye benzer yapı gösteren bir protein olan Acm E. faecium da tanımlanmıştır. Acm proteini ace geni homologu olan acm geni tarafından kodlanmaktadır. Acm proteini de Ace gibi kollajen bağlamadan sorumludur. Ace ile Acm proteini kısmen benzer yapı içermektedir. Ace, Acm proteininin yalnızca A domaini ile benzerlik gösterirken, S. aureus Cna proteininin hem A hem de B domainleri ile yüksek düzeyde benzerdir. Fonksiyonel olarak, Acm nin E. faecium un kollojene bağlanmasında birincil derecede sorumlu adhezin olduğu kanıtlanmıştır. Acm ve Cna nin her ikisi de kollojene bağlanırken, Ace aynı zamanda lamine de bağlanır. Acm ve Cna kollojen I e kollojen IV den daha fazla ilgi gösterirken, Ace kollojen I ve IV in her ikisine de özdeş ilgi gösterir (Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). 13

25 Agregasyon proteini Enterokoklarda önemli virülens faktörlerden biri olan agregasyon maddesi, enterokoklarda tanımlanan ilk yüzey proteinidir. Saç tokası benzeri yapıda 137 kda moleküler büyüklükte protein yapısındaki agregasyon maddesi bakteriyel konjugasyon sırasında kümelenmeyi sağlayarak enterokok alıcı ve verici hücreleri arasında etkin temasın oluşmasına yardımcı olur. Bu sayede plazmit transferini kolaylaştırır. Plazmit transferinin kolaylaştırılması, antibiyotik direncine yol açan genetik determinantların türler arasında transfer olabilmesine imkan tanımaktadır. Günümüzde enterokoklarda 20 feromon bağımlı plazmit tanımlanmıştır. Agregasyon maddesi sayesinde enterokoklar kalp kapakçıkları ile böbrek epitel hücrelerine tutunabilir ve böylece üriner sistem ile endokardit enfeksiyonlarına sebep olabilir (Yoğurtçu, 2011; Yıldız, 2012; Yüksel, 2012; Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017) Sitolizin (Hemolizin) Sitolizin en çok karakterize edilen enterokokal virülens faktördür. Bakteriyosin tipi ekzotoksin olan sitolizin Gram negatif bakterilere karşı bakterisidal etki gösterirken, eritrosit, lökosit ve makrofajlara karşı toksik özellik göstermektedir (Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). Sitolizin üretimi cylr1, cylr2, cylll, cylls, cylm, cylb, cyla, ve cyli genlerini içeren operon tarafından gerçekleştirilmektedir. Sitolizin gen gruplarının sistronları iki ayrı transkript içinde kodlanmaktadır (Gilmore vd., 2002). Sitolizin kodlayan gen bölgesi plazmit üzerinde ya da bakteriyel kromozom üzerinde bulunabilmektedir (Şentürk, 2017). Sitolizin kodlayan genlerin varlığı hem enfeksiyon izolatlarında hem de kommensal mikrobiyotada gösterilmiştir. Sitolizin kodlayan genlerin varlığı E. faecalis, E. faecium, E. avium, E. casselifalvus, E. cecorum, E. durans, E. gallinarum, E. malodoratus ve E. raffinosus türlerinde gösterilmiştir (Chajęcka- Wierzchowska vd., 2017). 14

26 Hiyaluronidaz Hiyaluronidaz yaklaşık 45 kda moleküler büyüklüğünde hyl geni tarafından kodlanan bir proteindir (Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). Hiyaluronidaz, hiyaluronik asiti tahrip ederek doku hasarına yol açmaktadır. Hiyaluronidaz enzimi, doğada sülük ve kancalı kurtlar gibi parazitler, zehirli yılanlar ve spermatozoa gibi memeli hücreleri tarafından üretilir. Bu enzim streptokoklar ve diğer bakteriler tarafından da yüksek miktarda üretilmektedir (Hynes ve Walton, 2000). Bu enzim bağ dokuların mukopolisakkarit parçasını ve kıkırdağı tahrip ederek bakterinin yayılmasını sağlar. hyl geni genellikle klinik E. faecium izolatlarında bulunurken, E. faecalis izolatlarında son derece nadir görülür (Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). hyl geni aynı zamanda E. cassliflavus, E. durans ve E. mundtii (Trivedi vd., 2011) ve E. gallinarum (Akpınar Kankaya, 2017) gibi gıda izolatlarında da tespit edilmiştir. 15

27 3. METERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Bakteriler ve besiyeri Tez çalışması kapsamında Süleyman Demirel Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Bakteriyel Genetik Laboratuvarından temin edilen peynir örneklerinden izole edilmiş ve cinse/türe özgül primerler kullanılarak moleküler düzeyde tanısı yapılmış 18 E. feacalis, 15 E. feacium, 12 E. durans, 2 E. gallinarum ve 7 Enterococcus spp. olmak üzere toplam 54 yüksek seviyede aminoglikozid dirençli (YSAD) Enterococcus izolatı ve standart suş olarak E. faecalis ATCC kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan YSAD Enterococcus izolatları ve aminoglikozid direnç profilleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan YSAD Enterococcus izolatları ve aminoglikozid direnç profilleri No Bakteri Kodu Aminoglikozid 1 E. faecium RS12.1 Streptomisin 2 E. faecalis RS21.1 Streptomisin 3 E. faecalis RS21.2 Streptomisin 4 E. spp. RS21.3 Streptomisin 5 E. faecalis RS21.4 Streptomisin 6 E. faecalis RS25.1 Streptomisin 7 E. faecalis RS25.2 Streptomisin 8 E. spp. RS25.3 Streptomisin 9 E. faecalis RS25.4 Streptomisin 10 E. faecalis RS25.5 Streptomisin 11 E. faecalis RS27.1 Streptomisin 12 E. faecalis RS27.2 Streptomisin 13 E. faecalis RS27.3 Streptomisin 14 E. faecalis RS27.4 Streptomisin 15 E. faecalis RS27.5 Streptomisin 16 E. faecalis RS27.6 Streptomisin 17 E. spp. RS29.1 Streptomisin 18 E. faecium RS32.1 Streptomisin 19 E. faecium RS32.2 Streptomisin 20 E. faecalis RS32.3 Streptomisin 21 E. durans RS32.4 Streptomisin 22 E. faecalis RS32.5 Streptomisin 23 E. faecalis RS32.6 Streptomisin 16

28 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan YSAD Enterococcus izolatları ve aminoglikozid direnç profilleri (Devam) No Bakteri Kodu Aminoglikozid 24 E. faecium RS36.1 Streptomisin 25 E. faecium RS36.2 Streptomisin 26 E. durans RS36.3 Streptomisin 27 E. faecalis RS36.4 Streptomisin 28 E. durans RS42.1 Streptomisin 29 E. durans RS42.2 Streptomisin 30 E. durans RS42.3 Streptomisin 31 E. durans RS46.1 Streptomisin 32 E. durans RS46.2 Streptomisin 33 E. durans RS46.3 Streptomisin 34 E. durans RS50.1 Streptomisin 35 E. faecalis RS62.1 Streptomisin 36 E. faecium RS74.1 Streptomisin 37 E. faecium RS74.2 Streptomisin 38 E. durans RS85.1 Streptomisin 39 E. faecium RS88.1 Streptomisin 40 E. durans RG22.1 Gentamisin 41 E. durans RG22.2 Gentamisin 42 E. faecium RG22.3 Gentamisin 43 E. spp. RG22.4 Gentamisin 44 E. spp. RG26.1 Gentamisin 45 E. spp. RG26.2 Gentamisin 46 E. spp. RG26.3 Gentamisin 47 E. faecium RG36.1 Gentamisin 48 E. gallinarum RG46.1 Gentamisin 49 E. gallinarum RG46.2 Gentamisin 50 E. faecium RG52.1 Gentamisin 51 E. faecium RG52.2 Gentamisin 52 E. faecium RG53.1 Gentamisin 53 E. faecium RG53.2 Gentamisin 54 E. faecium RG73.1 Gentamisin Stok kültürler, de Man Rogosa Sharpe (MRS, LAB M Ltd., Lancashire, UK) besiyeri ortamlarına steril gliserol (% 15, v/v) ilave edilerek -20 C de muhafaza edilmiştir. Çalışma süresince kullanılan kültürler, MRS broth besiyeri ortamında 37 C de 18 saat süreyle ardışık iki pasaj aktifleştirme işlemi sonrası denemeye alınmıştır. 17

29 3.2. Yöntem Genomik DNA izolasyonu Enterokok suşlarından genomik DNA izolasyonu için, suşlar MRS broth besiyerlerinde 37 C de 18 saat süreyle ardışık iki pasaj yapılarak geliştirilmiştir. Gelişen kültürlerden 1 ml alınarak steril Eppendorf tüplerine aktarılmıştır. Tüpler devirde 5 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) işlemine tabi tutulmuş ve üst fazlar dökülmüştür. Hücre çökeltileri üzerine 0.5 ml liziz çözeltisi ilave edilmiş ve hücre çökeltileri çözülmüştür. Daha sonra, tüpler su banyosu (Nüve NB9, Türkiye) içerisinde 37 C de 45 dakika inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda tüplere 30 µl % 10 luk (w/v) sodyum dodesil sülfat (SDS, Serva, Heidelberg, Almanya) çözeltisi ilave edilmiş ve 80 C ye ayarlı su banyosunda (Daihan WB-22, Kore) 10 dakika tutulmuştur. Süre sonunda lize olan hücre süspansiyonları üzerine 1:30 (v/v) oranında hazırlanan fenol-kloroform karışımından 0.7 ml ilave edilmiş ve tüpler devirde 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj işlemini takiben üst faz mikropipet yardımıyla alınarak yeni steril Eppendorf tüplerine aktarılmıştır. Bu tüplerin üzerine 0.7 ml 2-propanol (Merck, Darmstadt, Almanya) ilave edildikten sonra tüpler bir kez daha devirde 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj işlemi sonunda izole edilen genomik DNA çökeltileri 50 µl Tris-EDTA tamponu (ph 8.0) içerisinde çözülmüş ve kullanılıncaya kadar -20 C de muhafaza edilmiştir (Cancilla vd., 1992). Liziz Çözeltisi NaCl 250 mm EDTA 10 mm Tris HCl 10 mm Lizozim 100 mg Destile su 50 ml ph 8.0±

30 SDS (% 10) SDS 10 g Destile su 100 g Tris-EDTA Tris g EDTA g Destile su 100 ml ph 8.0± Agaroz jel elektroforezi YSAD enterokok suşlarından izole edilen genomik DNA örneklerinin varlığı agaroz jel elektroforez yöntemi ile tespit edilmiştir. DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 (w/w) agaroz (AppliChem GmbH., Darmstadt, Almanya) oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır. Elektroforez işleminde Thermo OWL EASYCAST B2 (ABD) yatay jel sistemi kullanılmıştır. Agaroz jel 150 ml trisasetat elektroforez tamponu içerisinde hazırlanmış ve mikrodalga fırın (Arçelik MD 565 S, Türkiye) yardımıyla çözülmüştür. Hazırlanan ortamın 45 C ye kadar oda sıcaklığında soğuması beklenmiş ve elektroforez tankına dökülmüştür. Daha sonra, jelin üst ve orta kısmına iki adet jel tarağı yerleştirilmiş ve jelin polimerizasyonu için 30 dakika beklenmiştir. Jelin polimerizasyonunu takiben elektroforez tankına jelin üzerini kapatacak biçimde tris-asetat tampon çözeltisi ilave edilmiş ve jele zarar verilmeden taraklar ortamdan uzaklaştırılmıştır. 10 µl genomik DNA örneği üzerine 2 µl marker boya çözeltisi ilave edilerek hazırlanan örnekler mikropipet yardımı ile jel kuyucuklarına aktarılmıştır. Elektroforez işlemi 120 voltta 1.5 saat süreyle yapılmıştır. Süre sonunda elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jel, kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış 0.2 µg/ml etidyum bromit (Amresco Inc., Solon, OH, ABD) içeren çözeltisinde 30 dakika boyanmıştır. Boyama işleminin sonunda jeller, UV transilluminator (Vilber Lourmat, ECX-F20.M, Fransa) üzerinde incelenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde Nikon D500 dijital fotoğraf makinesi (Nikon Corp., Japonya) kullanılmıştır. 19

31 Tris-Asetat Tampon (1X) Tris 4.84 g Sodyum asetat 4.08 g EDTA 0.37 g Destile su 1000 ml ph8.0± 0.02 Maker Boya Brom fenol blue 0.25 g Sakaroz 40 g Destile su 100 ml Enterococcus spp. izolatlarının 16S rdna dizi analizi ile tür düzeyinde tanısı Türe özgül primerler yardımıyla tür düzeyinde tanısı yapılamamış olan 7 YSAD Enterococcus izolatının (RS21.3, RS25.3, RS29.1, RG22.4, RG26.1, RG26.2 ve RG26.3) tür düzeyinde tanısı 16S rdna dizi analizi ile yapılmıştır. İzolatların 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmasında pa (ileri) 5 -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ve pe (geri) 5 -CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3 genel bakteri primerleri kullanılmıştır (Edwards vd., 1989). Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) çizelge 3.2 de verilen PZR karışımı kullanılarak TurboCyler 2 gradient termal döngü cihazında (Blue-Ray Biotech Ltd., Tayvan) yapılmıştır. Çizelge 3.2. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PZR karışımı Madde adı Hacim PCR master mix (2X) (Thermo Scientific #K0172, ABD) 25 µl Nükleaz içermeyen H2O 20 µl İleri primer 1 µl Geri primer 1 µl Kalıp DNA 3 µl Toplam hacim 50 µl 20

32 PZR denemelerinde aşağıda verilen protokol uygulanmıştır. 94 C 2 dk 1 döngü 94 C 55 C 30 sn 90 sn 35 döngü 72 C 90 sn 72 C 10 dk 1döngü Çoğaltılan 16S rdna PZR fragmentlerinin elektroforezi Thermo OWL EASYCAST B2 yatay elektroforez tankında % 1 (w/v) agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır. Amplikon büyüklükleri O GeneRuler 100-bç Plus DNA marker (Thermo Scientific #SM1153, ABD) kullanılarak hesaplanmıştır. PZR ürünlerinin DNA dizi analizi Oligomer Biyoteknoloji A.Ş. (ODTÜ, Teknokent, Ankara, Türkiye) inde yaptırılmıştır. Sekans işleminde Applied Biosystems AB 3730XL (Thermo Fisher Scientific, ABD) otomatik gen sekans cihazı kullanılmıştır. 16S rdna dizi benzerliği National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST programı kullanılarak tespit edilmiştir Jelatinaz aktivitesi Enterokok suşlarının jelatinaz aktivitelerinin belirlenmesinde % 3 (w/v) jelatin (Merck) ilave edilmiş Todd-Hewitt agar (Liofilchem) besiyeri kullanılmıştır. MRS broth ortamında 37 C de 18 saat süre ile geliştirilen enterokok kültürlerinden hazırlanan Todd-Hewitt agar ortamlarına öze yardımı ile sürme yapılmış ve petri kutuları 37 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda petri kutuları +4 C de 5 saat buzdolabında tutulmuştur. Soğuk uygulaması sonunda enterokok suşlarının kolonileri etrafında bulanık zon oluşumu jelatinaz aktivitesinin pozitif olduğunun göstergesi olarak değerlendirilmiştir (Eaton ve Gasson, 2001). Denemelerde jelatinaz pozitif Enterococcus faecalis NYE7 suşu kontrol olarak kullanılmıştır (Inoğlu., 2012). 21

33 Hemolitik aktivite İzolatlar MRS broth ortamında 37 C de 18 saat geliştirilerek aktifleştirilmiştir. Elde edilen aktif kültürler % 5 (v/v) koyun kanı içeren Columbia agar (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, İtalya) besiyeri ortamında öze yardımı ile sürülerek 37 C de 48 saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda gelişen kolonilerin çevresinde berrak zon oluşumu beta (β) hemolitik, bulanık yeşilimsi zon oluşumu alfa (α) hemolitik ve zon oluşmaması ise gama (Ɣ) hemolitik reaksiyon olarak değerlendirilmiştir (Cariolato vd., 2008). Denemelerde β-hemolitik Staphylococcus auresus ATCC suşu kontrol olarak kullanılmıştır Enterokok suşlarında vürülens faktörlerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile belirlenmesi Enterokok suşlarında vürülens faktörleri kodlayan genlerin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması Çizelge 3.2 de verilen PZR karışımı kullanılarak TurboCyler 2 gradient termal döngü cihazında yapılmıştır. Tez çalışması kapsamında kullanılan enterokok suşlarında aranan virülens faktörleri kodlayan genler ve virülens faktör üretimindeki rolleri Çizelge 3.3 de verilmiştir. YSAD enterokok suşlarında vürülens faktörlerin belirlenmesinde kullanılan primerler Çizelge 3.4 de verilmiştir. Çizelge 3.3. Enterokok suşlarında aranan virülens faktörleri kodlayan genler ve virülens faktör üretimindeki rolleri Genler gele efaafm, efaafs cpd, cob, ccf, cad ace, acm espfm, espfs agg cylm cylb cyla hyl Vürülens faktör üretimindeki rolleri Hücre dışı metaloendopeptidaz (jelatinaz) Hücre duvarı adhezinleri Seks feromonları Kollojen bağalayan protein Ekstraselüler yüzey proteini Agregasyon proteini Sitolizinin translasyon sonrası modifikasyonu Sitolizinin taşınması Sitolizinin aktivasyonu Hiyaluronidaz 22

34 Çizelge 3.4. YSAD Enterococcus izolatlarında vürülens faktörlerin belirlenmesinde kullanılan primerler Gen Primer dizisi (5-3 ) Ürün boyutu Kaynaklar (bç) gele ACC CCG TAT CAT TGG TTT ACG CAT TGC TTT TCC ATC 419 Reviriego vd., 2005 efaa fm AAC AGA TCC GCA TGA ATA CAT TTC ATC ATC TGA TAG TA 735 Reviriego vd., 2005 efaa fs GAC AGA CCC TCA CGA ATA AGT TCA TCA TGC TGT AGT A 705 Reviriego vd., 2005 esp fm TTG CTA ATG CAA GTC ACG TCC GCA TCA ACA CTT GCA TTA CCG AA 955 Reviriego vd., 2005 esp fs TTG CTA ATG CTA GTC CAC GAC C GCG TCA ACA CTT GCA TTG CCG AA 933 Reviriego vd., 2005 cpd TGG TGG GTT ATT TTT CAA TTC TAC GGC TCT GGC TTA CTA 782 Reviriego vd., 2005 cob AAC ATT CAG CAA ACA AAG C GCG TCA TAA AGA GTGGTC AT 1405 Reviriego vd., 2005 ccf GGG AAT TGA GTA GTG AAG AAG AGC CGC TAA AAT CGG TAA AAT 543 Reviriego vd., 2005 cad TGC TTT GTC ATT GAC AAT CCG ACT TTT TCC CAA CCC CTC AA 1299 Reviriego vd., 2005 ace AAA GTA GAA TTA GAT CCA CAC Ben Belgacem vd., 350 TCT ATC ACA TTC GGT TGC G 2010 acm GGC CAG AAA CGT AAC CGA TA CGC TGG GGA AAT CTT GTA AA 353 Camargo vd., 2006 agg AAG AAA AAG AAG TAG ACC AAC Eaton ve Gasson, 1553 AAA CGG CAA GAC AAG TAA ATA 2001 cylm CTG ATG GAA AGA AGA TAG TAT TGA GTT GGT CTG ATT ACA TTT 742 Reviriego vd., 2005 cylb ATT CCT ACC TAT GTT CTG TTA AAT AAA CTC TTC TTT TCC AAC 843 Reviriego vd., 2005 cyla TGG ATG ATA GTG ATA GGA AGT TCT ACA GTA AAT CTT TCG TCA 517 Reviriego vd., 2005 hyl ACA GAA GAG CTG CAG GAA ATG Vankerckhoven vd., 276 GAC TGA CGT CCA AGT TTC CAA 2004 Vürülens genlerin PZR ile tespitinde acm, agg, gele, efaafm, efaafs, cdp, espfm, espfs, cob, ccf, cad, ace, cylm, cylb ve cyla genleri için protokol 1 ve hyl geni için protokol 2 olmak üzere iki farklı protokol uygulanmıştır. Protokol 1 de bağlanma sıcaklıkları acm geni için 52 C, agg geni için 56 C ve gele, efaafm, efaafs, cdp, espfm, espfs, cob, ccf, cad, ace, cylm, cylb ve cyla genleri için ise 54 C olarak uygulanmıştır. PZR denemelerinde E. faecalis ATCC 29212, E. faecalis ATCC ve E. faecium ATCC suşları kontrol olarak kullanılmıştır. 23

35 PZR denemelerinde aşağıda verilen protokoller uygulanmıştır. Protokol 1 (acm, agg, gele, efaafm, efaafs, cdp, espfm, espfs, cob, ccf, cad, ace, cylm, cylb ve cyla genleri) 95 C 5 dk 1 döngü 95 C Uygun bağlanma 0 C de 30 sn 30 sn 35 döngü 72 C 60 sn 72 C 10 dk 1döngü Protokol 2 (hyl geni) 95 C 2 dk 1 döngü 95 C 56 C 30 sn 90 sn 35 döngü 72 C 90 sn 72 C 10 dk 1döngü Çoğaltılan virülens genlerin PZR fragmentlerinin agaroz jel elektroforezi Thermo OWL EASYCAST B2 yatay elektroforez tankında % 1 (w/v) agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmış ve fragmentlerinin büyüklüğü O GenelRuler TM 100 bç Plus DNA marker (Thermo Scientific, #SM1153, ABD) kullanılarak hesaplanmıştır. Jeller kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış etidyum bromit içeren çözeltisinde 30 dakika boyanmıştır. Jeller boyama işleminin sonunda UV transilluminator (Vilber Lourmat, ECX-F20.M, Fransa) üzerinde incelenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde Nikon D500 dijital fotoğraf makinesi (Nikon Corp., Japonya) kullanılmıştır. 24

36 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Enterokok Suşlarından Genomik DNA İzolasyonu Tez kapsamında çalışma materyali olarak Süleyman Demirel Üniversitesi (SDÜ) Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Bakteriyel Genetik Laboratuvarından temin edilen 4739-YL1-16 nolu SDÜBAP projesi kapsamında peynir örneklerinden izole edilmiş ve türe özgü primerler kullanılarak moleküler düzeyde tanısı yapılmış olan 18 E. faecalis, 15 E. faecium, 12 E. durans, 2 E. gallinarum ve türe özgül primerler ile tanısı yapılamamış 7 Enterococcus spp. olmak üzere toplam 54 YSAD Enterococcus suşu kullanılmıştır. YSAD Enterococcus izolatlarından genomik DNA örneklerinin izolasyonu Cancilla vd. (1992), tarafından önerilen yönteme göre yapılmış ve genomik DNA örneklerinin varlığı % 0.7 (w/v) agaroz oranı ile hazırlanan jellerde tespit edilmiştir. YSAD Enterococcus izolatlarının genomik DNA örneklerinin agaroz jel elektroforez görüntüsü Şekil 4.1 de verilmiştir. Şekil 4.1. YSAD Enterococcus izolatlarının genomik DNA örneklerinin agaroz jel elektroforez görüntüsü 1-15 : YSAD Enterococcus izolatlarının genomik DNA sı M O GeneRuler DNA Marker : 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 bç 25

37 4.2. Enterococcus spp. İzolatlarının 16S rdna Dizi Analizi ile Tür Düzeyinde Tanısı Türe özgü primerler ile tanısı yapılamayan 7 Enterococcus spp. izolatının tür düzeyinde tanısı 16S rdna dizi analizi yöntemi ile yapılmıştır. Bakterilere özgü evrensel primerler kullanılarak yapılan PZR denemesi sonucu Enterococcus izolatlarının yaklaşık 900 bç büyüklüğünde amplikonlar verdiği belirlenmiştir (Şekil 4.2). Şekil 4.2. Enterococcus spp. izolatlarının 16S rdna PZR amplikonları 1-7 : Enterococcus spp. izolatlarının 16S rdna amplikonları M O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 8 : Negatif kontrol (su) Türe özgü primerler ile tür düzeyinde tanısı yapılamayan 7 Enterococcus izolatının (RS21.3, RS25.3, RS29.1, RG22.4, RG26.1, RG26.2 ve RG26.3) PZR ile çoğaltılan 16S rdna bölgelerinin BLAST programında dizi analizi sonucu izolatların tamamının E. faecalis türü üyesi olduğu belirlenmiştir. Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da elde edilen bulguları destekler nitelikte farklı gıda örneklerinden YSAD E. faecalis suşları izole edildiği rapor edilmiştir (Choi ve Woo, 2013; Chajęcka-Wierzchowska vd., 2016; Kürekci vd., 2016). 26

38 4.1. Jelatinaz Aktivitesi Enterococcus suşlarının jelatinaz aktiviteleri litreye 30 g olacak şekilde jelatin ilave edilmiş Todd-Hewitt agar besiyeri ortamında belirlenmiştir. Enterococcus suşlarının jelatinaz test sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1. Enterococcus suşlarının jelatinaz aktiviteleri No Bakteri Jelatinaz aktivitesi 1 E. faecium RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecium RS E. faecium RS E. faecalis RS E. durans RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecium RS E. faecium RS E. durans RS E. faecalis RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. faecalis RS

39 Çizelge 4.1. Enterococcus suşlarının jelatinaz aktiviteleri (Devam) No Bakteri Jelatinaz aktivitesi 36 E. faecium RS E. faecium RS E. durans RS E. faecium RS E. durans RG E. durans RG E. faecium RG E. faecalis RG E. faecalis RG E. faecalis RG E. faecalis RG E. faecium RG E. gallinarum RG E. gallinarum RG E. faecium RG E. faecium RG E. faecium RG E. faecium RG E. faecium RG Jelatinaz testi sonucu Enterococcus suşları içerisinden sadece E. faecalis RG22.4, RG26.1 ve RG26.2 suşlarının jelatinaz aktivitesine sahip olduğu saptanmıştır (Şekil 4.3). Jelatinaz enterokok suşları tarafından üretilen ve jelatin, kollajen, kazein, hemoglobin, insülin ve bazı bioaktif peptitleri hidrolize edebilen hücre dışı metalloendopeptidazdır (Su vd., 1991). Enterokok suşlarında jelatinaz üretiminin genelikle nozokomiyal, fekal ve klinik izolatlarda daha sık rastlanılan bir virülens faktör olduğu belirlenmiştir (Singh vd., 2007; Consentino vd., 2010). Tez çalışmasında elde edilen bulgulara benzer olarak, farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda jelatinaz üretim özelliğine sahip gıda kaynaklı enterokok suşlarının varlığı rapor edilmiştir (Eaton ve Gasson, 2001; Franz vd., 2001; Busani vd., 2004; Ben Omar vd., 2004; Trivedi vd., 2011; Yogurtcu, 2011; Avci ve Özden Tuncer, 2017; Domingos-Lopes vd., 2017; Santos vd., 2017). 28

40 Şekil 4.3. E. faecalis RG22.4 (9), E. faecalis RS25.1(10), E. faecalis RS25.2 (11) ve E. faecalis RS25.3 (12) suşlarının jelatinaz aktiviteleri 4.2. Hemolitik Aktivite YSAD Enterococcus suşlarının hemolitik aktivite test sonuçları Çizelge 4.2 de verilmiştir. Hemolitik aktivite testi sonucu, 54 Enterococcus suşundan, 26 sının (% 48.15) α-hemolitik, 25 inin (% 46.30) γ-hemolitik ve 3 ünün (% 5.55) ise β- hemolitik aktivite gösterdiği belirlenmiştir. β-hemolitik aktiviteye sahip olan E. durans RG22.2, E. gallinarum RG46.2 ve E. faecium RS74.1 suşları virülens faktör taşıması bakımından önem taşımaktadır. Çizelge 4.2. Enterococcus suşlarının hemolitik aktivite sonuçları No Bakteri Hemolitik aktivite 1 E. faecium RS12.1 α 2 E. faecalis RS21.1 α 3 E. faecalis RS21.2 γ 4 E. faecalis RS21.3 γ 5 E. faecalis RS21.4 α 6 E. faecalis RS25.1 γ 7 E. faecalis RS25.2 γ 8 E. faecalis RS25.3 γ 9 E. faecalis RS25.4 α 10 E. faecalis RS25.5 α 11 E. faecalis RS27.1 α 12 E. faecalis RS27.2 γ 13 E. faecalis RS27.3 γ 14 E. faecalis RS27.4 γ 15 E. faecalis RS27.5 γ 29

41 Çizelge 4.2. Enterococcus suşlarının hemolitik aktivite sonuçları (Devam) No Bakteri Hemolitik aktivite 15 E. faecalis RS27.5 γ 16 E. faecalis RS27.6 γ 17 E. faecalis RS29.1 γ 18 E. faecium RS32.1 α 19 E. faecium RS32.2 α 20 E. faecalis RS32.3 γ 21 E. durans RS32.4 γ 22 E. faecalis RS32.5 γ 23 E. faecalis RS32.6 α 24 E. faecium RS36.1 α 25 E. faecium RS36.2 γ 26 E. durans RS36.3 γ 27 E. faecalis RS36.4 α 28 E. durans RS42.1 α 29 E. durans RS42.2 α 30 E. durans RS42.3 α 31 E. durans RS46.1 α 32 E. durans RS46.2 α 33 E. durans RS46.3 α 34 E. durans RS50.1 γ 35 E. faecalis RS62.1 γ 36 E. faecium RS74.1 β 37 E. faecium RS74.2 α 38 E. durans RS85.1 γ 39 E. faecium RS88.1 γ 40 E. durans RG22.1 α 41 E. durans RG22.2 β 42 E. faecium RG22.3 α 43 E. faecalis RG22.4 γ 44 E. faecalis RG26.1 γ 45 E. faecalis RG26.2 α 46 E. faecalis RG26.3 γ 47 E. faecium RG36.1 α 48 E. gallinarum RG46.1 α 49 E. gallinarum RG46.2 β 50 E. faecium RG52.1 γ 51 E. faecium RG52.2 α 52 E. faecium RG53.1 α 53 E. faecium RG53.2 α 54 E. faecium RG73.1 γ Enterococcus suşları tarafından salgılanan vürülens faktörlerden birisi olan hemolisin/sitolizin, bakteriyel bir toksindir. Plazmid ya da kromozomal DNA 30

42 kodlu olabilen hemolitik aktivite, insan enfeksiyonlarında önemli bir rol oynamaktadır. Gıdalardan β-hemolitik aktiviteye sahip enterokok suşlarının izole edilmesi istenilmeyen bir durumdur. β-hemolitik aktivite daha çok E. faecium ve E. faecalis suşlarının klinik izolatlarında görülmektedir (Semedo vd., 2003). Özellikle β-hemolitik aktivite gösteren enterokok suşlarının fermente gıda üretiminde starter kültür olarak kullanılmaları önerilmemektedir (De Vuyst vd., 2003; Yoğurtçu, 2011). Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara benzer olarak farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da gıda kaynaklı Enterococcus suşları arasında β-hemolitik aktivitenin, α-hemolitik veya γ- hemolitik aktiviteye nazaran görülmediği veya düşük oranda gözlendiği bildirilmiştir (Eaton ve Gasson, 2001; Inoğlu, 2012; Avci ve Özden Tuncer, 2017; Domingos-Lopes vd., 2017; İspirli vd., 2017) Enterokok Suşlarında Virülens Faktörlerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Belirlenmesi Mikroorganizmaların hastalık yapıcı etkisini arttıran efektör moleküller virülens faktörler olarak isimlendirilmektedir. Enfeksiyona neden olan enterokok suşları sahip oldukları virülens faktör açısından farklılık göstermektedir. Yapılan çalışmalar, gıda kaynaklı enterokok suşlarında, virülens faktörlerin bulunuş derecesinin klinik enterokok izolatlarına oranla daha düşük düzeyde olduğunu göstermiştir. Enterokok suşlarının başlıca virülens faktörlerini hemolisin/sitolisin, agregasyon maddesi, hücre dışı yüzey proteini ve jelatinaz aktivitesi oluşturmaktadır (Giraffa, 2002; Moreno vd., 2006; İnoğlu, 2012; Akpınar Kankaya vd., 2017; Chajęcka-Wierzchowska vd., 2017). Araştırma kapsamında, Enterococcus suşlarında muhtemel virülens faktörlerin tespiti için jelatinaz (gele), hücre duvarı adhezinleri (efaafm, efaafs), ekstraselüler yüzey proteini (espfm, espfs), seks feromonları (cdp, cob, ccf, cad), kollojen bağlayan protein (ace, acm), agregasyon maddesi (agg), sitolizin (cylm, cylb, cyla) ve hiyaluronidaz (hyl) genlerinin varlığı PZR ile araştırılmış ve elde edilen sonuçlar Çizelge 4.3 de verilmiştir. 31

43 Çizelge 4.3. Enterococcus suşlarında virülens faktörlerin varlığı Bakteriler Jelatinaz Hücre duvarı adezinleri Seks feromonları Kollojen bağlayan protein Agregasyon proteini Sitolizin Hiyalüronidaz Ekstraselüler yüzey proteini gele efaafm efaafs cpd cob ccf cad ace acm agg cylm cylb cyla hyl espfm espfs E. faecium RS E. feacalis RS E. feacalis RS E. feacalis RS E. feacalis RS E. durans RG E. durans RG E. faecium RG E. feacalis RG E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RG E. faecalis RG E. faecalis RG E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecium RS E. faecium RS E. faecalis RS

44 Bakteriler Jelatinaz Çizelge 4.3. Enterococcus suşlarında virülens faktörlerin varlığı (Devam) Hücre duvarı adezinleri Seks feromonları Kollojen bağlayan protein Agregasyon proteini Sitolizin Hiyalüronidaz Ekstraselüler yüzey proteini gele efaafm efaafs cpd cob ccf cad ace acm agg cylm cylb cyla hyl espfm espfs E. durans RS E. faecalis RS E. faecalis RS E. faecium RS E. faecium RS E. durans RS E. faecalis RS E. faecium RG E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. durans RS E. gallinarum RG E. gallinarum RG E. durans RS E. faecium RG E. faecium RG E. faecium RG E. faecium RG E. faecalis RS E. faecium RG E. faecium RS E. faecium RS E. durans RS E. faecium RS E. faecalis ATCC E. faecalis ATCC E. faecium ATCC

45 Jelatinaz üretim özelliğinin genetik determinantlarının araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 54 Enterococcus suşundan 33 ünün (% 61.11) jelatinaz genini (gele) içerdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında gele genine özgü primerlerin kullanıldığı PZR uygulamaları sonucu beklenildiği gibi 419 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.4). Şekil 4.4. Enterococcus suşlarında gele geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecium RS12.1 : 419 bç 2. E. faecalis RS21.3 : 419 bç 3. E. faecalis RS21.4 : 419 bç 4. E. faecalis RS21.1 : 419 bç 5. E. faecalis RS21.2 : 419 bç 6. E. durans RG22.1 : 419 bç 7. E. durans RG22.2 : 419 bç 8. E. faecium RG22.3 : 419 bç 9. E. faecalis RG22.4 : 419 bç M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS25.1 : 419 bç 11. E. faecalis RS25.2 : 419 bç 12. E. faecalis RS25.3 : 419 bç 13. E. faecalis RS25.4 : E. faecalis RS25.5 : E. faecalis RG26.1 : 419 bç 16. E. faecalis RG26.2 : 419 bç 17. E. faecalis RG26.3 : E. faecalis RS27.1 : E. faecalis RS27.2 : - 25 E. faecalis suşundan 17 sinin (RS21.1, RS21.2, RS21.3, RS21.4, RG22.4, RS25.1, RS25.2, RS25.3, RG26.1, RG26.2, RS27.3, RS27.6, RS32.3, RS32.5, RS32.6, 34

46 RS36.4 ve RS62.1) gele geni içerdiği tespit edilmiştir. E. faecalis suşlarında gele geni bulunma sıklığının % olduğu tespit edilmiştir. 15 adet E. faecium suşunda 7 sinin (RS12.1, RG22.3, RS36.1, RS36.2, RG36.1, RS74.2 ve RS88.1) gele geni içerdiği ve E. faecium suşlarında gele geni bulunma sıklığının % olduğu belirlenmiştir. Denemelerde kullanılan 12 E. durans suşundan ise 9 unun (RG22.1, RG22.2, RS32.4, RS36.3, RS42.1, RS42.2, RS42.3, RS50.1 ve RS85.1) gele geni içerdiği belirlenmiştir. E. durans suşlarında gele geni bulunma sıklığı (% 75) E. faecium ve E. faecalis suşlarına oranla daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Tez çalışması kapsamında kullanılan enterokok suşlarında gele geni bulunma sıklığı Eaton ve Gasson (2001), Busani vd. (2004), Cariolato vd. (2008), Özmen Toğay vd. (2010), Boussouar vd. (2017), tarafından yapılan çalışmalarda bulunan oranlarla benzerlik göstermiştir. Bu çalışmalarda da gıda kaynaklı E. faecalis suşlarında gele geni bulunma sıklığı yüksek bulunmuştur. Franz vd. (2001), peynirden izole edilen enterokok suşlarında yüksek jelatinaz üretim özelliğinin bulunmasını peynirin proteince zengin bir kaynak olmasından ileri gelebileceğini belirmiştir. Enterokokların ürettikleri bu proteinaz sayesinde gelişmeleri için gerekli olan amino asit kaynağını sağladıklarını bildirmiştir. Tez kapsamında el edilen bulgular bu düşünceyi destekler niteliktedir. Diğer taraftan tezde elde edilen bulgurların aksine, Schleifer vd. (1984), fermente süt ürünlerinden izole ettikleri 17 E. faecium suşundan hiçbirinin gele geni içermediğini belirtmiştir. Benzer olarak Yousif vd. (2005), geleneksel bir Afrika fermente gıda maddesi olan Hussuwa dan izole ettikleri 22 E. faecium suşundan hiçbirinin gele geni içermediğini rapor etmişlerdir. Buna ilaveten süt ve ürünleri orijinli enterokok suşlarının kullanıldığı bir başka çalışmada ise yine E. faecium suşlarından hiçbirinde gele geni tespit edilmemiştir (De Perio, 2006). Trivedi vd. (2011) ise süt, et ve meyve-sebze ürünleri gibi farklı gıda maddelerinden izole ettikleri 250 enterokok suşu içeresinden 2 suşun (1 E. faecium ve 1 E. faecalis) gele geni içerdiğini bildirmişlerdir. Türkiye de yapılan bir çalışmada da Tulum peynirinden izole edilen 21 E. faecium suşundan 4 ünde gele geninin varlığına rastlanılmıştır (Inoğlu, 2012). 35

47 Enterokok suşlarının jelatinaz aktiviteleri ve gele geni varlığı birlikte incelendiği zaman yalnız E. faecalis RG22.4, RG26.1 ve RG26.2 suşlarında gele geni varlığının yanı sıra fenotipik jelatinaz aktivitesinin de görüldüğü tespit edilmiştir. PZR denemeleri sonucu gele geni içerdiği tespit edilen E. faecium, E. durans ve diğer E. faecalis suşlarında bu genin ifade edilmediği tespit edilmiştir. Tez çalışmasında elde edilen bulgulara bezer olarak Eaton ve Gasson (2001) tarafından yapılan çalışmada da enterokok suşlarında gele geni bulunmasına rağmen jelatinaz negatif fenotip görülebildiği rapor edilmiştir. Araştırıcılar yaptıkları çalışmada E. faecalis F41, F1, F4, P21, P26, P31, P36 ve E. faecium P20 suşlarında gele geninin varlığına rağmen jelatinaz aktivitesi tespit etmemişlerdir. Araştırıcılar bu suşlarda gele geninin sessiz gen (silent gene) olarak bulunduğunu ifade etmişlerdir. Cariolato vd. (2008), süt ve insan orijinli enterokok suşlarını kullandıkları çalışmalarında gele geni içerdiğini tespit ettikleri 28 enterokok suşundan 11 inin jelatinaz aktivitesi göstermediğini belirlemişlerdir. Ben Belgacem vd. (2010), ise fermente et ürününden izole ettikleri 24 bakteriyosin üretici E. faecium suşundan 5 inin gele geni içermesine rağmen hiçbirinin jelatinazı hidrolize edemediğini ve bu suşların sessiz gele geni içerdiğini bildirmişlerdir. Benzer olarak Trivedi vd. (2011), tarafından yapılan çalışmada da et ürününden izole edilen 1 E. faecium suşunun sessiz gele geni içerdiğini rapor edilmiştir. Tez çalışması kapsamında da gele geni içerdiği tespit edilen E. faecalis RS21.1, RS21.2, RS21.3, RS21.4, RS25.1, RS25.2, RS25.3, RS27.3, RS27.6, RS32.3, RS32.5, RS32.6, RS36.4 ve RS62.1, E. durans RG22.1, RG22.2, RS32.4, RS36.3, RS42.1, RS42.2, RS42.3, RS50.1 ve RS85.1 ve E. faecium RS12.1, RG22.3, RS36.1, RS36.2, RG36.1, RS74.2 ve RS88.1 suşlarında jelatinaz aktivitesinin görülmemesi bu suşların da sessiz gele geni içerdiğinin kanıtı olarak değerlendirilmiştir. Adhezin benzeri enterokok A antijenlerini (efaafm ve efaafs) determine eden genlerin varlığının araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 54 Enterococcus suşundan 48 inin (% 88.88) E. faecalis antijen A (efaafs) genini ve 11 inin (% 20.37) ise E. faecium antijen A (efaafm) genini içerdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.3). Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara benzer olarak farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da gıda orijinli enterokok suşlarında adhezin 36

48 benzeri E. faecium antijen A (efafm) ve E. faecalis antijen A (efaafs) genlerinin varlığı gösterilmiştir (Busani vd., 2004; Reviriego vd., 2005; Çelik vd., 2008; Inoğlu, 2012; Abauelnaga vd., 2016; Boussouar vd., 2017). Tez kapsamında kullanılan 25 E. faecalis suşunun tamamının (% 100) efaafs geni içerdiği saptanmıştır. Benzer olarak Eaton ve Gasson (2001), starter E. faecalis suşlarının tamamının ve gıda izolatı E. faecalis suşlarının ise % 89 unun efaafs geni içerdiğini tespit etmişlerdir. Cariolato vd. (2008), test ettikleri E. faecalis suşlarının tamamının efaafs geni içerdiklerini bildirmişlerdir. Farklı gıda örneklerinden (et ürünü, peynir, süt ve sebze) izole edilen E. faecalis suşlarının yer aldığı başka bir çalışmada ise 80 E. faecalis suşundan % 98.7 sinin efaafs geni içerdiği belirlenmiştir (Gomes vd., 2008). Barbosa vd. (2010), 76 E. faecalis suşunun tamamının efaafs geni içerdiğini rapor etmişlerdir. Benzer bir şekilde Afrika da yapılan bir çalışmada 49 E. faecalis suşunun tamamının efaafs geni içerdiği bildirilmiştir (Boussouar vd., 2017). Diğer taraftan Trivedi vd. (2011), tezde elde edilen verilerin aksine süt ve süt ürünlerinden izole ettikleri E. faecalis suşlarında efaafs geni bulunma sıklığını % 41.1 olarak rapor etmişlerdir. Enterococcus suşlarında efaafm genine özgü primerlerin kullanıldığı PZR uygulamaları sonucu 735 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.5). Tez kapsamında kullanılan 15 E. faecium suşundan 11 inin (% 73.33) efaafm geni içerdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.3). Elde edilen bulgulara benzer olarak farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da gıda orijinli E. faecium suşlarının yüksek oranda adhezin benzeri E. faecium antijen A (efaafm) geni içerdiği rapor edilmiştir (Eaton ve Gasson, 2001; Yousif vd., 2005; Cariolato vd., 2008; Özmen Toğay vd., 2010; Boussouar vd., 2017). Eaton ve Gasson (2001), 11 E. faecium suşundan 9 unun efaafm geni içerdiğini bildirmiştir. Yousif vd. (2005), sorgumdan yapılan geleneksel bir Afrika fermente gıda maddesi olan Hussuwa dan izole edilen 22 E. faecium suşunun % 90.9 unun efaafm geni içerdiğini rapor etmişlerdir. Benzer olarak Cariolato vd. (2008), süt ve süt ürünlerinden izole edilen 25 E. faecium suşunun tamamının efaafm geni içerdiğini tespit etmişlerdir. 37

49 Şekil 4.5. Enterococcus suşlarında efaafm geninin PZR amplifikasyonu 1. E. durans RS46.1 : - 2. E. durans RS46.2 : - 3. E. durans RS46.3 : - 4. E. gallinarum RG46.1 : - 5. E. gallinarum RG46.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 6. E. durans RS50.1 : - 7. E. faecium RG52.1 : 705 bç 8. E. faecium RG52.2 : 705 bç 9. E. faecium RG53.1 : 705 bç 10. E. faecium RG53.2 : 705 bç 11. E. faecalis RS62.1 : E. faecium RG73.1 : 705 bç 13. E. faecium RS74.1 : 705 bç 14. E. faecium RS74.2 : 705 bç 15. E. durans RS85.1 : E. faecium RS88.1 : E. faecalis ATCC : E. faecalis ATCC : E. faecium ATCC : 705 bç 20. Negatif kontrol (su) : - 38

50 Türkiye de yapılan iki farklı çalışmada ise fermente sosis, peynir ve zeytin örneklerinden izole edilen 16 E. faecium suşundan % 67.0 sinin (Özmen Toğay vd., 2010) ve Tulum peynirinden izole edilen bakteriyosin üreticisi 3 E. faecium suşunun tamamının efaafm geni içerdiği (Özden Tuncer vd., 2013) rapor edilmiştir. Yapılan bir başka çalışmada deve sütünden izole edilen 55 E. faecium suşunun % 74.2 sinin efaafm geni içerdiği bildirilmiştir (Boussouar vd., 2017). Diğer taraftan Ben Belgacem vd. (2010), starter kültür kullanılmadan üretilen geleneksel Tunus fermente et ürününden izole ettikleri E. faecium suşlarının yalnız % 20.8 inin efaafm geni içerdiğini rapor etmişlerdir. Tez kapsamında kullanılan 12 E. durans suşu içerisinden hiçbirinin efaafm geni içermediği tespit edilirken, 10 unun (RG22.1, RG22.2, RS36.3, RS42.1, RS42.2, RS42.3, RS46.2, RS46.3, RS50.1 ve RS85.1) efaafs geni içerdiği saptanmıştır (Çizelge 4.1). Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da gıda orijinli E. durans suşlarının yüksek oranda adhezin benzeri E. faecalis antijen A (efaafs) geni içerdiği rapor edilmiştir (De Perio vd., 2006; Dworkin vd., 2006; Lazreg vd., 2017). PZR aracılığı ile efaafm ve efaafs genlerinin varlığının araştırıldığı enterokok suşları içerisinden 10 E. faecium (RS12.1, RG22.3, RG36.1, RG52.1, RG52.2, RG53.1, RG53.2, RG73.1, RS74.1 ve RS74.2) suşunun her iki geni de içerdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.1). E. faecium suşları içerisinde hem efaafm hem de efaafs geni bulundurma oranı % 66.6 olarak tespit edilmiştir. E. faecalis suşları arasında her iki genide içeren bir suşa rastlanılmamıştır. Tez kapsamında elde edilen bulgulara benzer olarak Eaton ve Gasson (2001), gıda orijinli E. faecium suşlarında efaafm geninin yanı sıra efaafs geninin de bulunduğunu göstermiştir. Türkiye de yapılan bir çalışmada da farklı fermente gıdalardan izole edilen E. faecium suşlarının her iki geni (efaafm ve efaafs) de içerdiği bildirilmiştir (Metan vd., 2005). Adhezin benzeri E. faecalis ve E. faecium endokarditis antijenleri potansiyel virülens faktörler olarak nitelendirilmektedir. Ancak şimdiye kadar sadece efaafs geninin patojenite üzerine etkisi hayvan modellerinde gösterilmiştir. 39

51 efaafm geninin patojenite üzerindeki rolü henüz gösterilememiştir (Dworkin vd., 2006; Cariolato vd., 2008; Ben Belgacem vd., 2010; Lazreg vd., 2017). Bu nedenle tez kapsamında efaafs geni içerdiği tespit edilen YSAD E. faecalis, E. faecium ve E. durans suşları tüketici sağlığı açısından risk teşkil etmektedir. Tez çalışma kapmasında Enterococcus suşlarında seks feromonlarını kodlayan cdp, cob, ccf ve cad genlerinin varlığı PZR ile araştırılmıştır. PZR çalışmaları sonucu enterokok suşlarının hiçbirinin cad geni içermediği tespit edilmiştir. Diğer taraftan 54 Enterococcus suşundan 48 inin (% 88.89) ccf, 28 sinin (% 51.85) cdp ve 5 inin (% 9.26) cob geni içerdiği saptanmıştır. Enterokok suşları arasında sadece E. faecium RS32.2, RG53.2, E. faecalis RG26.3, RS27.5, E. durans RS46.1 ve E. gallinarum RG46.1 suşlarının ccf geni içermediği belirlenmiştir (Çizelge 4.1). PZR uygulamaları sonucu Enterococcus suşlarında ccf genine özgü 543 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.6). Tür bazında ccf geni bulunma sıklığı E. faecalis suşları için % (23/25), E. durans suşları için % (11/12), E. faecium suşları için ise % 86.6 (13/15) ve E. gallinarum % 50 (1/2) olduğu tespit edilmiştir. 40

52 Şekil 4.6. Enterococcus suşlarında ccf geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecium RS12.1 : 543 bç 2. E. faecalis RS21.3 : 543 bç 3. E. faecalis RS21.4 : 543 bç 4. E. faecalis RS21.1 : 543 bç 5. E. faecalis RS21.2 : 543 bç 6. E. durans RG22.1 : 543 bç 7. E. durans RG22.2 : 543 bç 8. E. faecium RG22.3 : 543 bç 9. E. faecalis RG22.4 : 543 bç M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS25.1 : 543 bç 11. E. faecalis RS25.2 : 543 bç 12. E. faecalis RS25.3 : 543 bç 13. E. faecalis RS25.4 : 543 bç 14. E. faecalis RS25.5 : 543 bç 15. E. faecalis RG26.1 : 543 bç 16. E. faecalis RG26.2 : 543 bç 17. E. faecalis RG26.3 : E. faecalis RS27.1 : 543 bç 19. E. faecalis RS27.2 : 543 bç PZR uygulamaları sonucu Enterococcus suşlarında cpd genine özgü 782 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.7). 25 E. faecalis suşundan 23 ünün (% 92), 15 E. faecium suşundan 3 ünün (% 20) ve 12 E. durans suşundan 2 sinin (% 16.67) cdp geni içerdiği belirlenmiştir. E. gallinarum suşlarında ise cdp geni varlığı tespit edilmemiştir (Çizelge 4.1). 41

53 Şekil 4.7. Enterococcus suşlarında cpd geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.3 : 782 bç 2. E. faecalis RS27.4 : 782 bç 3. E. faecalis RS27.5 : 782 bç 4. E. faecalis RS27.6 : 782 bç 5. E. faecalis RS29.1 : 782 bç 6. E. faecalis RS32.5 : 782 bç 7. E. faecalis RS32.6 : 782 bç 8. E. faecium RS32.1 : - 9. E. faecium RS32.2 : E. faecalis RS32.3 : 782 bç M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 11. E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : 782 bç 13. E. faecium RS36.1 : E. faecium RS36.2 : 782 bç 15. E. durans RS36.3 : 782 bç 16. E. faecium RG36.1 : 782 bç 17. E. durans RS42.1 : E. durans RS42.2 : E. durans RS42.3 : - Tez çalışma kapmasında Enterococcus suşlarında cob geni bulunma sıklığı % 9.2 olarak saptanmıştır. cob geni varlığı sadece E. faecalis RS27.4, RS27.5, RS27.6 ve RS32.5 suşlarında tespit edilmiştir (Şekil 4.8). 42

54 Şekil 4.8. Enterococcus suşlarında cob geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.3 : - 2. E. faecalis RS27.4 : 1405 bç 3. E. faecalis RS27.5 : 1405 bç 4. E. faecalis RS27.6 : 1405 bç 5. E. faecalis RS29.1 : 1405 bç 6. E. faecalis RS32.5 : 1405 bç 7. E. faecalis RS32.6 : - 8. E. faecium RS32.1 : - 9. E. faecium RS32.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS32.3 : E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : E. faecium RS36.1 : E. faecium RS36.2 : E. durans RS36.3 : E. faecium RG36.1 : E. durans RS42.1 : E. durans RS42.2 : E. durans RS42.3 : - Seks feromonları, enterokok suşları arasında plazmid DNA ının konjugatif transferini kolaylaştıran küçük hidrofobik peptitlerdir. Seks feromonları virülens faktör olarak değerlendirmemelerine rağmen, enterokok suşlarında seks feromonlarının üretimi virülens determinantların ve antibiyotik dirençliliğin feromon yanıt veren konjugatif plazmidler aracılığı ile diğer enterokok suşlarına yayılmasını teşvik etmektedir. Böylece virülens özelliklerin artmasını sağlamaktadır (Eaton ve Gasson, 2001; Klare vd., 2003; Inoğlu, 2012; Boussouar vd., 2017). Eaton ve Gasson (2001), 11 E. faecalis suşunun hepsinde 43

55 cdp, ccf, cop ve cad genlerinin varlığını tespit etmişken, 17 E. faecium suşunda ise bu genlerin varlığını belirleyememişlerdir. Benzer bir çalışmada Boussouar vd. (2017), deve sütünden izole edilmiş 123 enterokok suşunun hiçbirinin cad ve cob genlerini içermediğini rapor etmişlerdir. Pérez-Pulido vd. (2006) geleneksel fermente kapariden izole ettikleri bazı enterokok suşlarının cdp, cob, ccf ve cad genlerinden bir veya birkaçını içerdiğini bildirmişlerdir. Ben Belgacem vd. (2010), ise bakteriyosin üreticisi 24 E. faecium suşunda hiçbirinin cob ve cad geni içermediğini diğer taraftan 3 suşun cdp geni ve 12 suşun ise ccf geni içerdiğini tespit etmişlerdir. Türkiye de yapılan bir çalışmada Tulum peynirinden izole edilen 28 enterokok suşunun cpd, cob ve cad genlerini içermezken, 24 ünün ccf geni içerdiğini rapor etmiştir (Inoğlu, 2012). Enterokok suşlarında ekstraselüler yüzey proteinlerini (Esp) determine eden genlerin (espfm ve espfs) varlığının araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 54 enterokok suşundan 27 sinin (% 50) espfs geni içerdiği tespit edilmiştir. espfm geni ise sadece E. faecium RG53.2 suşunda belirlenmiştir. E. faecium RG53.2 suşu aynı zamanda her iki esp genini de içeren tek suştur. E. gallinarum suşlarının hiçbirinde (0/2) esp geni varlığı tespit edilmemiştir (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında espfs genine özgü primerlerin kullanıldığı PZR uygulamaları sonucu beklenildiği gibi 705 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.9). espfs geninin E. faecalis suşlarında, E. faecium ve E. durans suşlarına nazaran daha yaygın olduğu tespit edilmiştir. Tür bazında espfs geni bulunma sıklığının E. faecalis suşlarında % (23/25), E. durans ve E. faecium suşlarında ise sırasıyla % (2/12) ve % (2/15) olduğu saptanmıştır. 44

56 Şekil 4.9. Enterococcus suşlarında espfs geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.3 : 933 bç 2. E. faecalis RS27.4 : 933 bç 3. E. faecalis RS27.5 : 933 bç 4. E. faecalis RS27.6 : 933 bç 5. E. faecalis RS29.1 : 933 bç 6. E. faecalis RS32.5 : 933 bç 7. E. faecalis RS32.6 : 933 bç 8. E. faecium RS32.1 : - 9. E. faecium RS32.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS32.3 : 933 bç 11. E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : 933 bç 13. E. faecium RS36.1 : E. faecium RS36.2 : E. durans RS36.3 : E. faecium RG36.1 : E. durans RS42.1 : E. durans RS42.2 : E. durans RS42.3 : - Geçmiş yıllarda da farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da tezde elde edilen bulgulara benzer sonuçlar elde edilmiştir (Eaton ve Gasson, 2001; Franz vd., 2001; Inoğlu, 2012; Boussouar vd., 2017). Eaton ve Gasson (2001), gıda kökenli E. faecium suşlarının hiçbirinin, E faecalis suşlarının ise % 33 ünün esp geni içerdiğini bildirmişlerdir. Franz vd. (2001), 48 E. faecium suşundan sadece 1 inin (% 2.1) esp geni içerdiğini rapor etmişlerdir. Türkiye de yapılan bir çalışmada da gıda orijinli E. faecalis suşlarında E. faecium suşlarına nazaran esp geni bulunma sıklığı yüksek bulunmuştur. Yapılan bu çalışmada E. faecalis 45

57 suşlarının % 57 sinde, E. faecium suşlarının ise % 4.8 inde esp geni bulduğu tespit edilmiştir (Inoğlu, 2012). Benzer başka bir çalışmada da süt ve süt ürünleri orijinli E. faecalis izolatlarının E. faecium izolatlarına oranla daha yüksek sıklıkta esp geni içerdiği belirlenmiştir. Yapılan bu çalışmada E. faecalis suşlarında esp geni bulunma sıklığı % 93, E. faecium suşlarında ise % 12 olduğu bildirilmiştir (Boussouar vd., 2017). Yapılan çalışmalar ekstraselüler yüzey proteini üretimini determine eden genlerin klinik izolatlarda yüksek sıklıkla bulunduğu göstermiştir. Bu nedenden dolayı ekstraselüler yüzey proteini üretimi determine eden genler enfeksiyona neden olan enterokok izolatlarının tespitinde marker olarak kullanılmaktadır (Franz vd., 2001). Enterokok suşlarında ekstraselüler yüzey proteini üretimi hücre hidrofobisitesini, abiyotik yüzeylere tutunmayı in vitro koşullarda biofilm oluşumunu arttırmaktadır (İşleroğlu vd., 2008). esp genin adhezyon rolünün yanı sıra, konakçı bağışıklık yanıtından kurtulmada rol oynadığı düşünülmektedir. Bu sebepten dolayı, bu özelliğe sahip olan enterokok suşlarının gıdalarda starter kültür olarak kullanımı açıkça istenmemektedir (Franz vd., 2001). Yukarıda özetlenen nedenlerden dolayı tez kapsamında esp geni içerdiği tespit edilen 23 E. faecalis suşunun ve E. faecium RG53.2 ün tüketici sağlığı açısından risk oluşturma potansiyeli bulunmaktadır. Agregasyon maddesi (Agg) üretim özelliğinin genetik determinantların araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 54 enterokok suşundan sadece 5 (% 9.26) E. faecalis suşunun agg genini içerdiği tespit edilmiştir. E. faecium, E. durans ve E. gallinarum suşlarının hiçbirinin agg geni içermediği belirlenmiştir (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında agg genine özgü primerlerin kullandığını PZR uygulamaları sonucu E. faecalis RS27.2, RS27.3, RS27.4, RS27.5 ve RS27.6 suşlarında beklenildiği gibi 1553 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.10). Farklı araştırıcılar tarafında gıda kaynaklı enterokok suşlarının kullandığı çalışmalarda da E. faecium ve E. durans suşlarında agg geninin varlığı tespit edilmemiştir (Eaton ve Gasson, 2001; Pérèz-Pulido vd., 2006; Belgacem vd., 2010; Inoğlu, 2012). Diğer taraftan, gıda kökenli E. faecium suşlarında agg 46

58 geninin varlığının bildirildiği çalışmalar da bulunmaktadır (Semedo vd., 2003; Yüksel vd., 2012). Şekil Enterococcus suşlarında agg geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.3 : 1553 bç 2. E. faecalis RS27.4 : 1553 bç 3. E. faecalis RS27.5 : 1553 bç 4. E. faecalis RS27.6 : 1553 bç 5. E. faecalis RS29.1 : - 6. E. faecalis RS32.5 : - 7. E. faecalis RS32.6 : - 8. E. faecium RS32.1 : - 9. E. faecium RS32.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS32.3 : E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : E. faecium RS36.1 : E. faecium RS36.2 : E. durans RS36.3 : E. faecium RG36.1 : E. durans RS42.1 : E. durans RS42.2 : E. durans RS42.3 : - Eaton ve Gasson (2001), agg geni içermeyen enterokok suşlarında seks feromon determinantlarının bulunabileceğini diğer taraftan, agg geni içeren suşlarda ise mutlaka seks feromon determinantlarının bulunduğunu bildirmiştir. Bu bulgu tez kapsamında elde edilen sonuçlarla da desteklenmektedir. Agg geni içerdiği 47

59 tespit edilen E. faecalis RS27.2 (ccf +, cpd + ), E. faecalis RS27.3 (ccf +, cpd + ), E. faecalis RS27.4 (ccf +, cpd +, cob + ), E. faecalis RS27.5 (cpd +, cob + ) ve E. faecalis RS27.6 (ccf +, cpd +, cob + ) suşlarının da seks feromon geni içerdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.1). Adhezin kollojen bağlayan protein (ace ve acm) üretiminin genetik determinantlarının araştırıldığı PZR çalışmaları sonucu 54 Enterococcus suşundan 20 E. faecalis suşunun ace geni içerdiği, E. faecium, E. durans ve E. gallinarum suşlarının ise hiçbirinin ace geni içermediği tespit edilmiştir (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında ace geni bulunma sıklığı % olarak saptanmıştır. Diğer taraftan enterokok suşlarında acm geni bulunma sıklığı % (42/54) olarak hesaplanmıştır. E. faecalis suşlarının % 64 ünün (16/25), E. faecium suşlarının % sinin (13/15), E. durans suşlarının % sinin (11/12), E. gallinarum suşlarının % 100 ünün (2/2) acm geni içerdiği tespit edilmiştir. Enterokok suşlarında ace ve acm genlerine özgü primerlerin kullanıldığı PZR uygulamaları sonucu beklenildiği gibi sırasıyla 350 ve 353 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.11 ve Şekil 4.12). Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara benzer olarak farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da gıda orijinli enterokok suşlarında adhezin kollojen geni determine eden genlerin varlığı gösterilmiştir (Pérez-Pulido vd., 2006; Gomes vd., 2008; Trivedi vd., 2011; Boussouar vd. 2017). Pérez-Pulido vd. (2006), fermente kapariden izole ettikleri 17 enterokok suşunun 15 inin ace geni içerdiğini bildirmişlerdir. Gomes vd. (2008), tarafından yapılan çalışmada ise et ürünleri ve peynirden izole edilen E. faecium ve E. faecalis suşlarının adhezin kollojen geni içerdiği belirlenmiştir. Bu çalışmada E. faecalis suşlarının E. faecium suşlarına kıyasla çok daha yüksek oranda ace geni içerdiği tespit edilmiştir. Benzer olarak Trivedi vd. (2011), süt ürünleri, et ürünleri ve meyve sebze ürünlerinden izole ettikleri E. faecium ve E. faecalis suşlarının ace geni içerdiklerini rapor etmişlerdir. Boussouar vd. (2017), deve sütünden izole edilmiş 123 adet enterokok suşundan 9 unun ace geni içerdiğini bildirmiştir. Diğer taraftan yapılan bazı çalışmalarda ise gıda kökenli enterokok suşlarında adhezin kollojen (ace) geninin tespit edilmediği bildirilmiştir. Ben Belgacem vd. 48

60 (2010), Tunus fermente et ürünlerinden izole ettikleri 24 E. faecium suşundan hiçbirinin ace geni içermediğini bildirmişlerdir. Inoğlu (2012), Tulum peynirinden izole edilen E. faecium ve E. faecalis suşlarının hiçbirinin ace geni içermediğini rapor etmişlerdir. Şekil Enterococcus suşlarında ace geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.3 : 350 bç 2. E. faecalis RS27.4 : 350 bç 3. E. faecalis RS27.5 : 350 bç 4. E. faecalis RS27.6 : 350 bç 5. E. faecalis RS29.1 : 350 bç 6. E. faecalis RS32.5 : 350 bç 7. E. faecalis RS32.6 : 350 bç 8. E. faecium RS32.1 : - 9. E. faecium RS32.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 10. E. faecalis RS32.3 : 350 bç 11. E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : E. faecium RS36.1 : E. faecium RS36.2 : E. durans RS36.3 : E. faecium RG36.1 : E. durans RS42.1 : E. durans RS42.2 : E. durans RS42.3 : - 49

61 Şekil Enterococcus suşlarında acm geninin PZR amplifikasyonu 1. E. faecalis RS27.5 : - 2. E. faecalis RS27.6 : - 3. E. faecalis RS29.1 : 353 bç 4. E. faecalis RS32.5 : - 5. E. faecalis RS32.6 : - 6. E. faecium RS32.1 : 353 bç 7. E. faecium RS32.2 : - M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 8. E. faecalis RS32.3 : 353 bç 9. E. durans RS32.4 : E. faecalis SM36.1 : E. faecium RS36.1 : 353 bç 12. E. faecium RS36.2 : 353 bç 13. E. durans RS36.3 : 353 bç 14. E. faecium RG36.1 : 353 bç 15. E. durans RS42.1 : 353 bç 16. E. durans RS42.2 : 353 bç 17. E. durans RS42.3 : 353 bç Enterokok suşlarında sitolisin genlerinin (cylm, cylb, cyla) araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 2 E. faecalis (RS27.1 ve RS27.2) suşunda cylb ve 5 E. faecalis (RS27.1, RS27.2, RS27.4, RS27.5 ve RS27.6) suşunda cyla geni tespit edilirken, hiçbir suşta cylm geni varlığı tespit edilmemiştir (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında cylb geni bulunma sıklığı % 3.7, cyla geni bulunma sıklığı ise % 9.2 olarak saptanmıştır. Enterokok suşlarında sitolisin cylb genine özgüözgü primerlerin kullanıldığı PZR uygulamaları sonucu beklenildiği gibi 843 bç büyüklüğünde amplikonlar elde edilmiştir (Şekil 4.13). 50

62 Şekil Enterococcus suşlarında cylb geninin PZR amplifikasyonu M. O GeneRuler DNA Marker : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bç 1. E. faecalis RS25.1 : - 2. E. faecalis RS25.2 : - 3. E. faecalis RS25.3 : - 4. E. faecalis RS25.4 : - 5. E. faecalis RS25.5 : - 6. E. faecalis RG26.1 : - 7. E. faecalis RG26.2 : - 8. E. faecalis RG26.3 : - 9. E. faecalis RS27.1 : 843 bç 10. E. faecalis RS27.2 : 843 bç Tez kapsamında elde edilen bulgulara benzer olarak Yousef vd. (2005) Hussuwa dan izole ettileri 22 E. faecium suşundan hiçbirinin sitolizin geni içermediğini bildirmişlerdir. Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda tezde elde edilen bulguların aksine, gıda kökenli E. faecium ve E. faecalis suşlarının değişik düzeylerde cylm, cylb ve cyla genlerinin birini, ikisini veya üçünü birden içerdiği bildirilmiştir (Pérez-Pulido vd., 2006; Ben Belgacem vd., 2010, Trivedi vd., 2011; Boussouar vd., 2017). Eaton ve Gasson (2001), gıda kökenli E. faecium suşlarının hiçbirinin cylm, cylb, cyla genlerini içermediğini ancak, bazı E. faecalis suşlarının ise her üç geni de içerdiğini bildirmişlerdir. Diğer taraftan, Türkiye de Tulum peynirinden izole edilen 27 E. faecium ve E. faecalis suşlarından 51

63 hiçbirinin sitolisin (cylm, cylb, cyla) geni içermediğini belirtmişlerdir (Inoğlu, 2012). Hiyaluronidaz (Hyl) üretim özelliğini kodlayan genin araştırıldığı PZR denemeleri sonucu 54 enterokok suşu arasında E. gallinarum RG46.1, RG46.2 ve E. faecium RG53.1 suşlarının hiyaluronidaz (hyl) geni içerdiği tespit edilmiştir. E. faecalis ve E. durans suşlarının hiçbirinde hyl geni varlığı saptanmamıştır (Çizelge 4.1). Enterokok suşlarında hyl geni bulunma sıklığı % 5.5 (3/54) olarak saptanmıştır. Tez kapsamında elde edilen bulgulara benzer olarak Türkiye de yapılan bir çalışmada da 116 E. faecium ve E. faecalis suşu arasından sadece 3 E. faecium suşunun hyl geni içerdiği bildirilmiştir (Saba vd., 2016). Boussouar vd. (2017), ise deve sütünden izole edilmiş 26 enterokok suşundan 8 inin hyl geni içerdiğini rapor etmişlerdir. 52

64 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Tez çalışması kapsamında peynirden izole edilen toplam 54 YSAD enterokok (25 E. faecalis, 15 E. faecium, 12 E. durans ve 2 E. gallinarum) suşunda fenotipik ve genotipik yöntemler kullanılarak virülens faktörleri araştırılmıştır. Spesifik primerler aracılığı ile PZR yöntemi kullanılarak 16 farklı virülens determinantın araştırıldığı tez çalışması sonucu enterokok suşlarının (E. faecium RS32.2 hariç) 1 ile 9 arasında değişen sayıda virülens faktör determine eden gen içerdiği tespit edilmiştir. E. faecalis RS27.4 (efaafs +, cpd +, cob +, ccf +, ace +, acm +, agg +, cyla +, espfs + ) ve E. faecalis RS27.6 (gele +, efaafs +, cpd +, cob +, ccf +, ace +, agg +, cyla +, espfs + ) 9 adet ile en fazla virülens faktör determine eden gen içeren suşlar oldukları belirlenmiştir. YSAD enterokok suşlarında seks feromon (ccf ve cdp), hücre duvarı adhezini (efaafs), kollagen bağlayan protein (acm ve ace), jelatinaz (gele) ve ekstraselüler yüzey proteinini (espfs) determine eden genlerin en sık rastlanılan virülens genler olduğu tespit edilmiştir. YSAD enterokok suşlarında ccf geninin bulunma sıklığı % (48/54), efaafs geninin bulunma sıklığı % (46/54), acm geninin bulunma sıklığı % (42/54), gele geninin bulunma sıklığı % 59,26 (32/54), cdp geninin bulunma sıklığı % (28/54), espfs geninin bulunma sıklığı % 50 (27/54) ve acm geninin bulunma sıklığı % (20/54) olarak hesaplanmıştır. Diğer genlerinin bulunma sıklığı ise efaafm % (11/54), cob % 9.26 (5/54), agg % 9.26 (5/54), cyla % 9.26 (5/54), hyl % 5.56 (3/54) cylb % 3.70 (2/54) ve espfm % 1.85 (1/54) olarak hesaplanmıştır. YSAD enterokok suşlarının hiçbirinde cad ve cylm genlerinin varlığına rastlanılmamıştır. Fenotipik ve genotipik analizler birlikte yorumlandığı zaman E. faecalis RS21.1, RS21.2, RS21.3, RS21.4, RS25.1, RS25.2, RS25.3, RS27.3, RS27.6, RS32.3, RS32.5, RS32.6, RS36.4 ve RS62.1, E. durans RG22.1, RG22.2, RS32.4, RS36.3, RS42.1, RS42.2, RS42.3, RS50.1 ve RS85.1 ve E. faecium RS12.1, RG22.3, RS36.1, RS36.2, RG36.1, RS74.2 ve RS88.1 suşlarının sessiz gele geni içerdiği tespit edilmiştir. YSAD enterokok suşları arasından E. durans RG22.2, E. gallinarum RG46.2 ve E. faecium RS74.1 suşlarının hemolitik aktivite göstermeleri virülens faktör taşımaları bakımından önem taşımaktadır. 53

65 Tez kapsamında kullanılan geleneksel peynir örneklerinden izole edilen yüksek seviyede aminoglikozid dirençli (streptomisin/gentamisin) enterokok suşlarının aynı zamanda çok sayıda virülens faktör içermeleri tüketici sağlığı açısından endişe uyandırıcıdır. Elde edilen bulgular fermente gıda üretiminde starter kültür olarak kullanılacak enterokok suşlarının dikkatli bir güvenlik değerlendirilmesi gerektirdiğini göstermiştir. Bu nedenden dolayı, geleneksel fermente gıda maddelerinin üretiminde de tüketici sağlığı açısından mevcut riskleri azalmak için virülens faktör içermeyen enterokok suşlarının starter kültür kombinasyonlarında kullanılması gerekmektedir. 54

66 KAYNAKLAR Akgül, Ö., Tavuk ve Martı Kaynaklı Enterokok Türlerinin Antibiyotik Dirençliliğinin Fenotipik ve Genotipik Analizi. Doktora Tezi, T.C. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Van. Akpınar-Kankaya, D., Özden-Tuncer, B., Tuncer, Y., Gıda Kaynaklı Enterokokların Potansiyel Risk Faktörleri. Gıda Derleme, Avcı, M., Özden-Tuncer, B., Safety Evaluation of Enterocin Producer Enterococcus sp. Strains Isolated from Traditional Turkish Cheeses. Polish Journal of Microbiology,2, Ben Belgacem, Z., Abriouel, H., Ben Omar, N., Lucas, R., Martinez-Canamero, M., Galvez, A., Manai, M., Antimicrobial Activity, Safety Aspects, and Some Technological Properties of Bacteriocinogenic Enterococcus faecium from Artisanal Tunisian Fermented Meat. Food Control, 21. Ben Omar, N., Castro, A., Lucas, R., Abriouel, H., Yousif, N.M.K., Franz, C.M.A.P., Holzapfel, W.H., Perez-Pulido, R., Functional and Safety Aspects of Enterococci Isolated from Different Spanish Foods. Systematic and Applied Microbiology, 27, Boussouar, N., Caracterısatıon Technologıque et Sanitaire des Enterocoques Isoles à Partır de Laıt de Chamelle du Sud-Ouest Algerıen. Universié Aboubeka Belkaid Tlemcen, Département de Biologie, Doktora Tezi, 427s, Cezai. Brown, N.M., Cookson, B.D., Duckworth, G., Farrington, M.G.L., King, L., Lewis, D., Livermore, D.M., National Glycopeptide-Resistant Enterococcal Bacteraemia Surveillance. Working Group report to the Department of Health August Journal of Hospital Infection, Busani, L., Del Grosso, M., Paladini, C., Graziani, C., Pantosti, A., Biavasco, F., Caprioli, A., Antimicrobial Susceptibility of Vancomycin-Susceptible and Resistant Enterococci Isolated in Italy from Raw Meat Products, Farm Animals, and Human Infections. International Journal of Food Microbiology,97, Buydens, P., Debeuckelaere S., Efficacy of SF 68 in the Treatment of Acute Diarrhea. A Placebo-Controlled Trial. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 31, Camargo, C.H., Bruder-Nascimento, A., Lee, S.H.I., Junior, A.F., Kaneno, R., Rall, V.L.M., Prevalence and Phenotypic Characterization of Enterococcus ssp. Isolated from Food in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 45,

67 Cancilla, M. R., Powell, I. B., Hillier, A. J., Davidson, B. E., Rapid Genomic Fingerprinting of Lactococcus lactis Strains by Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction with P and Fluorescent Labels. Applied and Environmental Microbiology, Cariolato, D., Andrighetto, C,, Lombardi, A., Occurrence of Virulence Factors and Antibiotic Resistances in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium Collected from Dairy and Human Samples in North Italy. Food Control, 19, Carvalho, M.G.S., Shewmaker, P.L., Steigerwalt, A.G., Morey, R.E., Sampson, A.J., Joyce, K., Barrett, T.J., Teixeira L.M., Facklam, R.R., Enterococcus caccae sp. nov., Isolated from Human Stools. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, Chajęcka-Wierzchowska, W., Zadernowska, A., Zakrzewski, A., Prevalence and Biofilm Forming Ability of Listeria Monocytogenes Isolated From Meat. CBU International Conference on Innovations in Science and Education, March, 22-24, 2017, Prague, Czech Republıc. Chajęcka-Wierzchowska, W., Anna Zadernowska, A., Łaniewska-Trokenheim, Ł., Diversity of Antibiotic Resistance Genes in Enterococcus Strains Isolated from Ready-to-Eat Meat Products. Journal of Food Sciences, Vol. 81. Chen, Y.S., Lin, Y.H., Pan, S.F., Ji, S.H., Chang, Y.C., Yu, C.R., Liou, M.S., Wu, H.C., Otoguro, M., Yanagida, F., Liao, C.C., Chiu, C.M., Huang, B.Q., Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis subsp. nov., isolated from Broccoli. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63, Choi, J.M., Woo, G.J., Molecular Characterization of High-Level Gentamicin- Resistant Enterococcus faecalis from Chicken Meat in Korea. International Journal of Food Microbiology, 165, 1 6. Clewell, D.B., Francia, V.M., Flannagan, S.E., An, F.Y., Enterococcal Plasmid Transfer: Sex Pheromones, Transfer Origins, Relaxases, and the Staphylococcus aureus Issue. Plasmid, 48, Collins, M.D., Jones, D., Farrow, J.A. E., Kilpper-Bälz, R., Schleifer, K.H., Enterococcus avium nom. rev., comb. nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb. nov.; E. durans nom. rev., comb. nov.; E. gallinarum comb. nov.; and E. malodoratus sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 34, Collins, M. D., Farrow, J. A., Enterococcus hirae, a New Species that Includes Amino Acid Assay Strain NCDO 1258 and Strains Causing Growth 56

68 Depression in Young Chickens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 35, Collins, M.D., Farrow, J.A.E., Jones, D., Enterococcus mundtii sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 36, Collins, M.D., Facklam R.R., Identification of Enterococcus Species Isolated from Human Infections by a Conventional Test Scheme. Journal of Clinical Microbiology, 4, Collins, M.D., Rodrigues, U.M., Pigott, N.E., Facklam, R.R., Enterococcus dispar sp. nov. a new Enterococcus species from Human Sources. Letters in Applied Microbiology, 12, Cosentino, S., Podda, G.S., Corda, A., Fadda, M.E., Deplano, M., Pisano, M.B., Molecular Detection of Virulence Factors and Antibiotic Resistance in Clinical Enterococcus faecalis Strains in Sardinia. Journal of Preventive Medicine and Hygiene, 1, Cotta, M.A., Whitehead, T.R., Falsen, E., Moore, E. and Lawson, P.A Erratum to: Two Novel Species Enterococcus lemanii sp. nov. and Enterococcus eurekensis sp. nov., Isolated from a Swine-Manure Storage Pit. Antonie van Leeuwenhoek, 103, Çelik, Ü., Alhan, E., Pediatrik Enfeksiyonlarda Zorlu Patojen Enterokoklar. Çocuk Enfeksiyonları Dergisi, 2, Dağdemir, E., Özdemir, S., 2006, Süt ve Mamullerinde Enterokoklar. Türkiye 9. Gıda Kongresi; Mayıs 2006, Bolu. De Graef, E.M., Devriese, L.A., Vancanneyt, M., Baele, M., Collins, M.D., Lefebvre, K., Swıngs, J., Haesebrouck, F Description of Enterococcus canis sp. nov. from Dogs and Reclassification of Enterococcus porcinus Teixeira et al as a Later Synonym of Enterococcus villorum Vancanneyt et al International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53, De Perio, M.A., Yarnold, P.R., Warren, J., Noskin, G.A., Risk Factors and Outcomes Associated with Non-Enterococcus faecalis, Non-Enterococcus faecium Enterococcal Bacteremia. Infection Controland and Hospital Epidemiology, 27, De Vaux, A., Laguerre, G., Diviès, C., Prévost, H., Enterococcus asini sp. nov. Isolated from the Caecum of Donkeys Equus asinus. International Journal of Systematic Bacteriology, 48, De Vuyst, L., Moreno, M.R., Revets, H., Screening for Enterocin and Detection of Hemolysin and Vancomycin Resistance in Enterococci of Different Origins. International Journal of Food Microbiology, 84,

69 Devriese, L.A., Baele, M., Butaye, P., The Genus Enterococcus: Taxonomy In Prokaryotes 3 rd Edition (Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., stackebrandt, E., Eds): 4 pp Springer, New York, NY,USA. Domingos-Lopes M.F.P., Stanton C., Ross P.R., Dapkevicius M.L.E., Silva C.C.G., Genetic Diversity, Safety and Technological Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from Artisanal Pico Cheese. Journal of Food Microbiology, 63, Dworkin, M., Briana, K.K., Dunny, G.M., Pheromone-Inducible Conjugation in Enterococcus faecalis: A Model for the Evolution of Biological Complexity. International Journal of Medical Microbiology, 296, Eaton, T.J., Gasson, M.J., Molecular Screening of Enterococcus Virulence Determinants and Potential for Genetic Exchange Between Food and Medical Isolates. Applied and Environemental Microbiology, 67, Eaton, T.J., Gasson, M.J., A Variant Enterococcal Surface Protein Espfm in Enterococcus faecium; Distribution Among Food, Commensal, Medical, and Environmental Isolates. FEMS Microbiology Letters, 216, Foulquie Moreno, M.R., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L., The Role and Application of Enterococci in Food and Health. International Journal of Food Microbiology, 106, Fortina, M.G., Ricci, G., Mora, D., Manachini, P.L., Molecular Analysis of Artisanal Italian Cheeses Reveals Enterococcus italicus sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, Franz, C.M.A.P., Holzapfel, W.H., Stiles, M.E., Enterococci at the Crossroads of Food Safety, International Journal of Food Microbiology,47, Franz, C.M.A.P., Stiles, M.E., Schleifer, K.H., Holzapfel W.H., Enterococci in Foods and Conundrum for Food Safety. International Journal of Food Microbiology, 88, Frolkov, P., Švec, P., Sedláček, I., Mašlaňová, I., Černohlávková, J., Ghosh, A., Zurek, L., Radiměřský, T., Literák, I., Enterococcus alcedinis sp. nov., Isolated from Common Kingfisher (Alcedo atthis). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63: Gardiner, G.E., Ross, R.P., Wallace, J.M., Scanlan, F.P., Jagers P.P.J.M., Fitzgerald, G.F., Collins, J.K., Stanton, C., Influence of a Probiotic Adjunct Culture of Enterococcus faecium on the Quality of Cheddar Cheese. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47,

70 Gilmore, M., The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology and Antibiotic Resistance. Washington, DC: American Society for Microbiology. Giraffa, G., Functionality of Enterococci in Dairy Products. International Journal of Food Microbiology, 88, Gomes, B.C., Esteves, C.T., Palazzo, I.C., Darini, A.L.C., Felis, G E., Sechi, L.A., De Martinis, E. C., Prevalence and Characterization of Enterococcus spp. Isolated from Brazilian Foods. Food Microbiology, 25(5), Hacker, J. Ve Kaper, J.B., Pathogenicity Islands and the Evolution of Microbes. Annual Review of Microbiology, 54, Hynes, W.L., Walton, S.L., Hyaluronidases of Gram-Positive Bacteria. Microbiology Letters, 183, Inoğlu Z.N Tulum Peynirden İzole Edilen Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis Suşlarının Virülens Faktörlerinin ve Dekarbosilaz Aktivitelerinin Belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 78s, Isparta. Ispirli, H., Demirbaş, F., Dertli, E., Characterization of Functional Properties of Enterococcus spp. Isolated from Turkish White Cheese. Food Science and Technology, 75, İşleroğlu, H., Yıldırım, Z., Demirpençe, Y., Yıldırım, M., Enterokoklar: Biyokimyasal, Fizyolojik ve Fonksiyonel Özellikleri ile Patojenitesi. Derleme Makale. Akademik Gıda, 6(3), Kadri, Z., Spitaels, F., Cnockaert, M., Praet, J., El Farricha, O., Swings, J., Vandamme, P., Enterococcus bulliens sp. nov., a Novel Lactic Acid Bacterium Isolated from Camel milk. Antonie van Leeuwenhoek 108, Kim, J.Y., Shin, N.R., Na, H.K., Hyun, D.W., Whon, T.W., Kim, P.S., Yun, J.H., Bae, J.W., Enterococcus diestrammenae sp. nov., Isolated from the Gut of Diestrammena coreana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63, Klare, I., Konstabel, C., Badstubner, D., Werner, G., Witte, W., Occurrence and Spread of Antibiotic Resistances in Enterococcus faecium. International Journal of Food Microbiology, 88, Klein, G., Taxonomy, Ecology and Antibiotic Resistance of Enterococci from Food and the Gastro-Intestinal Tract. International Journal of Food Microbiology, 88, Koort J., Coenye T., Vandamme P., Sukura A., Björkroth J., Enterococcus hermanniensis sp. nov., from Modified-Atmosphere-Packaged Broiler Meat 59

71 and Canine Tonsils. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, Kuhn, I., Iversen, A., Burman, L.G., Olsson-Liljequist, B., Franklin, A., Finn, M., Aarestrup, F., Seyfarth, A.M., Blanch, A.R., Comparison of Enterococcal Populations in Animals, Humans, and the Environmental European study. International Journal of Food Microbiology, 88, Kusuda, R., Kawai, K., Fluvio, S., Fryer, J.L., Enterococcus seriolicida sp. Nov, a Fish Pathogen. International Journal of Systematic Bacteriology, 41, Kürekci, C., Yılmaz, E.S., Aslantaş, Ö., Önen, S.P., Türkyılmaz S., Prevalence, Antimicrobial Resistance and Virulence Traits in Enterococci from Food of Animal Origin in Turkey, 66, Latasa, C., Solano, C., Penade S.J. R., Lasa, I Biofilmassociated Proteins. Compte Rendus Biologie, 329, 849. Law-Brown, J. Ve Meyers, P.R., Enterococcus phoeniculicola sp. nov., a novel member of the enterococci isolated from the uropygial gland of the Red-billed Woodhoopoe, Phoeniculus purpureus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53, Lazreg, L., ZadiI Karam, H., Dalache, F., Bactériocines d Entérocoques Isolés de Lait Cru et Beurre de l Ouest Algérien. Université d Oran, Doktora Tezi, 158p, Oran/Cezayir. Li, C.Y., Tian, F., Zhao, Y.D., Gu, C.T., Enterococcus xiangfangensis sp. nov., Isolated from Chinese Pickle. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64, López-Díaz, T.M., Santos, J.A., Gonzalez, C.J., Garcia M.L., Bacteriological Quality of a Traditional Spanish Blue Cheese. Milchwissenschaft, 50, Lucena-Padrós, H., González, J.M., Caballero-Guerrero, B.N., Ruız-Barba, J.L., Maldonado-Barragán, A., Enterococcus olivae sp. nov., Isolated from Spanish-Style Green-Olive Fermentations. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64, Metan, G., Zarakolu, P., Unal, S., Rapid Detection of Antibacterial Resistance in Emerging Gram-Positive Cocci. Journal of Hospital Infection, 61, Morandi, S., Cremonesi, P., Povolo, M., Brasca, M., Enterococcus lactis sp. from Italian Raw Milk Cheeses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62,

72 Moreno, M.R.F., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E. and De Vuyst, L., The Role and Application of Enterococci in Food and Health. International Journal of Food Microbiology, 106, Muguerza, B., Ramos, M., Sanchez, E., Manso, M.A., Miguel, M., Aleizandre, A., Delgado M.A., Recio, I., Antihypertensive Activity of Milk Fermented by Enterococcus faecalis Strains Isolates From Raw Milk. International Dairy Journal, 16, Mundt, J.O., Enterococci. Manual of Systematic Bacteriology, 2, Mutnick, A. H., Biedenbach, D.J., Jones, R.N Geographic Variations and Trends in Antimicrobial Resistance Among Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program ( ). Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases, 46, Naser, S.M., Vancanneyt, M., De Graef, E., Devriese, L.A., Snauwaert, C., Lefebvre, K., Hoste, B., Švec, P., Decostere, A., Haesebrouck, F. and Swings, J Enterococcus canintestini sp. nov., from Faecal Samples of Healthy Dogs. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, Niemi, R.M., Ollinkangas, T., Paulin, L., Švec, P., Vandamme, P., Karkman, A., Kosina, M., Lindström, K., Enterococcus rivorum sp. nov., from Water of Pistine Brooks. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, Ozmen Toğay, S., Celebi Keskin, A., Açık, L., Temiz, A., Virulence Genes, Antibiotic Resistance and Plasmid Profiles of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from Naturally Fermented Turkish Foods. Journal of Appliyed Microbiology, 109, Pérèz-Pulido, R., Abriouel, H., Ben Omar, N., Lucas, R., Martinez, M., Galvez, A., Safety and Potential Risks of Enterococci Isolated from Traditional Fermented Capers. Food and Chemical Toxicology, 44, Pompei, R., Berlutti, F., Thaller, M.C., Ingianni, A., Cortis, G., Dainelli, B., Enterococcus flavescens sp. nov., a New Species of Enterococci of Clinical Origin. International Journal of Systematic Bacteriology, 42, Rahkila, R., Johansson, P., Säde, E., Björkroth, J., Identification of Enterococci from Broiler Products and a Broiler Processing Plant and Description of Enterococcus viikkiensis sp. nov. Applied and Environmental Microbiology, 77,

73 Rich, R.L., Kreikemeyer, B., Owens, R.T., LaBrenz, S., Narayana, S.V., Weinstock, G.M., Murray, B.E., Höök, M., 1999 Ace is a Collagen-Binding MSCRAMM from Enterococcus faecalis. Journal of Biological Chemistry, 74, 45. Ruoff, K.L., De la Maza, l., Murtagh, M.J., Spargo, J.D., Ferraro, M.J., Species Identities of Enterococci Isolated from Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, 28 (3), Saba, Ç.Ş., Şahin, F., Göçmen, S.J., Determination of Virulence and Multidrug Resistance Genes with Polymerase Chain Reaction in Vancomycin-Sensitive and Resistant Enterococci Isolated from Clinical Samples. Turkish Journal of Medical Sciences, 46, Santos C. S.,Fraqueza J. M., Elias M., Barreto S. A.,Teresa Semedo-Lemsaddek T., Traditional Dry Smoked Fermented Meat Sausages: Characterization of Autochthonous Enterococci. Journal of Food Science and Technology, 79, Sava, I.G., Heikens, E., Huebner, J., Pathogenesis and Immunity in Enterococcal Infections. Clinical Microbiology and Infection, 16, Schleifer, K.H., Kilpper-Bälz, R., Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic and Bacteriology. Sedláček, I., Holochová, P., Mašlaňová, I., Kosina, M., Spröer, C., Bryndová, H., Vandamme, P., Rudolf, I., Hubálek, Z., Švec, P., Enterococcus ureilyticus sp. nov. and Enterococcus rotai sp. nov., Two Urease- Producing Enterococci from the Environment. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63, Semedo, T., Santos, M.A., Lopes, M.F., Marques, J.J.F., Crespo, M.T., Tenreiro, R Virulence Factors in Food, Clinical and Reference Enterococci: A Common Trait in the Genus. Systematic and Applied Microbiology, 26, Sistek, V., Maheux, A.F., Boissinot, M., Bernard, K.A., Cantin, P., Cleenwerck, I., De Vos, P., Bergeron, M.G., Enterococcus ureasiticus sp. nov. And Enterococcus quebecensis sp. nov., Isolated from Water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, Sukontasing, S., Tanasupawat, S., Moonmangmee, S., Lee, J.S., Suzuki, K., Enterococcus camelliae sp. nov., Isolated from Fermented Tea Leaves in Thailand. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57,

74 Şentürk, E., Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Suşlarının Moleküler Düzeyde Tanımlanması ve Antibiyotik Dirençlilik Düzeylerinin Saptanması. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 124s, Ankara. Švec, P., Vancanneyt, M., Devriese, L.A., Naser, S.M., Snauwaert, C., Lefebvre, K., Hoste, B., Swings, J., Enterococcus aquimarinus sp. nov., isolated from sea water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, Švec, P., Vancanneyt, M., Sedláček, I., Naser, S.M., Snauwaert, C., Lefebvre, K., Hoste,B., Swings, J., Enterococcus silesiacus sp. nov. and Enterococcus termitis sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, Švec, P., Vandamme, P., Bryndová, H., Holochová, P., Kosina, M., Mašlaňová, I., Sedláček, I., Enterococcus plantarum sp. nov., Isolated from Plants. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, Tanasupawat, S., Sukontasing, S., Lee, J.S., 2008, Enterococcus thailandicus sp. nov., isolated from fermented sausage 'mum' in Thailand. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58, Tendolkar, P.M., Baghdayan, A.S., Shankar, N., Pathogenic Enterococci: New Developments in the 21st Century. Cellular and Molecular Life Sciences, 60, Teixeira, L.M., Carvalho, M. D. G.S., Espinola, M.M.B., Steigerwalt, A.G., Douglas, M.P., Brenner, D.J., Facklam, R.R Enterococcus porcinus sp. nov. and Enterococcus ratti sp. nov., Associated with Enteric Disorders in Animals. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, Trivedi, K., Cupakova, S., Karpiskova, R., Virulence Factors and Antibiotic Resistance in Enterococci Isolated from Food-Stuffs. Veterinarni Medicina, 56, Tyrrell, G.J., Turnbull, L., Teixeira, L.M., Lefebvre, J., Carvalho, M.G.S., Facklam, R.R., Lovgren, M., Enterococcus gilvus sp. nov. and Enterococcus pallens sp. nov. Isolated from Human Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, 40, Upadhyaya, P.M., Ravikumar, K.L., Umapathy, B.L., Review of Virulence Factors of Enterococci: an Emerging Nosocomial Pathogen. Indian Journal Medical Microbiology, 27, Vancanneyt, M., Lombardı, A., Andrıghetto, C., Knııjff, E., Torrıanı, S., Bjorkroth, K.J., Franz, C.M., Foulquıe Moreno, M.R., Revets, H., De Vuyst, L., Swıngs, J., Kersters, K., Dellaglıo, F., Holzanpfel, W.H., Intraspecies Genomic 63

75 Groups in Enterococcus faecium and their Correlation with Origin and Pathogenicity. Applied and Environmental Microbiology, 68, Vancanneyt M., Zamfır M., Devriese L.A., Lefebvre K., Engelbeen K., Vandemeulebroecke K., Amar M., De Vuyst L., Haesebrouck F., Swıngs J., Enterococcus saccharominimus sp. nov., from Dairy Products. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, Vankerckhoven, V., Van Autgaerden, T., Vael, C., Lammens, C., Chapelle, S., Rossi, R., Jabes, D., Goossens, H Development of a Multiplex PCR for the Detection of asa1, gele, cyla, esp and hyl Genes in Enterococci and Survey for Virulence Determinants Among European Hospital Isolates of Enterococcus faecium. Journal of Clinical Microbiology, 42, Wheeler, A.L., Hartel, P.G., Godfrey, D.G., Hill, J.L., Segars, W.I., Potential of Enterococcus faecalis as a Human Fecal Indicator for Microbial Source Tracking. Journal of Environmental Quality, 31, Williams, J.J., Hergenrother, P.J Exposing Plasmids as the Achilles Heel of Drug-Resistant Bacteria. Current Opinion in Chemical Biolology, 12, Yıldız, C., Tavuk Etlerinde Enterococcus Spp. lerin Prevelansı, Biyofilm Özellikleri ve Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Dumlupınar Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Isparta. Yoğurtçu, N Tulum Peynirinden Enterokok Suşlarının İzolasyonu ve Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 70s, Isparta. Yousif, N.M., Dawyndt, P., Abriouel, H., Wijaya, A., Schillinger, U., Vancanneyt, M., Swings, J., Dirar, H.A., Holzapfel, W.H., Franz, C.M., Molecular Characterization, Technological Properties and Safety Aspects of Enterococci from 'Hussuwa', an African Fermented Sorghum Product. Journal of Appliyed Microbiology, 98, Yüksel, F.N Gıda Kaynaklı Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium Suşlarında Virülans Faktörlerin Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 116s, Ankara. 64

76 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Degnide Ephrem ADIFON Doğum Yeri ve Yılı : Benin, 1990 Medeni Hali Yabancı Dili E-posta : Bekar : Engilizce, Francızca : euphremadifon@yahoo.fr Eğitim Durumu Lise : Benin, 2009 Lisans : University of Abomey-Calavi Benin 2012 Mesleki Deneyim NGO CEBEDES Yayınları Degnide Ephrem ADIFON, Yasin TUNCER Investigation of virulence factors in high-level aminoglycoside resitant (HLAR) enterococci isolated from cheese. International Eurasian Conference on Biological and Chemical Sciences (EurasianBioChem 2018) April 2018, Ankara Turkey, 1017p. Degnide Ephrem ADIFON, Didem KANKAYA-AKPINAR, Banu ÖZDEN-TUNCER, Yasin TUNCER Virulence factors of food originated enterococci. International Eurasian Conference on Biological and Chemical Sciences (EurasianBioChem 2018) April 2018, Ankara Turkey, 1020p. 65