RIDA GENE CD Toxin A/B gerçek zamanlı PCR

Transkript

1 RIDA GENE CD Toxin A/B gerçek zamanlı PCR Mak.No: PG reaksiyon In Vitro Diagnostik Kullanım içindir -20 C R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Almanya Tel.: +49 (0) / Telefax: Faks: +49 (0)

2 1. Kullanım amacı In Vitro Diagnostik Kullanım içindir RIDA GENE CD Toxin A/B insan dışkı örneklerinde Clostridium difficile toxin A (tcda) ve toxin B (tcdb) genlerinin direkt,kalitatif tespiti için gerçek zamanlı PCR dır. RIDA GENE CD Toxin A/B gerçek zamanlı PCR Clostridium difficile ilişkili ishalin (CDAD) tanısında yardım amaçlı kullanılmak üzere tasarlanır. 2. Açıklama Clostridium difficile, bir gram-pozitif, sporlu anaerobik bakteri sağlıklı yenidoğanlarda bağırsak mikroflorasının bir parçası olarak Hall ve O'Toole tarafından ilk olarak 1935 de tanımlanmıştır 1.Ancak 1970lerin sonunda Clostridium difficile antibiyotik ile ilişkili ishal ve pseudomembranous colitis nedeni olarak tanımlanmıştır. 2 Bugün Clostridium difficile hastane kaynaklı ishalin en yaygın nedenlerinden biridir. Clostridium difficile antibiyotik ilişkili ishalin %15-25inden ve pseudomembranous colitis nerdeyse tüm vakalarından sorumludur. 3 CDAD için predispoze risk faktörleri örneğin antibiotica maruziyeti, ierlemiş yaş ve hastanede kalış süresidir. Ancak Clostridium difficile enfeksiyonu antibiyotiksiz tedavi ve hastane kalışı olmayan bireylerin artan sayısında da görülür. Belirtiler pseudomembranous colitis, antibiyotik ile indüklenen enflamatuar bağırsak hastalığının en ciddi biçimi dahil hafif ishalden değişken şiddette bağırsak enfeksiyonlarına kadar değişir. Klinik semptomatik olgular toxin A ve toxin B üreten toksijenik Clostridium difficile zincirlerinden kaynaklanır. Yakın yıllarda Clostridium difficile enfeksiyonlarının insidansı ve şiddeti dünya çapında artmıştır. 4 Gerçek zamanlı PCR Clostridium difficilce enfeksiyonunun hızlı, oldukça duyarlı ve spesifik tespitine izin verir. Clostridium difficile enfeksiyonunun erken ve güvenilir tanısı CDAD hastalarının özel tedavilerinin uygulanmasını ve ayrıca hastane kaynaklı geçişleri önlemek amacıyla hijyen önlemlerini başlatmayı mümkün kılar. 3. Test prensibi RIDA GENE CD Toxin A/B gerçek zamanlı PCR insan dışkı örneklerinde Clostridium difficile toxin A (tcda) ve toxin B (tcdb) genlerinin direkt, kalitatif tespiti içindir. DNA-İzolasyonundan sonra Clostridium difficile toxin A ve B si (varsa) için spesifik gen parçalarının amplifikasyonu meydana gelir. Amplifiye DNA hedefleri bir quencher ile bir ucunda ve fluorescent reporter boya ile diğer ucunda (fluorophore) etiketli hidroliz problarıyla tespit edilir. Hedef varlığında problar amplikonları hibridize eder. Uzatma aşaması esnasında Taq-polimeraz reporter-quencher yakınlığını kırar. Raportör gerçek zamanlı PCR cihazının optik birimi tarafından tespit edilen bir flüoresan sinyal yayar. Bu flüoresan sinyal oluşan amplikonların miktarıyla artar. 2 RIDA GENE CD Toxin A/B

3 RIDA GENE CD Toxin A/B testi örnek hazırlama prosedürünün dahili kontrolü olarak ve olası PCR-inhibisyonunu belirlemek amacıyla bir Internal Control DNA (ICD) içerir. 4. Sunulan reaktifler Tab.1: Sunulan reaktifler (Kit içindeki reaktifler 100 tespit için yeterlidir) Kit Kodu Reaktif Miktar Kapak Rengi 1 Reaksiyon Karışımı 2x 1100 µl sarı 2 Taq-Polimeraz 1x 11 µl kırmızı D İç Kontrol DNA 2x 1800 µl turuncu N PCR Su 1x 500 µl beyaz P Pozitif Kontrol 1x 200 µl mavi 5. Saklama talimatları - Tüm reaktifleri ışıktan koruyun ve -20 C de saklayın. Tüm reaktifler son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. - Kullanmadan önce reaktifleri dikkatlice çözün (ör. 2-8 C de buzdolabında). - Reaktifler test performansı etkilenmeksizin 5 dondurma/çözdürme döngüsüne kadar işlem görebilir (ör. ilk çözülmeden sonra porsiyonlayın ve hemen dondurun). - PCR hazırlığı esnasında tüm reaktifler uygun şekilde soğukta saklanmalıdır (2-8 C). 6. Ek ekipmanlar ve gerekli materyaller - Dışkı örnekleri için DNA-Ekstraksiyon kiti (ör. RTP Pathogen Kit (STRATEC Moleküler)) veya dışkı örnekleri için DNA-Ekstraksiyon sistemi (ör. Maxwell 16 (Promega), NucliSENS easy MAG (biomérieux)) - Gerçek zamanlı PCR Cihazı: Roche: LightCycler 2.0, LightCycler 480II Cepheid: SmartCycler Uygulanan Biyosistemler: ABI 7500 Abbott: m2000rt Stratagene: Mx3000P, Mx3005P QIAGEN: Rotor-Gene Q RIDA GENE CD Toxin A/B

4 - LightCycler 2.0 çalıştırmak için RIDA GENE Color Compensation II (PG0002) - Gerçek zamanlı PCR sarf malzemeleri (plaklar,tüpler,folyo) - Reaksiyon şişeleri için rotor ile santrifüjleme - Vortexer - Pipetler ( µl, µl, µl) - Filtre uçları - Pudrasız tek kullanımlık eldivenler 7. Kullanıcı önlemleri - Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. - Ekstraksiyon, PCR hazırlama ve PCR çalışması çapraz-kontaminasyonları önlemek için farklı odalarda ayrılmalıdır. - Bu test sadece moleküler biyoloji yöntemlerinde eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. - Çalışma talimatlarını sıkıca izleyin. - Örnekleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin. Test bittikten sonra ellerinizi yıkayın. - Örneklerin veya test reaktiflerinin kullanıldığı alanlarda sigara içmeyin, birşey yemeyin veya içmeyin. - Örnekler ve örneklere maruz kalan reaktifler ve materyaller olası bulaşıcı gibi işlenmelidir ve ulusal güvenlik düzenlemelerine göre kullanılmalıdır. - Son kullanma tarihinden sonra kiti kullanmayın. 8. Test prosedürü 8.1 Örnek Hazırlama Dışkı Örneklerinden DNA-İzolasyonu İnsan dışkı örneklerinin DNA-izolasyonu için kullanma, ticari olarak mevcut DNA izolasyon kiti (ör. RTP Pathogen Kit (STRATEC Molecular)) veya DNA ekstraksiyon sistemi (ör. Maxwell 16 (Promega)). Üreticinin talimatlarına göre DNA yı ekstrakte edin. Suyla ekstraksiyon 1:3 öncesi dışkı örneklerinin seyreltilmesini öneririz. Dilüe edilmiş dışkı numunelerini, şiddetlice vorteksleyin ve 30 sn. 3,000 rpm'de santrifüjleyin.üreticinin talimatlarına göre, süpernatantı uygun hacimde kullanın. 4 RIDA GENE CD Toxin A/B

5 RIDA GENE CD Toxin A/B testi PCR inhibasyon kontrolü ya da umune hazırlama prosedürü için ekstraksiyon kontrolü olarak ve PCR inhibasyon kontrolü olarak kullanılabilen, bir Internal Kontrol DNA (ICD) içerir. Eğer ICD sadece PCR inhibasyon kontrolü olarak kullanılırsa Master-Mix'e 1µl ICD eklenmelidir (Tab.3'e bakınız). Eğer ICD numune hazırlama prosedürü için ekstraksiyon kontrolü ve PCR inhibasyon kontrolü olarak kullanılırsa, ektraksiyon prosedürü esnasında 20 µl ICD eklenmesi gerekir. ICD her zaman numune/lysis tampon karışımına eklenmeli, kesinlikle numuneye doğrudan eklenmemelidir. 8.2 Master-Mix hazırlığı Gereken toplam PCR reaksiyonsayısını (numune ve kontrol reaksiyonları) hesaplayın. Her tahlil çalışmasının içinde, mutlaka bir pozitif ve negatif kontrolün olması gereklidir. Pipetlemenin tam olarak karşılanması için, %10 ilave hacim hesaplanmasını tavsiye ederiz. Kullanmadan önce, Reaksiyon Mix'i, Taq-Polymerase'ı, Pozitif Kontrolü,PCR Su ve ICD'yi çözün, nazikçe karıştırın ve kısa biz süre santrifüjleyin. Reaktifleri çalışma aşaması esnasında uygun soğuklukta muhafaza edin (2-8 C). Tab.2: Hesaplama ve pipetleme örneğin 10 Master-Mix resksiyonu için Kit Kodu (Ekstraksiyon ve PCR inhibasyonu olarak ICD) Master-Mix bileşenleri Reaksiyon başına hacim 10 reaksiyon (ekstra %10) 1 Reaksiyon Karışımı 19,9 µl 218,9 µl 2 Taq-Polimeraz 0,1 µl 1,1 µl Toplam 20,0 µl 220 µl Master-Mix bileşenlerini yavaşça kısa süreliğine aşağıya döndürerek karıştırın. Tab.3: Hesaplama ve pipetleme örneğin 10 Master-Mix resksiyonu için Kit Kodu (PCR inhibasyonu olarak ICD) Master-Mix bileşenleri Reaksiyon başına hacim 10 reaksiyon (Ekstra %10) 1 Reaksiyon Karışımı 19,9 µl 218,9 µl 2 Taq-Polimeraz 0,1 µl 1,1 µl D İç Kontrol DNA 1,0 µl 11 µl Toplam 21,0 µl 231,0 µl Master-Mix bileşenlerini yavaşça kısa süreliğine aşağıya döndürerek karıştırın. RIDA GENE CD Toxin A/B

6 8.3 PCR-Mix hazırlanması Her bir reaksiyon şişesine (tüp veya plaka) 20 Master-Mix pipetleyin. Negatif Kontrol : Önceden pipetlenen Master-Mix'e negatif kontrol olarak 5 µl PCR Su ekleyin. Not: Eğer ICD, PCR inhibasyon kontrolü ve numune hazırlama prosedüründe ekstraksiyon kontrolü olarak kullanılırsa, negatif kontrol PCR Mix'e 1 µl ICD ilave edilmesini öneririz. Örnek: Pozitif Kontrol: Önceden pipetlenen Master-Mix'e 5 µl DNA-extract ekleyin. Önceden pipetlenen Master-Mix'e 5 µl Pozitif kontrol ekleyin. Not: Eğer ICD, PCR inhibasyon kontrolü ve numune hazırlama esnasında ekstraksiyon kontrolü olarak kullanılırsa, pozitif kontrol PCR Mix'e 1 µl ICD ilave edilmesini öneririz. Tüpleri veya plakayı kapatın. Aşağıya döndürün ve real-time PCR cihazına yerleştirin. PCR reaksiyonu, PCR cihaz ayarlarına göre başlatılmalıdır. (Tab.4, Tab.5 e bakın). 8.4 PCR Cihaz ayarları Tab.4: LightCycler 2.0, LightCycler 480II, SmartCycler ve Rotor-Gene Q için Real-time PCR profile İlk Denatürasyon 1 dk, 95 C Cycling PCR denatürasyonu Sertleştirme/Uzatma 45 döngü 10 sn, 95 C 15 sn, 60 C Sıcaklık Geçiş Hızı /Ramp Oranı Maksimu m Not: Sertleşme ve uzatma aynı aşamada meydana gelir. Tab.5: Mx3000P, Mx3005P, ABI 7500 ve m2000rt için Real-time PCR profili İlk Denatürasyon 1 dk, 95 C Cycling PCR denatürasyonu Sertleştirme/Uzatma 45 döngü 15 sn, 95 C 30 sn, 60 C Sıcaklık Geçiş Hızı /Ramp Oranı Maksimu m Not: Sertleşme ve uzatma aynı aşamada meydana gelir. 6 RIDA GENE CD Toxin A/B

7 8.5 Kanal Set-up Algılama Tab.6: Uygun tespit kanallarını seçin. Real-time PCR Cihazı: Tespit Tespit Kanalı Dark- Quencher Not Roche LightCycler 2,0 Clostridium difficile Toxin A/B RIDA GENE Color Compensation Kit ICD II (PG0002) gerekir Roche LightCycler 480II Clostridium difficile Toxin A/B 465/510 + ICD 533/580 + Renk Telafisi gerekmez Cepheid SmartCycler Clostridium difficile Toxin A/B Kanal 1 + ICD Kanal ABI 7500 Clostridium difficile Toxin A/B FAM yok Pasif referans ROX seçeneğinin olmadığını kontrol ICD VIC yok edin. Abbott: m2000rt Clostridium difficile Toxin A/B FAM yok ICD VIC yok - Stratagene Mx3000P/ Mx3005P Clostridium difficile Toxin A/B FAM + Referans boyanın olmadığını kontrol ICD HEX + edin. Qiagen Rotor-Gene Q Clostridium difficile Toxin A/B Yeşil + ICD Sarı + - RIDA GENE CD Toxin A/B

8 9. Sonuçların Yorumlanması Numune analizleri, üreticinin talimatlarına göre kullanılan real-time PCR cihazının yazılımı tarafından yapılır. Pozitif ve negatif kontroller doğru sonuçları göstermek zorundadır (şekil 1 bakın). Pozitif kontrol, konsantrasyonu 10 3 kopya / µl dir. Her bir PCR çalışmasında toplam 10 3 kopya miktarı kullanılır. Şekil.1: Pozitif ve negatif kontrolün doğru çalışması (C. difficile toxin A/B genleri) LightCycler 480II Sonuç yorumlanması Tablo 7'ye göre yapılır Tab.7: Numune yorumlama Numune ICD Sonuç - + Örnek negatif + + Örnek pozitif + - Örnek pozitif,rekabet - - PCR İnhibisyonu Numune, tespit sisteminde amplifikasyon sinyali göstermezse, numune negatif olarak değerlendirilir, ancak Internal Kontrol (ICD) pozitif. Ekstraksiyon prosedüründeki PCR inhibasyonu ya da başarısızlığı, Internal Kontrol DNA (ICD) tespitiyle ekarte edilebilir. Hem numune hem de Internal Kontrol DNA (ICD), tespit sisteminde amplifikasyon sinyali gösteriyorsa, numune pozitif olarak değerlendirilir. 8 RIDA GENE CD Toxin A/B

9 Numune, tespit sisteminde amplifikasyon sinyali gösteriyorsa, numune pozitif olarak değerlendirilir, ancak Internal Kontrol DNA (ICD) negatiftir. Dahili amplifikasyon kontrolünün tespiti gerekli değildir, amplikonun yüksek konsantrasyonlarından dolayı dahili amplifikasyon kontrolünün zayıf sinyali meydana gelebilir ya da hiç sinyali olmayabilir. Hem numune hem de Internal Kontrol DNA (ICD), tespit sisteminde amplifikasyon sinyali göstermiyorsa, numune geçersiz olarak kabul edilir. Ektraksiyon prosedüründe bir hata oluşmuştur ya da numune bir PCR inhibitörü içermektedir. Ekstrakte edilen numunenin, PCR su (1:10) ile yeniden daha fazla dilüe edilmesi ya dayeniden amplifiye edilmesi ya da numune izolasyon ve purifikasyonunun iyileştirilmesi gerekir. 10. Test özellikleri 10.1 Analitik duyarlılık RIDA GENE CD Toxin A/B real-time PCR reaksiyon başına 5 DNA kopya tespit sınırına sahiptir (Şekil 2 bakın). Şekil.2:Dilution series C difficile toxin A/B genleri ( DNA copies / µl) LightCycler 480II Tüm prosedürün tespit sınırı örnek matrix, DNA-ekstraksiyonu ve DNA-konsantrasyonuna bağlıdır. RIDA GENE CD Toxin A/B

10 10.2 Analitik özgünlük RIDA GENE CD Toxin A/B real-time PCR insan dışkı numunelerinde Clostridium difficile için özeldir. Aşağıdaki türler için çapraz-reaksiyon tespit edilmedi (Tab.8 bakın): Tab. 8: Çapraz reaktivite testi Arcobacter butzleri - Clostridium sordellii - Salmonella enteritidis - Aeromonas hydrophila - Enteropathogenic E.coli - Salmonella typhimurium - Bacillus cereus - Enterotoxigenic E.coli - Serratia liquefaciens - Bacteroides fragilis - Shiga toxin-producing E.coli - Shigella flexneri - Campylobacter coli - Enterobacter cloacae - Staphylococcus aureus - Campylobacter jejuni - Enterococcus faecalis - Staphylococcus epidermidis Candida albicans - Klebsiella oxytoca - Vibrio parahaemolyticus - Citrobacter freundii - Proteus vulgaris - Yersinia enterocolitica - Clostridium perfringens - Pseudomonas aeruginosa Yöntem limitleri 1. Moleküler analizin sonucu tanıya yol açmamalıdır ancak her zaman tıp tarihi ve hasta semptomları bağlamında düşünülmelidir. 2. Bu test sadece dışkı numuneleri için onaylanır. 3. Uygunsuz numune toplama, taşıma, saklama ve işleme veya analitik duyarlılık altında numunede patojen yükleme yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. 4. PCR inhibitörlerinin varlığı geçersiz sonuçlara neden olabilir. 5. Mutasyonlar ya da primer polimorfizmler veya prob bağlama bölgeleri RIDAGENE CD Toksin A / B testi ile yalancı negatif bir sonuç, yeni varyantların saptanmasını etkileyebilir. 6. In vitro diagnostik testlere dayalı tüm PCR ile olduğu gibi, algılama hedef sınırının altında çok düşük seviyelerde (LOD) tespit edilebilir, ancak sonuçlar yeniden üretilebilir olmayabilir. 7. Pozitif bir test sonucu mutlaka canlı organizmaların varlığını göstermez. Bununla birlikte, pozitif bir sonuç C. difficile toksin A / B geninin (tcda/tcdb) varlığında göstergesidir. 10 RIDA GENE CD Toxin A/B

11 12. Literatür 1. Hall IC and O'Toole E. Intestinal flora in new-born infants: with a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am J Dis Child 1935, 49: Bartlett JG, et al. Antibiotica-associated pseudomembranous colitis due to a toxinproducing clostridia. N Engl J Med 1978:620298, Bartlett JG and Gerding DN. Clinical Recognition and Diagnosis of Clostridium difficile Infection. CID 2008, 46: S Bartlett JG. Narrative Review: The new Epidemic of Clostridium difficile-associated Enteric Disease. Ann Intern Med 2006; 145: RIDA GENE CD Toxin A/B