ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Leman Damla KOTAN İNSAN PÜBERTE SÜRECİNDE ROL ALAN YENİ BİR GENİN BELİRLENMESİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2014

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İNSAN PÜBERTE SÜRECİNDE ROL ALAN YENİ BİR GENİN BELİRLENMESİ Leman Damla KOTAN DOKTORA TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez / /2014 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Prof. Dr. A. Kemal TOPALOĞLU Prof. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ Prof. Dr. Mustafa YILMAZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE... Prof. Dr. Bilgin YÜKSEL ÜYE.. Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Mustafa GÖK Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE2013D1 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ İNSAN PÜBERTE SÜRECİNDE ROL ALAN YENİ BİR GENİN BELİRLENMESİ Leman Damla KOTAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. A. Kemal TOPALOĞLU Yıl: 2014, Sayfa: 79 Jüri : Prof. Dr. A. Kemal TOPALOĞLU : Prof. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ : Prof. Dr. Mustafa YILMAZ : Prof. Dr. Bilgin YÜKSEL : Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN Bu çalışma, insanlarda çocukluktan erişkinliğe geçişi sağlayan püberte sürecinin nasıl başladığının aydınlatılmasına katkıda bulunmak amacı ile süreçte yer alan yeni bir genin belirlenmesi için yapılmıştır. Buna yönelik olarak, koku alma duyusunun olmaması ve İdiopatik Hipogonadotropik Hipogonadizme bağlı püberte gelişmemesiyle karakterize olan Kallmann sendromu insan hastalık modeli olarak kullanılmıştır. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Endokrinoloji Polikliniğinde izlenen familyal Kallmann sendromlu 20 aile çalışmaya seçilmiştir. Genom boyu SNP genotiplemesine dayalı otozigosite haritalaması ve tüm eksom sekanslaması sonucu ailelerden ikisinin ortak olarak FEZF1 geninde olası zararlı varyantlar barındırdığı saptanmıştır. Fezf1 knockout edilmiş farelerde GnRH nöronlarının olfaktor plakoddan hipotalamusa doğru olan embriyonik göçlerinin kesintiye uğradığı literatürde daha önce gösterilmiştir. Birinci ailedeki varyantın (p.h278y) çinko parmak özelliğindeki FEZF1 genin işlevini bozduğu HEK293T hücrelerinde yapılan fonksiyonel çalışmalarla kanıtlanmıştır. İkinci ailedeki çerçeve kayması varyantının (c.651delt; A217fs13X) ise Nonsense-mediated decay mekanizmasını etkinleştirip kodlanan proteinin hiç üretilememesine neden olduğu öngörülmüştür. Bu iki ailedeki hastalarda GnRH nöronları çok yüksek olasılıkla embriyonik göçlerini tamamlayıp hipotalamustaki nihai lokasyonlarına ulaşamamış böylelikle yaşamın ikinci on yılında aktiflenerek püberte sürecini başlatan hipotalamo-hipofizer-gonadal eksen hiç kurulamamıştır. Böylelikle, insanda FEZF1 geni fonksiyonunun püberte süreci için zorunlu olduğu ve bu gendeki zararlı mutasyonların bir sonucu olarak Kallmann sendromu fenotipinin geliştiği literatürde ilk kez gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Püberte, Kallmann sendromu, FEZF1, Gonadotropin Releasing Hormone, Hipogonadizm I

4 ABSTRACT PhD THESIS IDENTIFICATION OF A NOVEL GENE TAKING ROLE IN PUBERTY Leman Damla KOTAN ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY Supervisor : Prof. Dr. A. Kemal TOPALOGLU Year: 2014, Pages: 79 Jury : Prof. Dr. A. KEMAL TOPALOGLU : Prof. Dr. Hatice K. GUVENMEZ : Prof. Dr. Mustafa YILMAZ : Prof. Dr. Bilgin YUKSEL : Prof. Dr. Mehmet Sami SERIN It is currently unknown how transition from childhood to adulthood, namely puberty, is started. This study was undertaken to identify a novel gene which has a role in pubertal process. To this end, familial anosmic hypogonadotropic hypogonadism (Kallmann syndrome), which is characterized by absence of pubertal development and sense of smell, was utilized as a human disease model. Patients from 20 multiplex families who were diagnosed with Kallmann Syndrome (KS) in the department of Pediatric Endocrinology of the Cukurova University, Faculty of Medicine were recruited. After screening out the genes known to be associated with KS, 10 of these families were further investigated for responsible gene mutations with SNPbased autozygosity mapping and whole exome sequencing. Two of these families harbored potentially harmful mutations in FEZF1. Knockout mice models for this gene were previously shown to suffer from a defective embryonic GnRH neuron migration from the olfactory placode to the hypothalamus. Mutation in the first family (p.h278y), which involves a zinc finger motif, was demonstrated to be deleterious in a heterologous expression study in HEK298 cell line. Mutation in the second family (c.651delt; A217fs13X) is predicted to result in the absence of a protein product due to Nonsense-mediated decay. These functional deficits most probably led to unsuccessful embriyonic migration of GnRH neurons, thus resulting in failure to establish hypothalamo-pituitarygonadal axis (HPG), activation of which in the second decade of life is the basis of puberty. In conclusion, it has been shown for the first time in this study that FEZF1 is required for normal pubertal development and deleterious mutations in FEZF1 result in KS in humans. Key Words: Puberty, Kallmann syndrome, FEZF1, Gonadotropin Releasing Hormone, Hypogonadism II

5 TEŞEKKÜR Eğitimim boyunca engin bilgi ve deneyimini büyük bir içtenlikle paylaşan ve bana İnsan Püberte Sürecinde Rol Alan Yeni Bir Genin Belirlenmesi konulu doktora tezini öneren, danışmanım ve fikir hocam Sayın Prof. Dr. Ali Kemal TOPALOĞLU na, Desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ, Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI, Sayın Prof. Dr. Yeşim MENDİ ve Biyoteknoloji Anabilim Dalı ailesine, Çalışmam süresince gördüğüm değerli yardımları için Sayın Prof. Dr. Bilgin YÜKSEL, Sayın Prof. Dr. Mustafa YILMAZ ve Pediatri Anabilim Dalı ailesine, Yapıcı ve yönlendirici fikirleri ile bana daima yol gösteren Sayın Doç. Dr. Ayşe SERİN ve Sayın Dr. Hüsniye CANAN a, Gösterdikleri üstün sabır ve desteklerinden dolayı kıymetli aileme, en içten teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ... X SİMGELER VE KISALTMALAR... XII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal KS Hasta Kohortu Alım Kriterleri Dışlama Kriterleri Metod Çalışma Ailelerinin Belirlenmesi Aday Genler Aday Genlerin Taranması (1). DNA İzolasyonu (2). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) (2).a. Primerlerin Hazırlanması (2).b. PCR Reaksiyonunun Hazırlanması (3). Agaroz Jel Elektroforezi (3).a. Agaroz Jelin Hazırlanması (3).b. Elektroforez (4). PCR Pürifikasyonu (4).a. PCR Pürifikasyon Protokolü (5). DNA Dizi Analizi (6). Sekans Reaksiyonu Pürifikayonu IV

7 (6).a. Sekans Reaksiyonu Pürifikasyon Protokolü (7) Kapiller Elektroforez (8). Sekans Analizinin Değerlendirilmesi (9). Veritabanı Kontrolü (10). In slico Kontrol (11). Aile İçi Segregasyon Çalışması Genom Boyu 250K Mikroarray Genotiplemesi Genom Boyu 250K Mikroarray SNP Genotiplemesi Veri Analizi Tüm Eksom Sekansı Tüm Eksom Sekansı Veri Analizi Fonksiyonel Çalışmalar Transfeksiyon Çalışması Western Blot Analizi BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Genom Boyu SNP Genotiplemesine Dayalı Otozigosite Haritalaması Tüm Eksom Sekansı (Whole Eksome Sequencing) Genom Boyu SNP Genotiplemesi ve Tüm Eksom Sekansı Verisinin Ortak Değerlendirilmesi FEZF Çalışma Aileleri Birinci Çalışma Ailesi (1). Klinik Özellikler (2). Genetik Çalışmalar (2).a. DNA Düzeyinde (2).a.1. In slico Analiz (2).a.1.a. Mutation Taster (2).a.1.b. SIFT (2).a.1.c. PolyPhen (2).a.2. Aile İçi Segregasyon Çalışması V

8 (2).a.3. Kontrol Grubu Çalışması (2).b. Protein Düzeyinde (2).b.1. Çinko Parmak (Zinc Finger) İkinci Çalışma Ailesi (1). Klinik Özellikler (2). Genetik Çalışmalar (2).a. DNA Düzeyinde (2).a.1. In slico Analiz (2).a.1.a. Mutation Taster (2).a.2. Aile İçi Segregasyon Çalışması (2).a.3. Kontrol Grubu Çalışması (2).b. Protein Düzeyinde (2).b.1. Nonsense-mediated Decay (NMD) Tartışma SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER VI

9 VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. PCR işleminde kullanılan reaksiyon karışımının içeriğinin gösterilmesi Çizelge 3.2. PCR işlemi için kullanılan programın gösterilmesi Çizelge 3.3. Sekans işleminde kullanılan reaksiyon karışımının içeriğinin gösterilmesi Çizelge 3.4. Sekans işlemi için kullanılan programın gösterilmesi Çizelge 4.1. KS aday genleri taraması sonrası çalışma ailelerinde mutasyon tespit edilen genlerin gösterilmesi Çizelge 4.2. Genom boyu 250K SNP Mikroarray genotiplemesi ve tüm eksom sekansı verisinin ortak değerlendirilmesi sonucu çalışma ailelerinde bulunan varyantların gösterilmesi Çizelge 4.3. FEZF1 geni özelliklerinin gösterilmesi Çizelge 4.4. FEZF1 geni eksonları primerler dizilerinin gösterilmesi VIII

11 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. GnRH nöronları embriyonik migrasyonu gösterilmesi... 5 Şekil 1.2. Hipotalamo-hipofizer-gonadal eksen gösterilmesi... 7 Şekil 3.1. Sequencher programı örnek görüntüsü gösterilmesi Şekil 3.2. Genom boyu 250K mikroarray SNP genotiplemesi verisi örnek görüntüsü gösterilmesi Şekil 3.3. AutoSNPa programı örnek görüntüsü gösterilmesi Şekil 3.4. Eksom sekanslama verisi analizi örnek görüntüsü gösterilmesi Şekil 4.1. Farede Fezf1 ekspresyonunun yoğun olduğu bölgelerin gösterilmesi Şekil 4.2. Birinci çalışma ailesi aile ağacının gösterilmesi Şekil 4.3. Olfaktör bulbusun Magnetik Rezonans görüntülemesi gösterilmesi Şekil 4.4. p.h278y varyantının Mutation Taster in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi gösterilmesi Şekil 4.5. p.h278y varyantının SIFT in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi gösterilmesi Şekil 4.6. p.h278y varyantının PolyPhen-2 in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi gösterilmesi Şekil 4.7. p.h278y varyantının değiştirdiği Histidin amino asidinin evrim sürecindeki korunumunun PolyPhen-2 in slico tahmin programındaki değerlendirilmesi gösterilmesi Şekil 4.8. Birinci çalışma ailesindeki p.h278y varyantının aile içi segregasyonu gösterilmesi Şekil 4.9. Birinci çalışma ailesinde tespit edilen p.h278y (c.c832t) varyantı kontrol çalışmasının gösterilmesi Şekil p.h278y varyantı için yapılan tek hücre analizinde DsRed ekspresyonunun GFP floresan ile karşılaştırılmasının gösterilmesi Şekil Çinko parmak örneklerinin gösterilmesi X

13 Şekil İkinci çalışma ailesi aile ağacının gösterilmesi Şekil c.651delt varyantının Mutation Taster in slico tahmin programı ile değerlendirilmesinin gösterilmesi Şekil İkinci çalışma ailesindeki p.a217fs13x varyantının aile içi segregasyonunun gösterilmesi Şekil İkinci çalışma ailesinde tespit edilen p.a217fs13x (c.651delt) varyantı kontrol çalışmasının gösterilmesi Şekil Nonsense-mediated decay mekanizması örneğinin gösterilmesi Şekil GnRH nöronlarının embriyonal migrasyonunun gösterilmesi Şekil Fezf1 knockout farelerin gösterilmesi Şekil Xp22.3 kromozomal delesyonu olan fetüste GnRH nöronları ve olfaktör bulbus yapısı gösterilmesi XI

14 SİMGELER VE KISALTMALAR KS : Kallmann Sendromu ml : Mililitre E 2 T FSH LH LHRH : Estradiol : Testosterone : Folikül stimülan hormon : Luteinizing hormone (Lüteinize edici hormon) : Luteinizing hormone-releasing hormon PROP1 : PROP paired-like homeobox 1 HESX1 : HESX homeobox 1 DM : Diabetes mellitus KBY : Kronik böbrek yetmezliği IHH : İdiyopatik Hipogonadotropik Hipogonadizm KAL1 : Kallman syndrome 1 sequence FGFR1 : Fibroblast growth factor receptor 1 FGF8 : Fibroblast growth factor 8 PROKR2 : Prokineticin receptor 2 PROK2 : Prokineticin 2 CHD7 : Chromodomain helicase DNA binding protein 7 NELF : Nasal embriyonic LHRH factor DNA : Deoksiribonükleik asit C : Santigrad derece µl : Mikrolitre sn : Saniye dk : Dakika rpm : Rounds per minute (Dakikadaki dönüş sayısı) x g : G force (Dakikadaki dönüş sayısı) PCR : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) dntp : Deoksinükleotid trifosfat F : Forward XII

15 R : Reverse TBE : Tris-Borik asit-edta UV : Ultraviyole SNP : Single Nucleotide Polymorphism (Tek nükleotid polimorfizmi) mirna : mikrorna Mb : Mega base FEZF1 : FEZ family zinc finger 1 ORN : Olfactory Receptor Neurons OB : Olfactor bulbus CNS : Central Nervous System HCG : Human chorionic gonadotropin A : Adenin T : Timin G : Guanin C : Sitozin A : Alanin X : Stop H : Histidin Y : Tirozin c. : cdna p. : Protein fs : Frameshift del : Delesyon Tm : Erime ısısı NMD : Nonsense-mediated Decay mrna : messenger RNA (mesajcı RNA) WT : Wild type M : Mutant EJC : Exon junction complex HEK : Human embriyonic kidney (İnsan embriyonik böbrek) GFP : Green Fluorescent Protein XIII

16 DIC : Differential Interference Contrast Hes5 : Hairy and enhancer of split 5 DsRed : Red fluorescent protein from Discosoma sp. RIPA : Radioimmunoprecipitation assay HCl : Hidroklorik asit NaCl : Sodyum klorür mm : Milimolar SDS : Sodyum dodesil sülfat EDTA : Etilendiamintetraasetikasit Tris : Tris hidroksimetil aminometan DMEM : Dulbecco s Modified Eagle Medium V : Volt PVDF : Polyvinylidene fluoride (Polivinilidenflorür) ZNF312B : FEZF1 HRP : Horseradish peroxidase ddntp : Dideoksinükleotidtrifosfat XIV

17 XV

18 1. GİRİŞ Leman Damla KOTAN 1. GİRİŞ İnsanlarda ve diğer memelilerde, çocukluktan erişkinliğe geçişi sağlayan püberte sürecinin nasıl başladığı bilinmemektedir. Pübertenin başlangıcını belirleyen temel olay hipotalamustaki GNRH nöronlarının pulsatil olarak GNRH salgılamaya başlamasıdır. Günümüzdeki anlayışa göre çocukluk çağı boyunca GNRH pulse generator frenlenmiştir. Pübertenin başlamasını belirleyen olay bu inhibisyonun kalkmasıdır fakat bunun nasıl olduğu bilinmemektedir. Sistemin hiyerarşik nöroendokrin bir mekanizma tarafından kontrol edildiği sanılmaktadır (Ojeda ve ark, 2010). Hipogonadotropik hipogonadizm (HH) çeşitli nedenlerle gonadotropinlerin salgılanmasındaki bir yetersizlik sonucu, adolesan dönemde ikincil cinsiyet karakterleri ve üreme işlevlerinin yani pübertenin gelişememesini tanımlar (Topaloglu ve Kotan, 2010). HH sıklıkla hipotalamo hipofizer bölgeyi etkileyen yapısal bir lezyon (tümör, infiltrasyon vb.) ya da işlevsel bir bozukluk (aşırı zayıflık, kronik hastalık vb.) sonucu oluşur. İdiyopatik HH (IHH) tanımı böyle bir yapısal ya da işlevsel bozukluğun olmadığı heterojen bir grubu kapsar. Bu gruptaki olguların yaklaşık yarısında neden Kallmann sendromudur (KS). Bu sendromda; olfaktor aksonlar boyunca GnRH nöronlarının embriyonik migrasyonunda da bir bozukluk olduğu için, KS lu olgularda, IHH yanında koku alma işlevi de yoktur (anosmi) (Hardelin ve Dode 2008). Bu özgün patofizyolojik ilişkiye GnRH ve olfaktör nöronların ortak gelişimindeki bir defekt neden olmaktadır (Schwanzel-Fukuda ve Pfaff, 1989; Wray ve ark, 1989). Her iki nöron da olfaktör plakoddan orjin alır, GnRH nöronları olfaktör reseptör nöronlarının aksonları ile beraber merkezi sinir sistemine göç eder. Merkezi sinir sistemine girdikten sonra, olfaktör aksonlar olfaktör bulbus ile sinaps yaparlar. GnRH nöronları ise pulsatil GnRH salgısını başlatmak üzere daha ileri, nihai yerleri olan mediobazal hipotalamusa göç ederler. Bütün bu embriyonik migrasyonun bozulması KS ile sonuçlanır. Mutasyona uğradığında KS na neden olan çok sayıda gen belirlenmiştir. Bunlar; KAL1 (Legouis ve ark, 1991; Franco ve ark, 1991) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal yolağı genleri (FGF8, FGFR1, FGF17, IL17RD, DUSP6, SPRY4 ve FLRT3) (Dode ve ark, 1

19 1. GİRİŞ Leman Damla KOTAN 2003; Falardeau ve ark, 2008; Miraoui ve ark, 2013), PROK2 sinyal yolağı genleri (PROK2 ve PROKR2) (Dode ver ark, 2006; Pitteloud ve ark, 2007), CHD7 (Kim ve ark, 2008), WDR11 (Kim ve ark, 2010), SEMA3 (Hanchate ve ark, 2012; Young ve ark, 2012), SOX10 (Pingault ve ark, 2013), HESX1 (Newbern ve ark, 2013) ve HS6ST1 (Tornberg ve ark, 2011) dir. Bu genler familyal vakaların yarısından azını açıklamaktadır ki bu durum GnRH nöronal migrasyonundan sorumlu henüz bilinmeyen genlerin varlığına işaret etmektedir (Topaloglu ve Kotan, 2010). Püberte sürecinin başlamaması sonucunu doğuran monogenik bir hastalığın arandığı bu tezde bulunacak hastalığın kalıtım şeklinin büyük bir olasılıkla otozomal resesif olacağı varsayılmaktadır. Bilindiği gibi, ender görülen ve otozomal resesif olarak kalıtılan hastalıklar, akraba evliliklerinden doğan bireylerde genel toplum ortalamasına göre çok daha yüksek bir sıklıkla görülmektedir. Batı toplumlarında %1 den az olan akraba evlilikleri oranı ülkemizde %20-25 gibi çok yüksek oranlardadır (Tuncbilek ve Koc, 1994). Ayrıca Çukurova Üniversitesi nin bulunduğu Doğu Akdeniz bölgesindeki bir çalışmada bu oran %30.6 olarak bulunmuştur (Donbak, 2004). Çok sayıda SNP lerin belirlenmesi ve yüksek ayrıntılı genomik haritaların geliştirilmesi, insanda hastalık yapan genlerin haritalanmasında etkili stratejilere olanak sağlamaktadır. SNP ler insan genomu boynunca ortalama 1300 bazda bir rastlanan, genel olarak tekdüze dağılım gösteren polimorfik belirleyici(marker)lerdir. SNP genotiplemesi ve yüksek dansiteli genomik haritalardaki gelişmelerin olanaklı kıldığı etkili gen haritalama stratejilerinden en önemlisi Otozigosite Haritalaması (autozygosity mapping) dır (Lander ve Botstein, 1987). Bu kavrama göre; akraba evliliklerinden doğan kişilerde görülen otozomal resesif hastalıklarda, anne ve babadan kalıtılan her iki mutant allelin de kökeni tek bir ortak atadır (IBD: identical by descent). IBD ile ilgili bir başka gerçek ise hasta kişi yalnızca hastalık geni için değil, onun birkaç centimorgan komşuluğundaki SNP ler gibi polimorfik belirleyiciler açısından da homozigottur. Belli bir homozigot bölgeyi ortaklaşa barındıran hasta kişilerin sayısı ne kadar çoksa ve homozigot bölge ne kadar genişse hastalıkla ilişkili geni barındırma olasılığı o kadar yüksektir (Lander ve Botstein, 1987; Mueller ve Botstein, 1993; Woods ve ark, 2004). Otozigosite haritalanmasında 2

20 1. GİRİŞ Leman Damla KOTAN en verimli sonuçlar, bir akraba evliliğinden doğan birden çok hasta bireyin olduğu bir ailedeki bütün bireylerin SNP genotiplemesiyle elde edilir. Çünkü burada genetik heterojenite olasılığı pratik olarak sıfırlanmıştır (Mueller ve Botstein, 1993). Şu ana kadar püberteyle ilgili bilinen iki sinyal sisteminin de (Kisspeptin ve Neurokinin B) keşfinde otozigosite haritalaması yaklaşımının kullanılmış olması çalışmada kullanılacak yöntemin verimliliğinin güçlü bir kanıtıdır. Son yıllarda genomik tekniklerde çok önemli gelişmeler olmuştur. Bunlardan en önde geleni gelecek nesil sekans analizi adı verilen bir tekniktir. Bu teknikte çok büyük miktardaki DNA aynı anda paralel olarak sekanslanabilmekte ve çok kısa zamanda yüksek güvenirlikte DNA sekans sonuçları elde edilebilmektedir. Bu tez kapsamında özel bir gelecek nesil sekans analizi tekniği olan eksom sekanslaması (exome sequencing) kullanılmıştır (Okou ve ark, 2007). Eksom sekanslaması sonucu bir insanda ortalama olarak bin varyantın saptandığı gözlenmiştir. Bunların %95 inden fazlası bilinen zararsız SNP lerdir. Otozigosite haritalaması modeline göre hastalıktan sorumlu allel homozigot olarak (aa) bulunmalıdır. Yeni geliştirilen bir yöntemle bilinen SNP ler ve heterozigot mutasyonlar (Aa) online olarak süzülebilmektedir (Chang ve ark, 2012). Bütün bunlar düşünüldüğünde birden çok hasta kardeşin bulunduğu KS ailelerinde hastalıktan sorumlu mutant gen(ler)in (dolayısıyla pübertede rol alan gen(ler)in) eksom sekanslamasının ve otozigosite haritalaması yönteminden elde edilen verilerinin örtüşmesi ile saptanabileceği öngörülmektedir. Herediter KS olgularında hastalıktan sorumlu mutant gen(ler)in bulunması ile bu genlerin püberte mekanizmasındaki rolü ortaya koyulmuş olunacaktır. İnsan püberte sürecinde rol aldığı henüz bilinmeyen bir gende KS fenotipine yol açan bir mutasyonun gösterilmesi, normal pübertenin başlangıcını belirleyen ve önemli ölçüde henüz bilinmeyen mekanizmalara ışık tutacaktır. Püberte sürecindeki konum ve işlevi yeni saptanmış olacak olan gen(ler)in kodladığı proteinlerin manipülasyonu yoluyla, insan püberte ve üremeyle ilgili hastalıkların tedavisi için ilaç geliştirme konusunda yardımcı olması, uluslararası bilimsel bilgi birikimine önemli bir katkı oluşturması ve yeni araştırma alanları için açılımlar sağlaması da öngörülmektedir. 3

21 1. GİRİŞ Leman Damla KOTAN Bu tez çalışmasında insanda FEZF1 geninde zararlı mutasyonların bir sonucu olarak KS fenotipinin oluştuğu literatürde ilk kez gösterilmiştir. 4

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Leman Damla KOTAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mutasyona uğradıklarında insanda İdiopatik Hipogonadotropik Hipogonadizm hastalık fenotipine yol açan genlerin püberte mekanizmasında esansiyel rollere sahip oldukları defalarca gösterilmiştir. IHH olgularının yaklaşık yarısında neden Kallmann sendromudur. Bu sendromda; olfaktor aksonlar boyunca GnRH nöronlarının embriyonik migrasyonunda da bir bozukluk olduğu için, Kallmann sendromlu olgularda IHH yanında koku alma işlevi de yoktur (anosmi). (Hardelin ve Dode, 2008; Wray, 2010). GnRH hücrelerinin de üzerinde birlikte göç ettiği olfaktor reseptör nöronlarının beyine ulaşamamasının bir sonucu olarak gelişemeyen olfaktör bulbus yapısından dolayı hastalarda anosmi gözlenmektedir (Wray, 2010). Teixeira ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada (2010) KS ndan sorumlu KAL1 geninin bulunduğu Xp22.3 bölgesinde kromozomal delesyonu olan insan fetüsünde olfaktör bulbus yapısının gelişmemiş olduğu ve beyinde GnRH hücrelerinin olmadığı gözlenmiştir. Şekil 1.1. GnRH nöronları embriyonik migrasyonu gösterilmiştir. (Saurez ve ark, 2010). Bozukluğunda KS fenotipine neden olan genler ilk tanımlanışlarına dayalı kronolojik sıraya göre; KAL1 (Franco ve ark,1991; Legouis ve ark, 1991; Hardelin ve ark, 1992), FGFR1 (Dodé ve ark, 2003), PROKR2 ve PROK2 (Dode ve ark, 2003), CHD7 (Vissers ve ark, 2004), FGF8 (Falardeau ve ark, 2008), CHD7 (Kim ve ark, 2008), WDR11 (Kim ve ark, 2010), HS6ST1 (Tornberg ve ark, 2011), SEMA3 5

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Leman Damla KOTAN (Hanchate ve ark, 2012; Young ve ark, 2012), SOX10 (Pingault ve ark, 2013), HESX1 (Newbern ve ark, 2013), FGF17, IL17RD, DUSP6, SPRY4 ve FLRT3 (Miraoui ve ark, 2013) dir. Eksom sekanslaması kullanılarak son 2-3 yılda otozomal resesif kalıtıma sahip onlarca hastalığın genetik temeli ortaya koyulmuştur (Ng ve ark, 2009; Reversade ve ark, 2009; Bamshad ve ark, 2011). İnsan IHH olgularında ilk kez KISS1 mutasyonunu gösteren laboratuarımızda yapılan bir çalışmada ise eksom sekanslaması, sorumlu mutasyonu bağımsız olarak ortaya koymuştur (Topaloglu ve ark, 2012). Bu ve daha önce otozigosite haritalamasına dayalı çalışmalarımızdaki bulguların tetiklediği çeşitli hayvan modellerindeki çalışmalar GnRH pulse generator ı açıklamak üzere KNDy (Kisspeptin, Nörokinin B, Dynorphin) olarak adlandırılan bir modelin ortaya çıkmasına yol açmıştır (Lehman ve ark, 2010). Buna göre; hipotalamustaki arcuate (insanda infindubular) nükleustaki KNDy nöronlarında 3 nöropeptit (Kisspeptin, NKB ve Dynorphin) birlikte eksprese olmaktadır. Bunlardan NKB stimülatör, Dynorphin (Dyn) ise inhibitör olarak çok kısa zaman aralıklı olarak reseptörleri (sırasıyla NK3R ve KOR) aracılığıyla karşılıklı etkileşmektedir. Bu etkileşimin sonucunda intermittent aksiyon potansiyelleri oluşmaktadır. Her bir aksiyon potansiyeli KNDy nöronlarından bir kisspeptin (Kp) molekülünün intermittent olarak aksonları vasıtası ile median eminense doğru salınması sonucunu doğurmaktadır. Kisspeptin median eminensteki GnRH nöron aksonlarında bulunan reseptörleri [GPR54 (KISS1R)] üzerinden hipotalamohipofizer portal dolaşıma doğru intermittent GnRH salgılanmasına yol açmaktadır. Bu da ön hipofizdeki gonadotroplardan pulsatil olarak FSH ve LH salgılanması sonucunu doğurmaktadır (Lehman ve ark, 2010). Bu mekanizmanın öteden beri soyut bir kavram olarak bilinen GnRH pulse generator olduğu düşünülmektedir. KNDy modeline göre GnRH pulse generator Şekil 1.2 de hipotalamo-hipofizergonadal eksen içinde gösterilmektedir (Pinilla ve ark, 2012 den modifiye edildi). 6

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Leman Damla KOTAN Şekil 1.2. Hipotalamo-hipofizer-gonadal eksen gösterilmiştir (Pinilla ve ark, 2012 den modifiye edildi). Ancak GnRH pulse generator ın kendisinin (dolayısıyla püberte sürecinin) nasıl başlatıldığı sorusunun yanıtı hala yoktur. Şu ana kadar tanımlanmış mutasyonlar tüm IHH ve KS olgularının ancak bir bölümünü açıklamaktadır (Crowley ve ark, 2008; Gurbuz ve ark, 2012). Dolayısıyla bozukluğunda püberte gelişmemesine yol açan henüz tanımlanmamış gen(ler)in varlığı güçlü bir olasılık olarak kabul edilmektedir. 7

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Leman Damla KOTAN 8

26 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal KS Hasta Kohortu Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Çocuk Endokrinoloji Polikliniğinde püberte gecikmesi nedeniyle izlenen yaş grubundaki hastaların KS hasta kohortuna uygunluğu alım ve dışlama kriterleri gereğince belirlenmiştir Alım Kriterleri Erkeklerde 14, kızlarda 13 yaşından büyük olmak Kızlarda Tanner evre 1 meme Erkeklerde testis hacmi < 4 ml Kemik yaşı > 11.5 yaş Prepübertal E 2, T ve FSH/LH düzeyleri LHRH uyarısına prepübertal yanıt Anosmi/hiposmi Ailede aynı fenotipe sahip hasta kerdeşin olması Dışlama Kriterleri Normal koku alma duyusu (Normosmi) Hipotalamo-hipofizer bölgede inflamasyon, tümör vs. Çoklu hipofizer hormon eksikliği (örn: PROP1, HESX1) Kronik sistemik hastalıklar (örn: kötü kontrollü DM, KBY vs.) Aşırı zayıflık (PEM, anoreksia nervoza) Obezite (Leptin, Leptin reseptör defekti) Bazı sendromlar (örn: Prader-Willi, Bardet Biedl vs.) 9

27 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 3.2. Metod Çalışma Ailelerinin Belirlenmesi Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırma Etik Kurulu nca uygun görülen (Ek) tez çalışması için, KS hasta kohortu alım ve dışlama kriterleri gereğince, püberte gecikmesi hastalarına yapılan ön değerlendirme ile çalışma aileleri belirlenmiştir. Tüm koşulları sağlayan aileler tez çalışmasına alınmış ve ailedeki hasta bireylerin fizik muayenesi yapılmış, ayrıntılı öyküleri alınmış, KS çalışma formu doldurulmuştur. Ailelerdeki tüm bireylerden EDTA lı tüpe 2 ml kan örneği alınmış ve çalışma boyunca +4 C de saklanmıştır. Kan örneği alınan tüm hastalardan, aile bireylerinden ve/veya velilerinden bilgilendirilmiş onam formu alınmıştır (Ek Çizelge 1-3) Aday Genler Mutasyona uğradığında KS na neden olduğu bilinen KAL1, FGFR1, FGF8, PROKR2, PROK2, ve CHD7 (Topaloglu ve Kotan, 2010; Hardelin ve Dode, 2008) genleri literatür taraması ile belirlenmiştir Aday Genlerin Taranması Seçilen ailelerdeki probandlarda, belirlenen KS aday genlerinin kodlayan eksonları ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler DNA sekans analizi yoluyla olası mutasyonlar açısından incelenmiştir. 10

28 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN (1). DNA İzolasyonu DNA izolasyonu için silika bazlı ticari bir kit (Qiagen, #10023) kullanılmıştır. Ön Hazırlıklar: Su banyosu 56 C ye ayarlanmıştır. Kullanılacak kan örneği oda sıcaklığına bulundurulmuştur. Buffer AE veya tercihen distile su oda sıcaklığında bulundurulmuştur. QIAGEN Proteaz ın liyofilize stok solüsyonu 1.2 ml proteaz çözücüsü ile karıştırılarak kullanıma hazır hale getirilmiştir. Buffer AW1 ve Buffer AW2 tamponlarına gereken miktarlarda saf (%96-100) ethanol eklenmiştir. o 95 ml konsantre Buffer AW1 tamponuna 125 ml saf ethanol eklenerek toplam hacim 220 ml ye tamamlanmıştır. o 66 ml konsantre Buffer AW2 tamponuna 160 ml saf ethanol eklenerek toplam hacim 226 ml ye tamamlanmıştır. Saf ethanol +4 C ye alınıp soğuması sağlanmıştır. DNA İzolasyonu: ml lik steril eppendorf tüpün dibine 20 µl QIAGEN Proteaz K (veya Proteinaz K) eklenmiştir. 2. Üzerine 200 µl kan örneği eklenmiştir. 3. Karışım üzerine 200 µl Buffer AL eklenmiş, vortexle 15 sn karıştırılmış ve kısa bir santrifüj yapılarak kapaktaki damlalar aşağı indirilmiştir. Not: İlk 3 maddenin tüpe koyuluş sırası önemlidir, kesinlikle Proteaz K ve Buffer AL üst üste koyulmamalıdır. 11

29 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 4. Karışım 56 C de 10 dk inkübe edilmiştir. 5. Karışımın üzerine 200 µl saf etanol eklenmiş, vortexle 15 sn karıştırılmış ve kısa bir santrifüj yapılıp kapaktaki damlalar aşağı indirilmiştir. 6. Tüm karışım filtreli tüpe aktarılmış, boşta kalan tüp atılmıştır. Karışımı içeren filtreli tüp 8000 rpm de (6000 x g) 1 dk santrifüj edilmiş, filtre temiz toplama tüpüne alınmış ve altta kalan toplama tüpü atılmıştır. 7. Filtre üzerine 500 µl Buffer AW1 eklenmiş, filtreli tüp 8000 rpm de (6000 x g) 1 dk santrifüj edilmiş, filtre temiz toplama tüpüne alınmış ve altta kalan toplama tüpü atılmıştır. 8. Filtre üzerine 500 µl Buffer AW2 eklenmiş, filtreli tüp rpm de (20000 x g) 4 dk santrifüj edilmiş, filtre 1.5 ml lik üzeri DNA izolasyonu yapılan kişinin bilgileri yazılı steril eppendorf tüpüne alınmış ve altta kalan toplama tüpü atılmıştır. 9. Filtrenin tamamı ıslanacak şekilde 200 µl Buffer AE tamponu (veya distile su) filtre üzerine eklenmiştir. Oda sıcaklığında 5 dk bekletilmiş, 8000 rpm de (6000 x g) 1 dk santrifüj edilmiştir. 10. Filtre atılmış, izole edilen DNA örneği -20 C de saklanmıştır (2). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR, bir çeşit in vitro klonlama yöntemidir. Temel olarak DNA nın denatürasyonu, hibridizasyonu ve polimerizasyonu basamaklarının sırasıyla tekrarlanması sonucu, özgün DNA dizisinin in vitro ortamda enzimatik olarak çoğaltılmasını sağlar (2).a. Primerlerin Hazırlanması Literatür taraması sonrası belirlenen KS aday genleri kodlayan eksonları ve yakın komşuluğundaki intronik bölgelerin primer baz dizileri UCSC Genome Bioinformatics ( ve Primer3 ( 12

30 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN veritabanları kullanılarak belirlenmiştir (Ek çizelge 4-9). Primerler Metabion international AG adlı şirketten elde edilmiştir (2).b. PCR Reaksiyonunun Hazırlanması Çizelge 3.1 de gösterildiği şekilde (Fermentas, #R050A) PCR Kit i protokolü doğrultusunda KS aday genlerinin primerleri (Ek Çizelge 4-9) kullanılarak 0.2 ml lik eppendorf tüplere çalışılan her hasta için PCR reaksiyonları ayrı ayrı hazırlanmıştır. Çizelge 3.2 de gösterilen döngü programı, Takara PCR Thermal Cycler cihazı kullanılarak PCR yapılmıştır. Çizelge 3.1. PCR işleminde kullanılan reaksiyon karışımının içeriği gösterilmiştir. Reaksiyon karışımının içerği Miktar (µl) (PrimeSTAR HS, Takara) 2 x GC Buffer 10 Nuclease free H 2 O 5.8 dntp 1.6 Primer F 0.8 Primer R 0.8 Template DNA 0.8 DNA Polimeraz 0.2 Toplam 20 Çizelge 3.2. PCR işlemi için kullanılan programın gösterilmiştir. Program adımları Sıcaklık ( C) Süre (sn) Döngü sayısı İlk denatürasyon Denatürasyon 95 1 Primer bağlanması * Uzama Bekleme 4 *Her primer için Tm değeri ek çizelge 1-7 de belirtilmiştir. 13

31 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN (3). Agaroz Jel Elektroforezi Makromoleküllerin elektriksel ortamda büyüklüklerine göre ayrılmasını temel alan elektroforez yöntemi, PCR ürünlerinin optimizasyon kontrolü amacıyla kullanılmıştır (3).a. Agaroz Jelin Hazırlanması 1. Agaroz dan (PeqLab, # ) 3 gram tartılarak temiz bir behere alınmıştır. 2. Üzerine 1xTBE Buffer dan 150 ml eklenmiştir. 3. Yaklaşık 7 dakika, mikrodalga fırında orta derecede ısıtılmış, homojen şekilde karışmaları sağlanmıştır. 4. Yaklaşık 50 C ye kadar soğuması beklendikten sonra sıvı haldeki karışımın içerisine 5 µl Ethidium Bromide eklenmiştir. 5. Hazırlanan karışım jel yatağına dökülmüş, üzerine taraklar yerleştirilmiş ve düz bir yüzede oda sıcaklığında 30 dk katılaşması için bekletilmiştir. 6. Taraklar, polimerize olmuş jelden çıkartılarak yükleme yapılacak kuyular oluşturulmuştur (3).b. Elektroforez 1. %2 yoğunlukta hazırlanan jel, jel tankı içerisine yerleştirilerek ve üzerini ince bir tabaka halinde örtecek kadar 1xTBE Buffer ile tank doldurulmuştur. 2. Jel kuyucuklarına 2 µl PCR ürünü ve 3 µl DNA (Loading Dye) yükleme boyası ile karıştırılarak yüklenmiştir. 3. Boşta kalan bir kuyucuğa da elde edilecek PCR ürünü bantların büyüklüklerini belirlemek amacıyla Fermentas FastRuler DNA Ladder, Low Range marker yüklenmiştir. 4. PCR ürünleri 120 voltluk elektrik akımında 14 dakika yürütülmüştür. 5. Bantlar, Syngene UV Transilluminator kullanılarak UV ışığı altında değerlendirilmiştir. 14

32 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Değerlendirme sonucunda PCR reaksiyonlarının, çalışmanın devamına uygun nitelikte olduğu belirlenmiştir (4). PCR Pürifikasyonu kullanılmıştır. PCR sonrası ürünlerin saflaştırılması için ticari (Axygen, #AP96PCR1) kiti (4).a. PCR Pürifikasyon Protokolü Ön hazırlıklar: Buffer W2 tamponuna gereken miktarda saf (%96-100) etanol eklenmiştir. o Konsantre Buffer W2 tamponuna 168 ml saf ethanol eklenmiştir. Eluent tamponu 65 C ye ısıtılmıştır. PCR Pürifikasyonu: 1. PCR reakasiyonunun üzerine 100 µl Buffer PCR A tamponu eklenmiş ve vortexle 15 sn karıştırılmıştır. 2. Karışımın tamamı filtreyi ortalayacak şekilde filtreli tüpe (toplama tüpü + filtre) aktarılmış, rpm de 1 dk santrifüj edilmiştir. 3. Filtre çıkarılıp toplama tüpü boşaltılmış ve filtre tekrar aynı tüpe koyulmuştur. 4. Filtre üzerine 700 µl Buffer AW2 tamponu eklenmiş, rpm de 1 dk santrifüj edilmiştir. 5. Filtre çıkarılıp toplama tüpü boşaltılmış ve filtre tekrar aynı tüpe koyulmuştur. 6. Filtre üzerine 400 µl Buffer AW2 tamponu eklenmiş, rpm de 1 dk santrifüj edilmiştir. 15

33 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 7. Filtre üzerinde PCR bilgileri yazılı olan saklama tüpüne alınmış ve filtrenin tamamını ıslatacak şekilde 30 µl Eluent tamponu eklenmiştir. 8. Oda sıcaklığında 1dk bekletilmiş, daha sonra rpm de 1 dk santrifüj edilmiştir. 9. Filtre atılmış, pürifiye edilmiş PCR reaksiyonu -20 C de muhafaza edilmiştir (5). DNA Dizi Analizi Çizelge 3.3 de gösterildiği şekilde (BigDye, # ) Sekans Kiti protokolü doğrultusunda KS aday genlerinin primerleri (Ek. Çizelge 4-9) kullanılarak 0.2 ml lik ependorf tüplere çalışılan her hasta için ayrı ayrı sekans reaksiyonları hazırlanmıştır. Çizelge 3.4 de gösterilen döngü programı, Takara PCR Thermal Cycler cihazı kullanılarak dizileme yapılmıştır. Çizelge 3.3. Sekans işleminde kullanılan reaksiyon karışımının içeriği gösterilmiştir. Reaksiyon karışımının içeriği Miktar (µl) (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit) Nuclease free H 2 O 6.25 Template DNA x Buffer 0.75 Primer (Forward veya Reverse) 1 BigDye 0.5 Toplam 10 Çizelge 3.4. Sekans işlemi için kullanılan program gösterilmiştir. Program adımları Sıcaklık ( C) Süre (sn) Döngü sayısı Denatürasyon Primer bağlanması Uzama Bekleme 6 16

34 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN (6). Sekans Reaksiyonu Pürifikasyonu Sekans reaksiyonu sonrası ürünlerin saflaştırılması için ticari (Qiagen, #63206) Spin Kit kullanılmıştır (6).a. Sekans Reaksiyonu Pürifikasyon Protokolü 1. DyeEx 2.0 Spin Kit kolonları nazikçe vorteks ile karıştırılmıştır. 2. Kolonların kapağı çeyrek tur açılarak gevşetilmiştir. 3. Kolonların altındaki kulakçık kırılıp, kolonlar 2ml lik toplama tüpüne yerleştirilmiştir rpm de 3 dakika santrifül edilmiştir. 5. Kolonlar, 2ml lik temiz mikrosantrifüj tüpüne alınmış, sekans reaksiyonu kolon içindeki jele aktarılmıştır rpm de 3 dakika santrifül edilmiştir. 7. Kolondan geçen kısım alınıp, jel atılmıştır (7). Kapiller Elektroforez Kapiller elektroforez işlemi için uygun hale getirilen örnekler MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate kuyularına aktarılmış ve ABI 3130 Kapiller Elektroforez cihazına yerleştirilerek örneklerin dizilenmesi gerçekleştirilmiştir (8). Sekans Analizinin Değerlendirilmesi Elektroforez sonrası elde edilen veriler (Şekil 3.1) DNA Sequencing Analysis Software-Sequencher 5.0 programı ( kullanılarak değerlendirilmiştir. 17

35 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Şekil 3.1. Sequencher programı örnek görüntüsü gösterilmiştir. Yapılan dizileme reaksiyonu sonrası Timin: kırmızı pik, Adenin: yeşil pik, Guanin: gri pik, Sitozin: lacivert pik ile gösterilmektedir (9). Veritabanı Kontrolü Yapılan çalışmalar sonrası gözlenen varyantların 1000 genomes browser ( veritabanı kullanılarak bilinen mutasyonlar olup olmadıkları kontrol edilmiştir (10). In slico Kontrol Veritabanında kontrol edilen varyantlar Mutation Taster, SIFT ve PolyPhen-2 in slico tahmin programları kullanılarak değerlendirilmiştir. 18

36 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN (11). Aile İçi Segregasyon Çalışması Gözlenen varyantların otozomal resesif Mendel kalıtımı kuralları gereği aile içi segregasyonlarına bakılmıştır. Ailedeki tüm bireylerde belirlenen KS aday genlerinin kodlayan eksonları ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler DNA sekans analizi yoluyla olası mutasyonlar açısından incelenmiştir Genom Boyu 250K Mikroarray SNP Genotiplemesi Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü ne Genom boyu 250K Mikroarray SNP Genotiplemesi için hasta, anne ve babadan yaklaşık 200 µl DNA örneği gönderilmiştir. Bu tekniğe göre DNA parçaları bir çip üzerinde yüksek yoğunlukta yan yana dizilmektedir. Temel olarak baz eşleşmesi (hibridizasyon) ile tek zincirli işaretlenmiş DNA molekülü, çip üzerindeki bulunan oligonükleotidlere bağlanır. Oluşan hibritlerin yaptığı ışımalar değerlendirilerek DNA örneğinin genotiplendirilmesi yapılır (Maskos ve Southern, 1992) Genom Boyu 250K Mikroarray SNP Genotiplemesi Veri Analizi Excel dosyası şeklinde elde edilen (Şekil 3.2) genom boyu 250K mikroarray genotiplemesi verilerinin analizi için AutoSNPa programı ( kullanılmıştır (Şekil 3.3). 19

37 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Şekil 3.2. Genom boyu 250K mikroarray SNP genotiplemesi verisi örnek görüntüsü gösterilmiştir. Her satır bir SNP yi göstermektedir. SNP lerin kolonlara göre gösteriminde ise; A: sayısını, B: numarasını (ID), C: hangi kromozomda bulunduğunu, D: fiziksel pozisyonunu, E: veritabanında gösterilen kimliğini, F: toplumda görülme sıklığını (AA: toplumda sık görülen homozigot allel, BB: toplumda daha az sık görülen homozigot allel, AB: heterozigot allel, NoCall: okuma kalitesi yetersiz) göstermektedir. 20

38 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Şekil 3.3. AutoSNPa programı örnek görüntüsü gösterilmiştir. Siyah renk toplumda sık görülen allel için homozigot, sarı renk heterozigot ve toplumda seyrek görülen allel için homozigot SNP leri göstermektedir Tüm Eksom Sekansı Tüm eksom sekanslaması için Seoul, Kore de bulunan Macrogen Inc. a tez çalışmasına seçilen ailelerdeki hasta kardeşlerden yaklaşık 1 ml DNA örneği gönderilmiştir. Bu tekniğe göre insan genomik DNA sı sonikasyon ve nebulizasyon ile fragmente edilmiştir. Fragmente örnekler sequence capture array la hibridize edilmiştir. İnsan genomik DNA sı ile hibridize edilmiş arraylar daha sonra ligationmediated PCR ile amplifiye edilmiştir. Amplifiye örnekler yüksek verimli dizi analizine tabii tutulmuş ve sonuçta DNA örneğinin dizi analizi elde edilmiştir (Okou ve ark, 2007). 21

39 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Tüm Eksom Sekansı Veri Analizi Excel dosyası şeklinde elde edilen (Şekil 3.4.) tüm eksom sekanslama verisinin analizi için AgileVariantMapper programı kullanılmıştır ( Hastalık fenotipi oluşturmayacak olan; intronik, sinonim, downstream, upstream, kodlamayan (noncoding), intergenik, UTR5 ve UTR3 varyantları elenmiştir. Çerçeve kayması, delesyon, insersiyon, sinonim olmayan (nonsynonymous), splays, stop kodonu oluşturan (stop gain), stop kodonu kaybettiren (stop loss) gibi hastalık fenotipi oluşturma potansiyeli yüksek varyantlar ise değerlendirilmiştir. Şekil 3.4. Eksom sekanslama verisi analizi örnek görüntüsü gösterilmiştir. Her satır bir varyantı göstermektedir. Varyantların kolonlara göre gösteriminde ise; A: varyantın hangi kromozomda bulunduğunu, B: hangi fiziksel pozisyonda başladığını, C: hangi fiziksel pozisyonda sonlandığını, D: wild-type halini, E: mutant halini, F: allellerde hangi şekilde bulunduğunu, G,H ve I: okuma kalitesini, J: genomun hangi bölgesinde bulunduğunu, K: hangi gende bulunduğunu, L: yaptığı değişimi, M: gendeki konumunu ve tanımını, N ve M: bilinen SNP olup olmadığını, P ve Q: allelik varsansının toplumdaki görülme sıklığını göstermektedir. 22

40 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Fonksiyonel çalışmalar Transfeksiyon Çalışması 1. Wild type ve mutant plazmidler (Geneart), Hes5p-DsRed haberci plazmidi (DsRed, Addgene #26868) ve CMV-GFP plazmidi ile birlikte üretici firmanın Lipofectamine LTX protokolü (Invitrogen) kullanılarak HEK hücrelerine transfekte edilmiştir. 2. Hücreler %80 yoğunluğa gelinceye kadar DMEM ve %20 fetal bovin serumda 6 ve 96 lık platelerde büyütülmüştür. 3. Hücreler üç kez ko-transfekte edilmiştir. 4. Hücreler hem floresans (tek hücre analizi) için test edilmiş hem de Western analizi için protein ekstraksiyonu yapılmıştır. 5. Ko-transfeksiyon verimliliği, DsRed-pozitif hücrelerin GFP ekspresyon yüzdesine göre (%97 nin üzerinde) ölçülmüştür. 6. Doymuş floresan konsantrasyonlarında bile kırmızı ve yeşil kanallar birbirine karışmamıştır. 7. Tek hücre analizi için, ilgilenilen hücre tespit edilmiş, görüntüler aşağıda listelenen ekipmanlar ile alınmış ve arka plan çıkartılmıştır. 8. Deneyler Differential Interference Contrast (DIC) optikli, a motorized stage (Ludl, Electronic Products Ltd, 171 Brady Avenue, Hawthorne, NY USA) ve ICCD kameralı (Retiga, Qimaging, Burnaby, Canada) görüntüleme yazılımı öncülüğündeki (IPLab Spectrum, Scanalytics Inc., Rockville, MD) Mac bilgisayar ekipmanlı TE200 mikroskobunda (Nikon USA, Melville NY) yapılmıştır. 9. Görüntüler ELWD 20x objektif (Nikon) ile alınmıştır. 10. DsRed ve GFP floresan ImageJ kullanılarak ölçülmüştür. 23

41 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN Western Blot Analizi 1. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücrelerden protein lizatı ekstrakte edilmiştir. 2. Hücreler buz üzerine alınmış ve PBS le yıkanmıştır. 3. Hücreler cell scraper ile plateden kazınarak 15 ml konik tüpe transfer edilmiş ve 1000 x rpm de 1 dakika pellet için santrifüj edilmiştir. 4. Protein lizatı pelletin vortekslenmesiyle (3 x 30 saniye) elde edilmiş ve 4 C de (>1 saat) 30 ml RIPA ekstraksiyon tamponu (10 mm Tris HCl, 150 mm NaCl, 1% Triton X-100, 1% Sodyum Deoksiklorat, 0.1% SDS, 5 mm EDTA) ve proteaz inhibitor karışımı (Roche, Cat # ) ile inkübe edilmiştir. 5. Lizat, santrifüj işlemi ile temizlenmiş (17,000 x g, 4 C, 45 dakika) ve örnekler kullanıma kadar -80 C de saklanmıştır. 6. Price BCA Protein Quantification Kit (Cat #23225) kullanılarak protein konsantrasyonu belirlenmiştir. 7. Örnek başına 50 ug total protein denature edilmiş (%5 lik bi-merkaptoethanol ve %95 lik laemelli örnek tamponu (Biorad, Cat # ) içerisinde 95 C, 5 dakika) ve %7.5 luk jele (Mini-Protean TGX Gel, Biorad, Cat # ) markır (Precision Plug Kaleidoscope Protein Standard, Biorad, Cat# ) ile beraber yüklenerek, Tris-Glisin-SDS yürütme tamponu içerisinde (25 mm Tris, 192 mm Glycine, 0.1% SDS) dakika 200V ta yürütülmüştür. 8. Jel kesilmiş ve protein PVDF membrana (Invitrogen, Cat# LC2002) 100V da, 1 saat, 4 C de Tris-Glisin-SDS transfer tamponu içerisinde (48 mm Tris, 39 mm Glycine, 0.1% SDS, 20% v/v Metanol) transfer edilmiştir. 9. Membran %5 lik süt (w/v) TBS-.1% Tween-20 ile 1 saat bloke edilmiş, daha sonra bloke solüsyonu içerisinde primer antibody ile inkübe edilmiştir (4 C de, nazikçe çalkalanarak, gece boyunca) 24

42 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 10. TBS-.1% Tween-20 ile yapılan yıkamanın ardından membran, bloke solüsyonu içerisinde 2 saat ikinci antibody HRP-konjuge ile inkübe edilmiştir. 11. Artan kimyasal ışıldama reaksiyonundaki proteinleri saptamak için (Kodak, Cat# ) (Perkin Elmer, Cat #NEL102001EA) kullanılmıştır. 12. Saptamadan sonra membran yıkanmış, Restore PLUS Western Blot Stripping tamponu (Pierce, Cat #46430) ile 37 C de 30 dakika çıkartılmış ve yukarıdaki protokol kullanılarak tekrar problanmıştır. 13. Bantların yoğunluğu Image J kullanılarak ölçülmüştür. 14. DsRed bant yoğunluğu deneyler arasındaki transfeksiyon verimliliği farkını hesaba katarak FEZF1 e normalize edilmiştir. 15. İstatistiksel değer Prism (Graphpad) kullanılarak belirlenmiştir. 25

43 3. MATERYAL VE METOD Leman Damla KOTAN 26

44 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Tez çalışması için KS alım ve dışlama kriterlerine uyan toplam 20 ailedeki hastalar çalışma kohortuna dahil edilmiştir. Mutasyona uğradığında KS na yol açtığı bilinen aday genlerin taranması sonucu 10 hastada zararlı mutasyon saptanmıştır (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. KS aday genleri taraması sonrası çalışma ailelerinde mutasyon tespit edilen genler gösterilmiştir. Çalışma aileleri KS genleri FGFR1 4-5 FGFR1 6 FGFR1 7 PROK2R FGFR1 13 FGFR PROKR2 16 FGFR KAL FGFR1 KS fenotipini açıklayabilme potansiyeline sahip varyantlar in slico analiz ve aile içinde doğru segregasyonun gösterilmesiyle teyit edilmiş ve böylelikle bu aileler çalışma kohortundan çıkarılmıştır. Geriye kalan 10 aile ile genom boyu SNP genotiplemesine dayalı otozigosite haritalaması ve tüm eksom sekanslamasıyla daha ileri düzey çalışmalar yapılmıştır. 27

45 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Genom Boyu SNP Genotiplemesine Dayalı Otozigosite Haritalaması Çok sayıda SNP lerin belirlenmesi ve yüksek ayrıntılı genomik haritaların geliştirilmesi, insanda hastalık yapan genlerin haritalanmasında etkili stratejilere olanak sağlamaktadır. SNP ler insan genomu boynunca ortalama 1300 bazda bir rastlanan, genel olarak tekdüze dağılım gösteren polimorfik belirleyici(marker)lerdir. SNP genotiplemesi ve yüksek dansiteli genomik haritalardaki gelişmelerin olanaklı kıldığı etkili gen haritalama stratejilerinden en önemlisi Otozigosite Haritalaması (autozygosity mapping) dır (Lander ve Botstein, 1987). Bu kavrama göre; akraba evliliklerinden doğan kişilerde görülen otozomal resesif hastalıklarda, anne ve babadan kalıtılan her iki mutant allelin de kökeni tek bir ortak atadır (IBD: identical by descent). IBD ile ilgili bir başka gerçek ise hasta kişi yalnızca hastalık geni için değil, onun birkaç centimorgan komşuluğundaki SNP ler gibi polimorfik belirleyiciler açısından da homozigottur. Belli bir homozigot bölgeyi ortaklaşa barındıran hasta kişilerin sayısı ne kadar çoksa ve homozigot bölge ne kadar genişse hastalıkla ilişkili geni barındırma olasılığı o kadar yüksektir (Lander ve Botstein, 1987; Mueller ve Botstein, 1993; Woods ve ark, 2004). Otozigosite haritalanmasında en verimli sonuçlar, akraba evliliğinden doğan birden çok hasta bireyin olduğu bir ailedeki bütün bireylerin SNP genotiplemesiyle elde edilir. Çünkü burada genetik heterojenite olasılığı pratik olarak sıfırlanmıştır (Mueller ve Botstein, 1993). Şu ana kadar püberteyle ilgili bilinen iki sinyal sisteminin de (Kisspeptin ve Neurokinin B) keşfinde otozigosite haritalaması yaklaşımının kullanılmış olması tez çalışmada kullanılan yöntemin verimliliğinin güçlü bir kanıtıdır (Topaloglu ve ark, 2012; Topaloglu ve ark, 2009) Tüm Eksom Sekansı (Whole Exome Sequencing) Son yıllarda genomik tekniklerdeki önemli gelişmelerin en önde geleni gelecek nesil sekans analizi adı verilen bir tekniktir. Bu teknikte çok büyük miktardaki DNA aynı anda paralel olarak dizilenebilmekte ve çok kısa zamanda yüksek güvenirlikte DNA dizi sonuçları elde edilebilmektedir (Okou ve ark, 2007). 28

46 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Bu tez kapsamında özel bir gelecek nesil sekans analizi tekniği olan tüm eksom sekanslaması (whole exome sequencing) kullanılmıştır. Mendel kalıtımına bağlı hastalıklardan sorumlu mutasyonların yaklaşık %85 i üretilecek olan proteinin amino asit dizisini etkileyecek ekson veya splays bölgelerinde bulunmaktadır (Teer ve Mullikin 2010). Bu yöntemde; genomda kodlayan bölgelerin dizileri (eksonlar) ve splays bölgeleri tanımlanıp sekans analizleri yapılmaktadır. Eksom sekanslaması sonucu bir insanda ortalama olarak bin varyantın saptandığı gözlenmiştir. Bunların %95 inden fazlası bilinen zararsız SNP lerdir. Otozigosite haritalaması modeline göre hastalıktan sorumlu allel homozigot resesif olarak (aa) bulunmalıdır. Yeni geliştirilen bir yöntemle bilinen SNP ler ve heterozigot mutasyonlar (Aa) online olarak süzülebilmektedir (Chang ve ark, 2012) Genom Boyu SNP Genotiplemesi ve Tüm Eksom Sekansı Verisinin Ortak Değerlendirilmesi Her iki yöntemin ortak değerlendirmesinde, öncelikle çalışma ailelerinin genom boyu SNP genotiplemesine dayalı otozigosite haritaları AutoSNPa programı ile incelenmiştir. Otozomal resesif kalıtım kuralları gereğince ailelerdeki hasta kişilerde bulunan toplumda sık görülen alleller için ortak homozigot bölgeler (siyah renk) ile aynı bölgelerin ebeveynlerde heterozigot (sarı renk) gözlendiği alanlar her aile için saptanmıştır. Çalışma ailelerindeki probandlardan elde edilen tüm eksom sekansı verileri detaylı şekilde incelenmiştir. Hastalık yapıcı zararlı mutasyonun kalıtım şeklinin büyük bir olasılıkla otozomal resesif olacağı varsayıldığı için F kolunundan heterozigot varyantlar dışlanmış, homozigot varyantlar alınmıştır. J kolonundan İntronik, nc (non-coding), intergenik, downstream, upstream, UTR5, UTR3 gibi mutasyona uğradığında üretilecek proteinin yapısını etkilemeyecek varyantlar dışlanmış, eksonik ve sıplays bölgeleri alınmıştır. L kolonundan sinonim kodon değişimleri ve non-frameshift gibi etkisi zararsız olarak düşünülen varyantlar dışlanmış, sinonim olmayan kodon değişimleri, missense değişimler, çerçeve 29

47 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN kaymasına yol açabilecek değişimler (frameshift, frameshift-deletion, frameshiftinsertion, frameshift-substitution) ve stop kodonu değişimleri (stop-lost, stop-gain) alınmıştır. N ve O kolonlarından önceden bilinen bir SNP olduğunu temsil eden rs numaralı varyantlar dışlanmıştır. P ve Q kolonlarından allelik varyansının toplumda görülme sıklığı 0.01 den büyük olan varyantlar dışlanmış, 0.01 den küçük olan varyantlar alınmıştır. Bu elemeler sonucunda her bir probandda zararlı olabilecek ortalama 40 varyant saptanmıştır. Yukarıda ayrıntılandırıldığı şekilde her iki yöntem ile elde edilen veriler paralel olarak değerlendirilmiştir. 4 numaralı çalışma ailesinde tüm eksom sekanslaması sonucu belirlenen olası zararlı varyantlardan yalnızca biri, otozigosite haritalaması sonucu saptanan üç otozigot bölgeden birisi 7. kromozom üzerinde ( Mb arası) bulunmuştur. Bu varyant FEZF1 genindeki p.h278y varyantıdır. Anlatıldığı gibi FEZF1 her iki yöntemin ortaklaşa işaret ettiği tek gendir. Geriye kalan 9 aileden birinde daha (11 no lu aile) eksom verisine göre FEZF1 geninde zararlı olma olasılığı çok yüksek bir çerçeve kayması varyantı gözlenmiştir. Bir genin hastalık fenotipiyle ilişkili olduğu iddiasında bulunabilmek için en az iki farklı ailede bu gende zararlı varyantların gösterilmesi zorunlu kabul edilmektedir. Bu çalışmada FEZF1, bu koşulu karşılayan yani en az iki ailede fenotiple ilişkili olabilecek olası zararlı varyantlar içeren tek gen olarak değerlendirilmiştir (Çizelge 4.2). Bu iki aile (Çizelge 4.2 deki 4. ve 11. aileler) daha ileri düzeyde çalışmalar yapmak üzere seçilmiştir. Kohortun geri kalanında en az iki aile benzer bir örtüşme göstermediğinden tez çalışmasından çıkarılmıştır. 30

48 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Çizelge 4.2. Genom boyu 250K SNP Mikroarray genotiplemesi ve tüm eksom sekansı verisinin ortak değerlendirilmesi sonucu çalışma ailelerinde bulunan varyantlar gösterilmiştir. Çalışma aileleri Olası varyantlar 1 Multiple varyant 2 Multiple varyant 4 FEZF1 8 Multiple varyant 9 Multiple varyant 10 Multiple varyant 11 FEZF1 14 Multiple varyant 17 Multiple varyant 19 Multiple varyant FEFZ1 FEZF1 (Çizelge 4.3) ilk olarak Xenopus ta, eksprese olduğu anterior nöronal katmandan klonlanan bir çinko parmak genidir (Watanabe ve ark, 2009). Altı adet C2H2 motifinde çinko parmak domaini içerir ve bunlar drosphila, zebrafish, fare ve insanda yüksek derecede korunmuştur (Matsuo-Takasaki ve ark, 2000). Yoğun ve özgün bir şekilde olfaktör epitelyum, hipotalamus, ventromedial hipotalamik nükleus (VMH), amigdala ve gebelik sırasında pretalamusta eksprese olan Fezf1 bir transkripsiyon represörüdür (Şekil 4.1) (Hirata ve ark, 2006; Watanabe ve ark, 2009, Kurrasch ve ark, 2007). Ayrıca gastrik kanserlerde overeksprese olup, KRAS ve ERK sinyal yolaklarını kullanarak özellikle gastrik tümörlerde onkogenik aktiviteyi tetikler (Song ve ark, 2009; Song ve ark, 2011). 31

49 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil 4.1. Farede Fezf1 ekspresyonunun yoğun olduğu bölgeler gösterilmiştir. (HT: hipotalamus, VMH: ventromedial hipotalamik nükleusi, OE: olfaktör epitelyum, MA: amigdala, OB: olfaktör bulbus) (Watanabe ve ark, 2009). Çizelge 4.3. FEZF1 geni özellikleri gösterilmiştir. Sembol FEFZ1 İsim FEZ family zinc finger 1 HGNC ID Gen ailesi Çinko parmak, C2H2 tipi Lokasyon Kromozom 7: 121,941, ,950,745 Daha önce kullanılan isim & sembol Zinc finger protein 312B & ZNF312B Sinonim - Gen tipi Protein kodlayan Transkript sayısı 4 Ekson sayısı 4 Sekans uzunluğu 475 aa Hücreiçi lokasyonu Nükleus Protein adı FEZ family zinc finger protein 1 32

50 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Çalışma Aileleri Birinci Çalışma Ailesi belirlenmiştir. Çizelge 4.2 de 4 numara ile gösterilen aile birinci çalışma ailesi olarak (1). Klinik Özellikler Proband 19 yaşında erkek olup (Şekil 4.2, II-3) pübertal gelişiminin olmaması yakınmasıyla başvurdu. Miyadında normal kiloda doğmuş ve büyümesi 14 yaşına kadar normal aralıktaymış. Dış merkezde 14 yaşında küçük fallus ve inmemiş testis için Testosteron ve HCG tedavisi almış. Daha sonra inmemiş testisten ameliyatı olmuştur. Testosteron tedavisi ile penisi yetişkin boyutunda gelişmiş fakat testisleri küçük kalmıştır. Yirmi dört yaşındaki kız kardeşte (Şekil 4.2, II-1) meme gelişiminin olmaması ve adet görememe şikayeti vardır. Sadece 18 yaşında östrojen replasman tedavisinden sonra meme gelişimi ve daha sonrasında adet kanaması başlamış. Şu an doğum kontrol hapı kullanmaktadır. Şimdiki meme gelişmesi Tanner evre 5, pübik kıllar evre 2 ve aksiller kıllar evre 2 dir. Tedavi öncesi pelvik ultrasonunda hipopilazik uterus ve folikülsüz yumurtalık görülmüştür. Yirmi iki yaşındaki sağlıklı erkek kardeş (Şekil 4.2, II-2) normal pubertal gelişim göstermiş ve şu an yetişkin testis volümüne sahiptir. On altı yaşındaki sağlıklı kız kardeş (Şekil 4.2, II-4) ilk adetini 12 yaşında görmüş ve halen düzenli adet görmektedir. En genç erkek kardeş (Şekil 4.2, II-5) 12 yaşındadır. Şu anki testis volümleri 5 ml olup kendiliğinden püberte gelişimi başlamıştır. Ebeveynler (Şekil 4.2, I-1 ve I-2) anne tarafından sağlıklı kuzenlerdir. Etnik olarak Kürt kökenlidirler. Anne ilk adetini 12 yaşında görmüş, baba traş olmaya 14 yaşında başlamıştır. 33

51 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil 4.2. Birinci çalışma ailesi aile ağacı gösterilmiştir. Ailedeki hastalar, diğer yönlerden sağlıklıdır. Herhangi bir mental rahatsızlıkları, dismorfik yüz görünümleri (yarık dudak, yarık damak veya hipodonti gibi), kemik anomalileri, sağırlıkları, böbrek rahatsızlıkları veya bazen KS ile beraber bulunan bimanual synkinesia ları yoktur (Topaloglu ve Kotan, 2010). Probanda onaylanmış koku alma testi olan UPSIT (Doty ve ark, 1984) uygulanıp probandın anosmik olduğu belirlenmiştir. Yapılan beyin Magnetik Rezonans görüntülemede probandın olfaktör bulbusunun tamamen aplazik olduğu saptanmıştır (Şekil 4.3). Yapılan laboratuvar sonuçları Ek Çizelge 10. da gösterilmiştir. Şekil 4.3. Olfaktör bulbusun Magnetik Rezonans görüntülemesi gösterilmiştir. Sol tarafta gösterilen sağlıklı kişide olfaktör bulbus (ok ile gösterilen) yapısı normalken, sağ tarafta gösterilen hastada apilaziktir. 34

52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (2). Genetik Çalışmalar Elde edilen veriler ışığında zararlı varyantlar barındırdığı belirlenen FEZF1 geni ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler probandda incelenmiştir (2).a. DNA Düzeyinde Probandda FEZF1 geni eksonları (Çizelge 4.4) ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler DNA sekans analizi yoluyla olası mutasyonlar açısından incelenmiş, Sequencher 5.0 programı kullanılarak değerlendirme yapılmıştır. Buna göre FEZF1 geninin ikinci eksonunda normalde olmayan farklı bir varyantın varlığı saptanmıştır. Genin 2. eksonunun 832. bazı olan sitozin (C) in timin (T) bazına değişmesi sonucu (c.832c T), gendeki 278. amino asit olan Histidin (H), Tirozin (Y) e değişmiştir (p.h278y) (Ek Çizelge 11). Çizelge 4.4. FEZF1 geni eksonlarının primer dizileri gösterilmiştir. Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı Tm Değeri ( C) 1A F CTACTGGTGGTGATGGTG R AGTGGTTGACCACACGC B F AGCGACCTGCTCAACTG R AGGAAAGGAGGAGCGAG F TTGTTAAGATTCTCTTCCTCC R AAATGAACGTTATCCTAAAGA F TTTGTTCTGCTTGAAAGTGTT R CTACACTTTAAACATCGTCTTCT F CTCTTCTGCTTGCCTGG R CGTCAGACGAACTCGGA (2).a.1. In slico Analiz c.832c T (p.h278y) varyantı Mutation Taster, SIFT ve PolyPhen-2 in slico tahmin programları ile kontrol edilmiştir. 35

53 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (2).a.1.a. Mutation Taster Şekil 4.4. p.h278y varyantının Mutation Taster in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi sonucu hastalık yapıcı (disease causing) olduğu öngörülmüştür (2).a.1.b. SIFT Şekil 4.5. p.h278y varyantının SIFT in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi sonucu hastalık yapıcı (damaging) olduğu öngörülmüştür (2).a.1.c. PolyPhen-2 Şekil 4.6. p.h278y varyantının PolyPhen-2 in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi sonucu hastalık yapıcı (probably damaging) olduğu öngörülmüştür. 36

54 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil 4.7. p.h278y varyantının değiştirdiği Histidin amino asidinin evrim sürecindeki korunumunun PolyPhen-2 in slico tahmin programındaki değerlendirilmesi görülmektedir. Bu diyagramdaki türler Ek Çizelge 12 de açıklanmıştır (2).a.2. Aile İçi Segregasyon Çalışması Bulunan varyantın in slico tahmin programları ile zararlı öngörülmesi üzerine, otozomal resesif Mendel kalıtımı kuralları gereği aile içi segregasyonlarına bakılmıştır. Bulunan p.h278y varyantı için; anne ve babanın heterozigot (H278Y/WT), hasta çocukların homozigot (H278Y/H278Y) ve sağlıklı çocukların heterozigot (H278Y/WT) alleller barındıran genotiplere sahip oldukları görülmüştür. Varyantın aile içi segregasyonu otozomal resesif Mendel kalıtımı gereğince beklenen tablo ile uyumlu bulunmuştur (Şekil 4.8). 37

55 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil 4.8. Birinci çalışma ailesindeki p.h278y varyantının aile içi segregasyonu gösterilmiştir (2).a.3. Kontrol Grubu Çalışması Hastalık fenotipine sebep olduğu düşünülen varyant hastalar ile aynı etnik kökene sahip 100 sağlıklı bireyde otomatik DNA sekansı yöntemi ile incelenmiş ve varyantların kontrol populasyonunda %1 den daha az sıklıkla bulunup bulunmadığı kontrol edilmiştir (Şekil 4.9). Bulunan varyanta kontrol populasyonunda rastlanmamıştır. Şekil 4.9. Birinci çalışma ailesinde tespit edilen p.h278y (c.c832t) varyantı; üst satırda normal (WT), orta satırda mutant (M/M), alt satırda ise heterozigot (M/WT) alleller gösterilmiştir. 38

56 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (2).b. Protein Düzeyinde p.h278y varyantının zararlı etkisinin protein düzeyinde kanıtlanması amacıyla ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (National Institute of Health) Hücresel ve Gelişimsel Nörobiyoloji bölümünde çalışan, konu ile ilgili alanda başat bir araştırmacı olan Dr. Susan Wray ile işbirliğine gidilmiştir. Ortaklaşa geliştirilen bir deneysel starteji ile bu varyantın kodlanan FEZF1 proteininin işlevini etkileyip etkilemediği anlaşılmaya çalışılmıştır. FEZF1 proteininin Hes5 aktivitesini baskıladığı bilinmektedir. (Shimizu ve ark, 2010). Bu durumda bir transkripsiyon represörü olan FEZF1 proteininin Hes5 in ekspresyonunu azaltması beklenir. Eğer p.h278y mutasyonu FEZF1 in işlevini bozarak azaltıyorsa bu durumda Hes5 ekspresyonu artmalıdır. Hes5 ekspresyonundaki değişim, kendi promotör bölgesine bağlı olan DsRed reporter plazmidinin ekspresyonunun deneysel ortamda izlenmesiyle anlaşılabilir. Diğer bir deyişle eğer p.h278y varyantı FEZF1 proteininin işlevini bozarak azaltıyorsa Hes5 ekspresyonu (dolayısıyla DsRed ekspresyonu) artmalıdır. DsRed ekspresyonu deneysel ortamda kendisini kırmızı renk artışı ile belli eder. Diğer taraftan aynı deneysel ortamda FEZF1 ekspresyonu ise ilişkilendirilmiş GFP reporter plazmidi nedeniyle yeşil renkli olarak izlenmiştir. Dr. Wray tarafından yapılan çalışmaların ilkinde HEK293T hücre dizisinde yapılan ko-transfeksiyon deneylerinde DsRed ekspresyonu (kırmızı) GFP floresan (yeşil) ile karşılaştırılmıştır. Şekil 4.10 A ve C de görüldüğü üzere WT FEZF1, DsRed ekspresyonunu represe etmiştir. Bunun tam tersi olarak FEZF1 yokluğu DsRed in tam ekspresyonuna yol açmıştır. p.h278y vektörünün varlığı, DsRed ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmakla birlikte yine de rezidüel bir aktivite kalmıştır. Şekil 4.10 B de ise p.h278y vektörünün DsRed in protein düzeyinde ekspresyonunu benzer şekilde önemli ölçüde azalttığı gözlenmektedir. Bu sonuçlar bize p.h278y mutasyonunun FEZF1 fonksiyonunda önemli bir kayba yol açtığını, dolayısyla mutasyonun zararlı karakterini göstermektedir. 39

57 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil p.h278y varyantı için yapılan tek hücre analizinde DsRed ekspresyonunun GFP floresan ile karşılaştırılmıştır. A ve C de WT FEZF1, DsRed ekspresyonunu represe etmiştir. Bunun tam tersi olarak FEZF1 yokluğu DsRed in tam ekspresyonuna yol açmıştır. p.h278y vektörünün varlığı, DsRed ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmakla birlikte yine de rezidüel bir aktivite kalmıştır. B de ise p.h278y vektörünün DsRed in protein düzeyinde ekspresyonunu benzer şekilde önemli ölçüde azalttığı gözlenmektedir (2).b.1. Çinko Parmak (Zinc Finger) Çalışma ailelerinde farklı varyantların bulunduğu FEZF1 geninin, C2H2 motifinde bir çinko parmak transkripsiyon faktörü özelliğinde olduğu bilinmektedir (Watanabe ve ark, 2009). Ökaryotik transkripsiyon faktörlerinin yapısal bakımdan ana ailesini oluşturan çinko parmaklar, gen regülasyonuna bir çok yönden katılırlar (Razin ve ark, 2012). Tipik bir çinko parmak motifinde, iki sistein ve iki histidin amino asidinin belirli aralıklarla tekrarlandığı bir bölge vardır (Şekil 4.11A). Bu bölgede CysN 2-4CysN HisN 3 His şeklinde tekrarlayan (N herhangi bir amino asittir) konsensus amino asit dizisi bulunmaktadır. Bu yapıda, histidin ve sistein amino asitleri çinko atomu ile kovalent bağ yaparak, amino asitleri çinko parmak olarak adlandırılan bir ilmek veya parmak şeklinde büker. Her bir parmak 23 amino asit içerir ve ilmekler arasındaki bağlantı bölgesi yaklaşık 7 ya da 8 amino asitten oluşur. İlmekte yer alan amino asitler özgül DNA dizileri ile etkileşip ona bağlanırlar. Bir çinko parmak 40

58 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN transkripsiyon faktöründeki parmakların sayısı 2 ile 13 arasında değişir (Klug ve Cummings, 2007). Dr. Wray tarafından yapılan çalışmalarda mutant (p.h278y) FEZF1 proteininin işlevsel bozukluğu gösterilmiştir. C2H2 çinko parmak motifinde merkezde bulunan çinko atomu, iki histidin ve iki sistein amino asidi tarafından uzaysal anlamda yerinde tutulmaktadır (Şekil 4.11B). p.h278y varyantı FEZF1 proteininde merkezi çinko atomunun stabilitesi için gerekli olan ilk histidin amino asidini değiştirmiştir (Brown, 2005). Bu amino asidin C2H2 çinko parmak motifinin değişmez bir öğesi olduğu, evrim sürecinde bu rezidünün son derece iyi korunmuş olmasından anlaşılmaktadır (Şekil 4.7). Bu nedenle, histidin amino asidinin yerine gelebilecek tüm varyantların zararlı olacağı tahmin edilmektedir. A B Şekil Çinko parmak örnekleri gösterilmiştir. A. C2H2 motifindeki tipik bir çinko parmak modeli gösterilmiştir. B. Çinko parmağın hedef DNA molekülüne (kahverengi çift sarmal) bağlanmış durumu örnek görüntüsü gösterilmiştir (C: sistein amino asidi, H: histidin amino asidi, Zn: çinko atomu, solda turuncu yapı: DNA molekülü, mavi yapı: çinko parmak, yeşil: çinko atomu) İkinci Çalışma Ailesi belirlenmiştir. Çizelge 4.2 de 11 numara ile gösterilen aile ikinci çalışma ailesi olarak 41

59 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (1). Klinik Özellikler Proband 14 yaş 3 aylık bir erkek hastadır (Şekil 4.12, II-2). Hasta iki yaşına kadar mikropenis ve inmemiş testis ile dış merkezde izlenmiş. İnmemiş testis için tekrarlanan HCG tedavilerindeki başarısızlık üzerine dış merkezde ameliyat olmuş. Yapılan testosteron enjeksiyonlarına rağmen kendiliğinden herhangi bir pübertal gelişme göstermemiş. Miyadında normal kiloda doğmuş ve büyüme gelişmesi normal aralıktaymış. Polikliniğimize başvuruda bilateral testis volümü 1 ml ve fallusu 4 cm olup, hastanın evre 2 aksiller ve pubik kıllanması mevcuttu. Yapılan GnRH stimülasyon testinde maksimum LH cevabı 0.2 miu/ml ydi. Hastanın 7 yaş 10 aylık olan erkek kardeşinin de (Şekil 4.12, II-4) mikropenisi ve inmemiş testisi mevcuttu. İnmemiş testis için tekrarlanan HCG tedavilerindeki başarısızlık üzerine 2 yaşında dış merkezde ameliyat olmuş. Miyadında normal kiloda doğmuş ve büyüme gelişmesi normal aralıktaymış. Polikliniğimize başvuruda prepübertal olan hastanın bilateral testis volümü 1 ml ve fallusu 3.6 cm olup, hastanın evre 1 aksiller ve pubik kıllanması mevcuttu. On yedi yaşındaki erkek kardeş (Şekil 4.12, II-1) normal pübertal gelişim görtermemiş olup şu anda yetişkin erkek testis volümlerine sahiptir. On bir yaşındaki kız kardeşte (Şekil 4.12, II-3) bir yıl önce meme büyümesi ve pübertal gelişimi başlamıştır. Ebeveynler (Şekil 4.12, I-1 ve I-2) baba tarafından sağlıklı kuzenlerdir. Etnik olarak Kürt kökenlilerdir. Anne ilk adetini 12.5 yaşında görmüş, baba traş olmaya 15 yaşında başlamıştır. Şekil İkinci çalışma ailesi aile ağacı gösterilmiştir. 42

60 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Ailedeki hastalar, diğer yönlerden sağlıklıdır. Herhangi bir mental rahatsızlıkları, dismorfik yüz görünümleri (yarık dudak, yarık damak veya hipodonti gibi), kemik anomalileri, sağırlıkları, böbrek rahatsızlıkları veya bazen KS ile beraber bulunan bimanual synkinesia ları yoktur (Topaloglu ve Kotan, 2010) Probanda onaylanmış koku alma testi olan UPSIT (Doty ve ark, 1984) uygulanıp probandın anosmik olduğu belirlenmiştir. Yapılan beyin MR da probandın olfaktör bulbusunun tamamen aplazik olduğu saptanmıştır (Şekil 4.3). Yapılan laboratuvar çalışmalarının sonuçları Ek Çizelge 10. da gösterilmiştir (2). Genetik Çalışmalar Elde edilen veriler ışığında olası zararlı varyant barındırdığı belirlenen FEZF1 geni ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler probandda incelenmiştir (2).a. DNA Düzeyinde Probandda FEZF1 geni eksonları (Çizelge 4.4) ve yakın komşuluğundaki intronik bölgeler DNA sekans analizi yoluyla olası mutasyonlar açısından incelenmiş, Sequencher 5.0 programı kullanılarak değerlendirme yapılmıştır. Buna göre FEZF1 geninin 1. eksonun 651. bazı olan timin (T) in delesyonu uğraması sonucu (c.651delt), 217. Alanin (A) amino asidinden sonrasını kodlayan dizide çerçeve kayması (frameshift) meydana gelmiş ve dizi 13 aminoasit ileride Stop (X) kodonu ile sonlanmıştır (p.a217fs13x) (Ek Çizelge 11) (2).a.1. In slico Analiz c.651delt (p.a217fs13x) çerçeve kayması Mutation Taster in slico tahmin programı ile kontrol edilmiş ve hastalığa neden olabileceği ön görülmüştür. 43

61 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (2).a.1.a. Mutation Taster Şekil c.651delt varyantının Mutation Taster in slico tahmin programı ile değerlendirilmesi sonucu zararlı olduğu ve Nonsense-mediated Decay e yol açabileceği öngörülmektedir (2).a.2. Aile İçi Segregasyon Çalışması Bulunan varyantın in slico tahmin programları ile zararlı öngörülmesi üzerine, otozomal resesif Mendel kalıtımı kuralları gereği aile içi segregasyonlarına bakılmıştır. Bulunan p.a217fs13x varyantı için; anne ve babanın heterozigot (A217fs13X/WT), hasta çocukların homozigot (A217fs13X/A217fs13X) ve sağlıklı çocukların heterozigot (A217fs13X/WT) alleller barındıran genotiplere sahip oldukları görülmüştür. Varyantın aile içi segregasyonu otozomal resesif Mendel kalıtımı gereğince beklenen tablo ile uyumlu bulunmuştur (Şekil 4.14). Şekil İkinci çalışma ailesindeki p.a217fs13x varyantının aile içi segregasyonu gösterilmiştir. 44

62 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil İkinci çalışma ailesinde tespit edilen p.a217fs13x (c.651delt) varyantı; üst satırda normal (WT), orta satırda mutant (M/M), alt satırda ise heterozigot (M/WT) alleller gösterilmiştir (2).a.3. Kontrol Grubu Çalışması Hastalık fenotipine sebep olduğu düşünülen varyant hastalar ile aynı etnik kökene sahip 100 sağlıklı bireyde otomatik DNA sekansı yöntemi ile incelenmiş ve varyantın kontrol populasyonunda %1 den daha az sıklıkla bulunup bulunmadığı kontrol edilmiştir (Şekil 4.15). Bulunan varyanta kontrol populasyonunda rastlanmamıştır (2).b. Protein Düzeyinde p.a217fs13x çerçeve kayması varyantı Mutation Taster in slico tahmin programının da öngördüğü şekilde yüksek olasılıkla Nonsense-mediated Decay (NMD) mekanizmasının çalışmasına yol açmıştır. 45

63 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN (2).b.1. Nonsense-mediated Decay (NMD) Genetik koddaki 64 kodondan 3 tanesi stop kodonudur. Ribozomlar stop kodonuyla karşılaştıklarında mrna dan ayrılırlar ve oluşan polipeptid serbest kalır. Hücreler, prematür stop kodonu içeren mrna ları tespit edip onları degrade eden NMD adlı bir mekanizmaya sahiptir. Nükleustan ribozoma giden mrna, intronların pozisyonlarını aklında tutar. Normalde, ekson kavşak kompleksi (exon junction complex - EJC) nükleustan ribozoma giden mrna nın splays bölgelerine tutunmuş olarak bulunur. Ribozom, mrna üzerinde her splays bölgesinden geçerken bu bölgelere bağlı EJC proteinlerini temizler. Eğer prematür sonlanma kodonu varsa ribozom mrna dan ayrılacağı için bütün splays bölgelerine uğramayacaktır ve böylelikle EJC ler temizlenemeyecektir (Şekil 4.16). Üzerinde EJC kalan mrna lar hücre içi yıkım mekanizmaları için hedeftir. Böylelikle prematür stop kodonu içeren mrna lardan herhangi bir protein üretimi olmaz. NMD her zaman tam olarak etkili değildir. Prematür stop kodonları genin son eksonundaysa veya son splays kavşağından en fazla 50 nükleotid daha 5 yönündeyse NMD uygulanmaz. Bu durumda bir miktar anormal protein üretilebilir. Anormal proteinler, proteinin hiç olmamasından daha patojenik bir etki yaratabilirler, çünkü normal protein ürününe müdahale etme riski vardır (dominant negatif etki). NMD in bu olası probleme karşı bir koruma mekanizması olduğu varsayılmaktadır (Strachan ve Read, 2011). 46

64 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Şekil Nonsense-mediated Decay (NMD) mekanizması örneği (Strachan ve Read, 2011). B de Ok boyunca mrna üzerinde hareket eden ribozom (yeşil renk), splays kavşaklarının (kırmızı çizgi) tuttuğu ECJ leri (kırmızı üçgen) mrna dan ayırır. Eğer ribozom prematür STOP kodonuyla karşılaşırsa (A da görüldüğü gibi) EJC lerin hepsini temizlemeden mrna dan ayrılır. Böyle mrnalar hücre içi yıkım mekanizmalrının hedefidirler. Prematür stop kodonlarının genin farklı bölgelerinde bulunması sonucu NMD mekanizması farklı hastalık fenotiplerine yol açar. Eğer prematür stop kodonu C panelinde gösterildiği gibi NMD nin çalışmadığı son eksondaysa (yeşil oklar) anormal bir protein üretilir. Bu durumda iki fenotip NMD nin çalıştığı daha önceki eksonlardaki stop kodonlarının oluşturduğundan farklıdır. 47

65 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN 4.2. Tartışma KS lu iki bağımsız ailede genom boyu SNP genotiplemesi ve tüm eksom sekansı verilerinin ortak değerlendirilmesi ile FEFZ1 adlı gende birbirinden farklı iki zararlı mutasyonun varlığı belirlenmiştir. Birinci çalışma ailesinde FEZF1 geninin 2. eksonundaki 832. baz olan sitozinin timin bazına değişmesi (c.832c T) ile genin 278. amino asidi olan histidin, tirozine değişmiştir (p.h278y). FEZF1 geninin transkripsiyon represörü olması ve Hes5 promotörünü etkileyerek bu genin ekspresyonunu resprese ettiğinin bilinmesi (Shimizu ve ark, 2010) üzerine kurgulanan fonksiyonel çalışmalarda da gösterildiği gibi mutant FEZF1 proteini normal aktivitesini gösterememiş ve Hes5 ekspresyonunu tamamen represe edememiştir. Bunun sebebi p.h278y değişiminin C2H2 çinko parmak motifindeki FEZF1 proteininin yapısında yer alan histidin amino asidini etkilemiş olmasıdır. Bu değişim yüksek olasılıkla iki histidin ve iki sistein amino asidi tarafından uzaysal anlamda yerinde tutulan ve merkezde duran çinko atomunun stabilitesini kaybetmesine yol açmıştır (Brown, 2005). Bu durum çinko parmak yapısının hedef DNA molekülü üzerinde bulunan dizileri tanıyıp DNA nın oluğuna yerleşmesini engellemiştir. Böylelikle FEZF1 proteininin işlevi bozulmuştur. İkinci çalışma ailesinde ise FEZF1 geninin 1. eksonundaki 651. baz olan timin in delesyonu uğraması ile (c.652delt) genin 217. amino asidi olan alaninden sonrasını kodlayan dizide çerçeve kayması (frameshift) meydana gelmiş ve dizi 13 amino asit ileride stop (X) kodonu ile sonlanmıştır (p.a217fs13x). Oluşan prematür stop kodonu in slico tahmin programının da öngördüğü üzere yüksek olasılıkla NMD mekanizmasının devreye girmesini sağlamış ve bu durumda FEZF1 geninden protein üretimi hiç gerçekleşmemiştir. Birinci çalışma ailesinde p.h278y mutasyonu ile yapısı bozulan ve ikinci çalışma ailesinde p.a217fs13x çerçeve kayması ile NMD mekanizmasının aktivasyonu sonucu hiç üretilemeyen FEZF1 proteini işlevini yerine getirememiştir. Çok sayıda omurgalı türünde yapılan embriyolojik çalışmalarda gösterildiği üzere, nöroendokrin GnRH hücreleri ilk oluştukları nazal epitelyumdan ön beyine 48

66 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN göç etmektedirler (Teixeira ve ark, 2010). Yapılan literatür taraması sonucu elde edilen bilgilere göre (Watanabe ve ark, 2009; Hirata ve ark, 2006) Fezf1 knockout farelerin GnRH nöronlarının embriyonik migrasyon sırasında, olfaktör aksonlarla beraber bazal laminayı geçemediği dolayısıyla santral sinir sistemine hiç giremediği gözlenmiştir. Aynı çalışmanın (Watanabe ve ark, 2009) bazal laminası çıkarılmış ve Fezf1 knockout farelerle tekrarlanması üzerine GnRH nöronlarının olfaktör aksonlarla beraber bazal laminayı geçtiği ve hipotalamustaki yerine ulaştıkları gözlenmiştir (Şekil 4.17A-B). A B Şekil GnRH nöronlarının embriyonal migrasyonu: A. Normal Fezf1 e sahip farelerde santral sinir sistemine girebilen GnRH nöronları ve ORN aksonları, B. Fezf1 mutasyonu sonucu santral sinir sistemine girmek için bazal laminayı geçemeyen GnRH nöronları ve ORN aksonları, C. GnRH nöronları ve ORN aksonlarının bazal laminadan geçişi, D. Fezf1 mutasyonu sonucu bazal laminayı geçemeyen GnRH nöronların birikerek bir kitle oluşturması (FCM) (OB: olfaktör bulbus, OE: olfaktör epitelyum, ORN: olfaktör reseptör nöronu, MC: migratory cell - göç eden GnRH hücresi, FCM: Fibro cellular mass - bazal laminada birikim yapmış GnRH hücreleri) (Watanabe ve ark, 2009). 49

67 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN Fezf1 knockout farelerin doğumdan bir gün sonra bağırsak faaliyetlerinin olmaması ile karınlarının şişip ölmeleri sonucu (Watanabe ve ark, 2009) püberteye girip giremedikleri gözlenememiştir (Şekil 4.18 A). Bu fatal karın distansiyonunun FEZF1 geninin gastrik kanserlerde overeksprese olması ile ilişkili olabileceği düşünülmüştür (Song ve ark, 2009; Song ve ark, 2011). A B Şekil Watanabe ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada (2009) Fezf1 knockout fareler gösterilmiştir. A. Solda normal Fezf1 e sahip fare görülmektedir. Sağda ise (ok ile gösterilen) Fezf1 knockout fare doğumdan sonraki ilk gün karın şişliği sonucu ölmüştür. B. Solda normal Fezf1 e sahip farenin olfaktör bulbus yapısı görülmektedir. Sağda ise Fezf1 homozigot mutant fare nin hipoplazik olfaktör bulbusu ok ile gösterilmiştir (OB: olfaktör bulbus, Cx: kortex). Embriyonik dönemde GnRH nöronlarının migrasyonu olfaktör aksonlar boyunca gerçekleşmektedir (Cariboni ve ark, 2007). ORN aksonları GnRH nöronlarının üzerinde beynin içine göç edebileceği yollar oluşturmaktadırlar. Migrasyon sırasında GnRH nöronlarının bazal laminayı geçebilmesi için ORN aksonlarının yüksek olasılıkla zarı delebilecek bir proteaz aktivitesini gerçekleştirmeleri gerekmektedir (Watanabe ve ark, 2009). Bu çalışmada KS lu hastalarda C2H2 motifindeki bir çinko parmak transkripsiyon faktörü olan ve FEZF1 geni tarafından kodlanan FEZF1 proteininin işlevini tam olarak yerine getiremediğini gösterilmiştir. Mutant FEZF1 proteini yüksek ihtimalle ORN aksonlarında proteaz kodlayan bir genin promotörü üzerindeki 50

68 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN işlevini yerine getirememiş ve aksonlar proteaz üretimi sağlayamamıştır (Watanabe ve ark, 2009). ORN aksonlarında proteaz aktivitesinin olmaması sonucu ise bazal lamina delinememiş dolayısyla GnRH nöronları bazal laminayı geçememiştir. Bazal laminayı geçemeyen GnRH nöronlarının hipotalamustaki nihai pozisyonlarına ulaşamamaları ve dolayısıyla Hipotalamo-Hipofizer-Gonadal eksenin hiç kurulamaması sonucu hipogonadotropik hipogonadizm tablosu oluşmuştur. Yapılan çalışmalarda (Hirata ve ark, 2006; Shimizu ve Hibi, 2009) Fez1 knockout farelerde anormal olfaktör sensör nöron projeksiyonu ve anormal olfaktör bulbus yapısı bildirilmiştir (Şekil 4.19 B). Fezf1 knockout olan farelerde bazal laminayı geçemeyen ORN aksonları, bildirildiği şekilde olfaktör bulbus yapısının gelişememesine neden olmuştur (Eckler ve ark, 2011; Hirata ve ark, 2006). Teixeira ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada (2010) KS ndan sorumlu KAL1 geninin bulunduğu Xp22.3 bölgesinde kromozomal delesyonu olan 19 haftalık insan fetüsünde olfaktör bulbus yapısının ve beyinde GnRH hücrelerinin olmadığı gözlenmiştir. Olfaktör bulbus yapısının yokluğu (arrhinencephaly) KS lu olgularda gözlenmektedir. Gelişemeyen olfaktör bulbus yapısına bağlı olarak ise KS lu hastalarda anosmi gözlenmektedir (Şekil 4.19). A B Şekil Xp22.3 kromozomal delesyonu olan fetüste GnRH nöronları ve olfaktör bulbus yapısı gösterilmektedir. A. ORN aksonları boyunca beynin içine göç edip nihai yerlerine ulaşmış GnRH nöronları ve normal gelişmiş olfaktör bulbus yapısı, B. KAL1 delesyonu sonucu bazal laminayı geçemeyen GnRH nöronları ve gelişemeyen olfaktör bulbus yapısı gösterilmektedir (Yeşil çizgiler: ORN aksonları, Kırmızı noktalar: GnRH nöronları, ob: olfaktör bulbus). 51

69 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Leman Damla KOTAN KS ndan sorumlu olduğu bilinen genler tüm KS olguların yarısından azını açıklamaktadır (Hardelin ve Dode, 2008). KS nda en sık görülen mutasyonlar KAL1 ve FGFR1 genindedir. KAL1 geni mutasyonlarında genin kodladığı ekstraselüler matriks glikoproteini olan anosmin-1 in işlevi bozulmaktadır. Bu durum GnRH nöronlarının embriyonik migrasyonunda, nöronlar arasındaki iletişimin bozulması sonucu KS fenotipinin oluşmasına neden olmaktadır (Hardelin ve Dode, 2008). FGFR1 geni mutasyonlarında genin kodladığı fibroblast büyüme faktörü reseptör-1 (fibroblast growth factor receptor-1) proteininin işlevi bozulmaktadır. Bu durum anosmin-1 için gerekli olan FGF sinyalini bozmaktadır (Dode ve ark, 2003). Sonuç olarak bu iki klinik antitenin yani hipogonadotropik hipogonadizm ve anosminin birlikteliğini betimleyen KS fenotipi, FEZF1 genindeki mutasyonlar sonucu daha önce bildirilen mekanizmalardan farklı bir şekilde oluşmuştur. 52

70 5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER Leman Damla KOTAN 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER İnsanlarda ve diğer memelilerde, çocukluktan erişkinliğe geçişi sağlayan püberte sürecinin nasıl başladığının aydınlatılmasına katkıda bulunmak amacı ile bu süreçte yer alan yeni bir genin belirlenmesini hedefleyen bu doktora çalışmasında elde edilen sonuçlar aşağıda özetlenmiştir. 1. Yirmi familyal Kallmann sendromu hastada yapılan çalışmada hastaların yarısında (%50) Kallmann sendromu ile ilişkisi olduğu bilinen genlerde (KAL1, FGFR1, PROKR2) mutasyonlar bulunmuştur. 2. Kallmann sendromundan sorumlu olduğu bilinen genlerde mutasyonu olmayan 10 Kallmann sendromlu hastanın 2 sinde (%20) FEZF1 geninde zararlı mutasyonlar bulunmuştur. 3. Birinci ailede gözlenen FEZF1 genindeki c.832c T (p.h278y) mutasyonunun genin çinko parmak modelini bozmak suretiyle Kallmann sendromuna yol açtığı fonksiyonel çalışmalarla gösterilmiştir. 4. İkinci ailede gözlenen FEZF1 genindeki c.651delt (A217fs13X) çerçeve kayması (frame shift) mutasyonunun Nonsense-mediated decay (NMD) mekanizması ile Kallmann sendromuna yol açtığı öngörülmüştür. 6. FEZF1 genindeki zararlı bir mutasyonun, C2H2 çinko parmak motifli FEZF1 proteinin yapısının ve işlevinin bozulmasına neden olduğu gösterilmiştir. 7. FEZF1 proteininin yapısının ve işlevinin bozulmasıyla, Olfaktör Reseptör Nöron aksonlarının embrionik migrasyon sürecinde beyin bazal laminasını geçmek için gerekli olan proteaz aktivitesini gösteremedikleri öngörülmüştür. 8. FEZF1 mutasyonu nedeniyle embrionik migrasyon sürecinde Olfaktör Reseptör Nöron aksonlarının beyin bazal laminasını geçip olfaktör bulbusun gelişimini uyaramamasının bir sonucu olarak hastalarda koku alma duyusu yokluğu (anosmi) gelişmiştir. 53

71 5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER Leman Damla KOTAN 9. FEZF1 mutasyonu nedeniyle GnRH nöronlarının bazal laminayı geçip nihai yerlerine ulaşamaması ve dolayısıyla Hipotalamo-hipofizer gonadal eksenin hiç kurulamasının bir sonucu olarak bu hastalarda hipogonadotropik hipogonadizm gelişmiştir. 10. İnsanda FEZF1 genindeki zararlı bir mutasyonun sonucu olarak bu genin kodladığı proteindeki yapısal veya fonksiyonel bozukluklar Kallmann sendromuna neden olmaktadır. 11. Kallmann sendromlu hastaların tanısal amaçlı mutasyon incelemelerinde FEZF1 geni de test edilmelidir. 12. Bu tezde kullanılan paradigma ile yalnızca püberte süreci değil diğer biyolojik süreçlerin de aydınlatılabileceğine inanmaktayız. 54

72 KAYNAKLAR BAMSHAD, M. J., NG, S. B., BIGHAM, A. W., TABOR, H. K., EMOND, M. J., NICKERSON, D. A., SHENDURE, J., Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nature Review Genetics, 12: BROWN, R, S., Zinc finger proteins: getting a grip on RNA. Current Opinion in Structural Biology, 15: CARIBONI, A., MAGGI, R., and PARNAVELAS, J, G., From nose to fertility: the long migatory journey of gonadotropin-releasing hormone neurons. Trends in Neuroscience, 30: CHANG, X., and WANG, K., wannovar: annotating genetic variants for personal genomes via the web. Journal of Medical Genetics, 49: CHANG, Y. F., IMAM, J. S., and WILKINSON, M. F., The Nonsensemediated decay RNA surveillance pathway. Annual Reviews of Biochemistry, 76: CROWLEY, W. F. JR., PITTELOUD, N., and SEMINARA, S., New genes controlling human reproduction and how you find them. Transactions of The American Clinical and Climatological Association, 119: DODE, C., LEVILLIERS, J., DUPONT, J. M., DE PAEPE, A., LE DU, N., SOUSSI, Y. N., COIMBRA, R. S., DELMAGHANI, S., COMPAIN, N. S., BAVEREL, F., PECHEUX, C., LE TESSIER, D., CRUAUD, C., DELPECH, M., SPLEMAN, F., VERMEULEN, S., AMALFITANO, A., BACHELOT, Y., BOUCHARD, P., CABROL, S., CAREL, J. C., DELEMARRE-VAN, D. W. H., GOULET, S. B., KOTTLER, M. L., RICHARD, O., SANCHEZ, F. F., SAURA, R., YOUNG, J., PETIT, C., HARDELIN, J. P., Loss-of-function mutations in FGFR1 cause autosomal dominant Kallmann syndrome. Nature Genetics,4: DODE, C., TEIXEIRA, L., LEVILLIERS, J., FOUVEAUT, C., BOUCHARD, P., KOTTLER, M. L., LESPINASSE, J., LIENHARDT-ROUSSIE, A., MATHIEU, M., MOERMAN, A., MORGAN, G., MURAT, A., TOUBLANC, J. E., WOLCZYNSKI, S., DELPECH, M., PETIT, C., YOUNG, J., HARDELIN, J. P., Kallmann syndrome: mutations in 55

73 the genes encoding prokineticin-2 and prokineticin receptor-2. PLoS Genetics, 2:e175. DONBAK, L., Consanguinity in Kahramanmaras city, Turkey, and its medical impact. Saudi Medical Journal, 25: DOTY, R. L., SHAMAN, P., and DANN, M., Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function. Physiology&behavior, 32: ECKLER, M, J., MCKENNA, W, L., TAGHVAEI, S., MCCONNELL, S, K., and CHEN, B., Fezf1 and Fezf2 are required for olfactory development and sensory neuron identity. Journal of Comparative Neurology, 519: FALARDEAU, J., CHUNG, W. C., BEENKEN, A., RAIVIO, T., PLUMMER, L., SIDIS, Y., JACOBSON-DICKMAN, E. E., ELISEENKOVA A. V., MA, J., DWYER, A., QUINTON, R., NA, S., HALL, J. E., HUOT, C., ALOIS, N., PEARCE, S. H., COLE, L.W., HUGHES, V., MOHAMMADI, M., TSAI, P., PITTELOUD, N., Decreased FGF8 signaling causes deficiency of gonadotropin-releasing hormone in humans and mice. Journal of Clinical Investigation, 118: FRANCO, B., GUIOLI, S., PRAGLIOLA, A., INCERTI, B., BARDONI, B., TONLORENZI, R., CARROZZO, R., MAESTRINI, E., PIERETTI, M., taıllıon, m. P., BROWN, C. J., WILLARD, H. F., LAWRENCE, C., GRAIELLA, P. M., CAMERINO, G., BALLABIO, A., A gene deleted in Kallmann's syndrome shares homology with neural cell adhesion and axonal path-finding molecules. Nature. 353: GENE CODES, (Erişim tarihi: 1 Kasım 2012). GURBUZ, F., KOTAN, L. D., MENGEN, E., SIKLAR, Z., BERBEROGLU, M., DOKMETAS, S., KILICLI, M. F., GUVEN, A., KIREL, B., SAKA, N., POYRAZOGLU, S., CESUR, Y., DOGAN, M., OZEN, S., OZBEK, M. N., DEMIRBILEK, H., KEKIL, M. B., TEMIZ, F., MUNGAN, N. O., YUKSEL, B., TOPALOGLU, A. K., Distribution of Gene Mutations Associated with Familial Normosmic Idiopathic Hypogonadotropic Hypogonadism. Journal of Clinical Research in Pediatric Endocrinology, 4:

74 HANCHATE, N. K., GIACOBINI, P., LHUILLIER, P., PARKASH, J., ESPY, C., FOUVEAUT, C., LEROY, C., BARON, S., CAMPAGNE, C., VANACKER, C., COLLIER, F., CRUAUD, C., MEYER, V., GARCIA- PINERO, A., DEWAILLY D., CORTET-RUDELLI, C., GERSAK, K., METZ, C., CHABRIER, G., PUGEAT, M., YOUNG, J., HARDELIN, J. P., PREVOT, V., DODE, C., SEMA3A, a gene involved in axonal pathfinding, is mutated in patients with Kallmann syndrome. PLoS Genetics, 8:e HARDELIN, J. P., and DODE, C The Complex Genetics of Kallmann Syndrome: KAL1, FGFR1, FGF8, PROKR2, PROK2, et al. Sexual Development, 2: HARDELIN, J. P., LEVILLIERS, J., DEL CASTILLO, I., COHEN, S. M., LEGOUIS, R., BLANCHARD, S., COMPAIN, S., BOULOUX, P., KIRK, J., MORAINE, C., et al X chromosome-linked Kallmann syndrome: stop mutations validate the candidate gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, 17: HGNC - HUGO Gene Nomenclature Committee, (Erişim tarihi: 3 Kasım 2012). HIRATA, T., NAKAZAWA, M., YOSHIHARA, S., MIYACHI, H., KITAMURA, K., YOSHIHARA, Y., and HIBI, M., Zinc-finger gene Fez in the olfactory sensory neurons regulates development of the olfactory bulb noncell-autonomously. Development, 133: INSILICASE BIOINFORMATICS - AgileVariantMapper, (Erişim tarihi: 2 Şubat 2013). KIM, H. G., KURTH, I., LAN, F., MELICIANI, I., WENZEL, W., EOM, S. H., KANG, G. B., ROSENBERGER, G., TEKIN, M., OZATA, M., BICK, D. P., SHERINS, R. J., WALKER, S. L., SHI, Y., GUSELLA, J. F., LAYMAN, L. C., Mutations in CHD7, encoding a chromatin-remodeling protein, cause idiopathic hypogonadotropic hypogonadism and Kallmann syndrome. American journal of human genetics, 83:

75 KIM, H. G., AHN, J. W., KURTH, I., ULLMANN, R., KIM, H. T., KULHARYA, A., HA, K. S., ITOKAWA, Y., MELICIANI, I., WENZEL, W., LEE, D., ROSENBERGER, G., OZATA, M., BICK, D. P., SHERINS, R. J., NAGASE, T., TEKIN, M., KIM, S. H., KIM, C. H., ROPERS, H. H., GUSELLA, J. F., KALSCHEUER, V., CHOI, C. Y., LAYMAN, L. C., WDR11, a WD protein that interacts with transcription factor EMX1, is mutated in idiopathic hypogonadotropic hypogonadism and Kallmann syndrome. American journal of human genetics, 87: KLUG, W. S., and CUMMINGS, M. R., Genetik Kavramlar, Sekizinci Baskıdan Çeviri, Palme Yayıncılık, KURRASCH, D, M., CHEUNG, C, C., LEE, F, Y., TRAN, P, V., HATA, K., and INGRAHAM, H, A., The neonatal ventromedial hypothalamus transcriptome reveals novel markers with spatially distinct patterning. The Journal of Neuroscience, 27: LANDER, E. S., and BOTSTEIN, D., Homozygosity mapping: a way to map human recessive traits with the DNA of inbred children, Science, 236: LEEDS INSTITUTE OF MOLECULAR MEDICINE - AutoSNPa, ( (Erişim tarihi: Ocak 2013) LEGOUIS, R., HARDELIN, J. P., LEVILLIERS, J., CLAVERIE, J. M., COMPAIN, S., WUNDERLE, V., MILLASSEAU, P., LE PASLIER, D., COHEN, D., CATERINA, D., et al The candidate gene for the X-linked Kallmann syndrome encodes a protein related to adhesion molecules. Cell, 672: LEHMAN, M. N., COOLEN, L. M., and GOODMAN, R. L., Minireview: kisspeptin/neurokinin B/dynorphin (KNDy) cells of the arcuate nucleus: a central node in the control of gonadotropin-releasing hormone secretion. Endocrinology, 151: MASKOS, U., and SOUTHERN, E, M., Oligonucleotide hybridisations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridisation properties of oligonucleotides synthesised in situ. Nucleic Acids Research, 20:

76 MATSUO-TAKASAKI, M., LIM, H, J., BEANAN, M. J., SATO, S, M., SARGENT, T, D., Cloning and expression of a novel zinc finger gene, Fez, transcribed in the forebrain of Xenopus and Mouse embryos. Mechanisms of Development, 93: MIRAOUI, H., DWYER, A. A., SYKIOTIS, G. P., PLUMMER, L., CHUNG, W., FENG, B., BEENKEN, A., CLARKE, J., PERS, T. H., DWORZYNSKI, P., KEEFE, K., NIEDZIELA, M., RAVIVIO, T., CROWLEY, W. F., SEMINARA, S. B., QUINTON, R., HUGHES, V. A., KUMANOV, P., YOUNG, J., YIALAMAS, M. A., HALL, J. E., VAN, V. G., CHANOINE, J. P., RUBENSTEIN, J., MOHAMMADI, M., TSAI, P. S., SIDIS, Y., LAGE, K., PITTELOUD, N., Mutations in FGF17, IL17RD, DUSP6, SPRY4, and FLRT3 are identified in individuals with congenital hypogonadotropic hypogonadism. American journal of human genetics, 92: MUELLER, R. F., and BOTSTEIN, D., Autozygosity mapping, complex consanguinity, and autosomal recessive disorders. Journal of Medical Genetics, 30: MUTATION TASTER, (Erişim tarihi: 4 Şubat 2013). NEWBERN, K., NATRAJAN, N., KIM, H. G., CHORICH, L. P., halvorson, L. M., CAMERON, R. S., LAYMAN, L. C., Identification of HESX1 mutations in Kallmann syndrome. Fertility and sterility, 99: NG, S. B., TURNER, E. H., ROBERTSON, P. D., FLYGASE, S. D., BIGHAM, A. W., LEE, C., SHAFFER, T., WONG, M., BHATTACHARJEE, A., EICHLER, E. E., BAMSHAD M., NICKERSON, D. A., SHENDURE, J., Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature, 461: OJEDA, S. R., LOMNICZI, A., SANDAU, U., MATAGNE, V., New concepts on the control of the onset of puberty. Endocrine Development, 17: OKOU, D. T., STEINBERG, K. M., MIDDLE, C., CUTLER, D. J., ALBERT, T. J., ZWICK, M. E., Microarray-based genomic selection for highthroughput resequencing. Nature Methods, 4:

77 PINGAULT, V., BODEREAU, V., BARAL, V., MARCOS, S., WATANABE, Y., CHAOUI, A., FOUVEAUT, C., LEROY, C., VERIER-MINE, O., FRANCANNET, C., DUPIN-DEGUINE, D., ARCHAMBEAUD, F., KURTZ, F. J., YOUNG, J., BERTHERAT, J., MARLIN, S., GOOSSENS, M., HARDELIN, J. P., DODE, C., BONDURAND, N., Loss-offunction mutations in SOX10 cause Kallmann syndrome with deafness. American journal of human genetics, 92: PINILLA, L., AGUILAR, E., DIEGUEZ, C., MILLAR, R. P., TENA-SEMPERE, M., Kisspeptins and reproduction: physiological roles and regulatory mechanisms. Physiological Reviews, 92: PITTELOUD, N., ZHANG, C., PIGNATELLI, D., LI, J. D., RAIVIO, T., COLE, L. W., PLUMMER, L., JACOBSON-DICKMAN, E. E., MELLON, P. L., ZHOU, Q. Y., CROWLEY, W. F., Loss-of-function mutation in the prokineticin 2 gene causes Kallmann syndrome and normosmic idiopathic hypogonadotropic hypogonadism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104: PREDICTION OF FUNCTIONAL EFFECTS OF HUMANS nssnps - PolyPhen-2 (Erişim tarihi: 4 Şubat 2013) PRIMER 3, (Erişim tarihi: 25 Aralık 2012). RAZIN, S. V., BORUNOVA, V. V., MAKSIMENKO, O. G., and KANTIDZE, O. L., Cys2His2 zinc finger protein family: classification, functions, and major members. Biochemistry,773: REVERSADE, B., ESCANDE-BEILLARD, N., DIMOPOULOU, A., FISCHER, B., CHNG, S. C., LI, Y., SHBOUL, M., THAM, P. Y., KAYSERILI, H., AL- GAZALI, L., SHAHWAN, M., BRANCATI, F., LEE, H., O'CONNOR, B. D., SCHMIDT-VON, K. M., MERRIMAN, B., NELSON, S. F., MASRI, A., ALKAZALEH, F., GUERRA, D., FERRARI, P., NANDA, A., RAJAB, A., MARKIE, D., GRAY, M., NELSON, J., GRIX, A., SOMMER, A., SAVARIRAYAN, R., JANECKE, A. R., STEICHEN, E., SILLENCE, D., HAUSSER, I., BUDDE, B., NURNBERG, G., NURNBERG, P., SEEMANN, P., KUNKEL, D., ZAMBRUNO, G., DALLAPICCOLA, 60

78 B., SCHUELKE, M., ROBERTSON, S., HAMAMY, H., WOLLNIK, B., VAN MALDERGEM, L., MUNDLOS, S., KORNAK, U.,2009. Mutations in PYCR1 cause cutis laxa with progeroid features, Nature Genetics, 41: SAUREZ, R., GONZALEZ, D. G., and CASTRO, F., Mutual influences between the main olfactory and vomeronasal systems in development and evolution. Frontiers in Neuroanatomy, doi: /fnana SHIMIZU, T., and HIBI, M., Formation and patterning of the forebrain and olfactory system by zinc-finger genes Fezf1 and Fezf2. 51: SHIMIZU, T., NAKAZAWA, M., KANI, S., BAE, Y. K., SHIMIZU, T., KAGEYAMA, R., HIBI, M., Zinc finger genes Fezf1 and Fezf2 control neuronal differentiation by repressing Hes5 expression in the forebrain, Development. 137: SHWANZEL-FUKUDA, M., and PFAFF, D. W., Origin of luteinizing hormone-releasing hormone neurons. Nature, 338: SIFT HUMAN PROTEIN, (Erişim tarihi: 4 Şubat 2013). SONG I., OH, N. S., KIM, H., HA, G., JEONG, S., KIM, J., KIM, D., YOO, H., KIM, C., KIM, H., Human ZNF312b promotes the progression of gastric cancer by transcriptional activation of the K-ras gene. Cancer Research, 69: SONG, I., HA, G., KIM, J., JEONG, S., LEE, H., KIM, Y., KIM, Y., KWON, T., KIM, N., Human ZNF312b oncogene is regulated by Sp1 binding to its promotor region through DNA demethylation and histone acetylation in gastric cancer. International Journal of Cancer, 129: STRACHAN, T., and READ, A., HUMAN MOLECULAR GENETICS, 4th Edition, USA. TEIXERIA, L., GUIMIOT, F., DODE, C., FALLET-BIANCO, C., MILLAR, R, P., DELEZOIDE, A, L., and HARDELIN, J, P., Defective migration of neuroendocrine GnRH cells in human arrhinencephalic conditions. The Journal of Clinical Investigation, 120:

79 TOPALOGLU, A. K., and KOTAN, L. D., Molecular causes of hypogonadotropic hypogonadism. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology, 22: TOPALOGLU, A. K., REIMANN, F., GUCLU, M., YALIN, A. S., KOTAN, L. D., PORTER, K. M., SERIN, A., MUNGAN, N. O., COOK, J. R., OZBEK, M. N., IMAMOGLU, S., AKALIN, N. S., YUKSEL, B., O'RAHILLY, S., SEMPLE, R. K., TAC3 and TACR3 mutations in familial hypogonadotropic hypogonadism reveal a key role for Neurokinin B in the central control of reproduction. Nature Genetics, 41: TOPALOGLU, A. K., TELLO, J. A., KOTAN, L. D., OZBEK, M. N., YILMAZ, M. B., ERDOGAN, S., GURBUZ, F., TEMIZ, F., MILLAR, R. P., YUKSEL, B., Inactivating KISS1 mutation and hypogonadotropic hypogonadism. The New England Journal of Medicine, 366: TORNBERG, J., SYKIOTIS, G. P., KEEFE, K., PLUMMER, L., HOANG, X., HALL, J. E., QUINTON, R., SEMINARA, S. B., HUGHES, V., VAN, V. G., VAN, U. S., CROWLEY, W. F., HABUCHI, H., KIMATA, K., pitteloud, N., Bulow, H. E., Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1, a gene involved in extracellular sugar modifications, is mutated in patients with idiopathic hypogonadotrophic hypogonadism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108: TUNCBILEK, E., and KOC, I., Consanguineous marriage in Turkey and its impact on fertility and mortality. Annals of Human Genetics, 58: UCSC GENOME BIOINFORMATICS, (Erişim tarihi: 25 Aralık 2012). UNIVERSAL PROTEIN RESOURCE - UniProt, (Erişim tarihi: 6 Kasım 2013). VISSERS, L. E., VAN, R. C. M, ADMIRAAL, R., HURST, J. A., DE VRIES, B. B., JANSSEN, I. M., VAN DER VLIET, W. A., HUYS, E., H., DE JONG, P. J., HAMEL, B. C., SCHOENMAKERS, E. F., BRUNNER, H. G., VELTMAN, J. A., VAN KESSEL, A. G., Mutations in a new member of the 62

80 chromodomain gene family cause CHARGE syndrome. Nature Genetics, 36: YOUNG, J., METAY, C., BOULIGAND, J., FRANCOU, B., MAIONE, L., TOSCA, L., SARFATI, J., BRIOUDE, F., ESTEVA, B., BRIAND- SULEAU, A., BRISSET, S., GOOSSENS, M., TACHDIJAN, G., GUIOCHON-MANTEL, A., SEMA3A deletion in a family with Kallmann syndrome validates the role of semaphorin 3A in human puberty and olfactory system development. Human reproduction, 27: WATANABE, Y., INOUE, K., OKUYAMA-YAMAMOTO, A., NAKAI, N., NAKATANI, J., NIBU, K, I., SATO, N., IIBOSHI, Y., YUSA, K., KONDOH, G., TAKEDA, J., TERASHIMA, T., TAKUMI, T., Fezf1 is required for penetration of the basal lamina by olfactory axons to promote olfactory development. The Journal of Comparative Neurology, 515: WOODS, C. G., VALENTE, E. M., BOND, J., and ROBERTS, E., A new method for autozygosity mapping using single nucleotide polymorphisms (SNPs) and EXCLUDEAR. Journal of Medical Genetics, 41:e101. WRAY, S., GRANT, P., and GAINER, H., H. Evidence that cells expressing luteinizing hormone-releasing hormone mrna in the mouse are derived from progenitor cells in the olfactory placode. Proceedings of the National Academy of Sciences, 86: WRAY, S From nose to brain: development of gonodotropin-releasing hormone -1 neurons. Journal of Neuroendocrinology, 22: GENOMES BROWSER, (Erişim tarihi: 3 Kasım 2012).. 63

81 64

82 ÖZGEÇMİŞ 1985 yılında Adana da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Adana da tamamladı yılları arasında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü nde lisans eğitimini, yılları arasında Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Adli Tıp Anabilim Dalı nda yüksek lisansını tamamladı yılında Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoteknoloji Anabilim Dalı nda doktoraya başladı. Halen devam etmektedir. 65

83 EKLER 66

84 67

85 Ek Çizelge 1. KS Çalışma formu İDİOPATİK HİPOGONADOTROPİK HİPOGONADİZM ÇALIŞMA FORMU Adı: İlk muayene tarihi: DT: Yaşı: Adres: Tel: (..) Gönderen birim: Gönderen birim Tel (..) Yakınma/Öykü: İnmemiş Testis Orşiopeksi HCG tedavisi Sporcu A. nervosa Ameliyat Travma İlaç Kronik hastalık (KBY, Astım, Kr. Karaciğer, KF, Çölyak, DM) Soygeçmiş: Lütfen soyağacı çiziniz. Etnisite: akrabalık: Boy: BMI: Ağırlık: Obezite zayıflık Aşırı Mental durum Okul başarısı Dismorfik bulgular: Orta hat anomalisi Coloboma Retinitis pigmentosa anosmi İşitme: Tiroid: hiposmi Meme: (tarih) Axilla: Pubik: Testis hacmi: (tarih) Fallus: Deri: Extremite: NMS: hirsutizm polidaktili hipotoni Elbilek:(tarih) Kranial MR: Pelvik USG: LH: (tarih) FSH: (tarih) Testosteron: (tarih) Estradiol: (tarih) Prolaktin: LHRH stim test: (tarih) ft4: TSH: ACTH: Cortisol: Karyotip: DÜŞÜNCELER: IGF-1: EMA: 68

86 Ek Çizelge 2. Bilgilendirilmiş Onam Formu (18 yaş altı) ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ÇOCUK ENDOKRİNOLOJİ VE METABOLİZMA BİLİM DALI İnsan Püberte Sürecinde Rol Alan Yeni Bir Genin Belirlenmesi ÇALIŞMASI BİLGİLENDİRİLMİŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU Prof. Dr. A. Kemal Topaloğlu danışmanlığında doktora öğrencisi Leman Damla Kotan tarafından yürütülecek olan bu çalışma çerçevesinden ergenlik özellikleri gelişmemiş kişilerde bu bozukluğa yol açan, beyin tabanında bulunan hipofiz adlı organdan bilinmeyen bir nedenle FSH ve/veya LH adında iki hormonun yetersiz salgılanmasıyla sonuçlanan genetik bozuklukların varlığı ve nedeni araştırılacaktır. Bu çalışma kapsamında hasta kişiden, anne babasından ve varsa kardeşlerinden 3 er ml kan alınacaktır. Sonuçlar sadece bilimsel amaçla kullanılacak, kişisel bilgileriniz gizli tutulacak, genetik sorun saptanması halinde durum size bildirilecektir. Çalışma bilimsel bilgi birikimine katkı sağlamayı amaçlamakta olup, size doğrudan bir yarar sağlamayacaktır. Parasal bir bedel ödemenizi gerektirmeyen ve size de bir ödeme yapılması söz konusu olmayan bu çalışmaya katılmama hakkınız ve istediğiniz herhangi bir zamanda çalışmadan çıkma hakkınız bulunmaktadır. Çalışmaya katılmama veya çalışmadan çıkma kararınız Bilim dalımız klinik ve polikliniklerindeki tedavinizi/çocuğunuzun tedavisini etkilemeyecektir. Ek bilgi talebiniz olursa sözlü olarak karşılanacaktır. YUKARIDA BELİRTİLEN KOŞULLAR ÇERÇEVESİNDE ÇOCUĞUMUN KANININ ALINMASINI VE GENETİK İNCELEME YAPILMASINI KABUL EDİYORUM. ANNE ADI SOYADI BABA ADI SOYADI TANIK ADI SOYADI TARİH İMZA İMZA İMZA 69

87 Ek Çizelge 3. Bilgilendirilmiş Onam Formu (18 yaş üstü) ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ÇOCUK ENDOKRİNOLOJİ VE METABOLİZMA BİLİM DALI İnsan Püberte Sürecinde Rol Alan Yeni Bir Genin Belirlenmesi ÇALIŞMASI BİLGİLENDİRİLMİŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU Prof. Dr. A. Kemal Topaloğlu danışmanlığında doktora öğrencisi Leman Damla Kotan tarafından yürütülecek olan bu çalışma çerçevesinden ergenlik özellikleri gelişmemiş kişilerde bu bozukluğa yol açan, beyin tabanında bulunan hipofiz adlı organdan bilinmeyen bir nedenle FSH ve/veya LH adında iki hormonun yetersiz salgılanmasıyla sonuçlanan genetik bozuklukların varlığı ve nedeni araştırılacaktır. Bu çalışma kapsamında hasta kişiden, anne babasından ve varsa kardeşlerinden 3 er ml kan alınacaktır. Sonuçlar sadece bilimsel amaçla kullanılacak, kişisel bilgileriniz gizli tutulacak, genetik sorun saptanması halinde durum size bildirilecektir. Çalışma bilimsel bilgi birikimine katkı sağlamayı amaçlamakta olup, size doğrudan bir yarar sağlamayacaktır. Parasal bir bedel ödemenizi gerektirmeyen ve size de bir ödeme yapılması söz konusu olmayan bu çalışmaya katılmama hakkınız ve istediğiniz herhangi bir zamanda çalışmadan çıkma hakkınız bulunmaktadır. Çalışmaya katılmama veya çalışmadan çıkma kararınız Bilim dalımız klinik ve polikliniklerindeki tedavinizi/çocuğunuzun tedavisini etkilemeyecektir. Ek bilgi talebiniz olursa sözlü olarak karşılanacaktır. YUKARIDA BELİRTİLEN KOŞULLAR ÇERÇEVESİNDE KANIMIN ALINMASINI VE GENETİK İNCELEME YAPILMASINI KABUL EDİYORUM. TARİH ADI SOYADI İMZA TANIK ADI SOYADI İMZA 70

88 Ek Çizelge 4. KAL1 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 1 F GTTGAAGGATTGAACTTTCC R ACCCCGACTGTAAGATCC F GGTTTTGCAAGATTGGGTAT R TGATTTCTCTGTGCTGTCTT F CAGGCATTGAAAAAGCAAC R CGTATATCCACACACACCTG F GTTTGGTGGGGAAAAATG R GGCTAATCTTTATGGGTCTG F GGAAATCTCAGTTGTCATCAG R AGCTATTTTGAGGCATAGCA F TGGCTGATGGGTTAGTGTAT R ACCTTCAAACACATCTGGTC F CCGTTTTCAGCTTTTCTATC R CTGCATTCTGTGAACTTCCT F AGAAGTTGGCATGCTTCATA R AAAACTCACTCTCCCTCCAT F CTGGAAGCTGCATAATGG R ACCGTTTGCCTTAGTATTGA F CATTTCCTCTCCTTTTCTCC R CTGATTTGTGGGAATGAGTT F TAGGAAAACATCCTTGTTGG R AGAGAGGCACTTTTGGTTTT F GATTGTCTGAACCCATGTTT R ATAGTGCAGCACACAGAATG F CCTTTACAAAGCAACCAAAC R TTCCCTATCTCATAGAAACCTG F GACATGGTCATAGGAAGGAA R CTCTGAGCAGTTCCCACT Tm değeri ( C) 71

89 Ek Çizelge 5. FGFR1 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 2 F TGCTATCTCACCAGACACTG R CAATATCAGCTAGGCTCCTG F CTTCTGGACGCCTTAGTAAG R GACCACATCACCTGCAAC F GTAGCCTCCAGTAAGTGATG R CACCTAGTCACCTCTCTGAG F TAAACAGTTTCCATCCCACC R CCTCTTCCTCCCCTTTCA F GGTGCCTGTTCTGCTAAG R ACAAATGACAAGGCAAGGAA F TCTGATATGGAGGGCAGG R GAAAAGTGAGGCTCAAAAGG F CTTTCCCCAGCTCTGTTTT R CTACTGAGATGGAGTGTGTG F GCATTTCTTCCTCTAGTCCC R CCATTCTTCCAGCTCTCCT F CAGTCCTAGCTAGAACTTGC R CATGATATTCCACTGTGCCT F TCTGTGTTGAGGAAAGAACA R AATGTTTCTGCAGGCATTTC F GCAGTTGGGTGAAATACAGA R AACAATCTCAAGGTGCAGAA F AGAGAATCAAGTCCCAGGG R CTGAATGAACACCAATGAGC F ATTTTCTGGACTATGCTGGG R ACGCCACCACAAGATGAT F GAAGTTCTATGAGACAAGTC R CATCCACTTCACAGGCAG F TGGTGGTTTCATCTGAGAAG R ACAGATCAGCCTTTCAACAT F GGACAAGCCCAGTAACTG R CATGAGAGAAGACGGAATCC F ACAGAGACCCACCTTCAA R CTCTTTGCACCTCTCACC Tm değeri ( C) 72

90 Ek Çizelge 6. FGF8 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 1 F CACCCTCTCCGCTCGCGC R TGGAGGCAGAGGACCAGCAA F CTGAGCTGCCTGTGAGTA R CTGGGTTTCTAAGGTGCC F ATTTGGCCCAATGATCGG R ATTATAATGCTACTCCGCCC F TGGGCGGAGTAGCATTATAAT R TTCCCTTCTGAGCTGGGG F TTTTGGGTTCCTGGTCTTTG R CTCTCAAACAGCTTCCTTCT F CGAGTTGTGAGGGATTAGAG R CAATATCAACAACCGGAACC Tm değeri ( C) Ek Çizelge 7. PROKR2 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 1 F AGTCAACTCTCCCCAAGG R CAAAGATTGGTGAGCATTCC F ACTATGCCAAATGATGTTGC R CACAGATGTCATTTCCCATG Tm değeri ( C) Ek Çizelge 8. PROK2 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 1 F CTAGCCTTTATAACGGCCC R TATTTTCCCAAGTGCACCAA F TCATAATCCAGGGGCTAGAA R TCATTTTGTTTGTCGAGCAC F GATGGCTTGGCTGTATCTT R ATCTTATGTTGGGGCTGAAC F AACGCTCAGTAAACACTAGT R TTGGAAAGTTGAGGAAGCAA Tm değeri ( C) 73

91 Ek Çizelge 9. CHD7 geni primerleri Ekson Yön Baz disizi (5-3 ) GC % si Baz sayısı 2A F GCAGGGTCCAAGAGAATTAA R CTGAGGTGGCAATAAAAGGA B F TACCAGACCAGATACGAGC R GGATAACTGCCAACTTCCAT C F ACACACAAACTATGCATCCT R AGACAAGTTAGCCATGTTGA F TTTGGATGAGAGAAGCTGAT R AAAATCATTGTGTCCCCTCC F GCCAGGAAAACTTAATTGGG R TAACAAGATAGGGGAGGTCT F GATCTCCTGACCTTGTGATC R GATGTTCCCCTGCTGAAAG F GACTTAAAAGGTGTGGAGGT R GTCCACTCTGAATGGTGTAA F GTCCTTTGCTGCTCTTTTC R CAGGCCATGATGACTAAAGA F TTCTAAACAGTGGTGGGTAT R GACAGCACCAAATGAGACTA F GTTTTATATTGCTGTGACCC R ACCAGGTCTAGGATTCTACC F GCATGCTTTTCCTTAATGTG R GAACTCTCCGATTTCTTCCA F GTGTGGTAAGAATTGGCTGA R CCACAAATGCATACCCAAAG F CTTTGGGTATGCATTTGTGG R TTTAGACCTTCCCAAGTCAC F ATAAAGAGATCTCCAAAGGG R AACAGACACTAGCCAACAAT F GCATAGGGTAGATGAGTAGG R TCTGTGTACTAGGTGGGAAA F CTCTCACTGGGCTTTGAAAA R GTGGACAGGAGACAGGAAT F GTGTTCTGGTTCCTACAGTT R TGTCCTCCTGTAGTCATCAT F ACGCCAATAAACCCTATTTG R GTGACGACGCAACATTAATT F TCATGACCTAATTACTTCCC R AGAGGTTTGCAGACTAAACA F TGAGTGGAAGAGAAAATGCT R CCAATGCATCTTGTAAGCAC F AGGAATGCACAATATCGGAG R CATCAGCTCATCTTCCTTCA Tm değeri ( C) 74

92 21 F AAATTTCTGGCAAAAGTGGG R AAGCATTCATTTGACTGTGC F GCTAGTTTTGACCCAGGATT R TGGGGTTTATGTCACATCTC F GAGATGTGACATAAACCCCA R CTCAGTTGACCCTCCAAATC F GCAGGATGATGGATGAACA R GGAGATGGGTTACTAGTGGT F TGACTCATGCCCTTTCTTTT R CGCCAAGAGTCCTTTGGA F ACAGAGATGCTAACCTTGAC R GACTGGTAAACATCTCCTGA F CCATGGCTGCATGTTTTAA R GAAAGCAAAGCAAGAAACAG F TGCCCACATAAGACTTGTTA R CACAAAACAGGTCAGTGTAG F TTCCCACACTGTCATTTGAA R CCTTTCTTTGGTGGTCACTA F CAACAAAGCAGTCTGTTTCC R GGCTCAATTATGGAGGAGAG A F CATGTGTAGGCGAGTATGTC R TCACATTCCTGCTTGCTC B F TCCTCCAGTCATCTCATCTG R GTTAGGTGCTATAAGGTGCG F GGTACTCAATAAAATGGAGCTG R CACATCACATTTCCCATCCT F TTGTCCTCCAGTTGACTTTT R GAGGAAACAGCAGCTATCTT F AAGATAGCTGCTGTTTCCTC R TTCATACAATGCTGCTGAGA F CCCAAACAACTAGACATTGT R ACATTCAAGGAAAAGGCAGA F TGGACGGGTAAAATAGGAGT R CCTCCCCTTTCTGTTAATCT F AAAAGAATCCTGTCTGCCC R CCTGGAGAAGTCTACCTCTA A F ATTTGGAATGGCAGGTTCA R GGAAAGGGTTGAAGGCTAG B F CACCACTACTGCTTCTAGTC R ACCTTTTGACACACCTGTAT

93 Ek Çizelge 10. Çalışma aileleri laboratuvar değerleri Çalışma ailesi 1 Çalışma ailesi 2 Aile üyesi II-1 II-3 II-2 FSH (miu/ml) LH (miu/ml) Estradiol (ng/dl) Testosterone (ng/dl) Prolaktin (pg/ml) ND II-4 Normal değerler M: F: M: F: ND ND M: F: ND ND ND M: F: TSH (miu/ml) ND free T4 (ng/dl) ACTH (pg/ml) Kortisol (mcg/dl) DHEAS (mcg/dl) LHRH Stimülasyon Testi (Max. LH) LHRH Stimülasyon Testi (Max. FSH) NA 1.0 ND ND ND ND ND M: F: M: F:

94 Ek Çizelge 11. FEZF1 geni amino asit sekansı Wild type MDSSCHNATTKMLATAPARGNMMSTSKPLAFSIERIMAR TPEPKALPVPHFLQGALPKGEPKHSLHLNSSIPCMIPFVPV AYDTSPKAGVTGSEPRKASLEAPAAPAAVPSAPAFSCSDL LNCALSLKGDLARDALPLQQYKLVRPRVVNHSSFHAMG ALCYLNRGDGPCHPAAGVNIHPVASYFLSSPLHPQPKTYL AERNKLVVPAVEKYPSGVAFKDLSQAQLQHYMKESAQL LSEKIAFKTSDFSRGSPNAKPKVFTCEVCGKVFNAHYNLT RHMPVHTGARPFVCKVCGKGFRQASTLCRHKIIHTQEKP HKCNQCGKAFNRSSTLNTHTRIHAGYKPFVCEFCGKGFH QKGNYKNHKLTHSGEKQFKCNICNKAFHQVYNLTFHMH THNDKKPFTCPTCGKGFCRNFDLKKHVRKLHDSSLGLAR TPAGEPGTEPPPPLPQQPPMTLPPLQPPLPTPGPLQPGLHQ GHQ* p.a217fs13x MDSSCHNATTKMLATAPARGNMMSTSKPLAFSIERIMAR TPEPKALPVPHFLQGALPKGEPKHSLHLNSSIPCMIPFVPV AYDTSPKAGVTGSEPRKASLEAPAAPAAVPSAPAFSCSDL LNCALSLKGDLARDALPLQQYKLVRPRVVNHSSFHAMG ALCYLNRGDGPCHPAAGVNIHPVASYFLSSPLHPQPKTYL AERNKLVVPAVEKYPSGVASKTCPRLSCSIT* H278Y MDSSCHNATTKMLATAPARGNMMSTSKPLAFSIERIMAR TPEPKALPVPHFLQGALPKGEPKHSLHLNSSIPCMIPFVPV AYDTSPKAGVTGSEPRKASLEAPAAPAAVPSAPAFSCSDL LNCALSLKGDLARDALPLQQYKLVRPRVVNHSSFHAMG ALCYLNRGDGPCHPAAGVNIHPVASYFLSSPLHPQPKTYL AERNKLVVPAVEKYPSGVAFKDLSQAQLQHYMKESAQL LSEKIAFKTSDFSRGSPNAKPKVFTCEVCGKVFNAHYNLT RYMPVHTGARPFVCKVCGKGFRQASTLCRHKIIHTQEKP HKCNQCGKAFNRSSTLNTHTRIHAGYKPFVCEFCGKGFH QKGNYKNHKLTHSGEKQFKCNICNKAFHQVYNLTFHMH THNDKKPFTCPTCGKGFCRNFDLKKHVRKLHDSSLGLAR TPAGEPGTEPPPPLPQQPPMTLPPLQPPLPTPGPLQPGLHQ GHQ* 77

95 Ek Çizelge 12. p.h278y varyantının evrim sürecindeki türlerde korunumu Simge Taksonomik isim İsim hg19 Homo sapiens İnsan cavpor3 Cavia porcellus Gine domuzu (kobay) erieur1 Erinaceus europaeus Batı Avrupa kirpisi dipord1 Dipodomys ordii Keseli fare loxafr3 Loxodonta africana Fil tupbel1 Tupaia belangeri Ağaç faresi ptevam1 Pteropus vampyrus Büyük yarasa echtel1 Echinops telfairi Kirpi procap1 Procavia capensis Yaban faresi micmur1 Microcebus murinus Küçük lemur mondom5 Monodelphis domestica Keseli sıçan ochpri2 Ochotona princeps Ada tavşanı taegut1 Taeniopygia guttata Zebra ispinozu galgal3 Gallus gallus Tavuk xentro2 Xenopus tropicalis Pençeli kurbağa sorara1 Sorex araneus Sivri fare dasnov2 Dasypus novemcinctus Armadillo anocar1 Anolis carolinensis Yeşil kertenkele danrer6 Danio rerio Zebra balığı fr2 Takifugu rubripes Japon balon balığı gasacu1 Gasterosteus aculeatus Dikenli balık tetnig2 Tetraodon nigroviridis Kirpi balığı orylat2 Oryzias latipes Japon balığı turtru1 Tursiops truncatus Yunus myoluc1 Myotis lucifugus Küçük yarasa canfam2 Canis familiaris Köpek petmar1 Petromyzon marinus Bofa balığı maceug1 Macropus eugenii Kanguru ornana1 Ornithorhynchus anatinus Ornitorenk chohof1 Choloepus hoffmanni Tembel hayvan spetri1 Spermophilus tridecemlineatus Sincap tarsyr1 Tarsius syrichta Maki 78

96 79