SAGE ve PROTEOMİK. Ayşen Günel-Özcan Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı

Transkript

1 SAGE ve PROTEOMİK Ayşen Günel-Özcan Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı 1

2 Takifugu rubripes (400 Mb) Homo sapiens (3000 Mb) 2

3 Replikasyon DNA Transkripsiyon Metilasyon Kromatin yapısı Epigenetik mekanizmalar RNA gen International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Nature. 431: Aktive olmuş bir hücre mrna molekülü içerir Çoğunlukla 5000 tip mesaj oluşur: 100 ü fazla miktarda (%90) 4900 ü ise hücrenin protein kütlesinin %10 unundan sorumlu 3

4 Gen ekspresyonunun düzenlenmesi Replikasyon Transkripsiyon Translasyon DNA RNA Protein Metilasyon Kromatin yapısı Epigenetik mekanizmalar Alternatif kırpılma Poliadenilasyon mrna maturasyonu/editing Sitoplazmaya geçiş mrna stabilitesi Çevrim düzenlenmeleri Çevrim sonrası değişikler Kararlılık/yıkım Protein-protein etkileşimleri Transport Aktivasyon/inaktivasyon değişik polipeptid 4

5 Global Gen Ekspresyon Profillerinin incelenmesine yönelik teknikler (Ahmed F, 2002.J. Environ. Sci & Health, c20:2;77-116) cdna çıkarımı (substraktif hibridizasyon) mrna diferansiyel display Mikroarray ler SAGE (gen ekspresyonlarının seri analizi) 5

6 SAGE (Velselescu ve ark., 1995) Genel Prensipleri: 1) transkriptlerin belirlenmesi için yeterli özgün bilgiyi taşıyan tanımlayıcı cdna bölgelerinden kısa etiketleyici diziler (10 bp) elde etmek 2) transkripsiyonun yeterli dizi analizini sağlamak üzere bu etiketlerin zincir haline getirilmesi. 6

7 mrna dan biotin ile işaretli oligodt primerleri ile cdna eldesi NlaIII kesimi ve 3 uçlarının paramanyetik streptavidin boncukları ile izolasyonu GTAC AAAAAA TT TTT T AAAAAA TT TTT T AAAAAA TT TTT T İkiye bölünmesi ve Linker (adaptör) bağlanması S-A CATG AAAAAA TT TTT T S-B CATG MmeI/BsmF1/Fok1 ile kesim ve ligasyon TCCRAC CATGXXXXXXXXXX CATGGTYGGA S-A AGGYTGGTACXXXXXXXXXX GTACCARCCT S-B 2 bp yapışkan uç ditag PCR amplifikasyonu S-A S-B AAAAAA TT TTT T Özgün ditag dizilerini NlaeIII ile kesilerek adaptörden serbestleştirilir, jelden saflaştırırılır, zincir oluşturmak üzere birleştirilir. Daha sonra vektöre klonlanarak dizi analizi yapılır. Oluşan zincirler ve Vektöre klonlanma CATG CATG CATG GTAC GTAC GTAC 7

8 8

9 Malign ve normal insan dokularına ait SAGE kullanılarak elde edilen gen ekspresyon verilerine adresinden ulaşılabilir 9

10 SAGE in avantaj ve dezavantajları Yeni gen saptayabilir Kantitasyon yapabilir Duyarlılığı yüksek Altyapı maliyeti düşük Laboratuvar teknikleri nispeten zor Çok sayıda örneğe uygulanması ekonomik değil 10

11 Bazı kanser türlerinde SAGE analizi ile normallerden farklı olarak ekspresyonu saptanan genler Kanser tipi Doku kaynağı Transkripsiyon A.C. adenokarsinomu A.C. Epitel hücresi küçük havayolu-ilişkili veya immünite ile ilgili proteinler p21 Pankreatik adenokarsinom Pankreatik duktal hücreler Mezotelin Prostat kök hücre antijeni Mesane karsinomu, özofagagal veya gastrik tm. Primer tümör prostat kök hücre antijeni Hepatoselüler karsinom Hepatosit IFN- ile ve oksidatif stres ile indüklenebilen genler Prostat kanseri Epitel hücre ve stroma E2F4 (epitel hücrelerinde) Daxx (stromada) Over kanseri Primer tm, kanser hücre hattı ApoE, ApoJ 11

12 Proteom bir organizma veya dokunun genomu tarafından belli koşullarda ifade edilen proteinlerin tümü Protein+Genom= Proteom Proteomik =Proteom Analizi Değişik koşullarda eksprese edilen proteinlerin İdentifikasyonunu Yapısal özelliklerinin tanımlanmasını Fonksiyonlarının aydınlatılmasını kapsar 12

13 Protein Tanımlanması (İdentifikasyonu) Rekombinant proteinler ile koelektroforez ile direk olarak belirlenebilir (homolog protein ile göç) Membrana blotlama sonrası immun boyama Aminoasit dizi analizi (Edman degradasyonu ve HPLC) Kütle spektrofotometrik yaklaşımlar(maldi- MS, ESI-MS/MS, SELDI-MS) 13

14 P.Jungblut(2002) Proteom Analizi Biyokimya Lisansüstü yaz okulu.çanakkale 14

15 P.Jungblut(2002) Proteom Analizi Biyokimya Lisansüstü yaz okulu.çanakkale 15

16 Genetik veya Biyokimya bilim dallarının genomu fonksiyonel olarak çalışma şeması DNA İzolasyonu ve klonlama Dizi Analizi Mutasyon analizi Gen ekspresyonu Protein identifikasyonu Yapısının incelenmesi (X-Ray Crystalography) Fonksiyonunun incelenmesi Protein saflaştırılması 16

17 17

18 18

19 IEF İzoelektrik noktada proteinlerin yükü yoktur ve elektrik alanda daha fazla ilerlemez 19

20 SDS-PAGE 20

21 SDS-PAGE boyama teknikleri ve protein görüntüleme alt-limitleri Gümüş ng SYPRO ruby ng Coomasie g» Berggren ve ark. (2000) Electrophoresis 21:

22 Tek boyutlu Protein Elektroforezi 22

23 İki Boyutlu Protein Elektroforezi (2-DE) 23

24 24

25 2-DE Analiz Program Paketleri Delta2D MelanieIII PDQuest Phoretix Proteomweaver TopSpot Z3 25

26 2-DE JELLERİN VERİ TABANLARI ExPasy ( 26

27 MALDI için örnek hazırlanması Jel den bant kesilir Jel parçalarının triptik kesimi yapılır Üst sıvı yeni bir tüpe alınır Ve plakalara aktarılır 27

28 MALDI MS (Matrix assisted Laser Desorption Ionisation) Katı bir matriks üzerine konulan spotlar LAZER ile iyonize edilir. LAZER in ateşleme zamanı ve iyonların detektöre varış zamanını saptayabilen sistem(tof) ile relatif kütle saptanabilmekte. Sadece tek iyon yüküne sahip iyonlar oluşturabilmekte. 500 Da Da (5aa-2000 aa) arasındaki polipeptidlerin analizini sağlayabiliyor. 28

29 MALDI İÇ YAPISI Hedef matriks Reflektör Laser yolu Detektör İyon yolu 29

30 Peptid Parmak İzinin Veri-tabanlarında araştırılması Belli bir proteolitik enzim ile veritabanındaki tüm proteinlerin teorik kesimi yapılır Teorik kesimler deneysel veriler ile karşılaştırılır Peptid/protein uygunlukları istatistiksel olarak değerlendirilir 30

31 Protein Tanımlama Araçları Prot-ID PepMAPPER wolf.bms.umist.ac.uk/mapper/ Mascot tml PepSea /PepSeaIntro.html Peptide Search GroupPages/PageLink/peptidesearchpage.html ProteinProspector prospector.ucsf.edu/ PROWL prowl.rockefeller.edu/ 31

32 Jel Triptik kesim MALDI (Matrix assisted Laser Desorption Ionisation) Peptid Kütle Parmak izi Protein tanımlanamadı Protein tanımlandı Örnek daha ileri işlemlere tabi tutulur MS/MS Peptid fragmentasyonu 32

33 Tandem MS (MS/MS) Peptid sekansını saptayabilmek için arka arkaya iki kütle spektrofotometrisi yapılmalıdır. Buna Tandem MS de denilmekte. Birincisi proteini triptik kesimden sonra ayırır. Bu peptidler daha sonra yüksek enerjili gas atomları ile ileri bir fragmantasyona uğrar. Bu fragmentasyon metodu peptid bağlarını yıkarak herbiri tek bir aminoasid farklılık gösteren merdiven oluşturur. Daha sonra ikinci kütle spektrofotometresi bu fragmanları ayırır. 33

34 MS/MS Analizleri Nanosprey/elektrosprey kütle spektrofotometresi ile gerçekleştirilir (ESI-MS). Örnek, katı bir yüzeye spot halinde uygulama yerine cihaz için kapiller aracılığı ile sıvı halinde uygulanır. Bu analizle tanımlanan peptid fragmanlarının kesimi cihazın içinde gerçekleşir. Oluşan iyonlar MALDI den farklı olarak farklı iyon yükleri içermektedir. Proteinlerin gerçek zamanlı saptanmasını ve dizi analizini sağlar 34

35 MALDI-MS ESI-MS/MS 35

36 SELDI-MS (SELDI:Surfaceenhanced laser desorption-ionization) Yüzeyin özgün proteinlere karşı ilgisini artırma esasına dayanır Array sisteminin bir parçası (çipler veya özgün prob yüzeyleri kullanılır) Proteinlerin metal ilgisi, Ak veya recep.lere bağlanma özelliklerinden faydalanılır SELDI-MS teknolojisi örneğin herhangi bir işlemden geçmeden direk kaynağından protein profillerinin elde edilmesini sağlar Mikrodiseksiyon ile elde edilen örnekleri incelemek için çok uygun Farklı programlar farklı analizlere yol açabilir 36

37 2-DE ve MS ile biyobelirteç olarak ön plana çıkmış bazı proteinler Düşük dereceli diferansiye mesane tümörlerinde (Osteogard ve ark,1997) Sitokeratinler, Psoriasin, Galektin 7,Stratifin Kolorektal karsinomalı ve ülseratif kolitli hastaların displastik poliplerinde (Jungblut, 1999) Calgranulin B Primer AC karsinomasında (Hirano ve ark, 1997) TAO1 ve TAO2(napsin) Over tümörlerinde (Alaiya ve ark, 1997) PCNA, OP18, phsp90, kalretikulin Renal hücre karsinomada (Sarto ve ark, 1997) Ubikuinol sitokrom C reduktaz 37

38 MS İLE PROTEOM ANALİZİ veya SAGE ANALİZİ in tek başına kullanımı önümüze uzun bir protein listesi çıkarmaktadır. Bu nedenle, tümör ilişkili Ak hedeflerini bulmak için etkin bir yol değildir. Bu amaçla, western blotlama+genomik profilleme+ms birleştirildiği proteo-genomik bir metod geliştirilmiştir (Huang ve ark, 2004) 38

39 Ab SCAN (Antibody Based Systematic Characterization of Hasta serumu Western blot Antigens) Huang ve ark., Clinical Immunology 2004 Hasta ile ilgili reaktifler görüntülenir ve bu reaktiflerin moleküler ağırlıkları saptanır. İnsan tümör hücre hattı (lizatlarını SDS-PAGE de yürüt) SAGE analizi ile hücrelerin gen ekspresyon profilleri saptanır. Western blot yapılan jele eşdeğer PAGE jelinden ilgili bantlar çıkarılır Proteinler tripsin ile kesilip, triptik peptidlerin kütleleri MALDI-TOF kütle spektroskopik analizi yapılır SAGE ile tahmin edilebilen ekspresyon profili MALDI- TOF MS protein listesi ile karşılaştırılır 39

40 Klinikte Proteomik OvaCheck over kanseri tarama testi Validasyonu henüz tamamlanmamıştır OncotypeDX tamoksifen ile tedavi olmuş nod-negatif ve hormon resppozitif meme kanserli olgularda rekürrens olasılığına karşı geliştirilmiş Validasyonu üç klinik denemeden geçerek 668 örnekte uygulanarak yapılmıştır 40

41 41

42 42

43 Fizyoloji Hücre Biyolojisi Transkriptom Proteom Genetik Biyokimya 43

44 44

45 45

46 46

47 Protein Score Probabilit y Description P OSTC_BOVIN Osteocalcin precursor 47