BİLEŞİM Ekstraksiyon kit, DNA EKSTRAKSİYON KIT Ref.: Amplifikasyon kit Ref.: B REF BC Tespit kit Ref.: C

Transkript

1 67-130_ _TR.doc JC/BK CONSENSUS REF REF BC REF BİLEŞİM Ekstraksiyon kit, DNA EKSTRAKSİYON KIT Ref.: Amplifikasyon kit Ref.: B REF BC Tespit kit Ref.: C 1. Kit Tanımı 2 2. Kullanım amacı 2 3. Test Prensibi 2 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 3 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 4 6. Reaktiflerin rekonstitüsyonu 5 7. Uyarı ve Önlemler 6 8. Örneğin işlenmesi ve taşınması 7 9. Kontroller Örnek ekstraksiyon prosedür Amplifikasyon protokol Tespit protokolü Sonuçların hesaplanması ve yorumlanması Test performansı Arıza giderme Kılavuzu Referanslar 18

2 1. Kit Tanımı JC/BK CONSENSUS kitinin 2 farklı formatı bulunur, bunlar: ekstraksiyon kiti (ref. : ) içeren komplet kit ve ekstraksiyon kiti (ref. : BC) içermeyen amplifikasyon/tespit kitidir. JC/BK CONSENSUS kit DNA saflaştırma ve amplifikasyon sonrası mikrotiter plakada JC ve BK poliomaviruslerin eş zamanlı tespitini sağlamak için tasarlanmıştır. Aynı protokol idrar, serum, plazma ve beyin omurilik sıvısından (CSF) JC ve BK virüslerinin tanınması ve tespitini sağlar. 2. Kullanım amacı JC (JCV) ve BK (BKV) virüsleri Polyomaviridae familyasına ait polyomavirüslerdir. Bu iki polyomavirus özellikle insanları etkiler. JCV ve BKV yaklaşık 5000 bp sahip süper ve dairesel çift zincirli DNA sarmallı virüslerdir. BKV ve JCV nükleotid dizisi düzeyinde güçlü bir homoloji çiftidir. İnsan polyomavirus JC ve BK populasyonda oldukça sık görülür. Seroprevalansın yetişkinlerde % oranında görüldüğü tahmin edilmektedir. Primer enfeksiyon çocukluk döneminde ortaya çıkar ve genellikle asemptomatiktir veya belirli bir klinik bulguya sahip değildir. Penetrasyon ardından, JCV ve BKV hem organizma içinde göç eder hem de hedef organlarda gizlice yer edinir. Endojen reaktivasyon dan gelen JCV ve BKV enfeksiyon sonuçları çoğunlukla asemptomatiktir ancak idrarda polyomavirusün atılımı ile tespit edilir. Semptomatik reaktivasyon sadece immünitesi zayıflamış konakçıda tanımlanır. Progresif multifokal lökoensefalopati (PML) HIV-enfeksiyonlu hastalarda JCV reaktivasyona bağlı merkezi sinir sisteminin ciddi demiyelinizan hastalıklarındandır. Bundan dolayı, JCV beyin ve/veya BOS da tespit edilebilir. Semptomatik BKV reaktivasyonu böbrek ya da kemik iliği nakli-alıcılarında interstisyel veya tüp interstisyel nefrit böbrek, hemorajik sistit ve üretral darlık gibi üriner sistem hastalığı içerir. Bundan dolayı, BKV idrar ve/veya kanda tespit edilebilir. JCV ve BKV farklı örneklerde ayrılabilir ve tespit edilebilir. Bu virüslerden bir yada daha fazlasının varlığı lokalizasyonlarına göre aynı öneme sahip değildir ve ne aynı tedavi ne de aynı tedavi süreci uygulanır. Geleneksel viroloji yöntemler virüslerin ağırlıklı olarak doğrudan tespitini içerir. Serolojik yöntem anti polyomavirus antikorun yüksek yayılma oranı sonucu sınırlıdır. Genik amplifikasyon yöntemleri geçerlidir ancak BK ile JC virüsleri ayrımı genellikle yapılamaz. Bir amplifikasyon tüpte JC / BK KONSENSÜS test tespit edilir ve yüksek bir duyarlılık düzeyli biyolojik örneklerde JCV ve BKV ayrılır. JC/BK CONSENSUS test SV40 polyomavirus ile çapraz reaksiyona girmez. 3. Test prensibi 3.1. Klinik örneklerden viral DNA saflaştırma Viral DNA bir mikrosantrifüjleme adımı ile silika jelin seçici bağlayıcı özellikleri ile ilişkili bir yöntemi izleyerek ekstre edilir. Örnek membran üzerinde DNA bağlayıcı kapasitelerini optimize etmek için doğru tamponda proteaz ile ilk defa parçalanır. Silika kolonunun kullanımı, DNA kaplandıktan sonra, kontaminasyonu elimine etmek için numunenin verimli yıkanmasını sağlar. Elüsyon sonrası, DNA amplifikasyon tekniklerinde doğrudan kullanım için uygundur. Bu ekstraksiyon ekstraksiyon kiti (ayrı ayrı mevcut değildir) ile yada QIAamp DNA Blood Mini Kit ile gerçekleştirilebilir (QIAGEN ref.:51104 yada ref.: 51106).

3 3.2. Amplifikasyon Amplifikasyon adımı JCV ve BKV in büyük T antijen geninin bir DNA bölgesine amplifiye olan spesifik primerler kullanılarak yapılır. Amplifiye edilmiş parça 197/198 baz çifti uzunluğundadır. İki pozitif kontrol amplifikasyon kiti B de sağlanır. İlgili kontrol plazmidleri JCV ve BKV primerler ile spesifik olarak tanınan diziler içerir. İnhibasyon kontrol premiks bu plazmidi içerir. Örnek test edildiğinde, DNA saflaştırılması sonrası amplifikasyon inhibitör maddelerin yokluğunu göstermeyi sağlar Tespit Amplifikasyon sonrası, amplifiye edilmiş ürünler mikrotiter plakada kimyasal olarak hibridizasyon ile analiz edilir ve denatüre edilir. Hibridizasyon JCV yada BKV spesifik olan biotinylated bir prob ile gerçekleştirilir. Tespit, sonra 3,3',5,5' tetramethilbenzidine(tmb) ile ilişkili streptavidine peroksidaz konjugat ile gerçekleştirilir. Optikal yoğunluk (OD) mikroplaka okuyucu ile 450 nm de okunur. 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 4.1. Viral DNA, DNA EXTRACTION KIT or QIAamp DNA Blood Mini Kit. (QIAGEN ref.:51104 yada ref.: 51106) saflaştırma için kit. Kit başına preparat sayısı: 50 o A QIAamp mini column 5 x 10 o B Toplama tüpleri (2 ml) 3 x 50 o C AL tampon Xn HARMFUL 12 ml o D AW1 tampon (konsantre) Xn HARMFUL 19 ml o E AW2 tampon (konsantre) 13 ml o F AE tampon 12 ml o G QIAGEN proteaz 24 mg o H Proteaz çözücü 1.2 ml Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. Yüksek sıcaklıkta saklamayınız. Çözündürülmüş QIAGEN proteazın tekrarlanan donmasını önlemek için -18 C/-22 C 'de eşit miktarlarda saklayınız. NOT: A, B, D, E, F, G, H reaktifleri sadece DNA EXTRACTION KIT (Ref. : ) içindir Amplifikasyon kiti B Amplifikasyon test sayısı: 60 o R9 Amplification premix...2x1 ml primerler içerir, buffer, MgCl2, dntps o R10 Inhibisyon kontrol premiks...2x0.75 ml primers içerir, buffer, MgCl2, dntps, inhibisyon kontrol o R11 JCV pozitif kontrol ml o R12 BKV pozitif kontrol ml

4 R10, R11 ve R12 reaktifler 18 C/-22 C de ekstraksiyon odada saklanmalıdır. Kiti, kutu üzerinde yazılı son kullanma tarihine kadar -18 C/-22 C de donmuş olarak açıldıktan sonra ve önce tutun Tespit kiti C Tespit sayısı: 192 o R13 Negatif tespit kontrol 0.15 ml o R14 Denatürasyon solüsyonu ml o R15 Denatürasyon solüsyonu 2 Xi-Irritant 1.5 ml o R16 Kaplama solüsyonu 35 ml o R17 Microtiter plaka (12 x 8 wells) 2 o R18 JCV prob kullanıma hazır (kırmızı) T-Toksik 5 ml o R19 BKV prob kullanıma hazır (kırmızı) T-Toksik 5 ml o R20 Kontrol kullanıma hazır (mavi) T-Toksik 8 ml o R21 Yıkama solüsyonu(10x) 2 x 60mL o R22 Konjugate dilution buffer T- Toksik 15 ml o R23 Streptavidine peroxydase konjugate (50x) 0.3 ml o R24 Substrat - Tetramethilbenzidin (TMB) 15 ml o R25 Stop solüsyonu C - Korrosive 20 ml o R26 Kendinden yapışkanlı folyolar 4 Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 5.1. Viral DNA, DNA EXTRACTION KIT ya da QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.:51104 ya da ref.: 51106) saflaştırma için kit. Etanol %. Santrifüj (6,000 g -12,000 g). Vorteks Numune hacmi < 0,2 ml için PBS Test tüpleri (1.5 ml, 2 ml). Su banyosu veya termocycler +56 C. Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. PBS (< 0,2 ml numune için) 5.2. Amplifikasyon kit B Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. Termocycler Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. Steril su. Ampifikasyon için 0.2 ml polipropilen tüpler. HotStarTaq QIAGEN, 5 units/μl de ref.: (250 U) Tespit kiti C Microtiter plaka okuyucu (450 yada 450/650 nm) ve yazıcı. Otomatik mikrotiter plaka yıkayıcı (opsiyonel).

5 Steril pipetler. Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. Multikanallı pipettör. Tek kullanımlık reaktif rezervuarlar. Polipropilen tüpler (1.5 ml and 15 ml). Inkübatör (+37 C). Vorteks karıştırıcı. Distile su. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. 6. Reaktiflerin çözündürülmesi 6.1. Viral DNA, DNA EXTRACTION KIT yada QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.:51104 yada ref.: 51106) in saflaştırılması için kit Proteaz stok solüsyon hazırlama 24 mg liyofilize proteaz (G) e 1.2 ml proteaz çözücü (H) ekleyin. -18 C/-22 C de aynı hacimlere bölerek saklayın (tekrar çözündürme ve dondurmadan kaçının) AL buffer (C) hazırlama Kullanım öncesi çalkalayarak AL tamponu (C) iyice karıştırın. AL tampona (C) direk olarak proteaz eklemeyin. Eğer çökelti AL tamponunda (C) görünürse, çökelti çözünene kadar +70 C de ısıtın. AL tamponu +2 C/+8 C de saklayın AW1 tampon (D) hazırlama AW1 tampon (D) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 19 ml konsantre edilmiş tampona 25 ml etanol (96-100%) ekleyin. Çözündürme sonrası, AW1 tampon (D) +2/+8 C de stabildir AW2 buffer (E) hazırlama AW2 tampon (E) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 13 ml konsantre edilmiş tampona 30 ml etanol (96-100%) ekleyin. Çözündürme sonrası, AW2 tampon +2/+8 C de stabildir Amplifikasyon kit B Kitte bulunan bütün reaktifler amplifikasyon protokolündeki talimatları izleyerek kullanıma hazırlanır Tespit kit C R21 Yıkama solüsyonu (10x) Eğer kristaller konsantre yıkama solüsyonunda (R21) gözlenirse, dilüsyon öncesi kristaller çözülene kadar +37 C de ısıtın. 9 hacimlik distile su ile konsantre yıkama solüsyonunun (R21) bir hacmini karıştırın. Bütün kuyuların 10 kez yıkanmasını sağlamak için yeterli reaktif hazırlayın ( her zaman kuyu başına 350 μl).

6 Yıkama solüsyonu 1x +2 C/+8 C de 3 ay stabilidir R22 / R23 Konjugat (50x) Beyaz bir çökelti konjugat dilüsyon tamponda (R22) görünebilir. Bu çökelti reaktif verimliliğini asla etkilemez. Bu durumda, reaktifi vorteksleyin ve gerekli hacim pipetleyin. ISITMAYIN. Daha önce homojen hale getirilmiş konjugat dilüsyon tampon (R22) içinde konjugatı (R23) 1/50 oranında dilüe edin. Kuyu başına 100 μl dağıtmak için yeterli reaktif hazırlayın. Dilüe edilmiş 1ml konjugat için örnek: 980 μl (R22) ile 20 μl (R23) karıştırın. Kullanıma hazır konjugat hibridizasyon adımı sırasında kullanım öncesi hazır olmalıdır. Dilüe edilmiş konjugatı saklamayın. Kitin kullanımı için önlemler UYARI: Ekstraksiyon ortamında deterjan ve/veya yüksek protein konsantrasyonları mikrotiter plakada DNA kaplama ile engellenebilir. Bu nedenle, kitler içinde sadece önerilen ve sağlanan reaktifleri kullanmak ve verilen prosedürü izlemek önemlidir. 7. Uyarılar ve önlemler 7.1. Moleküler biyoloji işlemleri için uyarılar ve önlemler Amplifikasyon prosedüründe numunenin kontaminasyon riskini önlemek için aşağıdaki talimatlar izlenmelidir: o Numune hazırlama, amplifikasyon reaksiyonu ve amplife edilmiş ürün analizi için ayrı çalışma alanları kullanın. Reaktif ya da numune hazırlama alanında amplifiye bir ürünü asla başlatmayın. o Kullanılan örnekler sadece bu analiz için ayrılmalıdır. o Numuneler biyolojik güvenlik kabini altında hazırlanmalıdır. Farklı örnek tüpleri aynı zamanda asla açılmamalıdır. o Örnekleri işlemek için kullanılacak pipetler sadece bu amaç için ayrılmalıdır. Bu pipetler filtre uçlu pozitif boşluklu pipetler veya hazırlanmış pipetler olmalıdır. Kullanılan uçların farklı türleri steril olmalıdır. o Eşit miktarlardaki reaktifler için kullanılan pipetler sadece bu çalışma için ayrılmalıdır. Amplifikasyon için gerekli reaktifler tek bir deney sırasında kullanılmak üzere eşit miktarlarda ayrılmıştır Genel uyarılar ve önlemler Potansiyel enfeksiyöz olan örnekleri ve malzemeleri işlemeyin ya da atmayın. Kullandıktan sonra: malzemenin, reaktiflerin ve atığın potansiyel olarak enfeksiyöz olarak ele alınması gerekir. Bu testi gerçekleştirmeden önce tüm talimatları okuyun. Son kullanım tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın (etiket basılmış). Yalnızca kitte bulunan reaktifleri kullanın. Diğer üreticilerin yada farklı lot numaralı kitlerin reaktiflerini değiştirmeyin. Ağız ile asla pipetlemeyin. Özel çalışma alanlarında sigara veya içecek içmeyin, yemek yemeyin Spesifik reaktiflerin uyarı ve önlemleri AL (C) tampon ve AW1 tampon (D) guanidinyum klorür içerir (kaotropik tuz) R22: Yutulursa zararlıdır. R36/38: Göz ve cilt için zararlıdır. S13: Hayvan yemi, yiyecek ve içeceklerden uzak tutun.

7 S26: Göz ile temas halinde, derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım isteyiniz. S36: Uygun koruyucu önlük giyin. S46: Yutulduğunda derhal tıbbi yardım alınız ve bu konteynırı veya etiketi gösterin. Bu bileşen çamaşır suyu içeren dezenfeksiyon ajanlar ile kullanılmamalıdır. AW2 tampon (E) ve proteaz çözücü (H) koruyucu olarak % 0.04 Sodyum Azide içerir. Denatürasyon solüsyonu 2 (R15) sodyum hidroksit içerir: R36/38: Göz ve cilt için zararlıdır. S26 :Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. S37/39 : Göz/yüz koruyucu ve uygun eldiven giyin. S45 :Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). Kullanıma hazır problar (R18, R19 ve R20) formamid içerir: R61: Hamile kadınlara zaralı olabilir. S45 :Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). S53 :Maruz kalmaktan sakının- kullanmadan önce özel kullanım talimatlarını okuyun. Yıkama solüsyonu (R21) koruyucu olarak 0.01% timerosal içerir. Konjugat dilüsyon tampon (R22) potasyum dikromat içerir. R46 : Kalıtsal genetik hasarlara neden olabilir. R49 : Kanser yapabilir. S45: Kaza durumunda veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız, hemen bir doktora başvurunuz (mümkünse etiketi gösterin). S53: Maruz kalmaktan sakının- kullanmadan önce özel kullanım talimatlarını okuyun. S60: Bu maddenin veya ambalajının imhası tehlikeli maddelere göre yapılmalıdır S61: Çevreye kontrolsüz verilmesinden kaçının. Özel kullanım talimatına / Güvenlik Bilgi Formuna bakın. Stop solüsyonu (R25) hidrojen klorür içerir. R20: Solunması halinde sağlığa zararlıdır. R34: Yanıklara neden olur. S26:Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. S45: Kaza halinde veya kendinizi iyi hissetmiyorsanız hemen bir doktora başvurun. (Mümkünse bu etiketi gösterin.) Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. 8. Örneğin alınması ve taşınması Örnekler standart laboratuar prosedürleri izlenerek toplanır ve taşınır. Taşınacak örnekler için, tehlikeli ve bulaşıcı malzeme taşınması ile ilgili yerel mevzuat kontrol edilmelidir İdrar İdrar steril bir kap içinde toplanır. 3 ml bir hacim yeterlidir (200 μl minimum). İdrar tercihen oda sıcaklığında (+18 C/25 C ) ya da +2 C/+8 C de laboratuara gönderilmelidir. İdrarı alındığında direk kullanılmadığında bir hafta boyunca +2 C/+8 C de saklanabilir. Bu gecikme dışında, serum ve plazma -18 C/-22 C de saklanır.

8 Eğer idrar kuru buz içinde laboratuara gönderilirse, daha sonra -18 C/-22 C de veya tercihen - 78 C/-82 C saklanmalıdır Serum ve plazma Kan EDTA lı yada kuru tüpte toplanmalıdır. UYARI: Heparinize tüplerin kullanımı genik amplifikasyon analizine uygun değildir. Sitrat içeren kan toplama tüpleri amplifiye edilmiş ürünlerin tespiti sırasında sinyal azalmasından sorumlu olabilir. 20 C de 10 dakika boyunca 1200xg de tüpü santrifüj edin. Maksimum 2 ml (200μL minimum) serum ve plazma soğuk tüplerde biyolojik güvenlik kabini altında dökülür. Serum ve plazma tercihen oda sıcaklığında (+18 C/25 C ) ya da +2 C/+8 C de laboratuara gönderilmelidir. Serum ve plazma alındığında direk kullanılmadığında bir hafta boyunca +2 C/+8 C de saklanabilir. Bu gecikme dışında, serum ve plazma -18 C/-22 C de saklanır. Eğer serum ve plazma kuru buz içinde laboratuara gönderilirse, daha sonra -18 C/-22 C de veya tercihen -78 C/-82 C saklanmalıdır Beyin omurilik sıvısı (CSF) Maksimum 200 μl. CSF lomber ponksiyon klasik koşulları izlenerek kuru tüpte toplanır. CSF tercihen oda sıcaklığında (+18 C/25 C ) ya da +2 C/+8 C de laboratuara gönderilmelidir. CSF alındığında direk kullanılmadığında bir hafta boyunca +2 C/+8 C de saklanabilir. Bu gecikme dışında, CSF -18 C/-22 C de yada tercihen 78 C/82 de saklanır. Eğer serum ve plazma kuru buz içinde laboratuara gönderilirse, daha sonra -18 C/-22 C de veya tercihen -78 C/-82 C saklanmalıdır. 9. Kontroller Pozitif ve inhibasyon kontroller için aynı prensibi takip edin. Kontrollerin kullanımı manipülasyonu doğrulamak için zorunludur Pozitif Kontrol İki pozititf kontrol şişesi (R11) ve (R12), JC ve BK virüsleri ile ilgili bir sıradan bir fragmenti amplifiye etmek için JC/BK CONSENSUS primerlerin kapasitesini kontrol eden amplifikasyon kitinde B sağlanır. Bu kontroller ekstre edilmiş numuneler ile aynı işlemi gerçekleştirir ve tam proses ile devam eder (amplifikasyondan tespite). Kontroller, C tespit kitinde sağlanan kontrol prob (R20) ile hibridize edilir.

9 9.2. Inhibisyon kontrol Bu kontrol numunede amplifikasyon inhibitörlerin varlığını tespit eder. Her örnek hem amplifikasyon premiksi (R9) hem de inhibisyon kontrol premiks (R10) ile amplife edilecektir. Bu kontroller ekstre edilmiş numuneler ile aynı işlemi gerçekleştirir ve tam proses ile devam eder (amplifikasyondan tespite). Kontroller, C tespit kitinde sağlanan kontrol prob (R20) ile hibridize edilir Negatif amplifikasyon kontrolü Bu kontrol kontaminasyon yokluğunu gösterir. Amplifikasyon premikse (R9) sahip genomik amplifikasyondan mikroplaka tespiti numune dışında tüm reaktifler ile yapılır. Bu kontroller ekstre edilmiş numuneler ile aynı işlemi gerçekleştirir ve tam proses ile devam eder (amplifikasyondan tespite). Bu kontrol, C tespit kitinde sağlanan kontrol prob (R20), JCV probe (R18) ve BKV prob(r19) ile hibridize edilir Negatif tespit kontrolü (R13) Bu kontrol cut-off tespitini sağlar. Bu kontrol (R13) tespit kitinde C kullanıma hazır olarak sağlanır. Bu kontroller post-amplifikasyon prosesi sırasında amplifiye numuneler ile aynı işlemi gerçekleştirir (denatürasyondan görüntülemeye). Bu kontrol, C tespit kitinde sağlanan kontrol prob (R20), JCV probe (R18) ve BKV prob(r19) ile hibridize edilir. 10. Numune Ekstraksiyon prosedürü DNA, DNA EXTRACTION KIT kit or QIAamp DNA Blood Mini Kit. (QIAGEN ref.:51104 or ref.: 51106) nın saflaştırılması için kit. Örnek ekstraksiyonu için ayrılmış odada Örnekleri +18 C/+25 C oda sıcaklığına getirin. AE buffer (F) +18 C/+25 C oda sıcaklığına getirin. AW1 tamponu (D), AW2 tampon (E) ve çözündürülmüş proteazı kılavuzda verilen bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon a göre hazırlayın. Gerekirse +70 C 'de ısıtarak AL tampon (C) daki çökeltiyi tekrar çözün ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir Lizis adımı Analiz edilecek numune için 1.5 ml microcentrifuge tüplerinden eşit sayıda belirleyin (kapakta) ve hazırlayın. +56 C ye termocylere ya da su banyosunu ısıtın. Bir 1.5 ml bir mikrosantrifüj tüp içine 20 μl proteaz pipetleyin. Bu tüpe 200 μl numune ekleyin. o Numune hacmi 200 μl den azsa, PBS tampon ile 200 μl ye ayarlayın. Numune hacmi 100 μl den daha az olmamalıdır. Numuneye 200 μl AL buffer (C) ekleyin ve 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. o Verimli lizis sağlamak için, örnek homojen bir solüsyon verene kadar iyice karıştırılır.

10 o Numune hacmi 200 μl den fazla ise, proteaz ve bufferın miktarını belli oranda arttırın. +56 C de 10 dakika boyunca inkübasyon edin. Lizisin 10 dakika sonra inkübasyonu tamamlanır. Uzun inkübasyon süresinin saflaştırılmış DNA nın kalitesi veya verimi üzerinde etkisi yoktur. Potansiyel olarak enfeksiyöz ajanlar lizis adımdan sonra numune 95 C'de 15 dakika inkübe edilerek inaktive olabilir. Ancak uzayan bu inkübasyon DNA nın bozulmasına neden olur. Kapağın içindeki damlaları uzaklaştırmak için 1,5 ml Mikrosantrifüj tüpünü kısa süre santrifüjleyin Yükleme adımı Numuneye 200 μl % lik etanol ekleyin ve 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. o Eğer numune hacmi 200 μl den fazla ise, aynı oranlarda etanolun miktarını arttırın. Test edilecek örnekler ile spin kolonu aynı sayıda belirleyin ve hazırlayın. Kenarlarını ıslatmadan spin kolonuna (2 ml toplama tüpünde) yukarıdaki karışımı dikkatle uygulayın. Kapağı kapatın ve 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. Santrifüj sırasında aerosol oluşumunu önlemek için her spin kolonunu kapatın. Eğer lizisat santrifüj sonrası kolon üzerinden tamamen geçerse, spin kolonu boşalana kadar daha yüksek hızda tekrar santrifüjleyin Yıkama adımı Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW1 tampon (D) ekleyin. Kapağı kapatın ve 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. o Orijinal numune hacmi 200 μl den daha fazla ise, AW1 tampon (D) un hacminin arttırılmasına gerek yoktur. Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW2 tampon (E) ekleyin. Kapağı kapatın ve full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin kolonu yerleştirin, süzüntülü eski toplama tüpünü alın. Ek bir adım ekleyin. Temiz bir 1.5 ml tüpe kolonu yerleştirin ve elusion öncesi full hızda (12000xg) 1 dakika santrifüjleyin. Bu adım AW2 tampon etkisini ortadan kaldırır Elution adımı Spin kolonunu dikkatlice açın ve CSF, serum ve plazma için 50 μl AE tampon (F) ekleyin. İdrar için 200 μl AE tampon (F) ekleyin. 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Eğer numune hacmi 200 μl den daha azsa, 50 μl lik bir sınır içinde orantılı olarak elüsyon hacmini değiştirin (100 μl bir başlangıç numune hacmi). Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca spin kolonun (AE tampon ile yükleme) inkübasyonu, santrifüjleme adımından önce, DNA nın verimini arttırabilir. Ekstre edilmiş DNA -18 C/-22 C de saklandığında bir yıla kadar stabildir. 11. Amplifikasyon protokolü Amplifikasyon Kit B NOT: Amplifikasyon protokolü sadece aşağıdakiler içindir: -Aşağıda bölüm 10 da açıklanan protokolde DNA EXTRACTION KIT (Ref.:67-000) yada QIAamp DNA Mini Blood Kit. (QIAGEN ref.:51104 yada ref.: 51106) ile elde edilen ekstraksiyon ürünleri.

11 - Amplifikasyon premiksin su kontrolü. UYARI: Inhibisyon kontrolü Premix (R10) ve pozitif kontrol (R11, R12) DNA içerir ve aldıktan sonra - 18 C/-22 C 'de saklanmalıdır ve ekstraksiyon odasında SADECE çalışılmalıdır. Termocyclerı programlayın. Her amplifikasyon çalışması için, aşağıda 0.2 ml polipropilen tüp sayılarını tespit edin: o Test edilecek her numune için 2 tüp (amplifikasyon premiks ve inhibisyon kontrol premiks); o Amplifikasyon pozitif kontrol için 2 tüp; o Negatif bir amplifikasyon kontrol için 1 tüp (steril su yerine numune ). n = numune sayısı + 2 pozitif kontrol tüp + 1 negatif amplifikasyon kontrol tüpü. (n = amplifikayson premiks için gerekli tüp sayısı ). n' = numune sayısı (n' = inhibisyon premiks için gerekli tüp sayısı ). 5 numune için örnek: n = 5 + 3= 8 ve n = Dilute HotStarTaq hazırlama Reaktif hazırlama için ayrılmış odada UYARI: Önerilen HotStarTaq QIAGEN kullanmalısınız (ref : , konsantrasyon 5U/mL, 250 birim). Bu HotStarTaq den, (n+1) tüp kadar amplifikayson premiks ve (n +1) tüp kadar inhibisyon premiks için steril bir suda bir dilüsyon hazırlayın: o Bir tüp içine (n + n + 2) x 5 μl steril su pipetleyin. o 5 units/μl de (n + n + 2) x 0.3 μl HotStarTaq ekleyin. 5 numune için örnek: 75 μl steril suyu pipetleyin ve 4.5 μl konsantre edilmiş HotStarTaq ekleyin Amplifikasyon premiks hazırlama (R9) o (n +1)X 35 μl amplifikasyon Premix (R9) pipetleyin ve ml tüp içine dağıtın. o (n+1) x 5 μl dilüe edilmiş HotStarTaq ekleyin. n tüpünün her birine 40 μl dağıtın. 5 numuneler için örnek: 315 μl R9 pipetleyin ve 45 μl dilue edilmiş HotStarTaq ekleyin; 8 amplifikasyon premiks tüplerin her birine 40 μl dağıtın. Hazırlanan amplifikasyon premiks tüplerini yerleştirin ve buz üzerinde dilüe edilmiş HotStarTaq bırakın. Bütün tüpleri yeni konumlarına geçirmeden önce dikkatlice kapatın. Tüm hazırlanmış premiks tüpleri ve inhibisyon kontrolü premiksi için n' boş tüpleri ile birlikte dilüe edilmiş HotStarTaq ( inhibisyon kontrol tüpleri için verilmiş hacim) alın ve numune ekstraksiyonu için ayrılmış odada devam edin. Numune ekstraksiyonu için ayrılmış odada

12 11.4. Inhibisyon kontrol premiks hazırlama (R10) o (n +1)x 40 μl inhibisyon kontrol premiks (R10) pipetleyin ve ml tüp içine dağıtın. o (n +1) x 5 μl dilüe edilmiş HotStarTaq ekleyin. n tüpünün her birine 40 μl dağıtın. 5 numuneler için örnek: 210 μl R10 pipetleyin ve 30 μl dilue edilmiş HotStarTaq ekleyin; 5 inhibisyon kontrol premiks in her birine 40 μl dağıtın Numunelerin ve kontrollerin eklenmesi Oda sıcaklığına (18 C/+25 C) ekstre edilmiş örnekleri getirin ve sonra homojenize etmek için 15 saniye vorteksleyin. Eğer gerekirse: kapak içindeki damlacıklar veya düşük ekstre örnek hacmi için kısa süre santrifüjleyin. Her bir amplifikasyon çalışması için, numune ve kontrol hacimlerini aşağıdaki premikslerin her biri için ekleyin: o 1 hazırlanmış inhibisyon kontrol premiks tüpünde 10 μl ekstre edilmiş numune; o 1 hazırlanmış amplifikasyon premiks tüpünde 10 μl ekstre edilmiş numune; o 1 hazırlanmış amplifikasyon premiks tüpünde 10 μl JCV pozitif kontrol (R11); o 1 hazırlanmış amplifikasyon premiks tüpünde 10 μl BKV pozitif kontrol (R12); o 1 hazırlanmış amplifikasyon premiks tüpünde 10 μl steril su (negatif amplifikasyon kontrol için). Amplifikasyon için ayrılmış odada Termocyler içine tüpleri yerleştirin; aşağıdaki amplifikasyon programını çalıştırın. NOT: 95 C de 15 dakika denatürasyon adımı zorunludur. Bu HotStarTaq, QIAGEN DNA polimeraz aktive olur. NOT: Her tüpteki hacim 50 μl dir Amplifikasyon programı THERMOCYCLER PE 2400/ döngü 95 C 15 dakika 40 döngü 94 C 55 C 72 C 30 saniye 30 saniye 30 saniye 1 döngü 72 C 7 dak. 4 C Amplifikasyon ürünleri hemen analiz edilebilir ve analizden sonra 18 C/-22 C'de donmuş olarak saklanmalıdır. Uzun zamanlı saklamalarda (>1 ay), her amplifiye ürüne 1 μl EDTA 1M ekleyin ve -18 C/-22 C de saklayın.

13 12. Tespit protokolü Tespit kit, C Her çalışma için, aşağıdaki modele göre kuyular için gerekli sayıları seçin: o Numune (ler): Her amplifiye ürün için 2 kuyu JCV prob (R18) ile hibridize etmek için 1 kuyu BKV prob (R19) ile hibridize etmek için 1 kuyu Her ilgili inhibasyon için 1 kuyu Kontrol prob (R20) ile hibridize etmek için 1 kuyu o Kontroller: Kontrol prob (R20) ile hibridize etmek için amplifiye edilmiş JCV pozitif kontrol için 1 kuyu Kontrol prob (R20) ile hibridize etmek için amplifiye edilmiş BKV pozitif kontrol için 1 kuyu Prob (R18) ile hibridize etmek için negatif amplifikasyon kontrol JCV için 1 kuyu BKV prob (R19) ile hibridize etmek için negatif amplifikasyon kontrol için 1 kuyu Kontrol prob (R20) ile hibridize etmek için negatif amplifikasyon kontrol için 1 kuyu JCV prob (R18) ile hibridize etmek için negatif tespit kontrolü (R13) için 1 kuyu BKV prob (R19) ile hibridize etmek için negatif tespit kontrolü (R13) için 1 kuyu Kontrol prob (R20) ile hibridize etmek için negatif tespit kontrolü (R13) için 1 kuyu 5 numuneler için örnek: Mikroplaka üzerinde 23 kuyuyu planlayın: 10 amplifiye numune kuyusu 5 inhibisyon kontrol kuyusu Yukarıda anlatıldığı gibi 8 kontrol kuyusu NOT: JCV(R18) ve BKV(R19) problar ilgili negatif bir inhibisyon kontrolünün zayıf OD sonucu elde edildiğinde ekstraksiyonun miktarının anlaşılmamasını önlemek için numune ile aynı anda kullanılmalıdır. Aslında, kullanılmayan prob gözlenen inhibisyonun sorumluluğunda olmasından dolayı ikinci patojenin yüksek bir viral yükünü tespit edemez (Bkz.: bölüm 13.2 son cümle). Bir mikroplaka planı çizin. R13, cut-off değerini hesaplamak için C kitte bulunan negatif tespit kontrolüdür. Bütün kontrolleri amplifiye ürünlerle aynı işleme tabi tutun Denatürasyon ve kaplama Post-amplifikasyon için ayrılmış odada Aşağıdakiler için bir ml numaralanmış polipropilen tüpleri hazırlayın: - her klinik örnek, - ilgili inhibasyon kontrol, - JCV pozitif kontrol, - BKV pozitif kontrol. Aşağıdakiler için iki ml numaralanmış polipropilen tüpleri hazırlayın: - negatif tespit kontrol (R13) - negatif amplifikasyon kontrol (H2O) 5 numuneler için örnek: Denatürasyon adımı için 16 tüp planlayın. Her numaralanmış polipropilen tüplere 5 μl amplifiye edilmiş ürünü dağıtın.

14 10 μl denatürasyon solüsyonu 1 (R14) ekleyin ve vorteksleyin. 10 μl denatürasyon solüsyonu 2 (R15) ekleyin, vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Her tüpe 200 μl kaplama solüsyonu (R16) ekleyin ve vorteksleyin. UYARI: Sonuçları kolay yorumlamak için mikroplaka kuyuları (R17) dikkatlice tanımlayın. 100 μl dağıtın: o Her numune için 2 kuyuda; o inhibisyon kontrol premiksli her amplifiye örnek için 1 kuyuda; o JCV pozitif kontrol için 1 kuyuda; o BKV pozitif kontrol için 1 kuyuda; o Negatif amplifikasyon kontrol için 3 kuyuda; o Negatif tespit kontrol (R13) için 3 kuyuda. Bir yapışkan (R26) ile plakayı kapatın ve 15 dakika boyunca 37 C'de inkübe edin (Alternatif inkübasyon: oda sıcaklığında bir gece). Kullanıma hazır probları (R18, R19 ve R20) +37 C de (kullanım öncesi 15 dakika) ısıtın Hibridizasyon Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve kağıt bir havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun. JCV probun (R18) (kırmızı) kuyu başına 100 μl sini dağıtın: o iki numune kuyusunun biri içinde; o üç negatif amplifikasyon kontrol kuyularından biri içinde; o üç negatif tespit kontrol kuyularından biri içinde. BKV probun (R19) (kırmızı) kuyu başına 100 μl sini dağıtın: o her inhibisyon kontrol kuyusu içinde; o ikinci negatif amplifikasyon kontrol kuyusunda; o ikinci negatif tespit kontrol kuyusunda. Kontrol probun (R20) (mavi) kuyu başına 100 μl sini dağıtın: o İnhibasyon kontrol premiks ile amplifiye örneğe karşılık gelen her bir kuyu içinde; o JCV pozitif kontrol kuyusunda; o BKV pozitif kontrol kuyusunda; o üçüncü negatif tespit kontrol kuyusunda; o üçüncü negatif amplifikasyon kontrol kuyusunda. Bir yapışkan (R26) ile plakayı kapatın ve 30 dakika boyunca 37 C'de inkübe edin. Hibridizasyon adımı sona ermeden önce: o Bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon da açıklandığı gibi 10x yıkama solüsyonu (R21) çözündürün; o +18 C/+25 C oda sıcaklığında ısınması için Konjugat dilüsyon tamponu (R22) bekletin. Bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon da açıklandığı gibi konjugat dilüsyonunda konjugatı 50x (R23) dilüe edin Post hibridizasyon yıkama Bir mikroplaka yıkayıcı veya manuel olarak yıkama ile plakayı yıkayın. o Oto yıkama için: a. Başlamadan önce 500 μl bir purjeyi gerçekleştirin; b. Kuyuların içeriğini aspirte edin; c. 1x yıkama solüsyonun 350 μl si ile kuyuları doldurun. 30 saniye bekletin ve kuruluğu aspirte edin (tamamen aspirasyon için kontrol edin); d. "c. " adımı 4 kere ek olarak tekrar edin;

15 e. Kalıntı yıkama solüsyonu ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerinde plakaya hafifçe vurun. o Manuel yıkama için: a. Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve kağıt bir havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun; b.1x yıkama solüsyonun 350 μl si ile kuyulara dağıtın. 30 saniye bekletin. Devirerek kuyuları boşaltın ve kağıt havlu üzerine kuruluğu alın; c. 4 kere ek olarak adımı tekrar edin Tespit ve post-tespit yıkama Post-hibridizasyon yıkama adımı sonunda, plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve bir kağıt havlu üzerine kurutma kağıdı ile kurutun. Tekrarlayıcı pipet veya diğer uygun pipet cihazı kullanarak 100 μl kullanıma hazır konjugatı ekleyin; Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin (+18 C/+25 C). Bölüm"12.3" deki açıklamaya göre yıkayın Görüntüleme Substrate (R24) oda sıcaklığına getirin. Plakayı baş aşağı döndürerek kuyuları boşaltın ve bir kağıt havlu üzerinde kurutma kağıdı ile kurutun. Her kuyu içine substratın 100 μl sini dağıtın; Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin; Her kuyuya stop solüsyonun (R25) 100 μl sini ekleyerek reaksiyonu durdurun. Blanki boş okutun ve 450 nm de optikal yoğunluğu okuyun. Çift okumada yapılabilir(450/650 nm). 13. Sonuçların yorumlanması ve hesaplanması 13.1 Testin doğrulanması ve cut-off değerinin tespiti Eğer üç ilgili kuyunun her biri için negatif tespit kontroller (R13) (JCV prob (R18), BKV prob (R19) ve kontrol prob (R20) ile hibridize edilen) ile edilen OD değeri 0.4 ü aşmamışsa, test de doğrulanabilir. Cut-off tespiti (CO): o Cut-off değeri (CO) negatif tespit kontrol değerlerinin ortalamasından hesaplanır. Hesaplama: o Eğer OD okuma 450 nm de yapılırsa, CO = OD ortalama o Eğer OD okuma 450/650 nm de yapılırsa, CO = OD ortalama Kontaminasyon kontrol: negatif amplifikasyon kontrol (H2O) ile elde edilen absorbans değeri cutoff değeri altında olmalıdır. Amplifikasyon kontrol: pozitif amplifikasyon kontrollerinden elde edilen absorbans değeri cut-off değeri üzerinde olmalıdır. UYARI: Eğer bu şartların biri yerine getirilmezse, test GEÇERLİ DEĞİL olarak kabul edilir ve test tekrar edilmelidir. Örneklerin ve inhibisyon kontrollerin absorbans değerini analiz edin Sonuçların Yorumlanması Test GEÇERLİ olarak kabul edildikten sonra, sonuçların yorumlarını gerçekleştirin. Yorum aşağıdaki gibi yapılır: o Eğer OD numune > CO + 10% ise; Amplifikasyon JCV yada BKV için pozitiftir.

16 o Eğer OD numune < CO - 10% ise; Amplifikasyon JCV yada BKV için negatiftir. o Eğer OD numune = CO ± 10%; Amplifikasyon belirlenemez ve amplifiye edilen ürün tekrar test edilmelidir. Belirlenemeyen amplifiye edilmiş ürünlerin tekrar test edilmesinden sonra: o Eğer OD numune > CO + 10% ise; Amplifikasyon JCV yada BKV için pozitiftir. o Eğer OD numune < CO - 10%A ise; Amplifikasyon herpesvirus JCV yada BKV için negatiftir. o Eğer OD numune = CO ± 10%; Yeni bir numune elde edin ve tekrar test edin. Eğer yeni numune ile elde edilen OD değeri CO 10% ise, numune JCV ya da BKV için pozitif olarak belirlenir. Son olarak negatif sonuçları doğrulamadan önce, ilgili inhibisyon kontrolü ile bu sonuçları doğrulamak gereklidir: o Eğer inhibisyon kontrol > 0.8 OD ise, numune inhibitör maddeleri içermez ve JCV yada BKV problu sonuç negatif onaylanır. o Eğer inhibisyon kontrol < 0.8 OD yada negatif ve numune sonucu JCV ve BKV için negatif ise, numune muhtemelen inhibitör maddeleri içerir. Sonuç yorumlanmaz. Numune tekrar ekstre edilmelidir ve amplifikasyon reaksiyonu tekrarlanmalıdır. o Numune JCV veya BKV için pozitif iken inhibisayon kontrolün OD değeri negatif ise, numune pozitif olarak kabul edilmelidir. Kuvvetli bir viral pozitif yükleme plazmid amplifikasyonu için bir rakip gibi davranabilir ve inhibisyon kontrolünün zayıf ya da negatif sonucuna neden olur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılan DNA amplifikasyonu için yöntemler Hoffman- La Roche için yayınlanan ABD patent N ve tarafından karşılanmaktadır. Ne ARGENE den herhangi bir ürün ne de bu yayında her şeyi satın almak bu yöntemleri kullanma yetkisi olarak yorumlanmamalıdır. QIAamp, ARGENE lisansıyla QIAGEN GmbH, Hilden, Almanya nın tescilli markasıdır. QIAGEN bileşenleri QIAGEN GmbH, Hilden, Almanya tarafından üretilmiş ve geliştirilmiştir. 14. Testin performansı NOT: JC/BK CONSENSUS kit performansı DNA EXTRACTION KIT (Ref. : ) yada QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ref.:51104 yada ref.: 51106) ile kombinasyon halinde sadece doğrulanmış olabilir klinik örneklerde retrospektif çalışmada elde edilen sonuçlar Çalışma CHU Robert DEBRE de Reims (Fransa) viroloji laboratuarında yapıldı. İn-house multipleks PCR ile daha önce karakterize edilen 231 klinik örneğin (idrar, kan ve CSF) toplamı 2001 boyunca -80 C de muhafaza edildi, sonra JC/BK CONSENSUS kit ile analiz edildi. In-house multipleks PCR için aşağıdaki sırayı izleyin: DNA izolasyonu, poliomavirus PCR için Qiagen DNA Mini Blood, sonra güçlendirilmiş ürünler HYBRIDOWELL kit (Argene ref. : ) ile microtiter plakada tespit edildi. 231 örnek arasında, % 47 si (109) in-house PCR ile JCV ve/veya BKV için pozitiftir. Sonuçlar aşağıdaki tablolarda gösterilir: 128 idrar örneği In-house PCR + - JC/BK CONSENSUS İdrar örneğinde, Hassasiyet: 96.7% ; Özgüllüğü: 75.6%

17 51 kan örneği In-house PCR + - JC/BK CONSENSUS Kan örneğinde, Hassasiyet: 100% ; Özgüllüğü: 95% 52 CSF örnek In-house PCR + - JC/BK CONSENSUS CSF örnekte, Hassasiyet: 87.5% ; Özgüllüğü: 93.2% TOPLAM: 231 klinik örnek In-house PCR + - JC/BK CONSENSUS Hassasiyet: 96% Özgüllüğü: 88.5% JC/BK CONSENSUS PCR sonuçları, JC/BK consensus kitinde daha iyi bir hassasiyet gösteren örneklerin farklı türlerinden elde edilen referans PCR sonuçları ile 91% uyumludur Retrospektif çalışmanın sonuçları Çalışma CHU Robert DEBRE de Reims (Fransa) viroloji laboratuarında yapıldı. Test edilen örnekler HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV (NAMALWA cells), Adenovirus, Enterovirus Coxsackie A9, ve HIV1 enfekte hücre kültürü ekstraklarıdır. Test edilen tüm patojen ajanları JCV ve BKV probları ile negatif bulundu. Bu sonuçlar JC/BK CONSENSUS test değerlendirilmesine özgüdür. 15. Arıza Giderme Zayıf tepki ya da tepkisiz OLASI NEDENLER ÖNERİLER Ekstraksiyon prosedürü. Eğer kan örnekleri EDTA tüpünde toplanmışsa, kontrol edin. Eğer inhibisyon kontrolü negatif ise, plazma ve serum için 100 μl ek elüsyon hacmi ile tekrar ekstraksiyon yapın ve inhibisyon kontrol sonucunu kontrol edin. Yıkama adım prosedüründe önerilen ek santrifüj gerçekleştirin. Hem JCV hem de BKV probları ile elde edilen sonuçları tekrar edin. Eğer ekstraksiyon prosedürü bu data kağıdında ekstraksiyon protokolüne uygunsa kontrol edin. Eğer ekstraksiyon yöntemleri BC kiti ile

18 doğrulanmış olanlara karşılık gelirse, kontrol edin. Ampilifikasyon prosedürü Pozitif kontrol sonucunu kontrol edin. Eğer zayıf ya da negatifse, amplifikasyon programını kontrol edin. Üretici tarafından önerildiği gibi termocycler ın performansını kontrol edin. Denatürasyon prosedürü Uygun prosedür: -Denatürasyon 1, vorteks, -Denatürasyon 2, vorteks, -5 dakika inkübasyon. Hibridizasyon sıcaklığı yetersizdir. Hibridizasyon süresince sıcaklığı kontrol edin. Konjugat konsantrasyonu çok düşüktür. Konjugat dilüsyonunu kontrol edin Yüksek arka plan OLASI NEDENLER ÖNERİLER Yıkama prosedürü. Post-hibridizasyon ve post-tespit yıkama prosedürünü, sayısını ve zamanını izleyin. Konjugat konsantrasyonu çok yüksektir. Konjugat dilüsyonu kontrol edin. Konjugat çökeltisi sırasında sorun. Konjugat kuyu üstüne değil kuyu altına pipetlenmelidir. Konjugatın inkübasyon sıcaklığı çok yüksektir. Oda sıcaklığını kontrol edin (+18 C/+25 C).

19 16. Referanslar (1) Moret H., Guichard M., Matheron S., Katlama C., Sazdovitch V., Huraux JM. et Ingrand D. Virological diagnosis of progressive multifocal leukoencephalopathy : detection of JC virus DNA incerebrospinal fluid and brain tissue of AIDS patients. J.Clin.Microbiol Dec ;31 (12) : (2) Lescieux A., Andreoletti L., Dewilde A., Hober D. and Wattre P. Rapid detection of JCV-DNA in peripheral blood leucocytes and PBMCs from HIV-infected patients without PML. Inaugural Meeting of the European Society for Clinical Virology, Progress in Clinical Virology September 10, 1997 Bologna, Italy.