ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ BĠLĠMSEL ARAġTIRMA PROJELERĠ KOORDĠNASYON BĠRĠMĠ KOORDĠNATÖRLÜĞÜNE. : Lisansüstü Tez Projesi (Yüksek Lisans)

Transkript

1 ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ BĠLĠMSEL ARAġTIRMA PROJELERĠ KOORDĠNASYON BĠRĠMĠ KOORDĠNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yürütücüsü : Lisansüstü Tez Projesi (Yüksek Lisans) : 16L : Doç. Dr. Pınar ŞANLIBABA Proje BaĢlığı :Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Suşlarının Gıdalardan İzolasyonu, Moleküler Düzeyde Tanımlanması ve Antibiyotik Dirençlilik Düzeylerinin Fenotipik Düzeyde Saptanması Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM GEREKÇESİ: Doç. Dr. Pınar ŞANLIBABA Proje Yürütücüsü İmza

2 ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ BĠLĠMSEL ARAġTIRMA PROJESĠ SONUÇ RAPORU Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Suşlarının Gıdalardan İzolasyonu, Moleküler Düzeyde Tanımlanması ve Antibiyotik Dirençlilik Düzeylerinin Fenotipik Düzeyde Saptanması Doç. Dr. Pınar ŞANLIBABA (Yürütücü) Esra ŞENTÜRK (Araştırmacı) Proje Numarası: 16L Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2017

3 1. PROJENĠN TÜRKÇE VE ĠNGĠLĠZCE ADI VE ÖZETLERĠ Projenin Türkçe Adı: Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Suşlarının Gıdalardan İzolasyonu, Moleküler Düzeyde Tanımlanması ve Antibiyotik Dirençlilik Düzeylerinin Fenotipik Düzeyde Saptanması ÖZET: Bu çalışmada Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlardan temin edilen 503 adet farklı non-fermente ve fermente gıda örneğinden, 459 tanesinde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmiştir. Bunlardan 165 i mm arasında değişen tür içi antibakteriyel inhibisyon zonu oluşturmuştur. 165 izolatın tamamı ph 9,6 da, % 6,5 NaCL de ve o C de gelişim özelliği göstermiştir. Gr (+), katalaz (-) ve eskulin hidrolizi (+) olarak da tanımlanan 165 izolat, muhtemel Enterococcus spp. olarak belirlenmiştir. 140 izolat α-hemolitik, 12 izolat β-hemolitik ve 13 izolat ise γ- hemolitik yapı göstermiştir. İndikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan 100 enterokok izolatı seçilmiş ve bu suşlara API20 Strep test kitleri uygulanarak tür düzeyinde tanımlama yapılmıştır. 16S rdna dizi analizleri sonucunda 100 enterokok suşunun 61 i E. faecium ve 39 u E. faecalis olarak belirlenmiştir. Tür düzeyinde tanımlamada API20 Strep test kitleri ile elde edilen başarı oranının % 68 olduğu saptanmıştır. Fermente ve non fermente et ürünlerinde baskın tür olarak E. faecium, fermente peynir örneklerinde ise E. faecalis tanımlanmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde 12 antibiyotik diski kullanılmıştır. Enterococcus suşlarının tamamı streptomisin ve vankomisine karşı duyarlılık gösterirken, nalidilik aside karşı % 100 dirençlilik göstermiştir. Enterococcus suşlarının antibiyotik dirençlilikleri; kanamisine % 99, rifampine % 81, ampisiline % 60, eritromisine % 37, siprofloksasine % 34, tetrasikline % 9, penisilin G ye % 8, kloramfenikole % 3 ve gentamisine % 2 olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda E. faecalis suşlarının E. faecium suşlarına oranla daha fazla dirençlilik fenotipi gösterdiği belirlenmiştir.

4 Projenin Ġngilizce Adı: Isolation of Enterococcus spp. with antimicrobial activity from foods, molecular identification and phenotypic characterization of antibiotic resistance ABSTRACT: In this study, suspicious colony morphology for Enterococcus was observed in 459 out of 503 different non-fermented and fermented food samples from bazaars, butchers and markets in Ankara. Among them 165 isolates showed in-species antibacterial inhibition zones ranging from mm. All the isolates had showed optimal growth at ph 9.6, 6.5% NaCL and C. Also identified as Gr(+), catalase(-) and esculin hydrolysis(+) they were determined as possible Enterococcus spp. Out of 165 isolates, 140 isolates were α-hemolytic, 12 isolates β-hemolytic and 13 isolates γ-hemolytic. Among them, 100 enterococcal isolates with the highest inhibition zone against indicator strain were selected and identified using API20 Strep kits. As a result of 16S rdna sequence analysis, 61 of the 100 enterococci strains were identified as E. faecium and 39 as E. faecalis. Identification at the species level, the success rate achieved with API20 Strep test kits was found as 68%. While E. faecium was the dominant species in fermented and non-fermented meat products, E. faecalis strains were dominant in fermented cheese samples. To determine the antibiotic susceptibility level of Enterococcus strains, 12 antibiotic discs were used. While all Enterococcus strains were susceptible to streptomycin and vancomycin, they showed 100% resistance against nalidixic acid. Antibiotic resistance of Enterococcus strains was found as; kanamycin 99%, rifampin 81%, ampicillin 60%, erythromycin 37%, ciprofloxacin 34%, tetracycline 9%, penicillin G 8%, chloramphenicol 3% and gentamicin 2%. In our study, it was determined that E. faecalis strains showed more resistance phenotype than E. faecium strains

5 2. AMAÇ VE KAPSAM Başta süt ürünleri olmak üzere gıdalarda yaygın ve yüksek oranlarda bulunabilen enterokoklar; bakteriyosin üretimi ve probiyotik karakter gibi önemli biyoteknolojik özelliklere sahiptir. Bununla birlikte gıdalarda yaygın olarak bulunan enterokokal suşların sahip olduğu bu önemli teknolojik özelliklere karşılık, bazı türleri tüketim için güvenli kabul edilmez. Nosokomial enfeksiyonlar olarak bilinen bir dizi enfeksiyonların başlıca etmeni olan bu enterokok suşlarında, çeşitli virülens faktörler ve başta vankomisin olmak üzere çoklu antibiyotik dirençliliği tanımlanmaktadır. Özellikle çoklu antibiyotik dirence sahip enterokokların oranının dünyada ve ülkemizde giderek artıyor olması, antibiyotik duyarlılığa sahip suşların belirlemesini son yıllarda yapılan araştırmaların odak noktası haline getirmektedir. Ayrıca son yıllarda yapılan çalışmaların büyük bir çoğunluğunun odak noktasını klinik izolatlar oluşturmuş; bu izolatların direnç durumları ve mekanizmaları detaylı bir şekilde ortaya konmuştur. Kuşkusuz ki enterekokların Staphylococcus aureus tan sonra hastane enfeksiyonlarında en sık görülen bakteri olması ve birçok antimikrobiyal ajana karşı intrensek ve kazanılmış tipte dirençlilik göstermesi, klinik enterekok izolatlarını daima ilgi çekici kılacaktır. Bu proje ile farklı gıda kaynaklarından antimikrobiyel aktiviteye sahip enterekok suşlarının izole edilmesi, bu izolatların öncelikle fenotipik ve takiben moleküler düzeyde tanımlanması ile tanımlanan bu türlerin antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. İzolasyon materyali olarak Ankara ve çevre ilçelerde çeşitli market ve pazarlardan temin edilmiş olan geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile non-fermente gıdalar kullanılmış olup, bu çalışma ile hem enterekok izolasyonu açısından hem de gıda kökenli enterekokların antibiyotik duyarlılık düzeylerini saptama bakımından geniş kapsamlı bir tarama yapılmıştır. Farklı gıdalardan izole edilecek olan enterokok suşlarının olası antibiyotik dirençlilik düzeylerinin ve yaygınlığının (veya sıklığının) belirlenmesi, önerilen bu projeye özgünlük sağlamaktadır. Proje sonucunda elde edilecek veriler ile aynı zamanda literatürdeki önemli bir veri eksikliğinin giderilmesi amaçlanmıştır.

6 Projemiz kapsamında üç ana bölüm yer almaktadır. 1. Ankara ve çevre ilçelerde çeşitli market ve pazarlardan temin edilecek olan geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile non-fermente gıdalar izolasyon materyali olarak kullanılmış olup, antimikrobiyel aktiviteye sahip enterokok izolatları elde edilmiştir. İzolatların biyokimyasal tanımlanması için gram boyama, katalaz testi, eskulin hidrolizi, ph 9,6 da gelişme, % 6,5 NaCL de gelişme, 10 C ve 45 C de gelişme, hemoliz doğrulama testleri uygulanmıştır. Tüm testlerde enterokoklar için tipik reaksiyon gösteren antimikrobiyel aktiviteye sahip 100 adet enterekok izolatının API 20 Strep (Bio-Merieux, France) biyokimyasal test kitleri ile tür düzeyinde tanımlanması yapılmıştır. 2. Biyokimyasal tanımlaması yapılan 100 adet enterekok izolatının genotipik tanımlaması için öncelikle saflık kontrolü yapılmıştır. Suşların moleküler düzeyde tanımlanması için öncelikle genomik DNA izole edilmiştir. Örnekler Polimeraz Zincir Reaksiyonunda (PZR) kullanılmak üzere -20 C de muhafaza edilmiştir. İzole edilen genomik DNA üzerindeki 16S rdna bölgeleri; 16S ileri (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3') ve 16S geri (3'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -5') üniversal primerleri kullanılarak, thermal cycler (Techne- TC-512, England) da çoğaltılmıştır. PZR tüpleri, cihaza yerleştirilerek bir çevrimi 94 C de 30 saniye (çift zincirin açılması), 55 C de 60 saniye (primerlerin bağlanması), 72 C de 90 saniye (zincir uzaması) ve 72 C de 10 dakika şeklinde tanımlanan, toplam 30 çevrimlik PZR protokolü uygulanmıştır. PZR ürünleri % 1 agaroz içeren jelde yürütülerek 16S rdna gen bölgelerinin büyüklükleri kontrol edilmiş ve PZR ürünlerinin temizlenmesi için PZR saflaştırma kiti kullanılmıştır. Daha sonraki aşamada ise temizlenmiş PZR ürünlerinin iki yönlü DNA dizi analizi yapılmıştır. Dizi analiz sonuçları, BLAST (Basic Local Alingment Search Tool/ ) programı kullanılarak NCBI (National Center for Biotechnology Information) veri tabanında bulunan yaklaşık S rrna diziyle karşılaştırılmasıyla aranan dizi sırasının hangi mikroorganizmaya ait olabileceği, benzerlik yüzdesiyle belirlenmiştir. 3. Antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde Bauer vd., (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır. Projede kullanılan antibiyotikler ve disk konsantrasyonları ise şu şekilde sıralanmıştır: Penisilin

7 G (10 µg), Ampisilin (10 µg), Vankomisin (30 µg), Eritromisin (15 µg), Tetrasiklin (30 µg), Kloramfenikol (30 µg), Gentamisin (120 µg), Kanamisin (30 µg), Streptomisin (300 µg), Nalidiksik asid (30 µg), Rifampin (5 µg), Ciprofloksasin (5 µg). Paralelli olarak yapılan çalışmada antibiyotik disklerinin etrafında oluşan zonların çapı ölçülmüş ve iki çalışmanın ortalaması alınarak belirlenen sonuçlar Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI, 2011) ile Charteris ve arkadaşları (1998) tarafından bildirilen standartlara göre Dirençli (R), Yarı hassas (I) ve Hassas (S) olarak değerlendirilmiştir.

8 3.MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Gıda Örnekleri Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlarda satışa sunulan ve geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile non-fermente gıdalar izolasyon materyali olarak kullanılmıştır. Tek kullanımlık steril örnekleme kaplarına alınan gıda örnekleri, soğuk zincir korunarak Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuarına ulaştırılmış ve herhangi bir depolama işlemiuygulanmaksızın aynı gün içinde enterokok suşlarının izolasyon çalışmalarına başlanmıştır Referans Bakteriler Proje kapsamında kontrol amaçlı olarak kullanılmış olan Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli LMG 3083 (ETEC) ve Staphylococcus aureus ATCC 6538 referans suşları Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Prokaryot Genetiği Laboratuarı kültür koleksiyonundan temin edilmiştir Besiyerleri Proje kapsamında kullanılan besiyerleri ve ürün kodları Çizelge 1 de yer almaktadır. Çizelge 2 de ise moleküler çalışmalar sırasında kullanılan besiyerleri, çözeltiler ve ürün kodları belirtilmiştir.

9 Çizelge 1. Çalışmada Kullanılan Besiyerleri ve Ürün Kodları BESĠYERĠ ADI KODU FĠRMA Agar G SIGMA-ALDRICH API 20 Strep BIOMERIEUX Bile Eskulin Azide Agar MERCK Brain Heart Infusion (BHI)Broth MERCK Etanol MERCK Gliserol MERCK Hidrojen Peroksit(H 2 O 2 ) ( 30%) MERCK Kanamisin Eskulin Azide Agar (KAA) MERCK Gram-Boyama Seti MERCK Ringer Tableti MERCK Sodyum Klorür (NaCL) MERCK Sodyum Hidroksit (NaOH) MERCK Tryptik Soy Agar (TSA) MERCK Tryptik Soy Broth (TSB) MERCK

10 Çizelge 2. Moleküler Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri, Çözeltiler ve Ürün Kodları BESĠYERĠ ADI KODU FĠRMA 10*Taq Buffer (KCl ve 15 mm MgCl 2 ile birlikte) THERMO SCIENTIFIC 25mM MgCl THERMO SCIENTIFIC 6*DNA Loading Dye THERMO SCIENTIFIC Agaroz A G SIGMA-ALDRICH Kloroform MERCK dntp (100 mm) THERMO SCIENTIFIC Etidyum Bromit E7637-1G SIGMA-ALDRICH Etilendiaamintetraasetik asit (EDTA) E G SIGMA-ALDRICH Fenol (sıvı) pure grade TK TEKKİM Gene Ruler 1kb DNA Ladder THERMO SCIENTIFIC GeneJET PCR Purifikasyon Kiti THERMO SCIENTIFIC Izoamil Alkol MERCK RNaz A THERMO SCIENTIFIC Sodyumdodesil Sülfat (SDS) MERCK Sukroz MERCK Taq DNA Polimeraz THERMO SCIENTIFIC Tris (hidroksimetil aminometan) MERCK Tris-Hidroklorür T G SIGMA Antibiyotikler Tez çalışmasında antibiyotik duyarlılık deneylerinde ticari olarak temin edilen antibiyotik diskleri (BIOANALYSE) kullanılmıştır. Enterococcus faecalis ATCC standart suşu, antibiyotik duyarlılık deneylerinde kontrol suşu olarak

11 kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin sembol, grup ve disk konsantrasyonları Çizelge 3 de belirtilmiştir. Çizelge 3. Çalışmada Kullanılan Antibiyotikler ANTĠBĠYOTĠK SEMBOL GRUBU KATALOG NUMARASI DĠSK KONSANTRASYONU (µg) Penisilin G P Βeta laktam ASD µg Ampisilin AM Βeta laktam ASD µg Vankomisin VA Glikopeptid ASD µg Eritromisin E Makrolid ASD µg Tetrasiklin TE Tetrasiklin ASD µg Kloramfenikol C Fenikol ASD µg Gentamisin CN Aminoglikozid ASD µg Kanamisin K Aminoglikozid ASD µg Streptomisin S Aminoglikozid ASD µg Nalidiksik asid NA Kinolon ASD µg Rifampin RA Ansamisin ASD µg Siprofloksasin CIP Florokinolon ASD µg Bakterilerin Stok Kültürlerinin Hazırlanması Hem referans bakterilerinin hemde proje kapsamında fermente ve non-fermente gıdalardan izole edilen enterokok izolatlarının, % 20 gliserol içeren Brain Heart Infüsion (BHI) Broth stok kültürleri hazırlanmıştır. Stok kültür ortamları 20 C de muhafaza edilmiştir. Proje çalışması süresince kültürler BHI broth ortamında ve/veya Triptik Soy Broth (TSB) ortamında 37 C de 18 h geliştirildikten sonra denemeye alınmıştır.

12 3.2. Yöntem Gıda Örneklerinin Analize Hazırlanması ve Enterokokların Ġzolasyonu Gıda örnekleri, aseptik koşullara dikkat edilerek laboratuar ortamına getirilmiştir. Örnekler depolanmadan aynı gün içinde enterokok suşlarının izolasyonu amacıyla analize alınmıştır. Steril kaplarda net ağırlıkları 10 g olacak şekilde tartılan gıda örnekleri 90 ml seyreltme sıvısı ile homojenize edilmiştir. Seyreltme sıvısı olarak, peynir örnekleri için 1/4 kuvvetinde ringer çözeltisi, diğer gıda örnekleri için ise steril fizyolojik su (% 0,85' lik NaCL çözeltisi) kullanılmıştır. Seyreltme sıvısı ile homojenize edilen örnekler tam homojenizasyonun sağlanması amacıyla oda sıcaklığında 10 dk inkübe edildikten sonra, 10-5 düzeyine kadar seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Her bir dilüsyondan 100 µl alınarak, paralelli olacak şekilde Kanamisin Eskulin Azid Agar (KAA) besiyerine yayma kültürel ekimler yapılmıştır. 37 C de h süreyle inkübasyona bırakılan petrilerde, zeytin yeşili/siyah arası renk veren koloniler muhtemel enterokok olarak değerlendirilmiş ve koloni sayımları kob/g olarak hesaplanmıştır. İzolatların saflaştırılması amacıyla, tipik koloni morfolojisine sahip olan koloniler steril kürdan yardımıyla Triptik Soy Agara (TSA) nokta ekim yöntemi ile tekrar aktarılmış ve 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokok Ġzolatlarının Belirlenmesi TSA üzerinde gelişen koloniler steril kürdan yardımıyla alınıp nokta ekim yöntemi ile BHI Agar ortamına inoküle edilmiş ve 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda gelişen kolonilerin üzerine % 1 tür içi indikatör suş (Enterococcus faecalis ATCC 29212) içeren BHI yumuşak agar (% 0,7 agar oranı) ortamı dökülerek, 37 C de 24 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası indikatör suşa karşı zon oluşturan koloniler steril öze yardımıyla alınarak, BHI broth ortamına aktarılmıştır (Todorov vd. 1999, Harwood vd ). İnhibisyon zonu oluşturan muhtemel enterokok izolatlarına EP kodu, oluşturmayanlara ise rakamlarla

13 kod verilmiştir. Projenin bundan sonraki kısmında ise, antimikrobiyel aktiviteye sahip izolatlara morfolojik ve biyokimyasal testler uygulanmıştır Morfolojik ve Biyokimyasal Testler Gram Boyama Gram boyama işlemi Temiz (2000) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Tek ya da kısa zincirler halinde kok ya da kokobasil morfolojisine sahip gram pozitif izolatlar, tez kapsamındaki diğer çalışmalarda kullanılmak üzere % 20 steril gliserol içeren BHI broth ortamlarında mikrosantrifüj tüplerine alınarak -20 C de muhafaza edilmiştir Katalaz Testi TSA besiyerinde 37 C de 24 h inkübe edilerek gelişimi sağlanan kolonilerden, temiz bir lam üzerine tek bir koloni aktarılmıştır. Koloni üzerine % 3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) çözeltisi damlatılarak gaz çıkışı olup olmadığı kontrol edilmiştir. Kabarcıkların görülmesi halinde test pozitif olarak değerlendirilmiştir (Temiz 2000). Staphylococcus aureus ATCC 6538 kontrol suşu, katalaz testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır Eskulin Hidrolizi Muhtemel enterokok izolatlarından Bile Eskulin Azide Agar besiyeri üzerine yayma kültürel ekimler yapılmıştır. 37 C de 24 h inkübe edilerek, besiyerinde siyah pigment oluşumu eskulin hidrolizi testinin pozitif olduğunu göstermiştir (Navidghasemizad vd. 2009). Enterococcus faecalis ATCC kontrol suşu, eskulin hidrolizi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

14 ph 9,6 da GeliĢme Muhtemel enterokok izolatlarının ph 9,6 da gelişim düzeyini saptamak amacıyla, ph sı 9,6 ya ayarlanmış olan BHI broth besiyeri kullanılmıştır. % 1 oranında inokülasyonu yapılan kültürlerin, 37 C de h inkübasyon sonunda gelişimleri incelenmiştir (Manero ve Blanch 1999). Enterococcus faecalis ATCC kontrol suşu, ph 9,6 da gelişme testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir Tuz Toleransının Belirlenmesi Muhtemel enterokok izolatlarının tuz toleransının belirlenmesi amacıyla, % 6,5 NaCL içeren BHI broth besiyeri kullanılmıştır. % 1 oranında inokülasyonu yapılan kültürlerin, 37 C de h inkübasyon sonunda gelişimleri incelenmiştir (Facklam vd. 2002). Enterococcus faecalis ATCC kontrol suşu, tuz toleransının belirlenmesi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi Muhtemel enterokok izolatlarının sıcaklık toleranslarının belirlenmesi amacıyla, BHI broth ortamına % 1 oranında inoküle edilmiş kültürlerin 10 C ve 45 C de h inkübasyon sonunda gelişme özellikleri incelenmiştir (Facklam vd. 2002, Harwood vd. 2004). Enterococcus faecalis ATCC kontrol suşu, sıcaklık toleranslarının belirlenmesi testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Sıvı besiyerinde bulanıklığın gözlenmesi, pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir Hemoliz Testi Muhtemel enterokok izolatlarının hemolizin aktivitesinin belirlenmesinde Valenzuela vd. (2009) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. İzolatlardan % 5 (w/v) koyun kanı

15 içeren TSA besiyerine çizgi ekim şeklinde sürme işlemi uygulanmıştır. Kanlı agar ortamları 37 C' de h tutulmuş ve gelişen koloniler etrafındaki zonlar incelenmiştir. Kolonilerin etrafında kenarları keskin hatlı olmayan, bulanık ve yeşilimsi bir zon oluşumu α-hemolitik, düzgün bir hatla çevrilmiş temiz ve berrak bir zon oluşumu ise β-hemolitik olarak tanımlanmıştır. Kanlı agar üzerinde hemoliz oluşturmayan izolatlar ise γ-hemolitik olarak belirlenmiştir. Çalışmada kontrol bakterileri olarak Escherichia coli LMG 3083 (ETEC) ve Staphylococcus aureus ATCC 6538 kullanılmıştır API Testi , , , , ve da belirtilen testlerde enterokoklar için tipik reaksiyon veren izolatlar arasından, 100 adet tür içi indikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan Enterococcus spp. seçilmiş ve proje çalışmasının bundan sonraki kısmı, seçilen bu 100 adet enterokok izolatı üzerinden yürütülmüştür. Enterokok izolatlarının API 20 Strep (Biomerieux) biyokimyasal test kitleri ile tür düzeyinde tanımlanması yapılmıştır. API sistemindeki biyokimyasal testler, inkübasyon süresi sonunda kuyucuklarda gözlemlenen renk değişimlerine göre pozitif (+), negatif (-) veya şüpheli (?) olarak kaydedilmiştir. Sonuçlar Apiweb Identification Software Database (V8.1) kullanılarak izolatların tür düzeyinde tanımlanması yapılmıştır (Biomerieux 2004) Enterococcus SuĢlarının 16S rdna Dizi Analizi ile Tür Düzeyinde Moleküler Tanısı Toplam Genomik DNA Ġzolasyonu TSB besiyerinde 37 C de 18 h süreyle geliştirilen enterokok kültürlerinin ve şahit suşun (Enterococcus faecalis ATCC 29212) genomik DNA izolasyonu, Miteva vd. (1991) ve Cancilla vd. (1992) tarafından önerilen yöntemlerde bazı modifikasyonlar

16 yapılarak uygulanmıştır. 37 C de 18 hinkübe edilerek geliştirilen Enterococcus kültürleri, 10 ml lik steril santrifüj tüplerine aktarılmıştır rpm de 15 dksantrifüjişlemi uygulandıktan sonra supernetant kısmı dökülmüştür. Hücre çökeltisi 500 µl Tris-EDTA (TE) tampon içerisinde çözülerek, rpm devirde 1 dk oda sıcaklığında santrifüj edilmiştir. Santrüfüj işleminden sonra, süpernetant dökülmüş ve oluşan hücre çökeltisi üzerine 500 µl Sakkaroz-EDTA-Tris HCl (SET) tampon aktarılmıştır. Hücre çökeltisi tampon içinde tamamen çözündürüldükten sonra üzerine 30 µl lizozim eklenmiş ve 37 C'de 45 dk inkübe edilmiştir. 45 dk lık inkübasyon sonrasında, santrifüj tüplerindeki hacmin yarısı steril bir ependorfa aktarılmıştır. Bu içerik üzerine 200 µl TE tampon ve 30 µl % 20 lik taze hazırlanmış sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi ilave edilerek, birkaç kez elde çevrilerek ortam içeriğinin karışması sağlanmıştır. 5 M NaCL çözeltisinden 100 µl, bu karışım üzerine aktarılmış ve ortam içeriğinin karışması için yeniden elde çevirme işlemi uygulanmıştır. Daha sonra ortama eşit hacimde (~500 µl) % 3 tuza doyurulmuş fenol çözeltisinden eklenmiş ve emülsiyon oluşuncaya kadar elde çevrilerek karıştırılmıştır. Ortam +4 C de rpm devirde 15 dk santrifüj edilerek fazların ayrılması sağlanmıştır. Santrifüj işleminden sonra oluşan üst faz mikropipet yardımıyla alınarak steril bir eppendorfa aktarılmıştır. Eppendorflara aktarılan üst faz miktarı kadar (~500 µl) kloroformizoamil alkol çözeltisi (24/1) eklendikten sonra elde hafif karıştırma işlemi uygulanmış ve sonrasında oda sıcaklığında rpm devirde 15 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj işlemi berrak iki faz oluşuncaya kadar tekrar edilmiştir. Santrifüj sonunda berrak üst faz mikropipetlerle alınarak steril yeni bir eppendorfa aktarılmış ve üzerine aktarılan hacmin 2 katı kadar % 100 lük etil alkol ilave edilmiştir. Bu karışım +4 C de rpm devirde 15 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üst kısımdaki etil alkol dökülerek DNA pelet halinde elde edilmiştir. Oluşan çökelti 37 C'de 30 dk kurutulduktan sonra, 75 µl TE tampon çözeltisinde çözündürülmüştür. Bu karışım üzerine daha sonra 10 mg/ml konsantrasyonundaki RNaz A enziminden 2 µl eklenmiş ve 37 C'de tekrar 45 dk inkübasyon uygulanmıştır. 45 dkinkübasyon sonrasında elde edilen DNA saflığı spektrofotometrede A 260 /A 280 oranına bakılmak suretiyle ölçülmüştür. Elde edilen DNA peletleri 20 C de kullanılana kadar muhafaza edilmiştir.

17 Tris(hydroksimetil)aminometan / Etilen Diamin Tetra Asetik Asit (Tris-EDTA) Tris 1,21 g EDTA 0,37 g Destile su 1000 ml ph 7,4 ± 0,02 (Çözelti ph sı, 2 N HCL kullanılarak ayarlanmıştır. 121 C'de 15 dk sterilizasyon işlemi uygulanmıştır.) Sakkaroz-EDTA-Tris HCl (SET) Tris-HCL 0,788 g EDTA 1,86 g Sakkaroz 20 g Destile su 100 ml ph 8,0 ± 0,02 (Çözelti ph sı, 2 N HCL kullanılarak ayarlanmıştır. 121 C'de 15 dk sterilizasyon işlemi uygulanmıştır.) % 20 lik Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Çözeltisi SDS 20 g Steril destile su 100 ml Kloroform- Ġzoamil Alkol (24/1) Çözeltisi Kloroform 24 ml İzoamil Alkol 1 ml Toplam Genomik DNA Örneklerinin Elektroforezi % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde genomik DNA örneklerinin elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir. Elektroforez işlemi için yatay jel sistemleri kullanılmıştır. % 1 lik oranda tartılan agaroz, Tris-Asetat elektroforez tamponu içerisinde çözündürülmüş ve bu işlem için mikrodalga fırın kullanılmıştır. Hazırlanan ortam C ye kadar soğutulmuş ve elektroforez plakasına dökülmüştür. Jel tarakları yerleştirilerek, jelin polimerizasyonu için dk beklenilmiştir. Bu süre sonunda jelin üzerini tamamen

18 kapatacak şekilde elektroforez tankına Tris-Asetat tampon çözeltisi ilave edilerek, jel tarakları jele zarar vermeden çıkarılmıştır. 15 µl genomik DNA örneği, 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmıştır. Mikropipetler yardımıyla örneğin tamamı jel kuyucuğuna aktarılarak, elektroforez işlemi 80 V elektrik akımı altında 1,5-2 h süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemlerini terk etmesinden sonra, elektrik akımı kesilmiştir. Daha sonra ortamdan alınan jel, Tris-Asetat elektroforez tamponunun taze hazırlanmış 0,2 µg/ml etidyum bromit içeren çözeltisinde 1-1,5 h süreyle boyanmıştır (Macrina vd. 1982). Jeller 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör kullanılarak incelenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sistemi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) kullanılmıştır. Tris-Asetat Tamponu (1X) Tris Sodyum Asetat EDTA Destile Su 4,84 g 4,08 g 0,37 g 1000 ml ph 8,0 ±0,02 Marker Boya Brom Fenol Blue Sakkaroz Destile su 0,25 g 40 g 100 ml Enterokok SuĢlarının 16S rdna Bölgesinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Çoğaltılması Enterococcus suşlarında 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir amplifikasyonu (PZR) için Techne TC-512 Thermal Cycler (England) cihazı kullanılmıştır. PZR denemelerinde Çizelge 4 de verilen PZR karışımı kullanılmıştır. 200 µl lik PZR tüplerine toplam hacim 50 µl olacak şekilde PZR karışımı eklenmiştir. Tüm bileşenler

19 PZR tüpünde iyice karıştırıldıktan sonra, termal döngü cihazına yerleştirilmiştir. PZR denemelerinde; 95 C de 2 dk başlangıç denatürasyonu (1 döngü), 95 C de 45 sn çift zincirin açılması (35 döngü), 55 C de 45 sn primerlerin bağlanması (35 döngü), 72 C de 2 dk zincir uzaması (35 döngü) ve 72 C de 7 dk son uzama (1 döngü) şeklinde tanımlanan PZR protokolü uygulanmıştır (Blaiotta vd. 2002). Enterococcus suşlarında genomik DNA üzerindeki 16S rdna bölgeleri Beasley ve Saris (2004) tarafından önerilen 16S ileri (5 -CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3 ) ve 16S geri (3 -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -5 ) üniversal primerleri kullanılmıştır. PZR ürünlerinin temizlenmesi için PZR saflaştırma kitinden yararlanılmıştır. Pürifiye edilmiş 16S rdna PZR fragmentlerinden 5 µl alınarak 2 µl 6X yükleme boyası ile karıştırılmış ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 V elektrik akımı altında koşturulmuştur. Fragmentlerin büyüklüklerinin belirlenmesi amacıyla 1 kb DNA marker den yararlanılmıştır. Elektroforez sonrası jeller 0,2 µg/ml etidyum bromit çözeltisinde 20 dk süreyle boyanmış ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör kullanılarak görüntülenmiştir. Jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sistemi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) kullanılmıştır. PZR ürünlerinin çift yönlü DNA dizi analizi için hizmet alımı (Atlas Biyoteknoloji/Ankara) yapılmıştır. Dizi analiz sonuçları Basic Local Alingment Search Tool (BLAST) programı kullanılarak National Center for Biotechnology Information (NCBI) veri tabanında bulunan 16S rdna dizileriyle benzerliğini karşılaştırılmış ve aranan dizi sırasının hangi mikroorganizmaya ait olabileceği benzerlik yüzdesiyle belirlenmiştir.

20 Çizelge 4. Polimeraz Zincir Reaksiyonunda Kullanılan Karışım Madde Adı Miktarı Moleküler steril su 34,75µL PZR tamponu 5µL dntp (2 mm) 1 µl 16S ileri primer 1µL 16S geri primer 1 µl MgCl 2 (25 mm) 4µL Taq DNA polimeraz enzimi (5u/mL) 0,25 µl Genomik DNA 3µL TOPLAM HACĠM 50 µl Enterococcus SuĢlarının Antibiyotik Duyarlılıklarının Saptanması Enterokok suşlarının antibiyotik dirençlilik / duyarlılıklarının belirlenmesinde Bauer vd. (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır. Enterococcus suşları BHI agar besiyerine ekilip, 37 C de 18 h inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra kültür süspansiyonunun yoğunluğu 0,5 McFarland (1x10 6 kob/ml) standardına uygun bulanıklıkta olacak şekilde ayarlanmıştır. 90 ml lik BHI Agar ortamları dökme sıcaklığına ulaşınca (45 C) oda sıcaklığında soğumaya bırakılmış ve daha sonra bu ortama hücre yoğunluğu ayarlanmış kültür içeren 10 ml lık BHI broth inoküle edilmiştir. Ortamın homojen bir şekilde karışması sağlanmış ve hazırlanan bu ortam eşit miktarlarda 5 ayrı steril cam petri plağına dağıtılmıştır. Agar katılaştıktan sonra her plağa 4 adet antibiyotik diski yerleştirilmiş ve 37 C de h süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Disk difüzyonu için, 12 farklı antibiyotik kullanılmıştır (*). Kullanılan ticari antibiyotik diskler ve konsantrasyonları Çizelge 3 de belirtilmiştir. İnkübasyon süresinin sonunda antibiyotik disklerinin etrafında oluşan inhibisyon zon çapları milimetrik olarak ölçülmüştür. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde standart suş Enterococcus faecalis ATCC kullanılmıştır. Elde edilen zon çapları Klinik Laboratuar Standarları Enstitüsü nün belirlediği (Clinical

21 Laboratory Standards Institute) (CLSI 2011) zon çaplarıyla karşılaştırılmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotiklere duyarlı, az hassas ve dirençli olarak değerlendirilmesi yapılmıştır (Hombach vd. 2013). Çalışmamızda kullanılan antibiyotik disklerine ait duyarlılık sınırları Çizelge 5 de gösterilmiştir. Çizelge 5. Enterococcus Türleri için Antibiyotik Duyarlılık Sınırları (CLSI 2011) ANTĠBĠYOTĠKLER ZON ÇAPI (mm) Duyarlı Az Hassas Dirençli Penisilin G (P) Ampisilin (AM) Vankomisin (VA) Eritromisin ( E) Tetrasiklin (TE) Kloramfenikol ( C) Gentamisin (CN) Kanamisin (K) Streptomisin (S) Nalidiksik asid (NA) Rifampin (RA) Siprofloksasin (CIP) (* ) Proje önerisinde 13 adet antibiyotik disk ile çalışılacağı belirtilmişti. Ancak Linkomisin antibiyotiğini ticari olarak temin etmede sıkıntı yaşadığımızdan dolayı, Enterococcus suşlarının antibiyotik duyarlılıklarının saptanmasında 12 adet antibiyotik diski kullanılmıştır.

22 Ġstatistiksel Analiz İstatiksel analizlerin yapılmasında SPSS 16 paket programı kullanılmıştır. Gruplar arasında fark olup olmadığını ortaya koymak için F Testi (ANOVA, Analysis of Variance) uygulanmıştır.

23 4. BULGULAR ve TARTIġMA 4.1. Antimikrobiyel Aktiviteye Sahip Enterokokların Ġzolasyonu Ankara daki çeşitli market, kasap ve pazarlarda satışa sunulan ve geleneksel olarak üretilen fermente gıdalar ile non-fermente gıdalar izolasyon materyali olarak kullanılmış olup, toplam 503 gıda örneği araştırma kapsamına dahil edilmiştir. İzolasyon materyali olarak kullanılan gıda örneklerinin; 7 adedini siyah zeytin, 4 adedini yeşil zeytin, 11 adedini turşu, 215 adedini fermente peynir (93 beyaz peynir, 2 lor peyniri, 24 tulum peyniri, 3 çökelek, 17 keçi peyniri, 51 ezine peyniri, 11 örgü peynir, 14 kırık peynir), 186 adedini sucuk, 72 adedini tavuk ve 8 adedini tarhana oluşturmuştur. Genel olarak çalışma kapsamına dâhil edilen gıda örneklerinin 431 adedini (% 85,68) fermente gıdalar oluştururken, 72 adedini ise (% 14,32) non fermente gıdalar oluşturmuştur. Araştırmada 503 farklı gıda örneğinden, 459 tanesinde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmiştir (Çizelge 6). Çizelge 6. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Muhtemel Enterokok İzolatlarının Dağılımları Gıda Örnekleri ÇalıĢılan Örnek Sayısı Ġzolat Sayısı Siyah Zeytin ,28 Yeşil Zeytin ,00 Peynir Beyaz Peynir Lor Peyniri Tulum Peyniri Çökelek Keçi Peyniri Ezine Peyniri Örgü Peynir Kırık Peynir % 99,06 Sucuk ,54 Tavuk ,66 Tarhana ,00 Turşu ,45 Toplam ,25

24 Çalışmada 8 adet tarhana ve 4 adet yeşil zeytin örneklerinin hiçbirinde tipik zeytin yeşili/siyah arası renk veren şüpheli koloni morfolojisi gözlemlenmemiştir. Çalışma kapsamına dâhil edilen gıda örneklerinden % 91,25 inde enterokoklar için şüpheli koloni morfolojisi tespit edilmiş ve bu örneklerden tek koloniler alınmıştır. 215 adet peynir örneğinden, 213 adedinde (% 99,06) şüpheli enterokok izolatı tanımlanmıştır. Diğer gıdalarda izolasyon oranları ise; tavukta % 91,66, sucukta % 93,54, turşuda % 45,45 ve siyah zeytinde ise % 14,28 bulunmuştur (Çizelge 6). Antimikrobiyel aktivite çalışmaları, 459 adet enterokok izolatı üzerinde yürütülmüştür. İzolatların tür içi referans suş olarak seçilen Enterococcus faecalis ATCC karşı zon oluşturup oluşturmadığı tespit edilmiştir (Şekil 1). Oluşan inhibisyon zon çapları milimetrik olarak ölçülmüştür. Zon oluşturan koloniler steril öze yardımıyla alınarak, BHI broth ortamına aktarılmış ve daha ileriki biyokimyasal tanımlamalarda kullanılmıştır. İnhibisyon zonu oluşturan muhtemel enterokok izolatlarına EP kodu, oluşturmayanlara ise rakamlarla kod verilmiştir.

25 EP 17 izolatı 30 nolu izolat ġekil 1. Enterokok İzolatlarının Antimikrobiyel Aktiviteleri Çalışmalar sonucunda toplam 459 izolattan 165 i, mm arasında değişen inhibisyon zonu oluşturmuştur (Çizelge 7). Araştırmanın bu aşamasından sonraki morfolojik ve biyokimyasal tanımlama kısımlarına EP kodu verilen izolatlar ile devam edilmiştir.

26 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 1 Siyah Zeytin Turşu Beyaz Peynir EP1 5 Siyah Zeytin - - Siyah Zeytin - - Siyah Zeytin - - Beyaz Peynir EP2 20 Lor Peyniri EP3 20 Yeşil Zeytin - - Tulum Peyniri EP4 7 Çökelek Peyniri EP5 15 Tulum Peyniri EP6 22 Tulum Peyniri 1 - Beyaz Peynir EP7 5 Keçi Peyniri 2 - Beyaz Peynir 3 - Beyaz Peynir 4 - Keçi Peyniri 5 - Ezine Peyniri EP8 9 Ezine Peyniri 6 - KırıkPeynir EP9 7 Keçi Peyniri 7 - Beyaz Peynir 8 - Beyaz Peynir 9 - Lor Peyniri 10 - Keçi Peyniri EP10 10 Beyaz Peynir EP11 15 Beyaz Peynir 11 - Beyaz Peynir 12 - Ezine Peyniri 13 - Kırık Peynir 14 - Keçi Peyniri 15 - Örgü Peynir EP12 7 Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 34 Yeşil Zeytin - 35 Ezine Peyniri EP Keçi Peyniri EP Turşu EP Sucuk EP Tavuk Ezine Peyniri Turşu Beyaz Peynir Ezine Peyniri Turşu Turşu Turşu Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Keçi Peyniri Kırık Peynir EP Tulum Peyniri Ezine Peyniri 32 - Beyaz Peynir 33 - Beyaz Peynir EP18 8 Beyaz Peynir 34 - Keçi Peyniri 35 - Ezine Peyniri EP19 10 Beyaz Peynir 36 - Keçi Peyniri 37 - Beyaz Peynir 38 - Beyaz Peynir 39 - Beyaz Peynir 40 -

27 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 67 Keçi Peyniri Örgü Peynir Örgü Peynir EP Örgü Peynir EP Keçi Peyniri EP Siyah Zeytin Beyaz Peynir Keçi Peyniri Keçi Peyniri Keçi Peyniri Ezine Peyniri Ezine Peyniri Beyaz Peynir Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk 66 - Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 100 Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Yeşil Zeytin Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Örgü Peynir Sucuk EP Sucuk Ezine Peyniri Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir 83 - Beyaz Peynir EP30 20 Beyaz Peynir EP31 5 Ezine Peyniri EP32 35 Beyaz Peynir 84 - Ezine Peyniri EP33 15 Ezine Peyniri 85 - Kırık Peynir 86 - Örgü Peynir 87 - Örgü Peynir 88 - Beyaz Peynir 89 - Beyaz Peynir 90 -

28 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 133 Keçi Peyniri EP Keçi Peyniri EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir Keçi Peyniri EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir Ezine Peyniri Beyaz Peynir Tulum Peyniri Tulum Peyniri Tulum Peyniri Örgü Peynir EP Kırık Peynir Kırık Peynir Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir Ezine Peyniri Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Tulum Peyniri Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 166 Kırık Peynir EP Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Sucuk Beyaz Peynir Turşu Beyaz Peynir Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Beyaz Peynir Sucuk Sucuk Sucuk Yeşil Zeytin Sucuk Sucuk Sucuk Siyah Zeytin Sucuk Sucuk Tavuk 139 -

29 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 199 Tavuk Tavuk Tavuk Tarhana Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk EP Tavuk Tavuk Tarhana Tavuk EP Tarhana Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 232 Tavuk Tavuk EP Tavuk Örgü Peynir Örgü Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Tulum Peyniri Tulum Peyniri Ezine Peyniri Ezine Peyniri Beyaz Peynir Beyaz Peynir Kırık Peynir Kırık Peynir Beyaz Peynir Ezine Peyniri Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Beyaz Peynir Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Beyaz Peynir Tulum Peyniri Tulum Peyniri EP Örgü Peynir Ezine Peyniri EP54 6

30 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 265 Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Tarhana Beyaz Peynir EP Tulum Peyniri EP Tulum Peyniri EP Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir EP Tulum Peyniri EP Tulum Peyniri EP Beyaz Peynir EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP82 8 Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 298 Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Tavuk Tavuk Tarhana Tarhana Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk EP Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk Turşu Sucuk Sucuk Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir Beyaz Peynir EP Ezine Peyniri Kırık Peynir EP90 20

31 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Kaynağı Bakteri Kodu Zon Çapı (mm) 331 Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Turşu Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Turşu Turşu Tavuk EP Tavuk Tavuk Tavuk EP Tavuk EP Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 364 Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk Tavuk EP Tavuk EP Tavuk EP Tavuk EP Tavuk EP Tavuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP120 15

32 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 397 Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk EP Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 429 Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk Sucuk Ezine Peyniri Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri Ezine Peyniri Kırık Peynir Tavuk Tavuk Tavuk EP Sucuk Beyaz Peynir Kırık Peynir 276 -

33 Çizelge 7. Gıda Örneklerinden İzole Edilen Enterokok İzolatları ve Antimikrobiyel Aktiviteleri (devam) Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 461 Tulum Peyniri EP Tulum Peyniri EP Kırık Peynir EP Tulum Peyniri EP Beyaz Peynir Kırık Peynir Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir EP Tulum Peyniri EP Tulum Peyniri EP Tulum Peyniri Çökelek EP Çökelek EP Tavuk Tavuk EP Sucuk Sucuk Sucuk EP Sucuk EP158 6 Sıra Ġzolasyon Bakteri Zon Çapı Kaynağı Kodu (mm) 483 Sucuk Sucuk EP Sucuk Sucuk EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir EP Beyaz Peynir Ezine Peyniri EP Ezine Peyniri Ezine Peyniri Tarhana Ezine Peyniri Tulum Peyniri Tulum Peyniri Beyaz Peynir EP Siyah Zeytin Beyaz Peynir Tarhana Sucuk 294 -

34 Araştırmada enterokok izolatlarının Enterococcus faecalis ATCC suşuna karşı tür içi antimikrobiyel aktivitesi saptanmıştır. Bu kapsamda 79 adet enterokok izolatı mm arasında inhibisyon zonu oluştururken, 76 adedi mm arasında, 8 adedi arasında ve 2 adedi ise 31 mm ve üzeri oluşturmuştur. EP123 suşu 41 mm inhibisyon zon çapı oluşturarak, en yüksek antimikrobiyel aktiviteye sahip suş olarak tanımlanmıştır. Bu izolatı 35 mm zon çapı oluşturan EP32 izolatı takip etmiştir. EP6, EP29, EP32, EP60, EP77, EP78, EP84, EP123, EP128 ve EP144 izolatları 21 mm ve üzeri inhibisyon zon çapı oluşturması bakımından öne çıkan izolatlardır. 165 enterokok izolatının patojenler de dâhil diğer tür içi ve türler arası bakterilere karşı antimikrobiyel aktivite spektrumunun saptanması ve bu kapsamda bu izolatların ürettikleri antimikrobiyel maddenin bakteriyosin doğasının araştırılması önem taşımaktadır. Antimikrobiyel aktivite gösteren enterokok izolatlarının 63 tanesi sucuktan, 36 tanesi beyaz peynirden, 19 tanesi Ezine peynirinden, 14 tanesi tavuktan, 12 tanesi tulum peynirinden, 6 tanesi kırık peynirden, 6 tanesi keçi peynirinden, 4 tanesi örgü peynirden, 1 er tanesi ise lor peyniri ve turşudan izole edilmiştir (Çizelge 8).

35 Çizelge 8. Antimikrobiyel Aktivite Gösteren Enterokok İzolatları Gıda Örneği Antimikrobiyel Ġzolat No Ġzolat Sayısı Beyaz Peynir 36 EP1, EP2, EP7, EP11, EP18, EP29, EP30, EP31, EP40, EP41, EP42, EP43, EP44, EP56, EP57, EP58, EP59, EP60, EP61, EP62, EP63, EP69, EP70, EP72, EP75, EP89, EP92, EP93, EP148, EP149, EP150, EP151, EP161, EP162, EP163, EP165 Lor Peyniri 1 EP3 Tulum Peyniri 12 EP4, EP6, EP53, EP64, EP65, EP73, EP74, EP144, EP145, EP147, EP152, EP153 Çökelek Peyniri 3 EP5, EP154, EP155 Ezine Peyniri 19 EP8, EP13, EP19, EP32, EP33, EP37, EP38, EP46, EP50, EP54, EP55, EP66, EP67, EP68, EP71, EP91, EP140, EP141, EP164 Kırık Peynir 6 EP9, EP17, EP45, EP90, EP142, EP146 Keçi Peyniri 6 EP10, EP14, EP22, EP34, EP35, EP36 Örgü Peynir 4 EP12, EP20, EP21, EP39 Turşu 1 EP15 EP16, EP23, EP24, EP25, EP26, EP27, EP28, EP51, EP52, EP76, EP77, EP78, EP79, EP80, EP81, EP82, EP83, EP84, Sucuk 63 EP86, EP87, EP88, EP94, EP95, EP96, EP105, EP106, EP107, EP108, EP109, EP110, EP111, EP112, EP113, EP114, EP115, EP116, EP117, EP118, EP119, EP120, EP121, EP122, EP123, EP124, EP125, EP126, EP127, EP128, EP129, EP130, EP131, EP132, EP133, EP134, EP135, EP136, EP137, EP138, EP139, EP157, EP158, EP159, EP160 Tavuk 14 EP47, EP48, EP49, EP85, EP97, EP98, EP99, EP100, EP101, EP102, EP103, EP104, EP143, EP Enterokok Ġzolatlarının Tanımlanması Morfolojik ve Kültürel Testler Antimikrobiyel aktiviteye sahip toplam 165 izolata öncelikle Gram boyama testi uygulanmıştır. 165 izolatın tamamı Gr (+) morfoloji göstermiştir. Tek ya da kısa zincirler halinde kok ya da kokobasil morfolojisine sahip Gr (+) izolatlar, çalışma kapsamında diğer kültürel testlerde kullanılmak üzere % 20 steril gliserol içeren BHI broth ortamlarında mikrosantrifüj tüplerine alınarak -20 C de muhafaza edilmiştir.

36 Muhtemel enterokok izolatlarına katalaz testi, eskulin hidrolizi, ph 9,6 da gelişme, % 6,5 NaCL de gelişim, 10 C - 45 C de gelişim ve hemoliz doğrulama testleri uygulanmıştır (Çizelge 9). Enterococcus cinsi; ph 9,6 da, % 6,5 NaCL de, 10 C ve 45 C de gelişim özelliği gösterebilen, katalaz (-) ve eskulin hidrolizi pozitif (+) olan türler içermektedir (Klein 2003, Harwood vd. 2004, Ogier ve Serror 2008, Fischer ve Phillips 2009, Zhang vd. 2013, Oladipo vd. 2014, Abouelnaga vd. 2016). Bu esas doğrultusunda çalışma kapsamındaki 165 izolat, Enterococcus spp. olarak tanımlanmıştır. Hemoliz doğrulama testi sonuçlarına göre ise; 140 izolat α-hemolitik, 12 izolat β-hemolitik ve 13 izolat ise γ-hemolitik yapı göstermiştir. Enterococcus suşları tarafından salgılanan virülens faktörlerden birisi olan hemolisin/sitolizin, bakteriyel bir toksindir. Plazmit ya da kromozomal DNA kodlu olabilen hemolitik aktivite, insan enfeksiyonlarında önemli bir rol oynamaktadır. Gıdalardan β-hemolitik aktiviteye sahip enterokok suşlarının izole edilmesi ise istenilmeyen bir durumdur. β-hemolitik suşlar daha çok E. faecium ve E. faecalis suşlarında bulunmaktadır (Semedo vd. 2003). Özellikle β-hemolitik aktivite gösteren enterokok suşlarının fermente gıda üretiminde starter kültür olarak kullanılmaları ise önerilmemektedir (De Vuyst vd. 2003, Yoğurtçu 2011). Araştırma kapsamında EP9, EP24, EP40, EP74, EP88, EP134, EP135, EP148, EP151, EP157, EP160 ve EP161 suşlarının β-hemolitik aktivite göstermesi, bu suşların virulens faktör taşıması bakımından önem taşımaktadır. Ancak bu suşlar için diğer virülans faktörlerinin de araştırılması gerekmektedir. İlaveten β-hemolitik aktivite göstermeyen diğer izolatların da virulens özellik taşıyabileceği de gözden kaçırılmaması gereken bir durumdur.

37 GRAM REAKSĠYONU ESKULĠN HĠDROLĠZĠ KATALAZ TESTĠ %6,5 NaCL de GELĠġĠM HEMOLĠZ DOĞRULAMA TESTĠ 10 C GELĠġĠM 45 C GELĠġĠM ph 9,6 da GELĠġĠM Çizelge 9. Antimikrobiyel Akvitite Gösteren İzolatların Kısmi Karakterizasyonu İZOLAT KODU EP α -hemolitik EP α -hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP γ-hemolitik EP γ-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik + + +

38 GRAM REAKSĠYONU ESKULĠN HĠDROLĠZĠ KATALAZ TESTĠ %6,5 NaCL de GELĠġĠM HEMOLĠZ DOĞRULAMA TESTĠ 10 C GELĠġĠM 45 C GELĠġĠM ph 9,6 da GELĠġĠM Çizelge 9. Antimikrobiyel Akvitite Gösteren İzolatların Kısmi Karakterizasyonu (devam) İZOLAT KODU EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik + + +

39 GRAM REAKSĠYONU ESKULĠN HĠDROLĠZĠ KATALAZ TESTĠ %6,5 NaCL de GELĠġĠM HEMOLĠZ DOĞRULAMA TESTĠ 10 C GELĠġĠM 45 C GELĠġĠM ph 9,6 da GELĠġĠM Çizelge 9. Antimikrobiyel Akvitite Gösteren İzolatların Kısmi Karakterizasyonu (devam) İZOLAT KODU EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik + + +

40 GRAM REAKSĠYONU ESKULĠN HĠDROLĠZĠ KATALAZ TESTĠ %6,5 NaCL de GELĠġĠM HEMOLĠZ DOĞRULAMA TESTĠ 10 C GELĠġĠM 45 C GELĠġĠM ph 9,6 da GELĠġĠM Çizelge 9. Antimikrobiyel Akvitite Gösteren İzolatların Kısmi Karakterizasyonu (devam) İZOLAT KODU EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP γ-hemolitik + + +

41 GRAM REAKSĠYONU ESKULĠN HĠDROLĠZĠ KATALAZ TESTĠ %6,5 NaCL de GELĠġĠM HEMOLĠZ DOĞRULAMA TESTĠ 10 C GELĠġĠM 45 C GELĠġĠM ph 9,6 da GELĠġĠM Çizelge 9. Antimikrobiyel Akvitite Gösteren İzolatların Kısmi Karakterizasyonu (devam) İZOLAT KODU EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP β-hemolitik EP β-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik EP α-hemolitik + + +

42 Ġzolatların Biyokimyasal Tanımlanması Kültürel testlerde enterokoklar için tipik reaksiyonu veren 165 izolat arasından 100 adet antimikrobiyel aktiviteye sahip Enterococcus spp. seçilmiştir. Tür içi indikatör suşa karşı en yüksek inhibisyon zonu oluşturan izolatlar seçilmeye çalışılmıştır. Proje çalışmasının bundan sonraki kısmı, seçilen bu 100 adet enterokok izolatı üzerinden yürütülmüştür. İzolatların biyokimyasal aktivitelerinin belirlenmesinde API 20 Strep (BioMerieux, France) test kitleri kullanılmıştır (Çizelge 10, Çizelge 11).

43 BAKTERĠ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem Çizelge 10. Enterokok İzolatlarının Biyokimyasal Tanısı EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP

44 BAKTERĠ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem Çizelge 10. Enterokok İzolatlarının Biyokimyasal Tanısı (devam) EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP

45 BAKTERĠ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem Çizelge 10. Enterokok İzolatlarının Biyokimyasal Tanısı (devam) EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP

46 BAKTERĠ KODU VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG βhem Çizelge 10. Enterokok İzolatlarının Biyokimyasal Tanısı (devam) EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP EP VP Asetoin üretimi (Voges Proskauer) RIB D-ribose HIP Hidrolizis (HIPpurik asit) ARA L-arabinoz ESC β-glukosidaz hidrolizi (ESCulin) MAN D-mannitol PYRA PYRrolidonyl Arylamidaz SOR D-sorbitol αgal α-galaktosidaz LAC D-laktoz βgur β-giukuronidaz TRE D-trehaloz βgal β-galaktosidaz INU İnulin PAL Alkaline Phosphataz RAF D-raffinose LAP Lösin AminoPeptidaz AMD Nişasta ADH Arginin DiHidrolaz GLYG Glikojen

47 Çizelge 11. Enterokok İzolatlarının API 20 Strep Test Kiti ile Tür Düzeyinde Tanımlanması Ġzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür % ID Tanımlama Yüzdesi T Yakınlık EP2 Enterococcus faecium 98,1 0,97 EP3 Enterococcus faecium 67,4 0,31 EP4 Enterococcus faecalis 99,1 0,99 EP5 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP6 Enterococcus faecium 91,0 0,53 EP9 Enterococcus faecium 95,0 0,43 EP11 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP12 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP14 Enterococcus faecalis 86,8 0,77 EP16 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP17 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP19 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP21 Enterococcus faecium 91,0 0,53 EP22 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP23 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP24 Enterococcus faecium 96,8 0,71 EP26 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP28 Enterococcus faecium 99,4 0,85 EP29 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP30 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP32 Enterococcus faecium 99,4 0,79 EP33 Enterococcus faecium 98,6 0,73 EP35 Enterococcus faecium 89,9 0,89 EP37 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP39 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP40 Enterococcus faecium 99,8 0,36 EP41 Enterococcus faecium 70,5 0,56 EP44 Enterococcus faecium 76,5 0,72

48 Çizelge 11. Enterokok İzolatlarının API 20 Strep Test Kiti ile Tür Düzeyinde Tanımlanması (devam) % ID T Ġzolat API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlama Yakınlık Kodu Tanımlanan Tür Yüzdesi EP46 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP49 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP51 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP52 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP55 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP58 Enterococcus faecium 99,8 0,69 EP60 Enterococcus faecium 99,1 0,66 EP62 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP63 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP64 Enterococcus faecium 99,8 0,87 EP68 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP70 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP72 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP74 Enterococcus faecium 98,7 0,31 EP76 Enterococcus faecium 99,9 0,61 EP77 Enterococcus faecium 99,4 0,95 EP78 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP80 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP81 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP84 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP85 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP86 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP87 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP88 Enterococcus faecium 99,5 0,68 EP90 Enterococcus faecalis 86,8 0,77 EP92 Enterococcus faecium 99,9 0,57 EP98 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP101 Enterococcus faecium 99,2 0,41

49 Çizelge 11. Enterokok İzolatlarının API 20 Strep Test Kiti ile Tür Düzeyinde Tanımlanması (devam) % ID T Ġzolat API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlama Yakınlık Kodu Tanımlanan Tür Yüzdesi EP102 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP103 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP104 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP106 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP107 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP110 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP111 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP112 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP115 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP116 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP118 Enterococcus faecium 99,9 0,67 EP119 Enterococcus faecium 99,9 0,67 EP120 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP122 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP123 Enterococcus faecium 85,2 0,62 EP124 Enterococcus faecium 99,2 0,41 EP126 Enterococcus faecium 98,2 0,70 EP127 Enterococcus faecium 99,9 0,59 EP128 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP132 Enterococcus faecium 99,9 0,56 EP134 Enterococcus faecium 99,5 0,36 EP135 Enterococcus faecalis 96,2 0,46 EP138 Enterococcus faecium 98,2 0,70 EP139 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP140 Enterococcus faecium 73,1 0,59 EP142 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP143 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP144 Enterococcus faecium 71,3 0,70

50 Çizelge 11. Enterokok İzolatlarının API 20 Strep Test Kiti ile Tür Düzeyinde Tanımlanması (devam) % ID T Ġzolat API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlama Yakınlık Kodu Tanımlanan Tür Yüzdesi EP145 Enterococcus faecium 99,6 0,44 EP146 Enterococcus faecium 98,8 0,86 EP147 Enterococcus faecalis 74,3 0,67 EP148 Enterococcus faecium 99,9 0,38 EP149 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP151 Enterococcus faecium 99,8 1,00 EP153 Enterococcus faecium 98,5 0,42 EP154 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP155 Enterococcus faecium 98,2 0,56 EP157 Enterococcus faecium 73,1 0,26 EP159 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 EP160 Enterococcus faecium 98, EP161 Enterococcus faecalis 97,0 1,00 EP162 Enterococcus faecium 99,9 0,71 EP163 Enterococcus faecalis 97,0 0,79 EP165 Enterococcus faecalis 99,7 1,00 Mükemmel Tanımlama : % ID 99,9 T 0,75 Çok İyi Tanımlama : % ID 99,0 T 0,50 İyi Tanımlama : % ID 90,0 T 0,25 Kabul Edilebilir Tanımlama :% ID 80,0 T 0

51 Enterokok izolatlarının tür düzeyinde tanımlama testleri sonucunda, bu izolatlardan 15 tanesi (% 15) E. faecalis ve 85 tanesi (% 85) ise E. faecium olarak belirlenmiştir (Çizelge 11, Çizelge 12). Çizelge 12. Enterokok İzolatlarının API 20 Strep Test Kitine Göre Tür Düzeyinde Dağılımı Enterococcus Türleri Ġzolat Kod No Ġzolat Sayısı Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP4, EP14, EP23, EP51, EP90, EP135, EP142, EP143, EP147, EP149, EP154, EP159, EP161, EP163, EP165 EP2,EP3, EP5,EP6, EP9,EP11, EP12, EP16,EP17, EP19, EP21, EP22, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP35, EP37, EP39, EP40, EP41, EP44, EP46, EP49, EP52, EP55, EP58, EP60, EP62, EP63, EP64, EP68, EP70, EP72, EP74, EP76, EP77, EP78, EP80, EP81, EP84, EP85, EP86, EP87, EP88, EP92, EP98, EP101, EP102, EP103, EP104, EP106, EP107, EP110, EP111, EP112, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP134, EP138, EP139, EP140, EP144,EP145, EP146, EP148, EP151, EP153, EP155, EP157, EP160, EP162 n % Toplam Çalışmada API 20 Strep test kiti kullanılarak yapılan tür düzeyinde tanımlama testi için seçilen 100 izolatın; 52 tanesi fermente peynir (21 beyaz peynir, 1 lor peyniri, 8 tulum peyniri, 3 çökelek peyniri, 3 keçi peyniri, 8 Ezine, 3 örgü peynir, 5 kırık peynir), 40 tanesi sucuk ve 8 tanesi ise tavuk orjinlidir (Çizelge 13).

52 Çizelge 13. API 20 Strep Test Kiti Kullanılarak Tür Düzeyinde Tanımlaması Yapılan Enterokok Suşlarının Gıda Orjinleri Gıda Örnekleri Adet Enterococcus faecalis (Adet) Enterococcus faecium (Adet) Sucuk Tavuk Fermente Peynir Örnekleri Toplam Enterococcus SuĢlarının 16S rdna Dizi Analizi ile Moleküler Tanımlanması Enterococcus suşlarının moleküler tanımlanmasında 16S rdna dizi analizi yöntemi kullanılmıştır. Enterococcus suşlarının ve şahit suşun (Enterococcus faecalis ATCC 29212) genomik DNA izolasyonu, Miteva vd. (1991) ve Cancilla vd. (1992) tarafından önerilen yöntemlerde bazı modifikasyonlar yapılarak uygulanmıştır. Genomik DNA örneklerinin elektroforez işlemi için, % 1 agaroz içeren yatay jel sistemleri kullanılmıştır. Jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sistemi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) kullanılmıştır. 16S rdna bölgesinin PZR ile çoğaltılmasında; Blaiotta vd. (2002) tarafından önerilen PZR koşulları uygulanmış ve Techne TC-512 Thermal Cycler (England) cihazı kullanılmıştır. Genomik DNA üzerindeki 16S rdna bölgeleri Beasley ve Saris (2004) tarafından önerilen 16S ileri (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT -3') ve 16S geri (3'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -5') üniversal primerleri kullanılmıştır. PZR fragmentelerinin elektroforezi için de, % 1 agaroz içeren yatay jel sistemleri kullanılmış olup, jel fotoğraflarının çekiminde jel görüntüleme sisteminden (Kodak Gel Logic 200 Imaging System) yararlanılmıştır (Şekil 2).

53 M N ġekil 2. Enterococcus spp. Suşlarının PZR ile Çoğaltılan 16S rdna Fragmentleri M O Gene Ruler DNA marker (bç) 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, EP9, EP11, EP12, EP14, EP16, EP17, EP19, EP21, EP22, EP23, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP35, EP37, EP39 N Negatif Kontrol PZR ile çoğaltılan 16S rdna gen bölgesinin çift yönlü DNA dizi analizi sonuçları BLAST programı kullanılarak NCBI veri tabanında bulunan 16S rdna dizileriyle benzerliği karşılaştırılmıştır (Çizelge 14).

54 Çizelge 14. Enterococcus Suşlarının 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarına Göre Gerçekleştirilen Tanısı BAKTERĠ KOD NO Ġleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP2 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP3 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium EP4 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP5 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP6 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis EP9 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP11 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP12 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP14 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP16 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP17 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP19 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP21 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP22 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP23 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis EP24 Enterococcus faecium 89,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP26 Enterococcus faecium 92,0 Enterococcus faecium 85,0 Enterococcus faecium EP28 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP29 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP30 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP32 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP33 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 91,0 Enterococcus faecium EP35 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP37 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP39 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP40 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP41 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP44 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP46 Enterococcus faecalis 92,0 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis EP49 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 87,0 Enterococcus faecium EP51 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis EP52 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium EP55 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP58 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP60 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP62 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP63 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 81,0 Enterococcus faecalis

55 Çizelge 14. Enterococcus Suşlarının 16S rdna Dzi Analizi Sonuçlarına Göre Gerçekleştirilen Tanısı (devam) BAKTERĠ KOD NO Ġleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP64 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP68 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis 91,0 Enterococcus faecalis EP70 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium EP72 Enterococcus faecium 78,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP74 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP76 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP77 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP78 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP80 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP81 Enterococcus faecium 89,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP84 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP85 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP86 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP87 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP88 Enterococcus faecium 99 Enterococcus faecium 99 Enterococcus faecium EP90 Enterococcus faecium 91,0 Enterococcus faecium 99 Enterococcus faecium EP92 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP98 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP101 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP102 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP103 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium EP104 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP106 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP107 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP110 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP111 Enterococcus faecium 93,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP112 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis EP115 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium EP116 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP118 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP119 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP120 Enterococcus faecium 88,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP122 Enterococcus faecium 94,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP123 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP124 Enterococcus faecium 87,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP126 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP127 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium

56 Çizelge 14. Enterococcus Suşlarının 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarına Göre Gerçekleştirilen Tanısı (devam) BAKTERĠ KOD NO Ġleri (F) Benzerlik Oranı % Geri (R) Benzerlik Oranı % 16S rdna Dizisine Göre Yapılan Tanı EP128 Enterococcus faecium 92,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP132 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP134 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP135 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP138 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP139 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP140 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium EP142 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecium 92,0 Enterococcus faecalis EP143 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP144 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP145 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 88,0 Enterococcus faecalis EP146 Enterococcus faecium 96,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP147 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium 98,0 Enterococcus faecium EP148 Enterococcus faecium 95,0 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium EP149 Enterococcus faecalis 90,0 Enterococcus faecalis 89,0 Enterococcus faecalis EP151 Enterococcus faecalis 94 Enterococcus faecalis 97 Enterococcus faecalis EP153 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis EP154 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 93,0 Enterococcus faecalis EP155 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP157 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP159 Enterococcus faecalis 99,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis EP160 Enterococcus faecalis 96,0 Enterococcus faecalis 98 Enterococcus faecalis EP161 Enterococcus faecalis 94,0 Enterococcus faecalis 95 Enterococcus faecalis EP162 Enterococcus faecium 97,0 Enterococcus faecium 99,0 Enterococcus faecium EP163 Enterococcus faecalis 95,0 Enterococcus faecalis 97,0 Enterococcus faecalis EP165 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 98,0 Enterococcus faecalis 16 S rdna dizi analizlerinden elde edilen veriler dikkate alındığında, 100 Enterococcus suşunun 61 i (% 61) E. faecium ve 39 u (% 39) ise E. faecalis olarak tanımlanmıştır (Çizelge 14, Çizelge 15).

57 Çizelge S rdna Dizi Analizleri Sonucuna Göre Enterococcus Suşlarının Tür Düzeyinde Dağılımı Enterococcus Türleri Ġzolat Kod No Ġzolat Sayısı Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP5, EP6, EP11, EP16, EP17, EP21, EP22, EP23, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP51, EP55, EP60, EP62, EP63, EP68, EP77, EP98, EP112, EP134, EP135, EP138, EP142, EP143, EP144, EP145, EP149, EP151, EP153, EP154, EP155, EP159, EP160, EP161,EP163, EP165 EP2,EP3, EP4,EP9, EP12, EP14, EP19, EP24, EP26, EP28, EP29, EP30, EP32, EP33, EP39, EP40, EP49, EP52, EP58, EP64, EP70, EP72, EP74, EP76, EP78, EP80, EP81, EP84, EP85, EP86, EP87, EP88, EP90, EP92, EP101, EP102, EP103, EP104, EP106, EP107, EP110, EP111, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP139, EP140, EP146, EP147, EP148, EP157, EP162 Sayı % Toplam Çizelge 11 ile Çizelge 14 karşılaştırıldığı zaman API 20 Strep test kitleri ile tanımlanan 15 E. faecalis suşunun 16S rdna dizi analizleri sonucunda 4 tanesi (EP4, EP14, EP90, EP147) E. faecium olarak tanımlanmıştır. Aynı şekilde 85 E. faecium suşunun 28 tanesi (EP5, EP6, EP11, EP16, EP17, EP21, EP22, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP55, EP60, EP62, EP63, EP68, EP77, EP98, EP112, EP134, EP138, EP144, EP154, EP151, EP153, EP155, EP160) E. faecalis olarak tanımlanmıştır. Toplamda 32 enterokok suşunun tür düzeyinde adlandırması değişmiştir. 68 suşun ise 16S rdna dizi analizleri sonucunda tür düzeyinde tanımlanmasında herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir (Çizelge 16). Sonuç olarak; çalışmamızda API 20 Strep test kitleri enterokok izolatlarını tür düzeyinde tanımlama aşamasında başarı oranı % 68 olarak saptanmıştır.

58 Çizelge 16. Enterokok Suşlarının Tanımlanması Aşamasında API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarının Karşılaştırılması Ġzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP2 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP3 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP4 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP5 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP6 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP9 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP11 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP12 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP14 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP16 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP17 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP19 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP21 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP22 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP23 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP24 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP26 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP28 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP29 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP30 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP32 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP33 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP35 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP37 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP39 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP40 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP41 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP44 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

59 Çizelge 16. Enterokok Suşlarının Tanımlanması Aşamasında API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarının Karşılaştırılması (devam) Ġzolat API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizleri Kodu Tanımlanan Tür Sonucu Tanımlanan Tür EP46 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP49 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP51 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP52 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP55 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP58 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP60 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP62 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP63 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP64 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP68 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP70 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP72 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP74 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP76 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP77 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP78 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP80 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP81 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP84 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP85 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP86 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP87 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP88 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP90 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP92 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP98 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP101 Enterococcus faecium Enterococcus faecium

60 Çizelge 16. Enterokok Suşlarının Tanımlanması Aşamasında API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarının Karşılaştırılması (devam) Ġzolat Kodu API 20 Strep Test Kiti ile Tanımlanan Tür 16S rdna Dizi Analizleri Sonucu Tanımlanan Tür EP102 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP103 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP104 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP106 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP107 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP110 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP111 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP112 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP115 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP116 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP118 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP119 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP120 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP122 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP123 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP124 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP126 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP127 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP128 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP132 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP134 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP135 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP138 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP139 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP140 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP142 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP143 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP144 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

61 Çizelge 16. Enterokok Suşlarının Tanımlanması Aşamasında API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizi Sonuçlarının Karşılaştırılması (devam) Ġzolat API 20 Strep Test Kiti ile 16S rdna Dizi Analizleri Kodu Tanımlanan Tür Sonucu Tanımlanan Tür EP145 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP146 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP147 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium EP148 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP149 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP151 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP153 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP154 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP155 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP157 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP159 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP160 Enterococcus faecium Enterococcus faecalis EP161 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP162 Enterococcus faecium Enterococcus faecium EP163 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis EP165 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis

62 16S rdna dizi analizleri sonucu tanımlanan enterokok suşlarının gıda orjinleri Çizelge 17 de yer almaktadır. Sucuk örneklerinde izole edilen enterokok suşlarının % 25 ini (10 adet) E. faecalis ve % 75 ini (30 adet) ise E. faecium oluşturmuştur. 8 adet tavuk örneğinin ise % 25 ini (2 adet) E. faecalis ve % 75 ini (6 adet) E. faecium ve aynı şekilde 52 adet fermente peynir örneğinin % 51,92 sini (27 adet) E. faecalis ve % 48,08 ini (25 adet) E. faecium olduğu tespit edilmiştir. Çizelge S rdna Dizi Analizleri Kullanılarak Tür Düzeyinde Tanımlaması Yapılan Enterokok Suşlarının Gıda Orjinleri Gıda Adet Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Örnekleri İzolat No Sayı % İzolat No Sayı % Sucuk 40 EP16,EP23,EP51,EP77,E 10 25,00 EP24, EP26, EP28, EP52, EP76, EP78, EP80, EP81, EP84, EP86, EP87, EP88, 30 75,00 P112, EP134, EP135, EP106, EP107, EP110, EP138, EP159, EP160 EP111, EP115, EP116, EP118, EP119, EP120, EP122, EP123, EP124, EP126, EP127, EP128, EP132, EP139, EP157 Tavuk 8 EP98, EP ,00 EP49, EP85, EP101, 6 75,00 EP102, EP103, EP104 Fermente 52 EP5, EP6, EP11, EP17, EP21, EP22, EP35, EP37, EP41, EP44, EP46, EP55, 27 51,92 EP2, EP3, EP4, EP9, EP12, EP14, EP19, EP29, EP30, EP32, EP33, EP39, 25 48,08 Peynir EP60, EP62, EP63, EP40, EP58, EP64, EP70, Örnekleri EP68, EP142, EP144, EP72, EP74, EP90, EP92, EP145, EP149, EP151, EP153, EP154, EP155, EP140, EP146, EP147, EP148, EP162 EP161, EP163, EP Yapılan birçok araştırmada (Klein 2003, Alves vd. 2004, Fischer ve Phillips 2009, Toğay ve Temiz 2011, Silva vd. 2012, Valenzuela vd. 2012, Dada vd. 2013, Carasi vd. 2014, Klibi vd. 2015), E. faecium ve E. faecalis türlerinin gıdalardan sıklıkla izole

63 edilen enterokok türleri olduğu ifade edilmektedir. Araştırmamızda fermente ve nonfermente gıda ürünlerinden izole ettiğimiz enterokok izolatlarının moleküler düzeyde E. faecium ve E. faecalis olarak tanımlanması, literatür verileri ile paralellik göstermektedir. Proje çalışması kapsamında fermente et ürünleri ve non-fermente et ürünlerinden izole edilen suşların büyük bir kısmını E. faecium suşları oluşturmaktadır. Araştırmamızda fermente et ürünleri ve non-fermente et ürünlerinden izole edilen enterokok suşları E. faecalis ve E. faecium olarak tanımlanmıştır (Çizelge 17). Peters vd. (2003) tarafından, fermente et ürünlerinden izole edilen 416 Enterococcus suşunun 299 u E. faecalis, 54 ü E. faecium, 24 ü E. durans, 24 ü E. hirae, 22 si E. casseliflavus, 9 u E. aviumve 8 i ise E. gallinarum olarak tanımlanmıştır. Barbosa vd. (2009), fermente et ürünlerinden izole ettikleri 182 Enterococcus suşunun 76 sını E. faecalis, 44 ünü E. faecium, 1 ini E. casseliflavus ve 61 ini Enterococccus spp. olarak tanımlamıştır. Şahin (2012), 160 tavuk örneğinden izole ettiği 130 Enterococcus suşunun 46 sını (% 35,4) E. faecalis, 32 sini E. faecium (% 24,6), 17 sini (% 13,1) E. gallinarum, 12 sini (% 9,2) E. mundtii, 9 unu (% 6,9) E. durans, 7 sini (% 5,4) E. rafinosus ve 7 sini (% 5,4) Enterococcus spp. olarak tanımlamıştır. Jahan ve Holley (2013), non-fermente et ürünlerinden izole ettikleri 29 Enterococcus suşunun % 51,7 sinie. faecalis, % 44,8 ini E. faecium ve % 3,4 ünü E. gallinarum olarak moleküler düzeyde tespit etmişlerdir. Klibi vd. (2013), tavuk ve hindiden izole ettikleri 119 Enterococcus suşunun 49 unu E. faecalis, 30 unu E. faecium, 12 sini E. gallinarum, 12 tanesini E. hirae, 16 sını ise Enterococcus spp. olduğunu belirtmişlerdir. Hammad vd. (2014), balıktan izole ettikleri 48 Enterococcus suşunun 31 ini E. faecalis, 7 sini E. faecium, 7 sini E. casseflavus ve 3 ünü ise E. gallinarum olarak belirlemişlerdir. Araştırmada elde ettiğimiz sonuçlar, non fermente ve fermente et ürünlerinde yüksek E. faecalis oranına işaret eden literatür verileriyle uyumlu bulunmamıştır.

64 Hayes vd. (2003), non fermente et ürünlerinden izole ettikleri 1357 Enterococcus suşunun % 61 ini E. faecium, % 29 unu E. faecalis ve % 5,7 sini ise E. hirae, % 2,1 ini E. casseliflavus, % 2,1 ini E. durans, % 0,7 sini E. gallinarum, % 0,1 ini E. avium olarak saptamışlardır. Kasımoğlu-Doğru vd. (2010), 106 tavuk örneğinden izole ettikleri 83 Enterococcus suşunun % 48 ini E. faecium, % 23 ünü E. durans ve % 19 unu E. faecalis olarak tanımlamışlardır. Karabıyık (2011) Ankara nın çeşitli marketlerinden temin ettiği fermente et örneklerinden izole ettikleri 134 Enterococcus suşunun 79 unu (% 59) E. faecium, 35 ini (% 26,1) E. faecalis, 13 ünü (% 9,7) E. gallinarum, 5 ini (% 3,7) E. durans, 1 ini (% 0,7) E. avium ve 1 ini ise (% 0,7) E. hirae olarak tespit etmiştir. Bu çalışmalar non fermente ve fermente et ürünlerinde tanımlanan suşların büyük bir kısmını E. faecium suşları oluşturması bakımından, bizim çalışmamızda elde ettiğimiz verileri desteklemektedir. Proje kapsamında fermente süt ürünlerinden izole edilen suşların büyük bir kısmını E. faecalissuşları oluşturmaktadır. Araştırmamızda fermente süt ürünlerinden izole edilen enterokok suşları E. faecalis ve E. faecium olarak tanımlanmıştır (Çizelge 17). Cosentino vd. (2004) geleneksel olarak üretilen peynir örneklerinden izole ettikleri 118 Enteroccocus suşunun 84 ünü E. faecium, 24 ünü E.durans ve 10 unu ise E. faecalis olarak sınıflandırmışlardır. Jurkovic vd. (2006) peynirden izole ettikleri 308 Enterococcus suşunu moleküler düzeyde tanımlamışlar ve bunlardan 177 sini E. faecium, 59 unu E. durans, 41 ini E. faecalis, 13 ünü E. mundtii ve 11 ini E. casseflavus olarak tespit etmişlerdir. Yoğurtçu (2011) tulum peynirinden izole ettiği 47 adet Enterococcus suşunu 16S rdna sekans analizi ile tür düzeyinde tanımlamış ve 21suşu E. faecium, 14 suşu E. durans ve 12 suşu ise E. faecalis olarak saptamıştır. Oladipo vd. (2013) fermente süt ürünlerinden izole ettikleri 108 Enteroccocus suşunun % 75 ini E. gallinarum, % 14,5 ini E. faecium, % 7,6 sını E. faecalis ve % 2,8 ini E. casselliflavus olarak tanımlamışlardır. Vallejo vd. (2013), peynirden izole etikleri 27 Enterococcus suşunun 22 sini E. faecium ve 5 ini ise E. faecalis olarak belirlemişlerdir. Bulajić vd. (2015) fermente süt ürünlerinden 226 Enterococcus izolatı izole etmişler ve izolatların 119 unun (%52,65) E. faecium, 40 ının (% 17,7) E.

65 durans, 37 sinin (% 16,37) E. hirae, 29 unun (% 12,83) E. faecalis ve 1 inin (% 0,44) E. gallinarum olduğunu tespit etmişlerdir. Hammad vd. (2015) peynirden izole ettikleri 50 enterokokkal suşun 37 sini E. faecium ve 13 ünü E. faecalis olarak saptamışlardır. Araştırmada elde ettiğimiz sonuçlar, fermente süt ürünlerinde yüksek E. faecium oranına işaret eden literatür verileriyle uyumlu bulunmamıştır. Morandi vd. (2006), fermente süt ürünlerinden izole ettikleri 68 enterokok suşunun 35 ini E. faecalis, 27 sini E. faecium ve 6 sını E. durans olarak tanımlamışlardır. Fermente süt ürünlerinde tanımlanan suşların büyük bir kısmını E. faecalis suşları oluşturması bakımından, bu çalışma bizim çalışmamızda elde ettiğimiz verileri desteklemektedir Enterokok SuĢlarının Antibiyotik Duyarlılıkları Bauer vd. (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek, enterokok suşlarının antibiyotik dirençlilik/duyarlılıklarının belirlenmiştir (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6). Disk difüzyonu için, 12 farklı antibiyotik kullanılmıştır. Elde edilen zon çapları Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü nün belirlediği (Clinical Laboratory Standards Institute) (CLSI 2011) zon çaplarıyla karşılaştırılmıştır. Enterococcus suşlarının antibiyotiklere duyarlı, az hassas ve dirençli olarak değerlendirilmesi yapılmıştır. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde standart suş Enterococcus faecalis ATCC kullanılmıştır. 100 adet enterokok suşunun antibiyotiklere karşı oluşturduğu inhibisyon zon çapları (mm) ve duyarlılık düzeyleri (%) Çizelge 18 ve Çizelge 19 da verilmiştir. Antibiyotiklere karşı duyarlı, az hassas ve dirençlilik fenotipi gösteren suşlar ise çizelgede farklı renklerle işaretlenmiştir.

66 ġekil 3. Enterococcus faecalis EP17 Suşunun Disk Difüzyon Yöntemi ile Tanımlanan Antibiyotik Duyarlılığı ġekil 4. Enterococcus faecium EP24 Suşunun Disk Difüzyon Yöntemi ile Tanımlanan Antibiyotik Duyarlılığı

67 ġekil 5. Enterococcus faecalis EP35 Suşunun Disk Difüzyon Yöntemi ile Tanımlanan Antibiyotik Duyarlılığı ġekil 6. Enterococcus faecalis EP23 Suşunun Disk Difüzyon Yöntemi ile Tanımlanan Antibiyotik Duyarlılığı