Amino Acid Biological Fluids LC-MS/MS Analysis Kit (Plasma & Serum & Urine & Cerebrospinal Fluid)

Transkript

1 Amino Acid Biological Fluids LCMS/MS Analysis Kit (Plasma & Serum & Urine & Cerebrospinal Fluid) ZV C User Manual

2 Table Of Contents Page 1. INTENDED USE: SUMMARY AND EXPLANATION: TEST PRINCIPLE: WARNING AND PRECAUTIONS: STORAGE AND STABILITY: MATERIALS SUPPLIED: MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED: PROCEDURE NOTES: LIMITATIONS OF THE PROCEDURE: PRETEST SETUP INSTRUCTIONS: PRETEST SETUP INSTRUCTIONS:... 9 Sample Pretreatment (Automated):... 9 Sample Pretreatment (Manual):... 9 Sample Pretreatment (Automated) for Homocysteine, Cysteine Sample Pretreatment (Manual) for Homocysteine, Cysteine QUALITY CONTROL: CALCULATION OF RESULTS: INTERPRETATION OF RESULTS: EXPECTED VALUES: LCMS/MS PARAMETERS: MS SCAN PARAMETERS: ANALYTICAL PERFORMANCE SAMPLE CHROMATOGRAM: AUTOMATED SAMPLE PREPARATION METHOD PARAMETERS FOR ZİVAK MULTITASKER

3 1. INTENDED USE: Quantitative LCMS/MS analysis kit for Amino Acids in biological fluids (Plasma & Serum & Urine & Cerebrospinal Fluid). 2. SUMMARY AND EXPLANATION: Amino acids are the basic structural units of the proteins. Quantitative analysis of the amino acids in biological fluids is one of the most important parts of the clinical diagnosis of patients with inborn errors of amino acid metabolism or monitoring the healthy people. Amino acid analysis in urine is important for diagnosis of disorders which are related with renal amino acid transport. Quantitative analysis of amino acids in plasma is preferred over urine for the diagnosis of aminoacidopathies which cause to accumulation or the deficiency of amino acids in biological fluids. Quantitative analysis of the amino acids in biological fluids also has clinical importance for determining some neurological and endocrinal disorders. LCMS/MS is an influential device for the study of disorders related with amino acids. LCMS/MS analysis gives results for 47 free amino acids in 20 minutes. Zivak Quantitative Free Amino Acids LCMS/MS Analysis Kit was developed for quantitative detection of free amino acids in human serum, plasma, urine and cerebrospinal fluid LCMS/MS is an influential device for the study of metabolic disorders and LCMS/MS analysis gives results in 20 minutes with minimal sample preparation. Main methods and procedures that have been selected are based on EN ISO and 98/79/EC. 3. TEST PRINCIPLE: Free amino acids are extracted from human samples by using an acidic extraction and deproteinization steps. After the extraction, these amino acids derivatised via reagents. Then derivatisated amino acids are separated on a reversed phase HPLC column with a gradient elution and analysed by Tandem Mass spectrometry. 4. WARNING AND PRECAUTIONS: For invitro diagnostic use only. For professional use only. 3

4 Read the instructions carefully, before you start. In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier. Do not use expired kits and components. Please check the batch no and expiry date before start. Protective gloves and goggles should be worn. Please take any necessary precautions to prevent infection with pathogens while working with biological fluids. Appropriate biosafety precautions and disposal of biohazardous wastes should be followed. Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous material may cause eye and skin irritations. It s recommended to work in a fume hood for your safety as Reagent 2, 3 and 4 are volatile and please avoid inhaling. 5. STORAGE AND STABILITY: This analysis kit can be shipped at room temperature. After arrival, standards and controls should be stored at 28 C. Reagent 1, 2,3,4 should be stored at 28 C. All other components of the kit should be stored at between room temp. Reagent 2, 3 and 4 are volatile, please make sure that the lids of reagent bottles are closed tightly after use. All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended temperatures and used as described in these instructions. 4

5 6. MATERIALS SUPPLIED: Order No. Volume Symbol Component ZV300202R110 1 x 30 ml R1 Reagent 1, Contains deuterated internal standards ZV300202R210 1 x 50 ml R2 Reagent 2, Contains base ZV300202R310 1x 50 ml R3 Reagent 3, Contains derivatisation reagent ZV300202R410 1 x 50 ml R4 Reagent 4, Contains organic modifier ZV300202RH10 1 x 30 ml RH Reagent H, Protective Reagent for HCYS ZV300202MA10 1 x 1 L MA Mobile Phase A, Contains organic solvent ZV300202MB10 1 x 1 L MB Mobile Phase B, Contains organic solvent ZV300202WB10 1 x 1 L WB Washing solution, Contains organic solvent ZS2ML x100pcs 2 ml glass autosampler vial for automated Sample Preparation ZS x100pcs 2 ml glass autosampler vial caps preslit for automated Sample Preparation KK ZV3002KK10 1x1 pc User Guide 5

6 7. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED: Calibrator Level 1 ZV300202S110 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Calibrator Level1 Calibrator Level 2 ZV300202S210 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Calibrator Level2 Calibrator Level 3 ZV300202S310 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Calibrator Level3 Control Level 1 ZV300202K110 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Control Level 1 Control Level 2 ZV300202K210 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Control Level 2 Control Level 3 ZV300202K210 1 x 3 ml Lyophilized Plasma Control Level 3 ZV300202SGS110 1 x 3 ml Calibrator SGLevel 1 Sulfur Group Lyophilized Plasma Calibrator Level 1 ZV300202SGS210 1 x 3 ml Calibrator SGLevel 2 Sulfur Group Lyophilized Plasma Calibrator Level 2 ZV300202SGK110 1 x 3 ml Control SGLevel 1 Sulfur Group Lyophilized Plasma Control Level 1 Zivak Amino Acid Biological Fluids LCMS/MS Analytical Column µl pipette Pipette tips 2.0 ml glass sample preparation tube (for Manual Sample Preparation) Vortex mixer Centrifuge Bidistilled or deionised water 0.5 ml conical autosampler vial or vial insert (for Manual Sample Preparation) 6

7 8. PROCEDURE NOTES: Any inappropriate handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Leave aside all reagents and specimens to reach room temperature (1825 C) and gently swirl each vial of liquid reagent and sample before use. Mix reagents without foaming. Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps. Always keep vials closed when not been used. Do not reuse wells/tubes or reagents. Incubation time affects results. All tubes or wells should be handled in the same order and time sequences. 9. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE: Specimen collection and storage have a significant effect on the test results. Plasma samples from earlier days must be kept frozen before the analysis. If the urine sample is not clear, it must be centrifuged before sample preparation. 10. PRETEST SETUP INSTRUCTIONS: Setup the Instrument: Purge the HPLC pumps with a high flow rate of mobile phase(s). This should be done by pumping the mobile phase(s) through the system for 2 minutes at a flow rate of 4.0 ml/min. Switch off the pump and connect the column in flow direction. Activate the method and allow mobile phase(s) to flow through the column for 15 minutes. Make sure the bottle of mobile phase bottle is closed well, otherwise components of the mobile phase could evaporate; this alters the retention times. 7

8 Preparation of Zivak Calibrators: Add 3 ml of deionised water to lyophilised plasma calibrators and controls and dissolve. After reconstitution, plasma calibrator must be aliquoted into 150 µl volumes and stored at 20 C. Preparation of Zivak lyophilized Sulfur Group Calibrators & Control Add 3 ml of deionised water to lyophilised plasma calibrators and control and dissolve. After reconstitution, plasma calibrator must be aliquoted into 150 µl volumes and stored at 20 C. Note: Please use zivak lyophilized sulfur group calibrators, control for Homocysteine, cysteine, cystine, homocystine. Zivak lyophilized sulfur group calibrators contain homocysteine, cysteine, cystine, homocystine. Use zivak lyophilized plasma calibrators, controls for other 43 aminoacids. ReagentH for only homocysteine, cysteine. Don t use ReagentH if analysis cystine, homocystine and other 43 aminoacids. ReagentH is protective reagent for Cysteine, Homocysteine. Please make sure it is completely resolution before using, if there are particules please resolution. 8

9 11. PRETEST SETUP INSTRUCTIONS: Sample Pretreatment (Automated): Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the Zivak Multitasker Sample Preparation vials Make sure that reagents and wash solution are connected to the reagent pump and purged properly. Place the vials on the MULTITASKER system tray. Note: The prepared sample is stable at 28 C for 24 hours. Sample Pretreatment (Manual): Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube. Add 100 L of Reagent 1 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 2 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 3 and vortex for 10 seconds. Wait for 2 minutes and vortex again for 10 seconds. Wait for 1 minute. Add 200 L of Reagent 4 and vortex for 10 seconds. After mixing wait for a minute. Centrifuge at x rpm for 3 minutes. Take 100 L the upper phase into the autosampler vial. Inject 3 L to the LCMS/MS system. Note: The prepared sample is stable at 28 C for 24 hours. 9

10 Sample Pretreatment (Automated) for Homocysteine, Cysteine Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the Zivak Multitasker Sample Preparation vials Make sure that reagents and wash solution are connected to the reagent pump and purged properly. Place the vials on the MULTITASKER system tray. (Please use Aminoacids HCYS automated method) Note: The prepared sample is stable at 28 C for 24 hours. Sample Pretreatment (Manual) for Homocysteine, Cysteine Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube. Add 100 L of Reagent H and vortex for 10 seconds. Wait for 1 minute and vortex again for 10 seconds. Add 100 L of Reagent 1 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 2 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 3 and vortex for 10 seconds. Wait for 2 minutes and vortex again for 10 seconds. Wait for 1 minute. Add 200 L of Reagent 4 and vortex for 10 seconds. After mixing wait for a minute. Centrifuge at x rpm for 3 minutes. Take 100 L the upper phase into the autosampler vial. Inject 3 L to the LCMS/MS system. Note: The prepared sample is stable at 28 C for 24 hours. 10

11 12. QUALITY CONTROL: The test results are only valid if the test has been performed by following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the QC (Quality Control) Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation, the following technical issues should be proven: Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 13. CALCULATION OF RESULTS: The obtained area of the standard is plotted against their concentration. The standard curve is calculated by a linear regression or a weighted linear regression function. Using computer programs, the curve is best described by a 2point linear regression fit with linear axes. For the calculation of the regression curve, apply each signal of the standards (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read directly from the regression function. Sample signals above the highest standard have to be confirmed by a reference method. (Peak Area of Sample) x (Peak area of IS in Calibrator (Peak area of Calibrator) x (Peak area of IS in the Sample) X Concentration of Calibrator = Concentration of the Sample *IS: Internal Standard 11

12 14. INTERPRETATION OF RESULTS: Various societies recommend different CutOff values for repetition of the measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the application of patient samples from different populations, it is highly recommended that each laboratory establishes its own range of normal values and that this distribution of values is coordinated with the recommendations of the responsible society of this geographic region. The results themselves should not be the only reason for any therapeutic consequences. They have to be correlated to other clinical observations and diagnostic tests. 12

13 15. EXPECTED VALUES: Referance: It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values. 13

14 16. LCMS/MS PARAMETERS: Device Column Zivak Tandem Gold LCMS/MS System Zivak Amino Acid Biological Fluids LCMS/MS Analytical Column Injection Volume 3 µl Pump Program Flow 00:00 min 35 % B 14:00 min 55 % B 15:00 min 95 % B 16:30 min 95 % B 16:31 min 35 % B 20:00 min 35 % B 0.25 ml/min Ionization Mode CID Gas API Nebulizing Gas Scan Time SIM Width Drying Gas ESI positive+negative 2.4 mtorr 55 psi 2,62 sec 1.5 amu 35 psi Drying Gas Temp. 350 C Needle Shield Capillary Detector Column Oven 5000V 600V 50V 1500 V 25C 14

15 17. MS SCAN PARAMETERS: No Analyte 15 MH+ (m/z) MS/ MS Capill ary (ev) CE (ev) IS To Use 1 3methylhistidine (3MeHIS) (+) V 20V HISIS 2 5HydroxyLtryptophan (+)349, V TRPIS 3 Alanine (ALA) (+) V 10V ALAIS 4 Alphaaminoadipic acid (AAA) (+) V 15V PHEIS 5 Alphaaminobutyric acid (ABA) (+) V 15V ALA IS 6 Alphaaminopimelic acid (APA) (+) V 15V ALA IS 7 Anserine (+) V 20V TYR IS 8 Arginine (+) V 20V ARG IS 9 Asparagine (ASN) (+) V 15V ASN IS 10 Aspartic Acid (ASP) (+) V 15V ASP IS 11 Beta alanine (BALA) (+) V 15V ALAIS 12 Betaaminoisobutyric Acid (BAIB) (+) V 10V METIS 13 Carnosine (CAR) (+) V METIS 14 Citrulline (CIT) (+) V 15V ARG IS 15 Creatinine (+)260,1 200, V METIS 16 Cystathionine (CTH) (+) V 15V TYR IS 17 Cysteine (CYS) (+) V 15V CYS IS 18 Cystine (CC) (+) V 15V CCIS 19 Gammaaminobutyric Acid(GABA) (+) V 10V METIS 20 Glutamic Acid (GLU) (+) V 15V GLU IS 21 Glutamine (GLN) (+) V 15V GLN IS 22 Glycine (GLY) (+) V 8V GLY IS 23 Histamine (HISTA) (+) V 15V HIS IS 24 Histidine (HIS) (+) V 15V HIS IS 25 Hydroxylysine (HYL) (+) V 10V HIS IS 26 Homocystine (HCHC) (+) V 15V HCCH IS 27 Homocysteine (HCYS) (+) V 15V HCCH IS 28 Hydroxyproline (HYP) (+) V 10V PROIS 29 Isoleucine (ILEU) (+) V 10V ILEU IS 30 Leucine (LEU) (+) V 10V LEU IS 31 Lysine (LYS) (+) V 15V LYS IS 32 Methionine (MET) (+) V 15V MET IS 33 NacetylLtyrosine ()221,8 179, V TYRIS 34 Nmethylhistidine (NMeHIS) (+) V 20V HISIS 35 Ornithine (ORN) (+) V 15V PHE IS 36 OPhosphoLSerine (+)314,1 216,0 50 8V SERIS 37 Phenylalanine (PHE) (+) V 15V PHE IS 38 Proline (PRO) (+) V 15V PRO IS 39 Sarcosine (SAR) (+) V 8V ALA IS 40 Serine (SER) (+) V 15V SER IS 41 Serotonin (SRTN) (+) V 10V SER IS 42 Taurin ()209,7 149, V ALAIS 43 Thiaproline (THPR) (+) V 10V PRO IS

16 44 Threonine (THR) (+) V 15V THR IS 45 Trytophan (TRP) (+) V 15V TRP IS 46 Tyrosine (TYR) (+) V 15V TYR IS 47 Valine (VAL) (+) V 15V VAL IS No Internal Standards MH+ Capillar CE MS/MS (m/z) y (ev) (ev) 1 LALANINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 2 LARGININE:HCL (13C6, 99%; 15N4, 99%) (+) V 20V 3 LASPARAGINE:H2O (13C4, 99%; 15N2, 99%) (+) V 10V 4 LASPARTIC ACID (13C4, 99%; 15N, 99%) (+) V 8V 5 Cystine3333D4 (+) V 10V 6 LCYSTEINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 7 LGLUTAMINE (13C5, 99%; 15N2, 99%) (+) V 10V 8 LGLUTAMIC ACID (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 9 GLYCINE (13C2, 99%; 15N, 99%) (+) V 8V 10 Homocystine D8 (+) V 10V 11 LHISTIDINE (13C6, 9799%; 15N3, 9799%) (+) V 20V 12 LISOLEUCINE (13C6, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 13 LLEUCINE (13C6, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 14 LLYSINE:2HCL (13C6, 99%; 15N2, 99%) (+) V 15V 15 LMETHIONINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 16 LPHENYLALANINE (13C9, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 17 LPROLINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 18 LSERINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 19 LTHREONINE (13C4, 9799%; 15N, 9799%) (+) V 15V 20 LTRYPTOPHAN (13C11, 99%; 15N2, 99%) (+) V 15V 21 LTYROSINE (13C9, 99%; 15N, 99%) (+) V 20V 22 LVALINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 16

17 No 18. ANALYTICAL PERFORMANCE Analyte LOD (µmol/l) LOQ (µmol/l) Accuracy (%) InterAssay Precision (%CV) 1 st Day 2rd Day 3th Day Linearity (R 2 ) 1 3methylhistidine (3MeHIS) 0,016 0,051 91,98 3,12 3,57 5,90 0, Alanine (ALA) 0,004 0, ,98 2,03 3,70 3,22 0, Alphaaminoadipic acid (AAA) 0,067 0,222 90,52 2,93 6,20 2,89 0, Alphaaminobutyric acid (ABA) 0,031 0,102 96,75 5,91 5,09 5,22 0, Alphaaminopimelic acid (APA) 0,001 0, ,66 6,27 7,08 3,26 0, Anserine ( ANS) 0,025 0, ,09 12,16 14,43 12,06 0, Arginine (ARG) 0,007 0,023 92,45 3,56 5,89 6,12 0, Asparagine (ASN) 0,027 0,089 94,77 6,66 5,04 6,74 0, Aspartic Acid (ASP) 0,006 0,019 85,64 4,82 3,83 3,41 0, Beta alanine (BALA) 0,003 0,009 93,64 6,81 8,25 5,89 0, Betaaminoisobutyric acid (BAIB) 0,001 0,002 89,64 7,18 7,47 5,66 0, Citrulline (CIT) 0,028 0, ,15 3,10 3,42 2,75 0, Cystathionine (CTH) 0,001 0,005 87,81 3,99 2,19 1,64 0, Gammaaminobutyric acid (GABA) 0,182 0,601 94,81 11,76 7,47 7,01 0, Glutamic Acid (GLU) 0,001 0,002 83,42 5,45 6,92 3,99 0, Glutamine (GLN) 0,001 0, ,09 7,51 2,59 6,04 0, Glycine (GLY) 0,000 0,001 93,53 6,15 5,68 5,87 0, Histamine (HISTA) 0,002 0, ,35 2,11 1,78 4,79 0, Histidine (HIS) 0,008 0, ,63 3,99 3,58 4,82 0, Hydroxylysine (HYL) 0,013 0,043 91,95 4,59 2,83 6,04 0, Hydroxyproline (HYP) 0,002 0,005 96,86 5,31 4,01 5,96 0, Isoleucine (ILEU) 0,092 0,302 90,28 0,59 2,82 0,73 0, Leucine (LEU) 0,025 0,084 90,52 1,97 5,01 3,08 0, Lysine (LYS) 0,014 0, ,10 0,62 1,79 2,43 0, Methionine (MET) 0,023 0, ,09 3,56 3,66 3,97 0, Nmethylhistidine (NMeHIS) 0,008 0,028 93,09 7,11 5,54 7,57 0, Ornithine hydrochloride (ORN) 0,009 0,030 94,27 3,44 4,21 3,06 0, Phenylalanine (PHE) 0,029 0,094 99,73 5,49 4,15 4,85 0, Proline (PRO) 0,004 0,012 98,56 1,93 1,82 2,14 0, Sarcosine (SAR) 0,008 0,025 94,17 5,81 6,68 4,53 0, Serine (SER) 0,006 0,020 90,94 5,56 5,86 4,09 0, Serotonin (SRTN) 0,009 0, ,46 3,66 1,70 3,81 0, Thiaproline (THPR) 0,008 0,027 88,19 5,33 5,69 6,55 0, Threonine (THR) 0,003 0,009 91,72 2,06 3,24 2,69 0, Trytophan (TRP) 0,004 0, ,62 5,15 4,05 4,97 0, Tyrosine (TYR) 0,003 0, ,10 2,52 3,41 2,02 0, Valine (VAL) 0,033 0,108 99,00 3,52 4,36 2,98 0, Taurin (TAU) 0,018 0, ,11 8,20 6,63 7,42 0, Carnosine (Car) 0,015 0,050 85,01 9,12 9,60 7,17 0, OHTrp 0,037 0,121 98,95 12,47 12,24 10,89 0, OPhosphoLSerine (PS) 0,004 0,012 86,44 8,62 7,81 12,89 0, Creatinine (CRN) 0,017 0,056 99,22 3,16 5,18 4,26 0, NacetylLtyrosine (NAT) 0,350 1,154 98,68 4,11 5,05 6,09 0, Cysteine (CYS) 0,010 0,032 90,29 3,15 3,01 2,11 0, Homocysteine (HCYS) 0,014 0,047 95,11 2,54 3,44 4,18 0, Cystine (CC) 0,001 0,002 94,38 3,77 4,08 3,36 0, Homocystine (HCHC) 0,0001 0, ,66 4,07 2,16 3,27 0,97630 Analytical Specificity (Cross Reactivity): No crossreactivities were found with the typical substances tested. 17

18 19. SAMPLE CHROMATOGRAM: 18

19 19

20 20

21 21

22 22

23 23

24 24

25 25

26 26

27 20. AUTOMATED SAMPLE PREPARATION METHOD PARAMETERS FOR ZİVAK MULTITASKER Step Process Type Tray Barcode Reading Sample Adding Reagent Adding (R1) Reagent Adding (R2) Reagent Adding (R3) 27 Sample Waiting Reagent Adding (R4) Centrifuge Sample Injection Parallel Serial Parallel Parallel Parallel Parallel Parallel Parallel Serial Sample Tray Sample Tray From SR MR MR LR Analysis Tray Analysis Tray Vial Needle Height mm Quantity 150 µl 120 µl 220 µl 220 µl 220 µl 3 µl Use Detectio Active Active n Search Limit 10 0 Shake To Tray Analysis Analysis Analysis Analysis Analysis Tray Tray Tray Tray Tray Vial Needle Height Amount 100 µl 100 µl 200 µl 200 µl 200 µl Mix Count Wait Time Wash Place Syringe Pump Volume x Count Aspirate Port Others 1 min 1. Wash C 2. Wash A Reagent Syringe x x2 1. Wash C 2. Wash A Reagent Syringe x x 1 1. Wash C 2. Wash A Reagent Syringe x x1 Washing 1. Wash C 2. Wash A Reagent Syringe x x1 1. Wash C 2. Wash A Reagent Syringe x x1 1. Wash C 2. Injection Valve 3. Wash A Reagent Syringe x x x1 I6 I6 I6 I6 I6 I6 Syringe Speeds Syringe Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent XCalibur

28 Pump Syringe Syringe Syringe Syringe Syringe Aspirate Speed / Wait / Port Dispens e Speed / Wait / Port 18 / 1500 / I1 14 / 1500 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 Waste Before 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 16 / / 1500 Quantity To Air Segment Quantity Selectio n At First At First At First At First At First At First and Last Centrifuge Run Time 3 min Speed 5000 RPM Vortex Active Active Active Active Active Active V. Run Time 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min V. Speed 1000 RPM 1000 RPM 1000 RPM Purge Before 1000 RPM 1000 RPM 1000 RPM Repeat Aspirate Dispense Syringe Pump Wash Place Flush Volume Time Port Port Pump XLP Wash station C I6 O4 Pump XLP Injection Valve I6 O1 Pump XLP Wash station A I6 O1 28

29 Biyolojik Sıvılarda Amino Asit LCMS/MS Analiz Kiti (Plazma & Serum & İdrar & Beyin Omurilik Sıvısı) ZV C Kullanma Kılavuzu 29

30 İÇERİK Sayfa 1. KULLANIM AMACI: ÖZET VE AÇIKLAMA: TEST PRENSİBİ UYARILAR VE ÖNLEMLER SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK KİT İÇERİĞİ KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR Zivak Kalibratör ve Kontrollerin Hazırlanması : Zivak Sülfür Grubu İçeren Kalibratör ve Kontrollerin Hazırlanması : NUMUNE HAZIRLIĞI NUMUNE HAZIRLIĞI (OTOMATİK) NUMUNE HAZIRLIĞI (MANUEL) SÜLFÜR GRUBU İÇEREN AA NUMUNE HAZIRLIĞI (OTOMATİK) SÜLFÜR GRUBU İÇEREN AA NUMUNE HAZIRLIĞI (MANUEL) KALİTE KONTROL SONUÇLARIN HESAPLANMASI SONUÇLARIN YORUMLANMASI BEKLENEN DEĞERLER LCMS/MS PARAMETRELERİ MS SCAN PARAMETRELERİ ANALITIK PERFORMANS SAMPLE CHROMATOGRAM: OTOMATİK NUMUNE HAZIRLIĞI PARAMETRELERİ ZİVAK MULTITASKER

31 1. KULLANIM AMACI: Aminoasitlerin biyolojik sıvılarda LCMS/MS sistemi ile kantitatif analizi. 2. ÖZET VE AÇIKLAMA: Aminoasitler canlı organizmalardaki proteinlerin yapıtaşıdır. Aminoasitlerin biyolojik sıvılardan kantitatif analizi doğuştan gelen aminoasit metabolizmasındaki bozuklukların klinik tanısında ve veya sağlıklı insan taramasında büyük önem taşır. İdrarda aminoasit analizi renal amino asit taşınımnasıyla ilgili rahatsızlıkların(ör:sistinüri) tanısı için önemlidir. Aminoasitlerin biyolojik vücut sıvılarında birikmesine veya eksikliğine yol açan aminoasidopatilerin tanısında plazmada aminoasit kantitatif analizi tercih edilir. Biyolojik vücut sıvılarında aminoasitlerin kantitatif analizi bazı nörolojik ve endokronik bozuklukların tanısında klinik önem taşır. LCMS/MS aminoasitlerle ilgili rahatsızlıkların tanısında kullanılan ve minimal numune hazırlık prosedürü ile 20 dakikada 47 tane aminoasitin sonucu verebilen etkili bir sistemdir. Zivak Kantitatif Serbest Amino Asit LCMS/MS Analiz Kiti, serum, plazma, omurilik sıvısı ve idrarda aminoasitlerin kantitatif analizi için geliştirilmiştir. Kullanılan yöntem ve prosedürler EN ISO ve 98/79/EC direktiflerine dayanmaktadır. 3. TEST PRENSİBİ Serbest amino asitler asidik ekstraksiyon ve deproteinazyon işlemleri ile numunelerden ekstrakte edilir.ekstrakte edilen analitler reaktifler ile türevlendirilir. Türevlendirilmiş aminoasitler iyice kuruyana kadar uçurma işlemi uygulanır. Uçurma işleminden sonra tekrar reaktif eklenerek çözülür ve LCMS/MS sisteminde analiz edilir. 31

32 4. UYARILAR VE ÖNLEMLER Sadece invitro kullanım amaçlıdır. Profesyonel kullanım içindir. Çalışmaya başlamadan önce, kullanım kılavuzunu dikkatlice okuyunuz. Kit ambalajının zarar görmüş olması durumunda, lütfen Zivak veya bayinizle irtibata geçiniz. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri veya bileşenlerini kullanmayınız. Kullanmadan önce seri numarasını ve son kullanma tarihini kontrol ediniz. Toksik bileşen konsantrasyonları çok düşük olmakla birlikte güvenlik amacıyla çeker ocak altında çalışılması önerilir. Çalışırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanılmalıdır. Çalışılan kan veya biyolojik örneklerden kaynaklanabilecek enfeksiyonlara karşı gerekli her türlü önlemi alınız. Biyozararlı atıklar için uygun biyogüvenlik ve atık yönetimi koşullarını sağlayınız. 5. SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK Reaktif 1, 2,3,4 28 C arasında muhafaza edilmedilir. Diğer bileşenler oda sıcaklığında muhafaza edilir.plasma kalibrator ve kontrolleri 28 C de saklanmalıdır. Çözüldükten sonra da 20 C de saklanmalıdır. Bütün bileşenler önerilen koşullarda saklandığı takdirde son kullanma tarihine kadar garantilidir. 32

33 6. KİT İÇERİĞİ Sipariş Kodu Hacim Sembol ZV300202R110 1 x 30 ml R1 Reaktif 1, ZV300202R210 1 x 50 ml R2 Reaktif 2, ZV300202R310 1x 50 ml R3 Reaktif 3, ZV300202R410 1 x 50 ml R4 Reaktif 4, ZV300202RH10 1 x 30 ml RH Reaktif H, ZV300202MA10 1 x 1 L MA Mobil Faz A, ZV300202MB10 1 x 1 L MB Mobil Faz B, ZV300202WB10 1 x 1 L WB Yıkama Solüsyonu, ZS2ML x100 ad 2 ml cam vial otomatik hazırlık için ZS x100 ad 2 ml cam vial kesikli kapak otomatik hazırlık için KK ZV3002KK10 1x1 ad Kullanma Kılavuzu 33

34 7. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER Calibrator Level 1 ZV300202S110 1 x 3 ml İyophilize Plasma Kalibrator Level1 Calibrator Level 2 ZV300202S210 1 x 3 ml İyophilize Plasma Kalibrator Level2 Calibrator Level 3 ZV300202S310 1 x 3 ml İyophilize Plasma Kalibrator Level3 Control Level 1 ZV300202K110 1 x 3 ml İyophilized Plasma Kontrol Level 1 Control Level 2 ZV300202K210 1 x 3 ml İyophilized Plasma Kontrol Level 2 Control Level 3 ZV300202K210 1 x 3 ml İyophilized Plasma Kontrol Level 3 ZV300202SGS110 1 x 3 ml Calibrator SGLevel 1 Sulfur Grup İyophilized Plasma Kalibrator Level 1 ZV300202SGS210 1 x 3 ml Calibrator SGLevel 2 Sulfur Grup İyophilized Plasma Kalibrator Level 2 ZV300202SGK110 1 x 3 ml Control SGLevel 1 Sulfur Grup İyophilized Plasma Kontrol Level 1 Zivak AA Kolonu µl pipet Pipet uçları Vorteks karıştırıcı 2.0 ml cam durhaim hazırlık tüpü (Manuel Numune Hazırlığı) Eppendorf tüp santrifüj Bidistile veya deiyonize su 0.5 ml Vial (Manuel Numune Hazırlığı) 34

35 8. ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ Test prosedürünün yanlış ve değiştirilerek uygulanması test sonucunu etkileyebilir. Pipetleme hacimleri, inkübasyon zamanları ve hazırlık aşamaları tam olarak belirtilen miktarlarda ve talimatlara uygun bir biçimde yapılmalıdır. Her zaman ve sadece kalibre edilmiş pipetler ve cihazlar kullanılmalıdır. Teste bir kere başlandığı zaman, herhangi bir kesintiye uğramadan tamamlanmalıdır. Bunu sağlamak için gerekli reaktiflerin, maddelerin ve cihazların zamanında hazır olduğundan emin olunuz. Çalışmaya başlamadan önce bütün reaktiflerin ve numunlerin oda sıcaklığına (1825 C) gelmesini bekleyiniz, sıvı reaktifleri ve örneklerini kullanmadan önce hafifçe çalkalayarak karıştırınız. Reaktifler, pipetler ve numune hazırlık tüplerinde kirlilik ve bulaşma olmamasına dikkat ediniz. Her reaktif, standart ve numune için ayrı ve yeni pipet ucu kullanınız. Vial kapaklarını kendi aralarında değiştirmeyiniz. Kullanılmadığı zaman vial kapaklarını her zaman kapalı tutunuz. Vialler, vial kapakları, numune hazırlık tüpleri ve pipet uçları tek kullanımlıktır.inkübasyon süreleri sonuçları etkilemektedir. Bütün numune hazırlık işlemleri belirtilen sırada ve sürede yapılmalıdır. 9. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR Numune toplama ve saklama koşulları test sonuçlarını belirgin bir şekilde etkilemektedir. Daha sonraki günlerde çalışılacak plazma numuneleri analiz yapılana kadar dondurulmuş olarak saklanmalıdır. İdrar numuneleri bulanık ise çalışmadan önce santrifüj edilmelidir. 10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR Zivak Kalibratör ve Kontrollerin Hazırlanması : Plazma standart I numunesine 3ml deiyonize su eklenip çözülür. Hazırlanan kalibratör 150 μl lik hacimlere bölünerek 20 C de saklanmalıdır. Zivak Sülfür Grubu İçeren Kalibratör ve Kontrollerin Hazırlanması : Plazma kontrol level 1 numunesine 3 ml deiyonize su eklenip çözülür. Hazırlanan kontrol numunesi 150 μl lik hacimlere bölünerek 20 C de saklanmalıdır. Not: Sulfür grubu amino asitleri içeren kalibratör ve controller sadece Homocysteine, cysteine, cystine, homocysteine çalışmasında kullanılmalıdır. Diğer 43 aminoasit için sulfur grubu içermeyen Zivak Kalibratör ve Kontrollerini kullanınız. ReagentH homocysteine, cysteine sonucu verilmek istenildiği durumlarda numune hazırlığına dahil edilecektir. 43 amino asit ve cystine, homocystine çalışması için ReagentH kullanılmayacaktır. ReagentH içerisinde zamanla çökmeler olabilir, lütfen kullanmadan önce tamamen çözünmüş olduğundan eminolunuz. 35

36 11. NUMUNE HAZIRLIĞI NUMUNE HAZIRLIĞI (OTOMATİK) 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) numune hazırlık tüpüne (vialine) alınır. Reaktifler ve yıkama solüsyonunun sisteme bağlandığından emin olunuz. MULTITASKER Analiz tablasına vialleri yerleştiriniz ve başlat butonuna basınız. Hazırlanmış numune 28 C de 24 saat boyunca stabildir. NUMUNE HAZIRLIĞI (MANUEL) 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) durhaim cam hazırlık tüpüne alınır. 100 µl Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 3 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir.2 dakika süresince beklenip tekrar 10 sn vortekslenir. 200 µl Reaktif 4 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir.1 dakika kadar beklenir x rpm de 3 dakika boyunca santrifüj edilir. 100 µl üst faz bir viale alınır 3 L LCMS/MS sistemine enjekte edilir. Hazırlanmış numune 28 C de 24 saat boyunca stabildir. 36

37 SÜLFÜR GRUBU İÇEREN AA NUMUNE HAZIRLIĞI (OTOMATİK) 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) numune hazırlık tüpüne (vialine) alınır. Reaktifler ve yıkama solüsyonunun sisteme bağlandığından emin olunuz. MULTITASKER Analiz tablasına vialleri yerleştiriniz ve başlat butonuna basınız. Bu hazırlık için ReagentH içeren metodu kullanınız. Hazırlanmış numune 28 C de 24 saat boyunca stabildir. SÜLFÜR GRUBU İÇEREN AA NUMUNE HAZIRLIĞI (MANUEL) 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) durhaim cam hazırlık tüpüne alınır. 100 µl Reaktif H eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 100 µl Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 3 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir.2 dakika süresince beklenip tekrar 10 sn vortekslenir. 200 µl Reaktif 4 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir.1 dakika kadar beklenir x rpm de 3 dakika boyunca santrifüj edilir. 100 µl üst faz bir viale alınır. 3 L LCMS/MS sistemine enjekte edilir. Hazırlanmış numune 28 C de 24 saat boyunca stabildir. 37

38 12. KALİTE KONTROL Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir.kullanıcılar çalışırken GLP veya diğer kurumlar tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır.bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda olmalıdır.değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve tekrarlanmalıdır.her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri kullanmalıdır.bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi, saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır.ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir.bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi, saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır. Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir 13. SONUÇLARIN HESAPLANMASI Standardın alanına karşı standart konsantrasyonu grafiği çizilir. Standart eğrisi lineer regresyon veya ağırlıklı lineer regresyon fonksiyonu ile hesaplanır. Regresyon eğrisini hesaplamak için, her bir standarda karşılık gelen sinyal değeri grafiğe alınır. Bilinmeyen konsantrasyonu regresyon eğrisinin fonksiyonundan direk olarak okunabilir. Standart eğrisinin üzerinde kalan konsantrasyon değerleri referans bir metot ile teyit edilmelidir. 14. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Farklı toplumlarda farklı CutOff değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır. Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri ile desteklenmelidir. 38

39 15. BEKLENEN DEĞERLER Her laboratuvarın kendi normal değerlerinin belirlemesi önemle tavsiye edilir. 39

40 16. LCMS/MS PARAMETRELERİ Cihaz Kolon Zivak Tandem Gold LCMS/MS Sistemi ZivakAA Kolonu Enjeksiyon Hacmi 3 µl Gradiyant dk 38% B 12:00 dk 65% B 12:01 dk 95% B 14:00 dk 95% B 14:01 dk 38% B 20:00 dk 38% B Akış 0,25 ml/dk Iyonizasyon Modu: CID Gaz API Nebulizing Gaz Tarama Süresi SIM Width Drying Gaz ESI positif+netatif 2,4mTorr 55 psi 2,62 sn 1,5 amu 35 psi Drying Gaz Sıcaklığı 350 C İğne Voltajı Shield voltajı Kapiler voltaj Dedektör 5000V 600V 50V 1500 V 17. MS SCAN PARAMETRELERİ No Analyte 40 MH+ (m/z) MS/ MS Capill ary (ev) CE (ev) IS To Use 1 3methylhistidine (3MeHIS) (+) V 20V HISIS 2 5HydroxyLtryptophan (+)349, V TRPIS 3 Alanine (ALA) (+) V 10V ALAIS 4 Alphaaminoadipic acid (AAA) (+) V 15V PHEIS 5 Alphaaminobutyric acid (ABA) (+) V 15V ALA IS 6 Alphaaminopimelic acid (APA) (+) V 15V ALA IS 7 Anserine (+) V 20V TYR IS 8 Arginine (+) V 20V ARG IS 9 Asparagine (ASN) (+) V 15V ASN IS 10 Aspartic Acid (ASP) (+) V 15V ASP IS

41 11 Beta alanine (BALA) (+) V 15V ALAIS 12 Betaaminoisobutyric Acid (BAIB) (+) V 10V METIS 13 Carnosine (CAR) (+) V METIS 14 Citrulline (CIT) (+) V 15V ARG IS 15 Creatinine (+)260,1 200, V METIS 16 Cystathionine (CTH) (+) V 15V TYR IS 17 Cysteine (CYS) (+) V 15V CYS IS 18 Cystine (CC) (+) V 15V CCIS 19 Gammaaminobutyric Acid(GABA) (+) V 10V METIS 20 Glutamic Acid (GLU) (+) V 15V GLU IS 21 Glutamine (GLN) (+) V 15V GLN IS 22 Glycine (GLY) (+) V 8V GLY IS 23 Histamine (HISTA) (+) V 15V HIS IS 24 Histidine (HIS) (+) V 15V HIS IS 25 Hydroxylysine (HYL) (+) V 10V HIS IS 26 Homocystine (HCHC) (+) V 15V HCCH IS 27 Homocysteine (HCYS) (+) V 15V HCCH IS 28 Hydroxyproline (HYP) (+) V 10V PROIS 29 Isoleucine (ILEU) (+) V 10V ILEU IS 30 Leucine (LEU) (+) V 10V LEU IS 31 Lysine (LYS) (+) V 15V LYS IS 32 Methionine (MET) (+) V 15V MET IS 33 NacetylLtyrosine ()221,8 179, V TYRIS 34 Nmethylhistidine (NMeHIS) (+) V 20V HISIS 35 Ornithine (ORN) (+) V 15V PHE IS 36 OPhosphoLSerine (+)314,1 216,0 50 8V SERIS 37 Phenylalanine (PHE) (+) V 15V PHE IS 38 Proline (PRO) (+) V 15V PRO IS 39 Sarcosine (SAR) (+) V 8V ALA IS 40 Serine (SER) (+) V 15V SER IS 41 Serotonin (SRTN) (+) V 10V SER IS 42 Taurin ()209,7 149, V ALAIS 43 Thiaproline (THPR) (+) V 10V PRO IS 44 Threonine (THR) (+) V 15V THR IS 45 Trytophan (TRP) (+) V 15V TRP IS 46 Tyrosine (TYR) (+) V 15V TYR IS 47 Valine (VAL) (+) V 15V VAL IS 41

42 No Internal Standards MH+ Capillar CE MS/MS (m/z) y (ev) (ev) 1 LALANINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 2 LARGININE:HCL (13C6, 99%; 15N4, 99%) (+) V 20V 3 LASPARAGINE:H2O (13C4, 99%; 15N2, 99%) (+) V 10V 4 LASPARTIC ACID (13C4, 99%; 15N, 99%) (+) V 8V 5 Cystine3333D4 (+) V 10V 6 LCYSTEINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 7 LGLUTAMINE (13C5, 99%; 15N2, 99%) (+) V 10V 8 LGLUTAMIC ACID (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 9 GLYCINE (13C2, 99%; 15N, 99%) (+) V 8V 10 Homocystine D8 (+) V 10V 11 LHISTIDINE (13C6, 9799%; 15N3, 9799%) (+) V 20V 12 LISOLEUCINE (13C6, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 13 LLEUCINE (13C6, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 14 LLYSINE:2HCL (13C6, 99%; 15N2, 99%) (+) V 15V 15 LMETHIONINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 16 LPHENYLALANINE (13C9, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 17 LPROLINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 18 LSERINE (13C3, 99%; 15N, 99%) (+) V 15V 19 LTHREONINE (13C4, 9799%; 15N, 9799%) (+) V 15V 20 LTRYPTOPHAN (13C11, 99%; 15N2, 99%) (+) V 15V 21 LTYROSINE (13C9, 99%; 15N, 99%) (+) V 20V 22 LVALINE (13C5, 99%; 15N, 99%) (+) V 10V 42

43 No Analyte 18. ANALITIK PERFORMANS LOD (µmol/l) LOQ (µmol/l) Accuracy (%) InterAssay Precision (%CV) 1 st Day 2rd Day 3th Day Linearity (R 2 ) 1 3methylhistidine (3MeHIS) 0,016 0,051 91,98 3,12 3,57 5,90 0, Alanine (ALA) 0,004 0, ,98 2,03 3,70 3,22 0, Alphaaminoadipic acid (AAA) 0,067 0,222 90,52 2,93 6,20 2,89 0, Alphaaminobutyric acid (ABA) 0,031 0,102 96,75 5,91 5,09 5,22 0, Alphaaminopimelic acid (APA) 0,001 0, ,66 6,27 7,08 3,26 0, Anserine ( ANS) 0,025 0, ,09 12,16 14,43 12,06 0, Arginine (ARG) 0,007 0,023 92,45 3,56 5,89 6,12 0, Asparagine (ASN) 0,027 0,089 94,77 6,66 5,04 6,74 0, Aspartic Acid (ASP) 0,006 0,019 85,64 4,82 3,83 3,41 0, Beta alanine (BALA) 0,003 0,009 93,64 6,81 8,25 5,89 0, Betaaminoisobutyric acid (BAIB) 0,001 0,002 89,64 7,18 7,47 5,66 0, Citrulline (CIT) 0,028 0, ,15 3,10 3,42 2,75 0, Cystathionine (CTH) 0,001 0,005 87,81 3,99 2,19 1,64 0, Gammaaminobutyric acid (GABA) 0,182 0,601 94,81 11,76 7,47 7,01 0, Glutamic Acid (GLU) 0,001 0,002 83,42 5,45 6,92 3,99 0, Glutamine (GLN) 0,001 0, ,09 7,51 2,59 6,04 0, Glycine (GLY) 0,000 0,001 93,53 6,15 5,68 5,87 0, Histamine (HISTA) 0,002 0, ,35 2,11 1,78 4,79 0, Histidine (HIS) 0,008 0, ,63 3,99 3,58 4,82 0, Hydroxylysine (HYL) 0,013 0,043 91,95 4,59 2,83 6,04 0, Hydroxyproline (HYP) 0,002 0,005 96,86 5,31 4,01 5,96 0, Isoleucine (ILEU) 0,092 0,302 90,28 0,59 2,82 0,73 0, Leucine (LEU) 0,025 0,084 90,52 1,97 5,01 3,08 0, Lysine (LYS) 0,014 0, ,10 0,62 1,79 2,43 0, Methionine (MET) 0,023 0, ,09 3,56 3,66 3,97 0, Nmethylhistidine (NMeHIS) 0,008 0,028 93,09 7,11 5,54 7,57 0, Ornithine hydrochloride (ORN) 0,009 0,030 94,27 3,44 4,21 3,06 0, Phenylalanine (PHE) 0,029 0,094 99,73 5,49 4,15 4,85 0, Proline (PRO) 0,004 0,012 98,56 1,93 1,82 2,14 0, Sarcosine (SAR) 0,008 0,025 94,17 5,81 6,68 4,53 0, Serine (SER) 0,006 0,020 90,94 5,56 5,86 4,09 0, Serotonin (SRTN) 0,009 0, ,46 3,66 1,70 3,81 0, Thiaproline (THPR) 0,008 0,027 88,19 5,33 5,69 6,55 0, Threonine (THR) 0,003 0,009 91,72 2,06 3,24 2,69 0, Trytophan (TRP) 0,004 0, ,62 5,15 4,05 4,97 0, Tyrosine (TYR) 0,003 0, ,10 2,52 3,41 2,02 0, Valine (VAL) 0,033 0,108 99,00 3,52 4,36 2,98 0, Taurin (TAU) 0,018 0, ,11 8,20 6,63 7,42 0, Carnosine (Car) 0,015 0,050 85,01 9,12 9,60 7,17 0, OHTrp 0,037 0,121 98,95 12,47 12,24 10,89 0, OPhosphoLSerine (PS) 0,004 0,012 86,44 8,62 7,81 12,89 0, Creatinine (CRN) 0,017 0,056 99,22 3,16 5,18 4,26 0, NacetylLtyrosine (NAT) 0,350 1,154 98,68 4,11 5,05 6,09 0, Cysteine (CYS) 0,010 0,032 90,29 3,15 3,01 2,11 0, Homocysteine (HCYS) 0,014 0,047 95,11 2,54 3,44 4,18 0, Cystine (CC) 0,001 0,002 94,38 3,77 4,08 3,36 0, Homocystine (HCHC) 0,0001 0, ,66 4,07 2,16 3,27 0,97630 Analytical Specificity (Cross Reactivity): No crossreactivities were found with the typical substances tested. 43

44 19. SAMPLE CHROMATOGRAM: 44

45 45

46 46

47 47

48 48

49 49

50 50

51 51

52 52

53 Adım İşlem Tipi Tabla 20. OTOMATİK NUMUNE HAZIRLIĞI PARAMETRELERİ ZİVAK MULTITASKER Barkod Okuma Numune Ekleme Reaktif Ekleme (R1) Reaktif Ekleme (R2) 53 Reaktif Ekleme (R3) Numune Bekletme Reaktif Ekleme (R4) Santrifüj Numune Enjeksiyonu Paralel Seri Paralel Paralel Paralel Paralel Paralel Paralel Seri Numune Tablası Numune Tablası Nereden SR MR MR LR Analiz Tablası Tüp İğne Yüksekliğ i Analiz Tablası mm Miktar µl 220 µl 220 µl 220 µl 3 µl Sıvı Bulma Arama Limiti Çalkalam a Tabla Aktif Aktif 10 0 Analiz Tablası Analiz Tablası Analiz Tablası Nereye Analiz Tablası Analiz Tablası Tüp İğne Yüksekliğ i Miktar µl 200 µl 200 µl 200 µl Karıştırm a Tekrarı Bekleme Zamanı Yıkama Yeri Şırınga Pompası Miktar x Tekrar Çekme Portu Basma Portu Şırınga Pompası Diğer 1 dk 1. C Portu 2. A Portu Reaktif Şırıngası x x2 1. C Portu 2. A Portu Reaktif Şırıngası x x1 1. C Portu 2. A Portu Reaktif Şırıngası x x 1 Yıkama 1. C Portu 2. A Portu Reaktif Şırıngası x x1 1. C Portu 2. A Portu Reaktif Şırıngası x x 1 1. C Portu 2. Enjeksiyon Valfi 3. A Portu Reaktif Şırıngası x x x 1 I6 I6 I6 I6 I6 I6 1. O4 2. O1 Reaktif Şırıngası 1. O4 2. O1 Reaktif Şırıngası 1. O4 2. O1 Reaktif Şırıngası 1. O4 2. O1 Şırınga Hızları Reaktif Şırıngası 1. O4 2. O1 Reaktif Şırıngası 1. O4 2. O1 3. O1 XCalibur

54 Çekme Hız / Bekleme / Port Basma Hız / Bekleme / Port 18 / 1500 / I1 14 / 1500 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 Önce At 20 / 1000 / I1 16 / 1000 / O1 16 / / 1500 Miktar Nereye Hava Kabarcığı Miktar Seçim Başta Başta Başta Başta Başta Başta ve Sonda Çalışma Süresi Santrifüj 3 min Hız Vorteks Aktif Aktif Aktif Aktif Aktif Aktif V. Çalışma Süresi V. Hız 5000 RPM 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min 0.1 min 1000 RPM 1000 RPM 1000 RPM Önce Yıka 1000 RPM 1000 RPM Şırınga Pompası Yıkama Yeri Miktar Tekrar Çekme P. Basma P. Pump XLP C Portu I6 O4 Pump XLP Enjeksiyon Valfi I6 O1 Pump XLP A Portu I6 O RPM 54