PROSEDÜRÜN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI

Transkript

1 BD MAX StaphSR Assay İn Vitro Diyagnostik Kullanım İçindir BD MAX Sistemi ile kullanım içindir REF: P0082(0) Türkçe KULLANIM AMACI BD MAX Sistemi'nde gerçekleştirilen BD MAX StaphSR Assay, nazal kolonizasyon riski olan hastalarda nazal swab'larından otomatik kalitatif in vitro diyagnostik testtir; Staphylococcus aureus (SA) DNA'sını ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) DNA'sını hemen saptar. Test, MRSA ve SA DNA'yı algılamak ve farklılaştırmak amacıyla, spesifik DNA hedeflerinin amplifikasyonu için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve florojenik, hedefe spesifik hibridizasyon probları kullanır. BD MAX StaphSR Assay'in, sağlık bakımı ortamlarında MRSA ve SA enfeksiyonlarının önlenmesine ve kontrolüne yardımcı olması amaçlanmıştır. MRSA veya SA enfeksiyonlarına tanı koyması veya MRSA/SA enfeksiyonları konusunda tedaviye rehberlik yapması veya tedaviyi izlemesi amaçlanmamıştır. Negatif bir sonuç nazal kolonizasyonu önlemez. Eş zamanlı kültürler epidemiyolojik tipin belirlenmesi amacıyla organizmaların elde edilmesi veya daha ileri duyarlılık testleri için gereklidir. PROSEDÜRÜN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI S. aureus, klinik belirtileri püstüllerden sepsis veya ölüme kadar gidebilen nozokomiyal enfeksiyonların temel bir nedenidir. Sıklıkla sağlıklı bireylerin burnunda veya cildinde bulunur (asemptomatik taşıyıcılar). S. aureus enfeksiyonlarının tedavisi daha önceden etkili olan antimikrobiyel ajanlara dirençli suşların ortaya çıkmasıyla önemli bir konu haline gelmiştir. Metisiline dirençli S. aureus suşları sıklıkla sağlık bakımı ortamlarında bulunur; bazı sağlık tesislerindeki Kuzey Amerika hastanelerinde hastaneden kapılan S. aureus izolatlarının %60'ına yakınını temsil eder 2,3. Hastane ortamlarında MRSA, sağlık çalışanlarının kontamine ellerinden hastadan hastaya bulaşabilir. Sağlık bakımı ortamında MRSA ile kolonizasyonun risk faktörleri arasında hastanede uzun süre kalma, MRSA ile enfekte hastalara yakın olma, çok sayıda ve uzun süreli geniş spektrumlu antibiyotik tedavisi kullanma ve MRSA taşıma vardır. MRSA enfeksiyonu MRSA kolonili hastalarda yüksektir. S. aureus cerrahi bölge enfeksiyonlarının (SSI) başlıca sebeplerinden biridir. Cerrahi işlem geçiren hastaların %26 kadarı, SSI 2,4 geliştirmektedir. S. aureus en sık görülen SSI nedenleri arasında sürekli olarak bildirilmektedir. SSI nin %20-56 sından sorumludur ve bunlar arasında MRSA, izolatların %57 sini temsil edebilir 4. Her iki patojenle ilişkili mortalite oranı %5 ila %22 arasında 4,5 değişmektedir. SSI'li çoğu hastada, S. aureus enfeksiyonu endojen kaynaklıdır 4,6. S. aureus ve MRSA'yı saptamak için kullanılan geleneksel teknikler, kültür basamaklarını ve saf kolonilerin izolasyonunu gerektirirler ve bunları S. aureus'u saptamak için aglütinasyon testi ve ya oksasilin duyarlılık testi, metisiline direnç (meca geni) saptanması ya da MRSA'yı saptamak için penisilin bağlayıcı protein (PBP 2a) saptanması yer alır. Bu geleneksel yöntemler kullanıldığında S. aureus ve MRSA durumunu çözümlemek için, 48 saatten fazla ortanca süreyle minimum 24 saat gerekmektedir. S. aureus enfeksiyonlarıyla ilgili morbidite ve mortalite oranlarının artmasıyla birlikte, meca acil bırakma suşu ve yeni bir metisiline dirençli genin (örn., mecc geni) yayılması, S. aureus ve MRSA yı günler yerine saatler içerisinde saptamak ve ayrıştırmak, mevcut uygulamalar karşısında kesin bir avantaj getirir ve daha etkin hasta tedavisi ve yönetimine olanak sağlar. Bir nazal örnek alınıp laboratuvara önerilen swab kullanılarak gönderilir ("Gerekli Fakat Sağlanmamış Ekipman ve Malzemeler" kısmına bakın). Swab, BD MAX StaphSR Örnek Tampon Tüpüne yerleştirilir. Hücreleri swab'dan tampona bırakmak için Örnek Tampon Tüpü vortekslenir. Örnek Tampon Tüpü BD MAX Sistemine yerleştirilince buradaki otomatik prosedür oluşur: bakteriyel hücreler lizise uğratılır; DNA manyetik boncuklardan ekstrakt ve konsantre edilir; son olarak da, varsa, genetik hedefi amplifiye etmek için kullanılan SA'ya ve MRSA'ya spesifik primerlerin bulunduğu ayrılan DNA alikotu PCR reaktiflerine eklenir. Bu testte de Örnek İşleme Kontrolü (SPC) vardır. İnhibitör maddeler ve enstrüman kaynaklı yetersizlik veya reaktif hatası işlemini izlemek için SPC Ekstraksiyon tüpünde kalır ve ekstraksiyon, konsantrasyon ve amplifikasyon adımlarını uygular. BD MAX Sistemi'ne klinik örnek ve reaktif stripi yüklendikten sonra operatör müdahalesi gerekmez. BD MAX Sistemi örnek lizisi, DNA ekstraksiyonu ve konsantrasyonu, reaktif rehidrasyonu, nükleik asit amplifikasyonu ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak hedef nükleik asit sekansının saptanmasını otomatik olarak gerçekleştirir. Amplifiye hedefler, sönmüş floroforlarla etiketlenmiş hidroliz problarıyla algılanır. Sinyallerin amplifikasyonu, saptanması ve yorumlanması BD MAX Sistemi tarafından otomatik olarak yapılır. PROSEDÜR İLKELERİ BD MAX Sistemi, hücre lizisi ve DNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek üzere litik ve ekstraksiyon reaktiflerinin bir kombinasyonunu kullanır. Yüksek bir sıcaklıkta enzimatik hücre lizisi sonrasında serbest kalan nükleik asitler manyetik afinite boncuklarıyla yakalanır. Bağlı nükleik asitlerin bulunduğu boncuklar yıkanır ve nükleik asitler Elüsyon Tamponunda ısıyla elüsyona uğratılır. Elüsyondan geçmiş DNA, Nötralizasyon Tamponuyla nötralize edilir ve PCR reaktiflerinin rehidrasyonu için Master Mix Tüpüne aktarılır. Rekonstitüsyon yapılmış amplifikasyon reaktifi BD MAX PCR Kartuşuna dağıtılır. BD MAX PCR Kartuşundaki mikrovalfler PCR başlamadan önce buharlaşma ve amplifikasyon kontaminasyonu önlemek için sistem tarafından mühürlenir. P0082(0)

2 Amplifiye DNA hedefleri bir uçta söndürücü kısım ve öteki uçta bir floresan raportör boya (florofor) ile etiketlenmiş hidroliz (TaqMan*) problarıyla saptanır. Farklı floroforlarla etiketlenmiş problar SCCmec sağ uç bileşkesindeki (MREJ) belirli bir amplifikasyonu, metisiline dirençli meca ve mecc, BD MAX Sistemini dört farklı optik kanalındaki S. aureus ve SPC amplikonlarının ısıya dayanıklı nükleazını kodlayan nuc genini algılamakta kullanılır: MREJ amplikonları FAM kanalında, meca ve mecc amplikonları ROX kanalında, nuc amplikonları VIC kanalında, SPC amplikonları da Cy5.5 kanalında algılanır. Problar doğal durumundayken florofor floresansı söndürücüye yakınlığı nedeniyle söndürülür. Ancak hedef DNA varlığında problar tamamlayıcı sekanslarına hibridize olur ve DNA polimerazın, DNA şablonu boyunca yeni oluşan iplikçiği sentezlerken 5-3 ekzonükleaz aktivitesi ile hidrolize uğrar. Bunun sonucunda floroforlar söndürücü moleküllerden ayrılır ve floresans yayılır. BD MAX StaphSR Assay için kullanılan dört optik kanalda saptanan floresans miktarı doğrudan hidrolize uğrayan, karşılık gelen prob miktarıyla orantılıdır. BD MAX Sistemi bu sinyalleri her amplifikasyon döngüsünün sonunda ölçer ve verileri sonuç sağlamak üzere yorumlar. REAKTİFLER REF İçindekiler Miktar BD MAX StaphSR Master Mix (Ana Karışım) (B7) Polimeraz, nükleotidler ve spesifik moleküler problar ve primerlerle birlikte Örnek İşleme Kontrolüne spesifik moleküler prob içeren kurutulmuş PCR Ana Karışım. BD MAX StaphSR Reagent Strip (Reaktif Stripi) Örnek işleme ve DNA ekstraksiyonu için gerekli tüm sıvı reaktifler ve tek kullanımlık pipet uçlarını içeren Ünitelendirilmiş Reaktif stripi. BD MAX StaphSR Extraction Tube (Ekstraksiyon Tüpü) (B8) DNA manyetik afinite boncukları, Akromopeptidaz ve Örnek İşleme Kontrolü içeren kuru ekstraksiyon reaktifi BD MAX StaphSR Sample Buffer Tube (Örnek Tamponu Tüpü) (25 septum kapağıyla) 24 test 24 test 24 test 24 test GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAMIŞ EKİPMAN VE MALZEMELER BBL CultureSwab Liquid Stuart tek veya çift swab (BD katalog no veya 22009), Copan (Venturi) Transystem* Liquid Stuart tek veya çift swab (Copan, katalog no. 4C veya 39C) BBL CHROMagar* Staph aureus (BD katalog no ), BBL CHROMagar* MRSA (BD katalog no ), Mannitol Salt Agar (MSA) (BD katalog no veya 2227) veya eşdeğer ortam (isteğe bağlı) %6,5 NaCl eklenmiş BBL Trypticase Soy Broth (5 ml) (BD katalog no. 2235) (isteğe bağlı) %5 Koyun Kanı Agar plakası [örn., BBL Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% Sheep Blood, BD katalog no veya 2226) (isteğe bağlı) VWR Multi-Tube Vortexer (VWR katalog no ) NALGENE* Cryogenic Vial Holder (VWR, katalog no ) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Steril makas (isteğe bağlı) Steril Gazlı Bez Kronometre veya süre ölçer BD MAX PCR Cartridges (BD katalog no ) UYARILAR VE ÖNLEMLER İn vitro diyagnostik kullanım içindir. Dış kartonu mühürleyen etiket bozulmuşsa kiti kullanmayın. Koruyucu poşetler geldiklerinde açık veya yırtıksa reaktifleri kullanmayın. Reaktif koruyucu poşetini her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. Mühürlemeden önce varsa poşetlerdeki fazla havayı giderin. Reaktif poşetlerinden kurutucuyu çıkarmayın. Reaktif striplerini uygun sıvı dolması açısından kontrol edin (sıvıların tüplerin alt kısmında olmasını sağlayın) (bkz. Şekil ). Tüm pipet uçlarının var olduğundan emin olmak için reaktif striplerini kontrol edin (bkz. Şekil ). Reaktifleri reaktif poşetleri içinde kurutucu yoksa veya açılmışsa kullanmayın. Reaktifleri folyo açılmış veya hasarlıysa kullanmayın. Farklı poşetler ve/veya kitler ve/veya lotlardan reaktifleri karıştırmayın. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifler ve/veya materyalleri kullanmayın. Kontaminasyon oluşacağından ve test sonuçlarını olumsuz etkileyebileceğinden tüpler arasında kapakları karıştırmayın veya tekrar kullanmayın. Master Mix ve Ekstraksiyon tüpü barkod okunabilirliği bozulabileceğinden kimyasal solüsyonları kullanırken dikkatli davranın. SA veya MRSA amplikonlu ortamların kontaminasyonunu önlemek için kullanım öncesinde BD MAX PCR Kartuşunu açmayın. BD MAX PCR Kartuşlarındaki mühürler kontaminasyonu önler. Testi yapma süresinin önerilen süre aralığının dışına çıkması geçersiz sonuçlara neden olabilir. Belirtilen süreler içinde yapılmayan testler tekrarlanmalıdır. 2

3 Yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelere göre ek kontroller test edilebilir. Laboratuvarın aynı genel alanında diğer PCR testlerinin yapıldığı durumlarda BD MAX StaphSR Assay, test için gereken herhangi bir ek reaktif ve BD MAX Sisteminin kontamine olmamasına dikkat edilmelidir. Reaktifler ve kartuşlar kullanılmadan önce eldivenler değiştirilmelidir. Örnekleri daima bulaşıcı olabilirlermiş gibi ve CLSI Belgesi M29 7 'de ve Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 8 'de tanımlandığı şekilde güvenli laboratuvar prosedürlerine göre kullanın. Kit reaktiflerini kullanırken koruyucu giysiler ve tek kullanımlık eldivenler kullanın. Testi yaptıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Örneklerin veya kit reaktiflerinin kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey yemeyin ve içmeyin. Kullanılmamış reaktifleri ve atıkları ulusal, bölgesel ve yerel yönetmeliklere göre atın. SAKLAMA VE STABİLİTE Örnekler taşıma sırasında 2 C ile 25 C arasında tutulmalıdır. Donmaya veya aşırı sıcağa maruz kalmaya karşı koruyun. Örnekler test yapılmasından önce 25 C'de 48 saate kadar, 2-8 C'de de 20 saate kadar (5 gün) saklanabilir. BD MAX StaphSR Assay reaktifleri ve bileşenleri 2-25 C'de belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Son kullanma tarihi geçmiş bileşenleri kullanmayın. BD MAX StaphSR Ana Karışım ve Ekstraksiyon Tüpleri mühürlenmiş poşetlerde sağlanır. Ürünü nemden korumak için açtıktan hemen sonra tekrar mühürleyin. Reaktif tüpleri, poşetin ilk açılışından ve tekrar mühürlenmesinden sonra 2-25 C'de 7 güne kadar stabildir. Rekonstitüsyon Yapılmamış Ekstraksiyon ve Ana karışım reaktif tüpleri koruyucu paketinden çıkarıldıktan sonra 5 saate kadar 2-25 C sıcaklıkta stabildir. KULLANIM TALİMATLARI Örnek Toplama/Nakil Önerilen swab taşıma cihazının kullanılması ( Gereken Ama Sağlanmayan Ekipman ve Materyaller kısmına bakın), nazal örnekler kurumsal ve laboratuvar standardı çalışma prosedürlerine ve/veya aşağıdakilere göre toplanmalıdır:. Swab'ları iki damla (yaklaşık 50 µl) steril fizyolojik salinle nemlendirin veya kuru olarak kullanın. 2. Swab'ları dikkatle hastanın burun deliğine yerleştirin (swab ucu burun kanadının kenarından 2,5 cm ( inç) mesafeye kadar yerleştirilmelidir). 3. Swab'ları ikinci burun deliğinde 5 kez mukozayla yuvarlayın. 4. Aynı swab'ları ikinci burun deliğine yerleştirin ve 2. ve 3. adımları tekrarlayın. 5. Swab'ları kendi taşıma tüpüne yerleştirin. 6. Taşıma tüpünü etiketleyin. 7. Swab'ları laboratuvara kurumun standart işletim prosedürlerine göre taşıyın ( Saklama ve Stabilite kısmına bakın). Örnek Hazırlama NOT: Test edilecek her örnek ve her Harici Kontrol için bir () Örnek Tampon Tüpü, bir () Septum Kapağı, bir () Master Mix (B7), bir () Ekstraksiyon Tüpü (B8) ve bir () Reaktif Stripi gereklidir. NOT: BD MAX StaphSR Assay'i yapmadan önce klinik örneklerden kültür alma ayrıntıları için Klinik Örneklerden Kültür Alınması kısmına bakın.. Örnek ve çalıştırılacak harici kontrol sayısına karşılık gelen Örnek Tampon Tüpü sayısını koruyun. 2. Barkodların net olduğundan, üzerine yazılmadığından veya etiketlenmediğinden emin olarak her Örnek Tampon Tüpünü uygun hasta kimliğiyle etiketleyin. 3. Örnek Tampon Tüpünün kapağını çıkarın. 4. Örnek taşıma tüpünden swab'ı çıkarıp karşılık gelen Örnek Tampon Tüpüne yerleştirin. 5. Swab'ı tüp kenarına yakın olarak sapından tutun (kontaminasyon riskini en aza indirmek için steril gazlı bez kullanın). Swab'ı, Örnek Tampon Tüpünün en dibinden yaklaşık bir () cm kaldırın ve kırmak için tüpün kenarına doğru bükerek kırın. Alternatif yöntem: sapı kesmek için steril bir makas kullanın. 6. Örnek Tampon Tüpünü bir septum kapağıyla kapatın. 7. Örnek Tampon Tüpünü NALGENE* Kriyojenik Flakon Tutucuya yerleştirin ve Çoklu Tüp Vorteksleyici ile bir () dakika boyunca maksimum hızda vorteksleyin. Çoklu Tüp Vorteksleyici ile aynı anda en çok 24 örnek vortekslenebilir. BD MAX Sisteminin Çalışması NOT: Ayrıntılı talimat için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabına başvurun (Çalıştırma kısmı). NOT: BD MAX StaphSR Assay, yukarıdaki vorteksleme adımından hemen sonra yapılmalıdır ( Örnek Hazırlama, Adım 7). Yeniden test etmek gerekirse örnekleri yeniden vorteksleyin.. BD MAX Sisteminin gücünü açın ve <user name> (kullanıcı adı) ve <password> (şifre) girerek oturum açın. 2. BD MAX StaphSR Kitinden gerekli sayıda BD MAX StaphSR Reaktif Stripini çıkarın. Her stripi, tüm sıvıların tüplerin alt kısmında olmasını sağlayacak şekilde sert bir yüzeye hafifçe vurun. 3. Gerekli sayıda StaphSR Ekstraksiyon Tüpü/Tüpleri ve StaphSR Ana Karışım tüpü/tüplerini koruyucu poşetlerinden çıkarın. Fazla havayı çıkarın ve poşetleri fermuar şeklinde kapanan mühür ile kapatın. 4. Test edilecek her örnek ve harici kontrol için bir () BD MAX StaphSR Reaktif Stripini BD MAX Sistem Rakına, Rak A Pozisyon ile başlayıp boş alan bırakmadan sırayla devam ederek yerleştirin Boşlukları atlamayın. 5. Bir () BD MAX StaphSR Ekstraksiyon Tüpünü (beyaz folyo) her BD MAX StaphSR Reaktif Stripinin Pozisyon içine tıklatarak oturtun (bkz. Şekil ). 3

4 6. Bir () BD MAX StaphSR Ana Karışım tüpünü (yeşil folyo) her BD MAX StaphSR Reaktif Stripinin Pozisyon 2 içine tıklatarak oturtun (bkz. Şekil ). Şekil : BD MAX StaphSR Ekstraksiyon tüpleri ve Master Mix tüplerini reaktif stripine tıklatarak oturtun 7. BD MAX yazılımında, Run (Çalıştır) ekranı altında <Consumable info> (Sarf bilgisi) kısmını seçin. 8. BD MAX StaphSR Assay için kit lot numarasını barkodu tarayıcı ile tarayarak veya manuel giriş ile girin (lot izlenebilirliği için). NOT: Adım 7 ve 8'i her yeni kit lot numarası için tekrarlayın. 9. <Work List> (Çalışma Listesi) sekmesini seçin, <Assay> (Test) alanına tıklayın ve aşağı açılır menüyü kullanarak <BD MAX StaphSR> seçin. Bu işlem Rak A için kalan test alanlarını otomatik olarak "BD MAX StaphSR" ile doldurur. 0. BD MAX StaphSR Örnek Tampon Tüpü Kimliği, Hasta Kimliği ve Erişim Numarasını (geçerliyse) Rak A Pozisyon için D barkodu tarayıcıyla tarayarak veya manuel olarak girin.. <Lot Number> (Lot Numarası) alanına tıklayın ve açılır menüyü kullanarak uygun kit lot numarasını seçin (dış kutuda). Bu işlem Rak A için kalan lot numarası alanlarını otomatik olarak aynı lot numarasıyla doldurur. 2. Raktaki sonraki pozisyon için bilgiyi girin ve rakta tüm kalan Örnek Tampon Tüpleri için devam edin. NOT: Adım ve 2 her yeni kit lot numarası için tekrarlanmalıdır. 3. Rak B için adım 9 2'yi tekrarlayın. 4. BD MAX StaphSR Örnek Tampon Tüpünü/Tüplerini BD MAX Rakına/Raklarına çalışma listesinde girilenle aynı sırayla girin. Tüpler arasında alanları atlamayın veya boş pozisyonlar bırakmayın. NOT: Tüpleri, D barkod etiketleri dışarıya bakacak şekilde (böylece örnek kaydedilirken tüpler daha kolay taranabilir) örnek rafına yerleştirin. 5. BD MAX Sistemine gereken sayıda BD MAX PCR Kartuşu/Kartuşları yerleştirin (bkz. Şekil 2). Her kartuş toplam 24 örnek için 2 adede kadar örneklik 2 çalışmayı alır. BD MAX Sistemi her çalışma için PCR kartuşunda pozisyon ve sırayı otomatik olarak seçer. Kartuşlar çalışmaya göre VE raka göre temelinde kullanılır (kartuş başına 2 çalışma ve rak başına kartuş). Şekil 2: PCR Kartuşlarını Yükleyin 6. Rakı/rakları BD MAX Sistemine yükleyin (Şekil 3). Rakın/rakların yerleştirilmesinin (soldan sağa) oluşturulan çalışma listesine karşılık geldiğinden (yukarıdan aşağıya) emin olun. 4

5 Şekil 3: Rakları BD MAX Sistemine yükleyin. 7. BD MAX Sistemi kapağını kapatın ve işlemeye başlamak için <Start Run> (Çalışmayı Başlat) kısmına tıklayın. 8. Çalışma sonunda sonuçları hemen kontrol edin veya Örnek Tampon Tüpleri 2-8 C sıcaklıkta sonuçlar kontrol edilinceye kadar saklayın. NOT: Bir çalışma sırasında bir septum kapağı hasar görmüşse örneği saklamadan önce yenisiyle değiştirin. NOT: Örnek Tampon Tüpleri 25 C sıcaklıkta en çok 36 saat veya çalışma sonrasında 2-8 C'de en çok 20 saat (5 gün) saklanabilir. Bir Belirsiz (IND), Çözümlenmemiş (UNR) veya Eksik (INC) sonuç elde edildiğinde veya bir Harici Kontrol hatası oluştuğunda bu zaman çerçevesi içinde Örnek Tampon Tüpünden bir test tekrarı yapılmalıdır ( Tekrar Test Prosedürü kısmına bakınız). KALİTE KONTROLÜ Kalite kontrol prosedürleri test performansını izler. Laboratuvarlar test kontrol materyallerinin sayısı, tipi ve sıklığını yerel, bölgesel, eyalet ve ülke düzenlemeleri veya akreditasyon organizasyonlarının kılavuz ilkeleri veya gerekliliklerine göre belirlemelidir. Genel kalite kontrolü rehberliği için CLSI MM3 9 ve EP2 0 kısımlarına bakabilirsiniz.. Harici Pozitif Kontrolün önemli reaktif hatası açısından izlemesi amaçlanırken Harici Negatif Kontrolün diğer örneklerden ya da SA veya MRSA amplikonlarından çevresel kontaminasyonu (veya bulaşmayı) veya reaktif kontaminasyonunu saptaması amaçlanır. Harici Kontrol materyallerini BD sağlamaz. Kullanıcının laboratuvar kalite kontrol programı için en uygun kontrolü seçmesini mümkün kılmak üzere çeşitli tiplerde Harici Kontroller önerilir. Piyasada bulunan kontrol materyalleri [örn., referans MRSA suşu (ATCC* 43300), ve metisiline duyarlı Staphylococcus aureus suşu (örn., ATCC 2923) pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Staphylococcus epidermidis suşu (örn., ATCC 2228) negatif kontrol olarak kullanılabilir.]. S. aureus veya MRSA için pozitif veya negatif olduğu bilinen daha önce karakterize edilmiş örnekler. NOT: Bakteriyel suşların salin içinde izole kolonilerden 0,5 McFarland (~,0 x 0 8 CFU/mL) türbiditeye taze olarak hazırlanması ve sonrasında salin ile ~,0 x 0 4 CFU/mL son konsantrasyon elde edilecek şekilde seyreltilmesi önerilir. Seyreltilmiş bakteriyel süspansiyona bir swab daldırın, fazla sıvıyı çıkarın, swab'ı karşılık gelen Örnek Tampon Tüpüne yerleştirin ve Örnek Hazırlama kısmının 5. adımında açıklanan talimatları uygulayın. 2. Bir () Harici Pozitif Kontrol ve bir () Harici Negatif Kontrol BD MAX Sisteminde yeterli işlem doğrulama elde edilinceye kadar gündelik olarak çalışılmalıdır. MRSA ve MSSA kontrol suşları karşılıklı olarak test edilmelidir; her biri gün aşırı test edilmektedir. Kontrol testlerinin azaltılmış sıklığı bireysel laboratuvar tarafından belirlendiği şekilde protokol ve verileri temel almalıdır. 3. Pozitif test sonucu veren bir Harici Negatif Kontrol bir örnek muamelesi ve/veya kontaminasyon problemine işaret eder. Karışma ve/veya kontaminasyondan kaçınmak için örnek muamele tekniğini gözden geçirin. Negatif bir sonuç veren bir Harici Pozitif Kontrol bir örnek muamelesi/hazırlık problemine işaret eder. Örnek muamelesi/hazırlık tekniğini gözden geçirin. 4. Bir Çözümlenmemiş, Belirsiz veya Eksik test sonucu veren bir Harici Kontrol, bir reaktif veya BD MAX Sistemi başarısızlığına işaret eder. BD MAX Sistemi monitörünü herhangi bir hata mesajı açısından kontrol edin. Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabında "Sistem Hata Özeti" kısmına bakın. Problem devam ederse açılmamış bir poşetten reaktifler kullanın veya yeni bir BD MAX StaphSR kiti kullanın. Not: Örnek test sonucunu yorumlamak amacıyla BD MAX Sistemi yazılımı tarafından harici Pozitif veya Negatif Kontroller kullanılmaz. Harici kontroller hasta örnekleriymiş gibi ele alınır. 5. Her BD MAX StaphSR Assay Ekstraksiyon Tüpü bir sentetik hedef DNA dizisi içeren bir plazmid olan bir Örnek İşleme Kontrolü (SPC) içerir. Testin öngörüsünü sağlayarak, işlenen örnekte bulunan DNA ile birlikte SPC çıkarılır, yerleştirilir ve amplifiye edilir. SPC, örnek işleme adımları sırasında DNA yakalama, yıkama ve elüsyonun etkinliğini ve ayrıca PCR analizi sırasında DNA amplifikasyonu ve saptamanın etkinliğini izler. SPC sonucu kabul kriterlerini karşılamazsa, negatif örnek sonucu Çözümlenmemiş olarak bildirilir. Çözümlenmemiş bir sonuç örnekle ilişkili inhibisyon veya reaktif hatasına işaret eder. Çözümlenmemiş olarak bildirilen herhangi bir örneği aşağıdaki "Tekrar Test Prosedürü" kısmına göre tekrarlayın. 5

6 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Sonuçlar BD MAX Sistem monitöründe Results (Sonuçlar) penceresinde Results (Sonuçlar) sekmesinde bulunur. BD MAX Sistem yazılımı otomatik olarak test sonuçlarını yorumlar. Bir test sonucu hedef ve Örnek İşleme Kontrolünün amplifikasyon durumu temelinde SA NEG, MRSA NEG (negatif), SA POS, MRSA POS (MRSA pozitif), SA POS, MRSA NEG (SA pozitif) veya SA UNR, MRSA UNR (çözümlenmemiş) olarak belirtilebilir. IND (belirsiz) veya INC (eksik) sonuçlar BD MAX Sistemi başarısızlığı nedeniyledir. Sonuçlar aşağıdaki karar algoritmasını temel alır: BİLDİRİLEN TEST SONUCU SA POS MRSA POS SA POS MRSA NEG SA NEG MRSA NEG SA UNR MRSA UNR IND INC SONUCUN YORUMLANMASI MRSA DNA saptandı SA DNA saptandı; MRSA DNA saptanmadı SA DNA saptanmadı; MRSA DNA saptandı Hedef amplifikasyon yok; SPC amplifikasyon yok BD MAX Sistemi başarısızlığı nedeniyle belirsiz (Uyarı ve Hata Kodları ile*) Tamamlanmamış Çalışma (Uyarı veya Hata Kodları ile*) * Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabında "Sorun Giderme" kısmına başvurun. SA POS, MRSA POS (SA ve MRSA DNA saptandı) Hem MREJ (S. aureus spesifik), hem de meca/mecc hedefleri için floresans sinyali saptandı. Bazı nadir durumlarda, nuc geninin MRSA 2 için var olmayabildiğini gösterdiğinden nuc gen i hedefi saptanır veya saptanmaz. MRSA hedef amplifikasyonu bu kontrolü devre dışı bıraktığından SPC yok sayılır. SA POS, MRSA NEG (SA DNA saptandı; MRSA DNA saptanmadı) Floresans sinyali sadece nuc geni hedefi için saptandı (SA suşunu belirtir) veya Floresans sinyali nuc geni ve meca/mecc hedefleri için, MREJ sekanslarının olmadığı durumda saptandı (SA olmayan metisilin dirençli bakteriyel suşuyla birlikte kolonizasyonla gösterilen SA suşu belirtir) veya Floresans sinyali nuc geni ve MREJ hedefleri için saptandı (boş kaset çeşidi belirtir) veya Floresans sinyali sadece MREJ hedefi için saptandı (S. aureus boş kaset çeşidini belirtir. MREJ S. aureus örneklerine spesifiktir; bu nedenle de SA suşu belirtir. Boş kaset çeşidi için nuc geni hedefi saptanır veya saptanmaz.). SA hedef amplifikasyonu bu kontrolü devre dışı bıraktığından SPC yok sayılır. SA NEG, MRSA NEG (SA DNA saptanmadı; MRSA DNA saptanmadı) BD MAX StaphSR Assay tarafından hiçbir hedef (nuc, meca/mecc ve MREJ hedefleri) için floresans sinyali saptanmadı ve SPC için floresans sinyali saptandı. Floresans sinyali sadece meca/mecc geni için saptandı (meca ve mecc genleri S. aureus örnekleri için eşsiz değildir ve başka bakteriyel cinslerde (örn., S. epidermidis) bulunabilir). SA UNR, MRSA UNR (Çözümlenmemiş sonuç) Floresans sinyali nuc geni, meca/mecc, veya MREJ hedefleri için saptanmadı ve Floresans sinyali SPC için saptanmadı (İnhibitör örnek veya reaktif başarısızlığı) IND (Belirsiz sonuç) Uyarı veya Hata Kodlarıyla BD MAX Sistemi başarısızlığı. Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabında "Sorun Giderme" kısmına başvurun. INC (Eksik çalışma) Uyarı veya Hata Kodlarıyla BD MAX Sistemi başarısızlığı. Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabında "Sorun Giderme" kısmına başvurun. TEKRAR TEST PROSEDÜRÜ NOT : Kullanılabilen örnek hacmi nedeniyle Örnek Tampon Tüpünden BD MAX Sisteminde sadece bir tekrar test yapılabilir. 25 C sıcaklıkta saklanan Örnek Tampon Tüpleri için yukarıdaki "Örnek Hazırlama" kısmının kapsadığı adımların 36 saati içinde yapılmalıdır. Farklı olarak, 2-8 C sıcaklıkta saklanan Örnek Tampon Tüpleri için yukarıdaki "Örnek Hazırlama" kısmının kapsadığı adımların 20 saati (5 gün) içinde yapılmalıdır. NOT 2: Yeni örnekler tekrar örneklerle aynı çalışmada test edilebilir. 6

7 Çözümlenmemiş Sonuç Çözümlenmemiş sonuçlar, inhibitör madde veya reaktif başarısızlığı, uygun hedef veya SPC amplifikasyonunu önlerse alınabilir. Örnekler karşılık gelen Örnek Tampon Tüplerinden yukarıda tanımlanan zaman çerçeveleri içinde tekrarlanabilir. Örnekleri bir () dakika boyunca vorteksleyin ve BD MAX Sisteminin Çalışması kısmını izleyerek tekrar başlayın. Belirsiz Sonuç Belirsiz sonuçlar, bir Sistem hatası olması durumunda alınabilir. Örnekler karşılık gelen Örnek Tampon Tüplerinden yukarıda tanımlanan zaman çerçeveleri içinde tekrarlanabilir. Örnekleri bir () dakika boyunca vorteksleyin ve BD MAX Sisteminin Çalışması kısmını izleyerek tekrar başlayın. Uyarı veya hata kodu mesajlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabına ("Sorun Giderme" kısmı) bakın. Eksik Sonuç Eksik sonuçlar, sonlandırma uyarısı veya hata kodu durumunda veya Örnek Hazırlama veya PCR beklenen zaman noktalarına ulaşmadığı durumda alınabilir. Eksik sonuçlar çalışmaya veya şeride uygulanabilir. Örnekler karşılık gelen Örnek Tampon Tüplerinden yukarıda tanımlanan zaman çerçeveleri içinde tekrarlanabilir. Örnekleri bir () dakika boyunca vorteksleyin ve BD MAX Sisteminin Çalışması kısmını izleyerek tekrar başlayın. Uyarı veya hata kodu mesajlarının yorumlanması için BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabına ("Sorun Giderme" kısmı) bakın. Harici Kontrol Hatası Harici Kontroller test edildiklerinde beklenen sonuçlar vermelidir. Örneklerin hatalı bir Harici Kontrol sonucu nedeniyle tekrarlanması gerekirse, Örnek Tampon Tüplerinden taze hazırlanmış Harici Kontroller ile birlikte yukarıda tanımlanan zaman çerçeveleri içinde tekrarlanmaları gerekir. Örnekleri bir () dakika boyunca vorteksleyin ve BD MAX Sisteminin Çalışması kısmını izleyerek tekrar başlayın. KLİNİK ÖRNEKLERDEN KÜLTÜR ALINMASI Antimikrobiyel duyarlılık veya epidemiyolijik tip belirleme amacıyla, numune hazırlama prosedürünü gerçekleştirmeden önce (Streak-Plate yöntemi kullanılarak) veya numune hazırlama prosedüründen sonra (Enrichment Broth yöntemi kullanılarak) klinik numuneler toplama cihazlarından (swab) kültün alabilir. İlk PCR çalışmasından hemen sonra, swab'lar 2-8 C sıcaklıkta 36 saat, kültür alınmadan önce, hastane prosedürlerine göre Örnek Tampon Tüplerinde saklanabilir. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR Bu ürün, "Gerekli Fakat Sağlanmamış Ekipman ve Malzemeler" kısmında listelenin numune toplama ve aktarma cihazları kullanılarak toplanan nazal swab numuneleriyle kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu ürün sadece BD MAX Sistemiyle kullanılmalıdır. Yanlış test sonuçlarının nedeni uygunsuz örnek toplama, muamele veya saklama, teknik hata, örnek karışması veya örnekteki organizma sayısının testin analitik duyarlılığının altında olması olabilir. Hatalı sonuçları önlemek için prospektüs talimatı ve BD MAX Sistemi Kullanıcı El Kitabına dikkatle uymak gereklidir. Bu testin düzgün yapılması için uygun laboratuvar tekniği şarttır. Testin yüksek analitik hassasiyeti nedeniyle tüm malzeme ve reaktiflerin saflığını korumak için büyük dikkat gösterilmelidir. Kolonizasyon hastanın aldığı tedavi (örn., dekolonizasyon rejimi), hastanın durumu (örn., geçici SA veya MRSA kolonizasyonu) veya yüksek riskli ortamlara maruz kalma (örn., SA veya MRSA taşıyıcısıyla temas ve/veya uzun süreli hastanede yatma) gibi durumlarla değişebilir. Kolonizasyon durumu kurumsal politikalara göre izlenmelidir. BD MAX StaphSR pozitif bir sonuç DNA varlığında devam edebileceğinden eradikasyon tedavisi başarısızlığını kesin olarak göstermez. Daha önceki bir pozitif test sonucundan sonraki negatif bir sonuç eradikasyon tedavisi başarısını gösterebilir veya aralıklı kolonizasyon nedeniyle olabilir. Pozitif bir test sonucu canlı organizmaların mutlaka bulunduğu anlamına gelmez. Pozitif bir sonuç SA veya MRSA DNA varlığını gösterir. BD MAX StaphSR Assay, eş zamanlı olarak SCCmec kasetinde taşınan meca/mecc genini ve SCCmec kaseti ve orfx geni (MREJ) bileşkesinde yer alan S. aureus spesifik sekansı saptar. BD MAX StaphSR Assay S. aureus spesifik nuc genini de saptar. BD MAX StaphSR Assay, bugüne kadar BD tarafından test edilen dünya çapındaki suşların %98'den fazlasını oluşturarak, MRSA suşlarında yerleşen (farklı SSCmec/MREJ tiplerine ait) meca ve mecc öğelerinin çoğunu temsil eden i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv ve xxi MREJ genotiplerini saptamak üzere tasarlanmıştır. Bu testin saptadığı bölgelerdeki polimorfizm veya mutasyonlar yeni veya bilinmeyen MRSA varyantlarının saptanmasını, yanlış negatif sonuçla engelleyebilir. BD MAX StaphSR Assay performansı, bu suşlar değerlendirilmediğinden değiştirilen S. aureus (MOD-SA) saptamada bilinmez. MOD- SA suşundaki oksasilin direnci mekanizması, penisilin afinitisine bağlı oksasilin proteinlerindeki değişiklik nedeniyle meca geni değildir. MOD-SA suşları ABD'de nadir görülür. Tüm PCR tabanlı in vitro diyagnostik testlerde olduğu gibi testin LoD altında çok düşük hedef düzeyleri saptanabilir ama sonuçlar tekrar edilemeyebilir. Tobramisin BD MAX StaphSR Assay'de inhibitasyona neden olabilir (Daha fazla ayrıntı için Enterferans Yapan Maddeler kısmına bakınız). Yalancı negatif sonuçlar numunelerin yetersiz toplanması, taşınması veya saklanması sonucunda nükleik asit kaybı veya yetersiz bakteriyel hücre lizisi nedeniyle oluşabilir. Örnek İşleme Kontrolü teste PCR amplifikasyonu inhibitörleri içeren örneklerin tanımlanmasına yardımcı olmak üzere, bir bütün halinde reaktif entegrasyonu ve test sisteminin kontrolü olarak eklenmiştir. Örnek İşleme Kontrolü nükleik asidin örneklerin yetersiz toplanması, taşınması veya saklanması nedeniyle kaybedilip kaybedilmediğini veya bakteriyel hücrelerin yetersiz lizise uğrayıp uğramadığını belirtmez. BD MAX StaphSR Assay sonuçları bazen geçersiz örnek işleme kontrolü nedeniyle çözümlenmemiş olabilir veya enstrüman arızası nedeniyle belirsiz veya eksik olabilir ve son sonuçların elde edilmesinde gecikmeye neden olabilecek şekilde tekrar test yapılmasını gerektirebilir. Primer veya prob bağlayıcı bölgelerdeki mutasyonlar veya polimorfizmler yeni veya bilinmeyen MRSA veya SA varyantlarının saptanmasını etkileyebilir ve BD MAX StaphSR Assay ile yalancı negatif bir sonuç verebilir. 7

8 Tüm in vitro diyagnostik testlerle olduğu gibi pozitif ve negatif prediktif değerler prevalansa yüksek ölçüde bağlıdır. BD MAX StaphSR Assay performansı prevalansa ve test edilen popülasyona göre değişebilir. BD MAX StaphSR Assay için BD MAX Sistemine ait dört (4) optik kanalın kullanılması gerekir; FAM kanalı ( nm), ROX kanalı ( nm), VIC kanalı (530/565 nm) ve Cy5.5 kanalı (680/75 nm). Kalan optik kanalın performansını bu test gerçekleştirmez. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Klinik Performans BD MAX StaphSR Assay'in klinik performans özellikleri çok merkezli (3) bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çok merkezli prospektif çalışmaya katılmak için hastaların kurumsal politikalarına göre MRSA ve SA testi yapılması için uygun olmaları gerekmekteydi. Klinik çalışma yeri politikalarına göre hedeflenmiş tarama için uygunluk gereklilikleri arasında verilenlerle sınırlı olmamak üzere şunlar vardı: belirli sağlık bakımı sistemine kabul edilen tüm hastalar; Yoğun Bakım Ünitesine kabul edilen tüm hastalar; Yoğun Bakım Ünitesine aktarılan hastalar; elektif cerrahi öncesi hastalar ve uzun dönemli bakım tesislerinden kabul edilen hastalar. Çalışmaya daha önce kaydedilen hastalara ait numuneler katılmamıştır. Karşılaştırmalı Referans Yöntemi doğrudan kültürden oluşur zenginleştirilmiş kültürle tamamlanır. Zenginleştirilmiş kültür analizi, doğrudan kültürle MRSA ile ilgili negatif olan tüm numuneler için tamamlanmıştır. Kanlı Agarda (BA) alt kültür oluşturmuş selektif (S. aureus) kromojenik aracıda varsayılan S. aureus kolonileri gözlemlendi. Tanımlama bir aglütasyon testi ile yapılırken metisilin direnci Sefoksitin diski (30 μg) difüzyon duyarlılık testiyle doğrulandı. MRSA başlangıç yöntemiyle doğrulanmadığında %6,5 NaCl ile Triptik Soy Buyyon (%6,5 NaCl ile TSB) içinde geliştirme uygulandı. Turbid TSB %6,5 NaCl soya, ek kromojenik aracı ve Kanlı Agar plaklarını inoküle etmek için kullanıldı; MRSA doğrulaması yukarıda tanımlandığı şekilde yapıldı. Çalışma sırasında toplam 039 Doğrudan/Zenginleştirilmiş kültürlü numune test edilmiştir. Bunlardan, 038 nazal swab numunesi numunede ve PCR düzeyinde uyumlu bulunmuş, 40 nazal swab numunesi de referans yöntem düzeyinde uyumsuz bulunmuştur. İki (2) nazal swab numunesi PCR sonuçlarını bildirmediği için performans analizinden hariç tutuldu. Toplamda 996 numune sonucu BD MAX StaphSR Assay'in klinik performansını saptamak üzere kullanılmıştır. Referans Yöntemiyle (Doğrudan/Zenginleştirilmiş kültür) karşılaştırıldığında BD MAX StaphSR Assay MRSA'nın %93,2'sini pozitif numune, MRSA'nın %96,7'sini de negatif numune olarak tanımladı (Tablo ). Test edilen popülasyon için bu durum %99,4 Negatif Prediktif Değer (NPV), %69,3 Pozitif Prediktif Değere (PPV) karşılık gelmektedir. Tablo : BD MAX StaphSR Assay ile MRSA İçin Elde Edilen Sonuçların Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Tüm Çalışma Yerleri BD MAX StaphSR Assay Referans Yöntem MRSA Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Hassasiyet: %93,2 (68/73) (%95CI: %84,9, %97,0) Özgüllük: %96,7 (893/923) (%95CI: %95,4, %97,7) Referans yöntemi ve bildirilebilir PCR uyumlu olan numunelerin toplam sayısı Referans Yöntemiyle (Doğrudan/Zenginleştirilmiş kültür) karşılaştırıldığında BD MAX StaphSR Assay SA'nın %92,0'ını pozitif numune, SA'nın %9,4'ünü de negatif numune olarak tanımladı (Tablo 2). Test edilen popülasyon için bu durum %96,4 NPV ve %82,2 PPV karşılık gelmektedir. Tablo 2: BD MAX StaphSR Assay ile SA İçin Elde Edilen Sonuçların Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Tüm Çalışma Yerleri BD MAX StaphSR Assay Referans Yöntem SA Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Hassasiyet: %92,0 (277/30) (%95CI: %88,4, %94,6) Özgüllük: %9,4 (635/695) (%95CI: %89,0, %93,2) Referans yöntemi ve bildirilebilir PCR uyumlu olan numunelerin toplam sayısı Çalışma sırasında toplam 039 Doğrudan kültürlü numune test edilmiştir. Bunlardan, 038 nazal swab numunesi numunede, kültür ve PCR düzeyinde uyumlu bulunmuş, 3 nazal swab numunesi de tekrarlandığında bildirilebilir sonuç vermemiştir. Toplamda 035 numune sonucu BD MAX StaphSR Assay'in pozitif ve negatif yüzde anlaşmasını saptamak üzere kullanılmıştır. Doğrudan kültürle karşılaştırıldığında BD MAX StaphSR Assay MRSA'nın %95,4'ünü pozitif numune, MRSA'nın %96,0'ını da negatif numune olarak tanımladı (Tablo 3). Tablo 3: BD MAX StaphSR Assay ile MRSA İçin Elde Edilen Sonuçların Doğrudan Kültürle Karşılaştırılması Tüm Çalışma Yerleri BD MAX StaphSR Assay Doğrudan Kültür MRSA Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Pozitif Yüzde Anlaşması (PPA): %95,4 (62/65) (%95 CI: %87,3, %98,4) Negatif Yüzde Anlaşması (NPA): %96,0 (93/970) (%95 CI: %94,6, %97,0) 8

9 Doğrudan kültürle karşılaştırıldığında BD MAX StaphSR Assay SA'nın %94,9'unu pozitif numune, SA'nın %88,8'ini de negatif numune olarak tanımladı (Tablo 4). Tablo 4: BD MAX StaphSR Assay ile SA İçin Elde Edilen Sonuçların Doğrudan Kültürle Karşılaştırılması Tüm Çalışma Yerleri BD MAX StaphSR Assay Doğrudan Kültür SA Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Pozitif Yüzde Anlaşması (PPA): %94,9 (263/277) (%95CI: %9,7, %97,0) Negatif Yüzde Anlaşması (NPA): %88,8 (673/758) (%95CI: %86,3, %90,8) BD MAX StaphSR Assay ile test edilen, numune ve PCR düzeyi ile uyumlu 038 nazal swab numunesinden 4'ü (%0,4) ilk testin sonunda Çözümlenememiş olarak bildirildi. Tekrarlanan testin sonunda Çözümlenmemiş Oranı %0,'dir (/038). Analitik Hassasiyet BD MAX StaphSR Assay için analitik hassasiyet (Saptama Limiti veya LoD) şu şekilde saptanır: simüle numuneler, kültürlerden hazırlanan ve kantifiye edilen MRSA veya MSSA bakteriyel süspansiyonlarının geniş bir yelpazesinde swab'ları batırarak hazırlanır. Test edilin suşlarda MREJ genotipini (i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, iv ve xxi) temsil eden 5 SCCmec tipine (I, II, III, IV ve XI) karşılık gelen MRSA suşu ve 2 MSSA suşu bulunur. Swab'lar bundan sonra simüle nazal matrise yerleştirilir. Her MRSA ve MSSA suşu her konsantrasyonda 24 replika olarak iki farklı kullanıcı tarafından üç farklı BD MAX StaphSR Assay üretim lotu kullanarak çalışılmıştır. Pozitif test edilen tüm replikaların %95'inde en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan analitik hassasiyet (LoD), MRSA suşları saptaması için arası CFU/swab (Tablo 5), MSSA suşları saptaması için de 74-2 arası CFU/swab (Tablo 6) aralığındadır. Tablo 5: BD MAX StaphSR Assay ile MRSA Genotiplerini Saptama Limiti 4 LoD Konsantrasyonu MRSA Suşu MREJ Genotipi SCCmec tipi [CFU/swab (%95 Cl )] Tip i I 84 (49, 42) 2 Tip ii II 03 (64, 67) 3 Tip iii III 60 (93, 278) 4 Tip iv III 68 (42, 09) 5 Tip v IV 28 (73, 225) 6 Tip vi ND (86, 632) 7 Tip vii II 29 (0, 439) 8 Tip ix ND 3 44 (82, 255) 9 Tip xiii ND 3 64 (36, 4) 0 Tip xiv ND 3 78 (48, 27) Tip xxi 2 XI 2 (64, 97) Cl: Güven Aralıkları 2 mecc içeren MRSA suşlar (meca LGA25 suşu olarak da bilinir) 3 ND = belirlenmedi 4 SCCmec tipi, iki farklı tipte yöntem olduğundan MREJ tipiyle korelasyon göstermiyor. Tablo 6: BD MAX StaphSR Assay ile MSSA Saptama Limiti MSSA Suşu LoD Konsantrasyonu [CFU/swab (%95 Cl )] 74 (89, 34) 2 2 (05, 428) Cl: Güven Aralıkları Analitik Dahil Olma Analitik dahil etme çalışması, bir dizi MRSA ve MSSA suşları kullanılarak, coğrafi çıkışı, MREJ genotipi (vahşi tipi ve mutant), SCCmec tipi, Puls Alan Jel Elektroforezi (PFGE) tipi, temporal çeşitlilik ve duyarlılık paterni dikkate alınarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kamu koleksiyonlarından ve iyi karakterize edilmiş klinik izolatlardan örnek vankomisine dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve vankomisin ara Staphylococcus aureus (VISA) suşları dahil olmak üzere 27 ülkeden yetmiş yedi (77) suş ve 6 ülkeden 5 MSSA suşu dahil edilmiştir. BD MAX StaphSR Assay, test edilen tüm i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv ve xxi MREJ tiplerini düşük bakteriyel yükte (2-3 x LoD) saptamıştır. BD MAX StaphSR Assay I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII ve XI MRSA SCCmec tipleri ve 2-3 x LoD'da , 000 ve 00 MRSA PFGE tipleri USA saptamıştır. Vankomisine ek direnç gösteren tüm MRSA suşları da (VRSA ve VISA) saptanmıştır. BD MAX StaphSR Assay, test edilmiş, meca boş kaset çeşitleri de dahil edilmiş 5 MSSA suşunun tümünü saptamıştır. 9

10 İyi Karakterize Edilmiş bir Karşılaştırma Suşu Panelinin Değerlendirilmesi İyi düzenlenmiş karşılaştırma suşu panelini kullanarak BD MAX StaphSR Assay'in analitik performansını değerlendirmek için ek bir analitik çalışma gerçekleştirilir: 2-3 x LoD konsantrasyonunda test edilen PFGE tipleri USA 00 to 800, 000, PFGE tipi IV/IBERIAN ve mecc çeşidi de (meca içerin S. aureus suşu LGA25) dahil yüksek ve düşük oksasilin minimum inhibitör konsantrasyonlarıyla (MIC) 7 MRSA suşunun on yedisi (7) SA POS, MRSA POS sonuçlarını göstermiştir. 0 6 CFU/swab'da test edilen 4 BORSA suşunun (Sınırda oksasiline dirençli S. aureus) dördü (4) SA POS, MRSA NEG sonuçlarını göstermiştir. 0 6 CFU/swab'da test edilen 5 MSSA suşunun beşi (5) SA POS, MRSA NEG sonuçlarını göstermiştir. 0 6 CFU/swab'da test edilen metisilin dirençli (Sınırda oksasiline dirençli Staphylococcus epidermidis) (MRSE) suşunun biri () negatif bir sonuç göstermiştir. Analitik Özgüllük BD MAX StaphSR Assay, MRSA ve MSSA saptamaları amacıyla testin özgüllüğünü belirtmek için BD MAX Sistemini kullanarak hedef olmayan organizmaların ve MSSA suşlarının üst düzeyeni kapsayan örneklerde gerçekleştirilmiştir. 0 6 CFU/swab'daki 5 boş kaset çeşidi MSSA suşunun on beşi (5) SA POS, MRSA NEG sonuçlarını vermiştir. En az 0 6 CFU/mL (3 x 0 5 CFU/swab'da test edilen Cryptococcus neoformans hariç) konsantrasyonda test edilen stafilokoksik olmayan çeşitli 57 suşun eli yedisi (57) negatif sonuç vermiştir. 28 numuneyi temsil eden kırk beş (45) koagülez negatif stafilokoksik suşu (CoNS) ve koagülez pozitif stafilokoksik suşu (CoPS) BD MAX StaphSR Assay ile 0,5 McFarland konsantrasyonunda test edilmiştir. Test edilen 45 suşun kırk beşi (45) negatif sonuç göstermiştir. 0 6 CFU/swab'daki yüksek konsantrasyonda test edilen 50 MSSA suşunun ellisi (50) SA POS, MRSA NEG sonuçlarını vermiştir. 2 farklı viral numunede temsil edilen on yedi (7) virüs 0 5 PFU/mL'de test edilmiştir. 7 virüsün hepsi negatif sonuç vermiştir. Enterferans Yapan Maddeler BD MAX StaphSR Assay ile potansiyel enterferans açısından burun kanatlarında kullanılan veya nazal swab numunelerinde bulunan yirmi dokuz (29) mikroorganizma ve kimyasal madde değerlendirilmiştir (Tablo 7). MRSA negatif örnekler ve MRSA pozitif örnekler 2-3 x LoD değerinde örnek alma bölgesinde veya nazal swab örneğinde bulunması muhtemel olan her bileşenin en yüksek miktarı test edilmiştir. Sonuçlar, 4,5 x 0-3 g/swab konsantrasyonunda test edildiğinde BD MAX StaphSR Assay'inde inhibisyon gösteren Tobramisin dışında, mikroorganizmalarla veya kimyasal maddelerle bildirilecek enterferans belirtmemiştir. Tablo 7: BD MAX Staph SR Testi ile Test Edilen Endojen ve Ticari Olarak Eksojen Maddeler Madde Sonuç Madde Sonuç Mucin, sığır çene altı bezlerinden NI Rhinocort Aqua* NI Deksamethazon Sodyum Fosfat Oftalmik Solüsyon USP, %0, Deksamethazon Fosfat Eşdeğeri NI Zicam* Damlamayan Sıvı Nazal Jel* Uç Konjestiyon Tahliyesi * Chloraseptic* NI Flutikazon Propiyonat NI Taro-Mupirocin, Mupirocin Merhem USP, 2% NI Luffeel* NI Dayanıklı Dristan* Nazal Buhar NI Staphylococcus epidermidis NI Neo-Synephrine* NI Micrococcus luteus NI Equate* Nazal Sprey Dekonjestan NI Enterococcus faecium NI Beconase AQ* NI Enterococcus faecalis NI Flunisolid Nazal Solüsyon USP, %0,025 NI Escherichia coli NI Nasacort* AQ NI Corynebacterium flavescens NI Nasonex* NI Moraxella catarrhalis NI Relenza* NI Staphylococcus hominis subsp hominis NI Tobramisin I Haemophilus influenzae NI Kan NI Streptococcus pneumoniae NI FluMist* NI NI: BD MAX StaphSR Assay ile bildirilebilir enterferans yoktur. I: BD MAX StaphSR Assay ile bildirilebilir enterferans. Kesinlik Laboratuvar içi kesinlik bir () çalışma yerinde BD MAX StaphSR Assay için değerlendirilmiştir. Kesinlik paneli LoD yakınında dört numune kategorisinden oluşmuştur. Her numunede simüle nazal matrisi ve fazladan katılan Staphylococcus epidermidis (ATCC 4990) olan negatif numune vardır. MRSA ve MSSA suşları aşağıdaki şekilde test edilmiştir: Orta Pozitif (MP): 2 ve 5 x LoD (sadece MRSA suşuyla test edildi) Düşük Pozitif (LP): ve < 2 x LoD Yüksek Negatif (HN): < x LoD Gerçek negatif (TN): Negatif numuneler (hedef yok). Testler ikili olarak 2 gün boyunca günde iki çalışmayla iki ayrı teknisyen tarafından yapılmıştır. TN, MP, LP ve HN MRSA örnekleri için kesinlik çalışması sonuçları sırasıyla %00, %00, %97,9 ve %27, anlaşma göstermiştir. LP ve HN MSSA örnekleri için kesinlik çalışması sonuçları sırasıyla %00 ve %56,3 anlaşma göstermiştir. NI 0

11 Tekrarlanabilirlik Üretkenlik yukarıda tanımlandığı şekilde, Kesinlik Çalışması için aynı numune kategorileri kullanılarak yapılmıştır. Her kategorideki örnekler beş ayrı günde üçlü olarak test edilirken her gün iki panel iki teknisyen tarafından üç klinik çalışma yerinde bir reaktif lotu kullanılarak test edilmiştir (Çalışma Yerinden Çalışma Yerine). Bu klinik çalışma yerlerinden biri () iki ek reaktif lotunun test edildiği bir genişletilmiş çalışmaya katılmıştır (Lottan-Lota). Sonuçlar her numune kategorisi için, MRSA ve MSSA suşlarından veriler birleştirilmiş olarak gösterilmektedir. Çalışma Yerinden Çalışma Yerine Tekrarlanabilirlik için genel anlaşma yüzdesi MRSA MP ve TN kategorileri için %00; sırasıyla MRSA ve MSSA LP için %96,7 ve 97,8; sırasıyla MRSA ve MSSA HN için %36,7 ve %30,0 olmuştur (Tablo 8). Tablo 8: BD MAX StaphSR Assay'in Bir Lotunu Kullanarak Çalışma Yerinden Çalışma Yerine Tekrarlanabilirlik Çalışma Sonuçları Kategori ÇALIŞMA YERİ Çalışma yeri Çalışma yeri 2 Çalışma yeri 3 Yüzde Anlaşma Sayı Yüzde Anlaşma Sayı Yüzde Anlaşma Sayı Toplam Yüzde Anlaşması Yüzde Cl %95 HN 2 MSSA 6.7% 5/ % 7/ % 5/ % (2.5%, 40.%) HN 2 MRSA 40.0% 2/ % 8/ % 3/ % (27.4%, 47.0%) LP MSSA 96.7% 29/ % 30/ % 29/ % (92.3%, 99.4%) LP MRSA 95.0% 57/ % 59/ % 58/ % (92.9%, 98.5%) MP MRSA 00.0% 30/ % 30/ % 30/ % (95.9%, 00.0%) TN 00.0% 30/ % 30/ % 30/ % (95.9%, 00.0%) Güven Aralığı 2 Yüzde Anlaşması negatif sonuçların yüzdesiyle ilişkilidir. Lottan Lota Tekrarlanabilirlik için genel anlaşma yüzdesi sırasıyla MRSA MP ve TN için %00; MRSA ve MSSA LP için %96,7; MRSA ve MSSA HN için %40,0 ve %44,4 oranındadır (Tablo 9). Tablo 9: Üç Lot BD MAX StaphSR kullanılarak Lottan Lota Tekrarlanabilirlik Çalışma Sonuçları Kategori LOT Lot Lot 2 Lot 3 Yüzde Anlaşma Sayı Yüzde Anlaşma Sayı Yüzde Anlaşma Sayı Toplam Yüzde Anlaşması Yüzde Cl %95 HN 2 MSSA 50.0% 5/ % / % 4/ % (34.6%, 54.7%) HN 2 MRSA 43.3% 3/ % 3/ % 0/ % (30.5%, 50.3%) LP MSSA 96.7% 29/ % 28/ % 30/ % (90.7%, 98.9%) LP MRSA 96.7% 58/ % 58/ % 58/ % (92.9%, 98.5%) MP MRSA 00.0% 30/ % 30/ % 30/ % (95.9%, 00.0%) TN 00.0% 30/ % 30/ % 30/ % (95.9%, 00.0%) Güven Aralığı 2 Yüzde Anlaşması negatif sonuçların yüzdesiyle ilişkilidir. Bulaşma / Çapraz Kontaminasyon BD MAX StaphSR iş akışındaki yüksek MRSA (0 7 CFU/swab) örnekleri ve negatif örnekleri arasındaki çapraz bulaşma potansiyelini araştırmak üzere çalışma yapılmıştır. 203 bildirilebilir sonucun tamamında, bulaşma kontaminasyonu nedeniyle 3 yalancı pozitif sonuç bulunmuştur (%,5).

12 REFERANSLAR. Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin or soft tissue infection in a state prison. Mississippi, MMWR 200; 50: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 992 to June 2004, issued October Am J Infect Control. 2004; 32: Dulon, M. et al., MRSA prevalence in European healthcare settings: a review. BMC Infectious Diseases,, 20, :38. doi:0.86/ Jernigan, J., Is the burden of Staphylococcus aureus among patients with surgical-site infections growing? Infect.Control Hosp. Epidemiol., 2004; 25 (6): Mc Garry, S. et al., Surgical-site infection due to Staphylococcus aureus among elderly patients: mortality, duration of hospitalization, and cost. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2004; 25 (6): Kluytmans, J. and Wertheilm H., Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections.infection, 2005; 33 (): Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). 8. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Chosewood L.C. and Wislon D.E. (eds) (2009). HHS Publication No. (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, Document MM3 (Refer to the latest edition). 0. Clinical and Laboratory Standards Institute. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline, Document EP2 (Refer to the latest edition).. BD MAX Sistem Kullanıcı Kılavuzu (Son versiyona bakınız), BD Diagnostics, Sparks, MD, USA. 2. Pasanen, T. et al, A selective broth enrichment combined with real-time nuc-meca-pcr in the exclusion of MRSA. APMIS, 200; 8: doi: 0./j x 2

13 Bu ürün lisansla satılır ve bu ürünün satın alınması belirli kan ve doku izleme uygulamalarında ya da belirli endüstriyel uygulamalarda kullanım hakkını içermez. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye insan in vitro diyagnostik bilgisi sağlamak amacıyla nükleik asit dizilerinin amplifikasyonu ve saptanması için kullanılmasına izin verir. Bu satın almayla bu spesifik kullanım hakkı dışında herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir türde lisans verilmez. BD Diagnostics Technical Service: GeneOhm Sciences Canada, Inc Boul. du Parc Technologique Québec (QC), GP 4S5, Canada Made in Canada. Benex Limited Rineanna House Shannon Free Zone Shannon, County Clare, Ireland *Brands are trademarks of their respective owners. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 203 BD. 3