138 Hacettepe T p Dergisi 2001; 32(2):

Transkript

1 Turgay Dalkara: Prion hastal klar (Transmissible spongiform ensefalopatiler, TSE) insanlar ve hayvanlar etkileyen bir grup nörodejeneratif hastal kt r. Genetik çal flmalar hastal n patogenezinde ve aktar m nda prion proteinlerinin ana rolü üstlendi ini göstermifltir. Bu grupta yer alan bütün hastal klar süngerimsi ensefalopatiyle karakterize bir patolojik görüntü sergiler. Prion hastal klar demans, insomni ve ataksiye yay lan genifl bir yelpazede nörolojik belirtilerle ortaya ç karlar. Klinik bulgular n ortaya ç kmas prion vücuda girdikten sonra aylar hatta y llar alabilir. Prion proteinin (PrP) metabolizmas ndaki de ifliklikler sonucu ortaya ç kan nörolojik hastal klar prion ad verilen enfeksiyöz maddenin aktar m, defektif prion proteinin genetik geçifli ya da sporadik olarak bilinmeyen mekanizmalar ile ortaya ç kabilir (1, 2, 3). T.Dalkara: Prion hastal klar n n patogenezinde rol alan faktörler nelerdir? Y. Gürsoy-Özdemir: Prion hipotezine göre patogenezden sorumlu olan olay normal prion proteinin (PrP C ) proteaza dayan kl formu olan PrP Sc ye dönüflmesidir. Bu formun proteaza dayan kl k sm n n uzunlu u veya konformasyonu ve glikozilasyon özellikleri, de iflik klinik ve patolojik fenotiplerin ortaya ç kmas na neden olmaktad r (2). nsan prion geni üç ekzondan oluflur ve kromozom 20 nin k sa koluna lokalizedir. Prion geni sa l kl bireylerde beyinde ve di er dokularda yap sal olarak eksprese edilir. Hastal a neden olan PrP Sc proteazlara dayan kl olmas nedeni ile çözünmez ve agregatlar halinde beyinde birikerek nörodejeneratif hastal klara neden olur. PrP C ve PrP Sc proteinlerinin primer yap lar ayn d r ve hastal a neden olan formda post-translasyonel de iflikliklerin mevcut oldu u düflünülmektedir. Yap lan çal flmalar PrP C proteininde alfa sarmal yap s n n %40 oran nda bulundu unu, bununla birlikte beta tabaka yap s n n ise neredeyse hiç olmad n göstermifltir. Oysa patolojik olan PrP Sc proteinin %50 sini beta tabaka olufltururken alfa sarmal yap s ancak %20 oran ndad r (1,2). Hastal n ortaya ç kmas nda endojen PrP C proteinin varl gereklidir. Endojen protein için gerekli geni ç kar lm fl hayvanlar n hastal gelifltirmedikleri gösterilmifltir. Ayr ca hastal n inokülasyon döneminde bol miktarda PrP Sc proteini yap lmakta ve bu da var olan PrP C proteini ile orant l olmaktad r. PrP Sc proteini kendi toksik konformasyonunu normal proteine aktararak ço almaktad r. Ancak bu çevrim iflleminin ana mekanizmas tam olarak bilinmemektedir (1, 2). PrP proteininin beyinde baz görevleri oldu u düflünülmektedir. Yap lan çal flmalar bu proteinin SOD (süperoksit dismutaz) aktivitesine sahip oldu unu göstermektedir. PrP geni silinmifl fareler bu nedenle oksidatif strese daha hassas bulunmufllard r (4). Bütün prion hastal klar afla daki üç özellikten en az birini gösterir (34): 1) Prion proteinin (PrP) geninde missense mutasyon 2) Proteza rezistan PrP birikimi 3) Laboratuvar konakç s na aktar m 138 Hacettepe T p Dergisi 2001; 32(2):

2 Dalkara, Gürsoy - Özdemir, Söylemezo lu, Demirpençe, Haz ro lu: Prion hastal klar 139 T.Dalkara: nsanda tan mlanan prion hastal klar nelerdir ve bunlar n klinik özellikleri nas ld r? Y.Gürsoy- Özdemir: nsanda tan mlanan prion hastal klar Creutzfeldt-Jacobs hastal (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker hastal (GSS), Fatal ailevi insomnia (FFI), Kuru hastal ve CJD n n varyant d r (3, 5-7). (Tablo 1) CJD insan prion hastal klar n n en s k formudur. Popülasyonda sporadik olarak ortaya ç kar. Y ll k insidans milyonda birdir. Daha seyrek olarak ailelerde dominant geçiflli bir hastal k olarak görülür. Lübnan yahudilerinde ailevi geçifl nedeni ile en yüksek oranda rastlan r. Her iki form da primatlara ve laboratuvar rodentlerine aktar labilir. Doku transplantasyonu ve kontamine insan büyüme hormonu preperatlar ile de geçifl tespit edilen vakalar bildirilmifltir. Klinik olarak hastal k orta ve ileri yaflta, çok nadir olarak da erken eriflkinlik döneminde (ortalama ortaya ç k fl yafl 60) yavafl ilerleyen demans ile ortaya ç kar. Anksiyete, yorgunluk, bafla r s, karar verme yetisinde bozulma ve al fl lmad k davran fllar prodromal belirtilerdir. Haf za kayb tespit edildikten sonra h zla ilerler ve karakteristik bulgular ortaya ç kar. Demans d fl nda en s k rastlanan bulgular piramidal yolun tutulufluna ait bulgular (güçsüzlük, ekstremitelerde sertlik ve refleks de ifliklikleri), ekstrapiramidal bulgular (tremor, rijidite, dizartri ve hareketlerde yavafllama), serebellar bulgular ve TABLO 1. Prion Hastal klar n n Klinik Özellikleri: Hastal k Ad Ortalama bafllama Yafl Belirgin Bulgular Seyir CJH 60 Yafl Demans, H zl (2-7 ay) Ekstrapiramidal bulgular Serebellar bulgular Myoklonus GSS 60 Yafl Ataksi Yavafl (7-36 ay) Demans FFI yafl Uykuda azalma Otonom bozukluk Yavafl (7-36 ay) Kuru Dengesizlik 4-24 ay stemsiz hareketler VCJH 29 yafl Psikiyatrik semptomlar 6-22 ay Dizestezi Ataksi Demans TABLO 2. Farkl yöntemlerin kanda PrP SC taramas için deteksiyon eflikleri (9). Test yöntemi Test materyali Duyarl l k efli i Western blot Kobay beyni 100 pg-1 ng/ml Rekombinant kobay veya 300 pg/ml insan PrP Kapiller elektroforez Sentetik PrP peptidi 5-10 ng/ml Rekombinant insan PrP ng/ml CDI Kobay beyni <1ng/mL Rekombinant insan PrP <5pg/mL DELFIA Kobay beyni pg/ml Rekombinant insan PrP 160 pg/ml Rekombinant s r PrP 100 pg/ml Konfokal çift renk floresans Kobay beyni pg/ml korelasyon spektroskopisi

3 140 Hacettepe T p Dergisi uyarana hassas myoklonustur. Di er bulgular ise amyotrofi, kortikal körlük ve nöbetlerdir. Laboratuvar incelemelerinde hastal n orta ve ileri dönemlerinde EEG de karakteristik olarak 0,5-2,0 saniyede bir görülen periyodik deflarjlar vard r. Hastal k h zl seyreder ve bir y l içinde hastalar n %90 ölür. Genetik geçifl gösteren formda vakalar n %60 nda kodon 200 de mutasyon vard r. Kodon 129 da ve daha baflka pek çok mutasyon tan mlanm flt r. GSS hastal otozomal dominant ailevi bir hastal kt r. 2 ile 10 y l aras nda süren uzun bir seyri vard r. Klinik olarak ataksi ile bafllar demans onu takip eder. Ancak mutasyon tiplerine göre spastik paraparezi, ekstrapiramidal sendrom veya presenil demans ile de bafllayan formlar vard r. Beyin sap tutulumu daha belirgin oldu u için hasta bafllang çta olivipontoserebellar atrofisi var gibi de erlendirilebilir. EEG de genellikle periodisite yoktur ve yayg n yavafllama vard r. lk tan mlanan genetik mutasyon kodon 102 de prolin lösin yer de ifltirmesidir. FFI ailevi bir prion hastal d r. Hastal k toplam uyku zaman nda ilerleyici azalma ile karakterizedir ve otonom fonksiyonlarda erken dönemlerde bozulma gözlenir. Daha sonra piramidal, serebellar bulgular ve demans ile myoklonus geliflebilir. 18 ile 61 yafl aras nda bafllar ve 7 ile 36 ay sürer. EEG de yayg n yavafllama vard r. Bu hastal a kodon 129 daki mutasyonlar neden olabilmektedir. Kodon 129 da metionin ile asparajin yer de iflimi daha yavafl seyirli hastal a neden olurken burada ortaya ç kan aspartat de iflimi daha k sa süreli ve erken bafllang çl formun ortaya ç kmas na neden olmaktad r. FFI da belirgin olarak talamus tutulumu görülür. Kuru hastal ilk olarak Yeni Gine yerlilerinde tan mlanm flt r. Yürümede dengesizlik, ataksi, istemsiz hareketler, flafl l k ve hastal n ilerleyen dönemlerinde bunama ile karakterizedir. Hastal k 4 ile 24 ay aras nda ölümle sonlan r. Burada kannibalizm ana geçifl nedenini oluflturmaktad r. Kannibalizmin azalmas yla birlikte kuru hastal da h zla azalm flt r. Tarihi aç dan önemli bir hastal kt r çünkü insanda tan mlanan ilk prion hastal d r. T.Dalkara: CJD n n varyant formu nas l ortaya ç km flt r? Y.Gürsoy-Özdemir: ngiltere de ineklerde bovine spongiform ensefalopati (BSE) epidemisinin ortaya ç kmas n takiben 1990 y l nda CJD tarama üniteleri aktif hale getirilmifltir. Buradaki amaç koyunlarda olan scrapie ile ineklerdeki BSE aras nda bir iliflkinin olup olmad n n ve insana geçifl ihtimalinin tespit edilmesidir. O tarihten itibaren yap lan taramalar sonras nda 1996 y l nda CJD öntan s ile izlenen ve patolojik ve biyokimyasal incelemeleri yap lan ancak klasik CJD na hastal n ortaya ç k fl yafl ve nöropatolojik bulgular ile uymayan 10 vaka Lancet dergisinde yay nlanm fl ve bunun CJD n n yeni bir formu oldu u duyurulmufltur (8). T.Dalkara: BSE nedir ve nas l ortaya ç km flt r? R. Haz ro lu: Veteriner patolojide nonmyelinik spongiform ensefalomyelopatiler içerisinde de erlendirilen s rlar n spongiform ensefalopatisi (BSE), santral sinir sistemini etkileyen kronik dejeneratif ölümcül bir hastal kt r (9). Deli inek hastal (mad cow disease) fleklinde (10) tan mlanmas na karfl n ülkemizde deli dana olarak bilinmektedir. Hastal k Nisan 1985 den beri bilinmesine karfl n ilk kez Kas m 1986 da ngiltere den bildirilmifltir (9-11). Daha sonra birçok ülkeden varl na iliflkin raporlar devam etmifltir (10, 11, 14). lk epidemiyolojik çal flmalar BSE nin genifl bir co rafik bölge üzerinde ayn anda fakat genellikle tek olgu fleklinde ortaya ç kan bir epidemi fleklinde oldu unu göstermifltir (12). BSE; insanlarda kuru, CJD, GSS, FFI, çiftlik minklerinde görülen transmisibl mink ensefalopati, geyiklerin kronik zay flama hastal (CWD), kedilerde spongiform ensefalopati, koyun ve keçilerde scrapie gibi di er spongiform ensefalopatilerle genelde uyumlu birçok özelli e sahiptir (9, 11). Besi s rlar nda hastal a %4,7 oran nda rastlan rken süt ineklerinde bu oran %33 dür. nkübasyon süresi 2-8 y ld r. Hastal k en fazla 4-5 yafll s rlarda görülür. Difliler erkeklere oranla hastal a daha fazla yakalan r. Olgular n ço u Friesian-Holstein rk ineklerdedir (9, 10). Hastal k deneysel olarak s r ve farelere tafl nabilmifltir. BSE etkeninin horizontal tafl nd na iliflkin bir kay t yoktur. Maternal tafl nman n %5-15 oran nda olabilece ine iliflkin yay nlar (14) bulunmas na karfl n bu konu tam olarak ayd nlat lamam flt r. Embriyo transfer çal flmalar nda intrauterin tafl nma bulgular yoktur. BSE enfektivitesi sadece beyin, omurilik ve retinada bilinmektedir (12). Plasenta, süt, kolostrum, meme dokusu, sperma, testis, kas, kan ve jelatinde de etkene rastlanmam flt r (10, 14). Hastal a hayvanlara et unu, kan unu, kemik unu gibi geviflgetiren hayvan kökenli protein içeren yemlerin yedirilmesi neden olmaktad r (9-11). Günümüzde genel kabul gören bu görüflün yan nda genetik duyarl l k (9, 11) ve çok küçük viral partiküllerin hastal k nedeni olabilece ine iliflkin görüfller de vard r. Etkenin abnormal prion proteini (PrP Sc ) oldu u, DNA ya da RNA içermedi i, Proteinaz K ya, iyonizan fl nlara, ultraviyole fl nlar na, yüksek kuru s ya, nükleazlara ve dezenfektanlara

4 Dalkara, Gürsoy - Özdemir, Söylemezo lu, Demirpençe, Haz ro lu: Prion hastal klar 141 (formaldehit, betapropiolaktan) dirençli oldu u, proteolitik enzimlere duyarl oldu u ve otoklav s s gibi nemli yüksek s da ( C) en az 1/2 saatte y k mland bilinmektedir (9, 10, 14). Etken dokularda yang sal ya da immunolojik bir reaksiyon oluflturmaz. Sadece dejeneratif karakterli nonmyelinik spongiform ensefalomyelopati meydana getirir. Konakç da antikor oluflturmad klar ndan serolojik tekniklerle etkeni saptama ya da etkene karfl koruyucu afl haz rlama olas l da bulunmamaktad r. Hayvan n baflka antijenik uyar mlara karfl immun T ve B hücre fonksiyonlar tamd r. mmun bask lanma ya da immun güçlenme hastal n kuluçka süresini ya da seyrini de ifltirmemektedir (10, 14). Elektron mikroskopta scrapie-iliflkili fibriller (SAFs) benzeri oluflumlar özellikle beynin bazal ganglionlar bölgesinde gözlenir. Bu fibriller 10-20x nm boyutlar nda olup PrP lerin esas n oluflturmaktad r. Fibrillerin amiloid karakterde olduklar da aç klanm fl ve bunlara fl k mikroskopta amiloid plaklar ad verilmifltir (9). T.Dalkara: BSE ay r c tan s nas l yap lmaktad r? R.Haz ro lu: neklerde davran flta görülen de ifliklikler hipomagnezemi ve sinirsel ketozisten ay rt edilmelidir. Ayr ca listeriozis, kurflun zehirlenmesi, serebrospinal apseler, ya da beyin boflluklar nda yer alan di er lezyonlar ve spinal travmalar gözönünde bulundurulmal d r (14). Beyinde gözlenen vakuolleflme tam olarak aç klanamam flt r. Küçük ve çok say daki sitoplazmik vakuoller, viral ensefalomyelitislerde s kça görülür. Bunlar iskemik hücre y k m n n ilk devrelerindeki mitokondriyal fliflmelerdir. Nöronal ince vakuolleflmeler ise otolitik artefaktlarla ilgili olabildikleri gibi birçok lizozomal depo hastal klar nda dikkati çekmektedir. Az say daki nöronlarda tek ve büyük intrasitoplazmik vakuoller bazen yafll bo alar n k rm z ve okulomotor nükleuslar nda normalde de görülebilmektedir (9, 14). Etyolojik olarak ise status spongiozusla karakterize spongiform myelinopatiler; kimyasal, bitki toksikasyonu, metabolik ve kal t ma ilgili olarak flekillenebilmektedir. Bunlar da ay r c tan da gözden uzak tutulmamal d r (9). T.Dalkara: BSE nin insan sa l aç s ndan önemi nedir? R.Haz ro lu: 20 Mart 1996 da ngiltere Sa l k Sekreteri Mr.Stephen Dorrell in insanlarda CJD hastal n n yeni bir fleklinin vcjd (variant CJD) s rlardaki BSE ile iliflkili olabilece ini bildirmesi dünyada panik oluflturmufltur. nsanlarda gözlenen vcjd n, klasik CJD den farkl oldu u bildirilmifltir (8, 10, 11 13). Variant CJD ile BSE den sorumlu birbirine yak n etkenlerin do al ve deneysel yolla farkl hayvan türlerine tafl nmas Dünya Sa l k Örgütü uzmanlar n 1996 dan beri tart fl lan vcjd vakalar n n BSE ye neden olan etken ile ayn etken oldu u fleklinde bir sonuca götürmüfltür (11). nsanda görülen klasik CJD PrP leri BSE PrP den 30 dan fazla aminoasit yeri aç s ndan farkl d r. Bu nedenle uzun y llar hastal n insanlara geçmedi i düflünülmüfltür. Günümüzde ise PrP molekülünün baz bölümlerinin türler aras engellerle k r labildi i ve s r PrP nin kritik noktada insan PrP lerine benzeyebildi i kabul edilmifltir. BSE PrP i insan ve s rlar n genetik materyalleri çok farkl olmas na karfl n engelleri aflabilir (10). Ya da normal bir sinir hücresinde bulunan normal PrP (PrP C ), bilinmeyen bir nedenle abnormal PrP ne (PrP Sc ) dönüflebilir ve di er normal PrP leri abnormal PrP lere dönüfltürür (11, 14). T.Dalkara: Koruma ve kontrolde neler yap labilir? R.Haz ro lu: BSE gündemde tutulmal d r. BSE bulgular gösteren hayvanlar yok edilmeli ve hiçbir ürünü tüketime sunulmamal d r. thallerin BSE gözlenmeyen ülkelerden yap lmas na özen göstermelidir. Ülkemizde varl na iliflkin bir kay t bulunmamas na karfl n kökeni bilinmeyen et ve özellikle sakatat (beyin, omurilik,dalak,böbrek, karaci er) tüketiminde dikkatli olunmal d r. Geviflgetiren hayvanlarda gözlenen scrapie (koyun, keçi) ve CWD (geyik, elk) gibi di er PrP hastal klar ndan dolay, geviflgetiren hayvan ürünlerinin kesin kan tlar bulunmamas na karfl n risk oluflturmas bak m ndan tüketilmemesi Dünya Sa l k Örgütü taraf ndan önerilmektedir (11). Etkenin henüz saptanmad iskelet kaslar ndan görülebilen sinir ve lenfatik dokular uzaklaflt r larak yeniden kazan m sa lanabilir (11). Süt ve süt ürünlerinin güvenli olduklar düflünülmektedir. Ayr ca kozmetik sanayinde kullan lan ya ve jelatin de gerekli iflleme sistemlerinden geçti ise güvenlidir (11). nsan ve Veteriner afl haz rlanmas nda kullan lan s r materyalleri risk tafl yaca ndan kullan lmamal d r. laç endüstrisinde de s r ve di er hayvan

5 142 Hacettepe T p Dergisi materyallerinin kullan lmamas, ancak çok gerekli ise hastal n görülmedi i ülkelerinden ithalat n yap lmas tercih edilmelidir (11). Hayvanlar n beslenmesinde geviflgetiren hayvan kökenli g dalar kullan lmamal d r. Hayvansal kökenli g dalar iflleyen tesislerin çal flma durumlar kontrol edilmelidir. Konu ile ilgili çal flmalar desteklenmelidir. T.Dalkara: vcjd n n klinik özellikleri nelerdir? Y.Gürsoy-Özdemir: Bu vakalar n klinik seyirleri farkl d r. Tan mlanan vakalar n yafl ortalamas 29 dur. Bu rakam yafl ortalamas 60 olan sporadik CJD dan oldukça düflüktür. Ancak hastal k seyri bu yeni formda daha uzundur (6-22 ay vs ay). Ço unda bafllang ç semptomlar davran fl de iflikli idir ve psikiyatriste gönderilmifllerdir. Bir k sm nda ise dizestezi vard r. Hastal n erken evrelerinde hastalarda ataksi gözlenmifltir ve hastal k ilerledikçe demans ortaya ç km flt r. Oysa klasik CJD da bafllang ç semptomu genelde demanst r. Ayr ca vakalar n hiçbirinde CJD da rastlanan tipik EEG bulgular yoktur. Bu vakalar n nöropatolojileri de sporadik CJD dan oldukça farkl d r. fiimdiye kadar yaklafl k 100 vaka tan mlanm flt r (8, 15). T.Dalkara: vcjd ile BSE aras nda bir iliflki var m d r? Y.Gürsoy-Özdemir: Yap lan epidemiyolojik çal flmalar bu yeni form ile BSE aras nda bir iliflki oldu unu göstermektedir. BSE nin insana geçiflinde doz, maruz kal nan süre, genetik yatk nl k ve türler aras ndaki bariyer önemlidir. Prion hastal klar n n aktar m nda doz önemlidir ve oral al mdan çok inokülasyon daha infektiftir. Ancak ortaya ç kan yeni formdaki vakalar n hiçbirinde anormal diyet veya ifl yaflam nda BSE ye ekspozisyon yoktur. Bu nedenle hastal a yatk nl k bu formun ortaya ç kmas nda daha önemli gibi görünmektedir. Tan mlanan bütün hastalar kodon 129 da metionin için homozigotturlar. lginç olarak beyaz rk n %38 i bu homozigot yap y tafl maktad r. Yap lan inokülasyon çal flmalar inkübasyon periyodunun belirlenmesinde bu genetik yap d fl nda baflka genetik özelliklerin de önemli oldu unu göstermektedir. Hastal n oral yolla geçiflinde rol oynayabilecek di er faktörler bukkal lezyonlar, tonsil ve gastrointestinal enfeksiyonlar olabilir. Deneysel scrapie modellerinde erken prion ço al m n n lenforetiküler sistemde oldu u ve nöroinvazyonun inkübasyonun geç dönemlerinde ortaya ç kt gösterilmifltir. S r eti d fl nda bu yeni formun insana aktar m nda kan ve kan ürünleri, kontamine cerrahi ürünler rol oynayabilir. Ayr ca s rlardan koyunlara geri geçifl olabilir ve klinik ve patolojik olarak scrapieden ay rt edilemeyebilir. Tüm bu geçifl yollar n n hastal n yay lmas nda nas l rol oynayabilece i ise henüz bilinmemektedir (15). T.Dalkara: vcjd nin histopatolojik özellikleri nelerdir? CJD ile farkl l klar göstermekte midir? F.Söylemezo lu: vcjd, BSE etkeninin insano lunda oluflturdu u bir spongiform ensefalopatidir. Ve tüm prion hastal klar n n ortak nöropatolojik triad olan spongiform de iflme, gliozis ve nöron kayb ile karakterizedir. Bu bulgulara ek olarak baz prion hastal klar nda da izlenen PrP Sc plaklar mevcuttur. Spongiform de iflme. Putamen ve kaudat nükleusda a r gliozisin efllik etti i yo un spongiform de iflme izlenmektedir. Anterior talamus, tüm serebral kortikal laminalar yan s ra serebellar moleküler tabakada da spongiform de iflme mevcuttur. vcjd da izlenen bu spongiform de iflme ve gliozis patterni, daha ziyade serebral kortikal tutulum ile karakterize CJD dan oldukça farkl d r (16, 17). PrP Sc plaklar. vcjd ile CJD aras ndaki bir di er önemli farkl l k da, serebral ve serebellar kortikal yerleflimli eozinofilik plaklar n varl d r. Plaklar, yuvarlak, eozinofilik koru olan, periferal radiyer spiküllerin oluflturdu u, PAS pozitif, kongofili ve arjirofili gösteren yap lard r. mmünhistokimyasal olarak bu plaklar n santralinde PrP Sc depolanmas saptanmaktad r. Kuru plaklar olarak da bilinen bu plaklar n CJD olgular n n çok küçük bir k sm nda izlenebildi i bildirilmektedir (16, 17). Bugün için prion hastal klar nda izlenen klinik ve patolojik fenotipik heterojeniteden, hostun genotipi mi, prion suflu mu, yoksa bulaflma yolunun mu sorumlu oldu u kesin de ildir. Bildirilen tüm vcjd olgular nda PRNP geninde 129. kodonda metiyonin homozigositesi saptanm flt r. PrP Sc plaklar ile PRNP 129. kodon polimorfizminin iliflkili oldu u öne sürülmektedir (18). Periferal inokulasyonun ortak bulaflma mekanizmas oldu u kuru ve vcjd n karfl laflt ran bir baflka çal flmada da, prion sujunun, kliniko-patolojik fenotipin belirleyicisi oldu u görüflü öne sürülmüfltür (19). T.Dalkara: mmünhistokimyasal olarak prion proteini dokuda hangi patternlerde izlenmektedir? F.Söylemezo lu: vcjd olgular nda, PrP Sc yükünün di er baz insan TSE lerine oranla çok yüksek oldu u immünhistokimyasal olarak

6 Dalkara, Gürsoy - Özdemir, Söylemezo lu, Demirpençe, Haz ro lu: Prion hastal klar 143 demonstre edilmifltir (19). PrP Sc dokuda sferik plak veya difüz plak formunda birikebildi i gibi, difüz sinaptik patern ve perinöral bir da l m sergileyebilir (16). Sferik plak veya difüz plak formunda PrP Sc birikimi, serebral ve serebellar korteksde izlenmektedir. Difüz sinaptik patern ve perinöral PrP Sc birikimi, serebral ve serebellar korteks yan s ra kaudat nükleus, putamen, beyin sap ve spinal kordda saptanm flt r (17). Tüm insan prion hastal klar içinde vcjd ye özgü bir di er önemli bulgu da immünhistokimyasal olarak PrP Sc birikiminin lenforetiküler sistemde gösterilmesidir (16). Tüm vcjd otopsilerinde lenfoid dokuda PrP Sc birikimi izlenmektedir. Literatürde bir olguda vcjd klini inden 8 ay önce lenforetiküler PrP Sc birikimi gösterilmifltir (20). ngiltere de bu bulgudan yola ç k larak 3000 tonsilektomi ve appendektomi materyali üzerinde gerçeklefltirilen retrospektif çal flmada pozitif sonuç elde edilememifl olmakla birlikte, olas vcjd epidemisinin boyutunu saptamakta ekstranöronal PrP Sc birikiminin önemli bir araç olabilece i vurgulanmaktad r (21). T.Dalkara: Tedavi için neler düflünülmektedir? Y.Gürsoy-Özdemir: Yak n gelecek için önemli olan nokta tedavi stratejileri gelifltirebilmektir. Konformasyonlar ndaki de ifliklikler nedeni ile toksik hale gelip nörodejeneratif hastal klara neden olan baflka proteinler de bilinmektedir. Bütün bu hastal klarda proteinin beta tabaka yap s artmaktad r. Bu yüzden beta tabaka yap s n k ran peptitler umut verebilir. Bu tür peptitler Alzheimer hastal nda denenmifl ve baflar l sonuçlar al nm flt r. Genetik mühendislik yolu ile proteinlerin bozulmufl konformasyonunu eski haline getirebilecek flaperon proteinler de tedavi yaklafl m olarak ele al nabilir (1). T.Dalkara: TSE flüphesi olan hastaya yap lacak otopside al nmas gerekli önlemler neler olmal d r? F.Söylemezo lu: TSE nin kesin tan s n n otopsi ile konulabilece i göz önüne al n rsa, bu olgulara otopsi uygulaman n da kaç n lmaz bir gerçek oldu u ortaya ç kmaktad r. Avrupa Toplulu unun nsan prion hastal klar grubu taraf ndan yay mlanan konsensus raporunda otopsi ve nöropatoloji uygulamalar nda, ve dekontaminasyon konusunda uyulmas gerekli kurallar bildirilmektedir (22). Otopsinin sadece beyinin ç kart lmas ile s n rland r lmas mümkündür. Otopsiyi gerçeklefltirecek ekibin uymas gerekli kurallar flöyle özetlenebilir: 1. Otopsi ekibi gözlük ve a z maskesi takmal, lastik eldiven alt na teflon veya metal eldiven giymelidir. 2. Otopsi masas n n kontaminasyonunu engellemek amac yla otopsi, geçirgen olmayan dispos bl plastik bir örtü üzerinde yap lmal d r. 3. Beynin ç kart lmas : Kafan n alt na kal n selülöz örtü yerlefltirildikten sonra kafaya ola an pozisyonu verilir. Kafatas mekanik el testeresi ile aç ld ktan sonra beyin ç kart lmadan önce dondurulmak üzere serebrum ve serebellumdan 2-3 cm 3 lük dokular n in situ al nmas önerilmektedir. Al nan taze dokunun iki kat plastik torba içine yerlefltirildikten sonra a z s k ca kapanan bir plastik kapta, üzeri iflaretlenerek dondurulmas gerekmektedir. Normal yöntemler ile ç kart lan beyin tamponlanm fl %4 lük formaldehit ile dolu kapakl plastik bir kaba yerlefltirilir. Fiksatifin, içindeki tesbit olan beynin enfektif oldu u unutulmamal, üzerine not düflülmelidir. 4. Arzu edilirse iç organlar in situ incelenir ve örneklenebilir. 5. Otopsi tamamland ktan sonra plastik ve selülöz örtüler di er enfekte dispos bl materyalle birlikte yak lmak üzere hastanenin di er enfekte at klar aras na kat l r. 6. Kullan lan tüm materyal dekontamine edilmelidir. 7. Otopsi s ras nda meydana gelen kontaminasyona neden olabilecek tüm kazalar kaydedilmelidir. T.Dalkara: Histolojik olarak incelenmek üzere örneklenen doku bloklar nda CJD enfektivitesi nas l deaktive edilebilir? F.Söylemezo lu: Formaldehit ile tesbit edilmifl beyin hala enfektiftir. Beyinden küçük doku bloklar haz rlanmas sürecinde de otopsi yap l rken uygulanan tüm önlemler al nmal d r. Doku örneklemesi 5 mm yi geçmeyecek kal nl kta yap lmal, ve örneklenen doku % lük konsantre formik asit içinde bir saat bekletilmelidir. Bunu takiben dokular 48 saat taze %4 lük formaldehitte tesbit edilmeli ve bu ifllemlerden sonra bloklanmal d r. Bloklar ve kesitler TSE oldu u bilinecek flekilde saklanmal d r (22). T.Dalkara: TSE li hastalar n doku materyalleri veya vücut s v lar ile kontamine olmufl materyaller nas l dekontamine edilebilir? F.Söylemezo lu: Bu konuda önerilen yöntemlerden biri, 134 C da 1 saat buhar otoklav

7 144 Hacettepe T p Dergisi uygulamas d r. Baz laboratuvarlar 1er saatlik iki siklus veya NaOH uygulamas n takiben 1 saatlik otoklav n ancak yeterli olabilece i görüflündedirler. Otoklavlanamayacak materyal ve yüzeyler için önerilen bir di er yöntem de kimyasal dekontaminasyondur. Enfekte materyalin, 2N NaOH (80 mg/lt) içinde 1 saat veya 1N NaOH içinde 2 saat bekletilmesi önerilmektedir. NaOH alüminyum materyalde kullan lmamal d r. Bir di er kimyasal dekontaminasyon yöntemi de %5 lik NaOCl solüsyonunda 1 saat bekletmektir ki bu solüsyon da çelik için koroziftir (22). T.Dalkara: TSE lerin laboratuvar tan s nda kullan lan testler nelerdir? E.Demirpençe: BSE ve vcjd gibi epidemi oluflturabilen TSE lerin ortaya ç kmas, erken tan ve hatta tarama amac yla kullan labilecek testlerin gelifltirilmesi gere ini ortaya ç karm flt r. Bu hastal klara özgü merkezi sinir sistemi lezyonlar n n histopatolojik olarak tan nmas gold standard olarak tan mlan r; yani kesin tan koydurucu niteliktedir. Ancak bu amaçla antemortem olarak al nan biyopsi örne inde lezyonun saptanamamas olas l da vard r. Bunun nedeni henüz histopatolojik lezyonlar n geliflmemifl olmas veya biyopsi al nan bölgede lezyon bulunmamas olabilir. Oysa hastal n ayn evresinde dokuda hastal k etkeni olan PrP Sc proteini bulunmaktad r. Dolay s yla TSE lerin laboratuvar tan s nda kullan lan yöntemler esas olarak PrP Sc proteininin tan nmas na yöneliktir. Bu amaçla de iflik merkezlerde özgül antikorlar gelifltirilmifl ve antijen-antikor etkileflimine dayal yöntemler kurulmufltur. Bu yöntemlerden birincisi yukar da da belirtildi i gibi immünohistokimyasal yöntemdir (16). Avantaj, histolojik rezolüsyonunun yüksek olmas d r. Klasik histopatolojiden daha duyarl oldu u düflünülen bu yöntemin geliflmifl bir flekli ise histoblot olarak adland r lan yöntemdir (23). Burada dokudan al nan kesitin nitroselüloz membrana aktar lmas, proteinaz K ile muamele edilmesinin ard ndan önce PrP Sc antikoru ile, daha sonra da bu ilk antikora karfl gelifltirilmifl enzim-ba l ikinci bir antikorla inkübe edilmesi gerekmektedir. Enzimatik reaksiyon sonucu oluflan renklenme mikroskopta saptanabilmektedir. Bu yöntem parafin blokta bulunan dokulara da uygulanabilmektedir (paraffin-embedded tissue blot, PET blot) (24). Bir di er yöntem, proteinlerin kalitatif tayini için çok s k kullan lan Western blot yöntemidir (16, 24). Bu ve bundan sonraki yöntemlerde doku homojenize edilmekte ve proteinaz K ile muamele edilerek proteazlara dirençli PrP Sc proteininin saptanmas kolaylaflt r lmaktad r. Western blot yönteminde doku homojenat elektroforeze tabi tutulur ve bu flekilde proteinler büyüklüklerine göre ayr lm fl olur. Daha sonra elektroforez jelinden nitroselüloz veya benzeri bir membrana aktar lan proteinler, yukar da anlat lan flekilde iki aflamal olarak antikorlarla inkübe edilir. Burada da enzimatik reaksiyon sonucu genellikle kemilüminesans ile- PrP Sc proteinine özgü bantlar görünür hale gelir. Bu yöntemin üstünlü ü farkl boyuttaki PrP Sc proteinlerinin saptanmas na olanak sa lamas d r. PrP Sc proteininin farkl proteolitik kesime u ram fl veya farkl oranda glikozillenmifl flekilleri bu yöntemle ayr labilmektedir. Ancak henüz hangi protein izoformunun hangi klinik veya patolojik CJD ile korele oldu u kesinlik kazanmam flt r. Antijen-antikor etkileflimine dayanan yöntemlerden bir di eri olan ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) farkl flekillerde uygulanm flt r. Bu yöntemde antikorla kapl plastik mikrotitrasyon plaklar na örnek uygulanmakta ve antikora ba l bir deteksiyon sistemi ile antijen miktar ölçülebilmektedir. Bunun en çok kullan lan flekli olan sandviç ELISA da, örnek antikorla kapl plaklara uyguland ktan sonra deteksiyon sistemine ba l ikinci bir antikorla inkübasyon yap l r. Deteksiyon sistemi enzim-ba l bir kolorimetrik veya kemilüminesan reaksiyon olabilir. Sandviç ELISA yöntemi ile ayn prensibe sahip, ancak enzim-ba l bir deteksiyon sistemi kullanmayan geliflmifl bir yöntem ise DELFIA (dissociationenhanced lanthanide fluoroimmunoassay) olarak adland r lmaktad r (25). Burada ikinci antikor europium ile iflaretlenmifltir. Floresans h zland ran bir çözeltinin kullan lmas ndan sonra florometrede ölçüm yap l r. Çok hassas olan bu yöntem, konformasyon de iflikli inin izlenmesi ve PrP Sc -PrP C ay r m n n yap lmas amac ile de kullan labilir (conformation-dependent immunoassay, CDI). Bu yöntemde proteinaz K uygulamas na gerek yoktur. Sadece örne in bir k sm önce denatüre edilir, daha sonra hem denatüre edilmifl hem de edilmemifl örnekler yukar daki ifllemlerden geçirilir. ki proteinin denatürasyon ifllemine yan tlar farkl oldu u için, son konformasyonlar ve antikorla etkileflimleri de farkl olacakt r. DELFIA yönteminin bir baflka fleklinin de plaklar n bir antikor yerine, PrP Sc proteininin reseptörü oldu u ileri sürülen protocadherin-2 ile kaplanmas olabilece i düflünülmektedir. Antijen-antikor etkileflimine dayanan bir baflka duyarl yöntem ise kapiller immunelektroforez (CIE) yöntemidir (26). Burada örnekteki PrP Sc ile floresan iflaretli sentetik bir PrP nin ayn antikor için yar flmas

8 Dalkara, Gürsoy - Özdemir, Söylemezo lu, Demirpençe, Haz ro lu: Prion hastal klar 145 söz konusudur. Floresans, lazer ile indüklenen bir floresans detektörü ile ölçülür. Örnek, proteinaz K ile muamele edilmifl ve edilmemifl olarak çift çal fl l r. PrP Sc miktar artt kça, proteinaz K ile muamele edilmifl örnekte floresans azalacakt r. Bu grupta son olarak söz edebilece imiz yöntem, konfokal çift-renk floresans korelasyon spektroskopisi olarak adland r lan yöntemdir (27). Tek bir molekülü saptayabilen, çok duyarl bir yöntem oldu u ileri sürülmektedir. Burada örne in proteinaz K ile muamele edilmesine gerek yoktur. Örnek, farkl renkte floresan boyalarla iflaretlenmifl ve agregat oluflumlar n tan yabilen iki antikorla inkübe edilmekte, daha sonra oluflan yo un floresans bir konfokal lazer tarama cihaz ile ölçülmektedir. Bu yöntem ile serebrospinal s v da %100 do rulukla PrP Sc saptanabilmifltir. Avrupa Toplulu u nun 29 Aral k 2000 tarihli komisyon karar ile, 30 aydan büyük ve besin zincirine girecek olan bütün s rlarda postmortem BSE taramas yap lmas zorunlulu u vard r ve bu amaçla kullan labilecek üç test belirlenmifltir (28). Bunlardan biri (Prionics Check) Western blot yöntemini, di er ikisi (Enfer ve Platelia) ELISA yöntemini kullanmaktad r. Bu testlerin hepsi de duyarl l yüksek ve k sa sürede çok say da örne i sonuçland rabilme özelli ine sahip testlerdir; o nedenle de tarama testi olarak kullan lmaktad rlar. Bunlardan herhangi biri ile konacak olan tan n n histopatolojik olarak ta konfirme edilmesi gerekmektedir. Yukar da sözü edilen testlerin tamam vcjd tan s için de kullan labilir. T.Dalkara: Vücut s v lar ndan tan koydurabilecek laboratuvar testleri var m d r? E.Demirpençe: Vücut s v lar ndan al nan örneklerle tan koyulabilmesi hem örnek alma kolayl bak m ndan, hem de bu yolla oluflabilecek bulaflmalar izleyebilmek bak m ndan önemlidir. Özellikle kan ve kan ürünleri ile yap lm fl çok say da çal flma vard r (29). Bulafl c l kla ilgili çal flmalarda kan ürünlerinin tam kandan daha bulaflt r c oldu u, iv yolla verildiklerinde di er yollara (beyin içi, ic, sc, im, ip) k yasla bulaflma oran n n çok azald, ancak s f r olmad görülmüfltür. Ayr ca hastal n hem inkübasyon döneminde, hem de klinik faz nda bulafl c l k vard r. Bu çal flmalar al nan örnek insan kaynakl olsa bile- laboratuvar hayvanlar na inokülasyonla gerçeklefltirilmektedir ve henüz epidemiyolojik olarak kan veya kan ürünü ile olufltu u kan tlanm fl bir olgu yoktur. Ancak, özellikle vcjd de lenforetiküler organ tutulumu nedeniyle kanda PrP Sc proteini bulunma olas l n n yüksek oldu u düflünülmüfl ve yukar da anlat lan yöntemlerden baz lar kullan larak PrP Sc aranm flt r. Western blot yöntemi ile yap lan çal flmalar çöktürme, süzme veya kolon kromatografisi gibi saflaflt rma ifllemlerinin PrP Sc düzeyini azaltt n göstermifltir. Bu yöntemlerin kanda PrP Sc taramas için deteksiyon eflikleri Tablo 2 de gösterilmifltir. Erken tan ve tarama amac yla, örnek olarak vücut s v lar ndan birini kullanabilen bir test gelifltirilmesi için çal flmalar sürmektedir. Ne yaz k ki, bu hastal klarda saptanabilen bir immun yan t olmad için serolojik testler gelifltirilmesi mümkün olmam flt r. Serebrospinal s v da veya serumda saptanabilen baz proteinlerin ise belirleyici olabilece i öne sürülmüfltür. Bu proteinlerden biri proteinidir. Bu grup proteinler protein fosforilasyonunun regülasyonunda ve MAP kinaz (mitogen-activated protein kinase) yolunda rol al rlar. Özellikle g izoformu sinir dokusuna spesifiktir. Bir di er protein S100 proteinidir. S100 asidik bir kalsiyum ba lay c proteindir ve iki altbirimin (a ve b) homodimer ve heterodimerleri olarak bulunur. Bunun beyine özgü formu S100b olarak adland r l r ve esas olarak glial hücrelerde bulunur. Kafa travmalar ndan sonra serum ve serebrospinal s v da yükselir. Astrositik aktivite ile iliflkili olmas, CJD tan s nda kullan labilece ini düflündürmüfltür. Çal flmalarda önerilen di er iki protein ise nöron spesifik enolaz (NSE) ve tau proteinidir. NSE sinir dokusuna özgü bir enzimdir, tau ise mikrotübülbirleflik bir proteindir. Alzheimer hastal nda tau proteininin hiperfosforile formu çift sarmal filamentler halinde beyinde birikmektedir. Bu proteinler ayr ayr pek çok çal flmaya konu olmufl ve özellikle ve S100b için ümit verici sonuçlar elde edildi i öne sürülmüfltür (30, 31). Ancak, de iflik nörodejeneratif hastal klarda serebrospinal s v da bu dört parametreyi ayn anda karfl laflt ran yeni bir çal flma, hiçbirinin yeterince özgül ve duyarl olmad n ortaya koymufltur (32). Bu testlerin hiçbiri sporadik CJD ile vcjd nin ay r c tan s nda kullan lmamal d r. Hatta en güçlü aday olan proteininin negatif olmas n n, vcjd tan s n elememesi gerekti i sonucuna var lm flt r. Son olarak henüz kullan ma girmemifl iki testten söz edilebilir. Bunlardan biri immunopcr olarak adland r lan ve PrP Sc proteinine uyguland takdirde di er yöntemleri silece i düflünülen bir yöntemdir. Burada ölçülecek antijene karfl gelifltirilmifl bir antikor ile bir DNA parças n n birbirine ba lanmas ve daha sonra bu DNA n n PCR ile amplifiye edilmesi söz konusudur (29). Di eri ise daha çok toplumda vcjd ye yatk nl taramak amac yla kullan labilecek

9 146 Hacettepe T p Dergisi bir testtir. Bugüne de in incelenen vcjd olgular 129. kodonda metiyonin için homozigot olarak bulunmufltur (33). Henüz kesin bir sonuca varmaktan kaç n lsa da, bu genetik özelli e sahip kiflilerin izlenmesinin önemli oldu u düflünülmektedir. KAYNAKLAR: 1. Soto C, Sabario GP. Prions: disease propagation and disease therapy by conformational transmission. Trends in Molecular Medicine 2001; 7: Hope J. Prions and neurodegenerative diseases. Current opinion in genetics and development 2000; 10: Prion Diseases. Merritt's Textbook of Neurology, Ninth eds. Williams and Wilkins, Baltimore Ed. By Lewis P. Roland.: Brown RD. Prion and prejudice: normal protein and the synapse. Trend in Neuroscience: 2001; 24: Richardson EP, Masters JL. The Nosology of Cruetzfeldt-Jacob Disease and conditions related to the accumulation of PrP cjd in the nervous system. Brain Pathology 1995: Ghetti B, Dlouhy SR, Giaccone G, Bugiani O, Frangione B, Farlow MR, Tagliavini F. Gerstmann- Straussler-Scheinker Disease and the India Kindred. Brain Pathology 1995; Gambetti P, Parchi P, Peterson RB, Chen SG, Lugaresi E. Fatal Familial Insomnia and Familial Creutzfeldt-Jacob Disease: Clinical, Pathological and Molecular Features. Brain Pathology 1995; Will RG, Ironside JW, Cousens SN, Estibeiro K, Poser S, Pocchiari M, Hofman A, Smith PG. A new variant of Creutzfeldt-Jacob disease in UK. Lancet 1996; Milli UH ve Haz roglu R. Veteriner Patoloji, I.Cilt, kinci Bask, Özkan Matbaac l k Ltd fiti. Ankara, Internet NM/madcow96.html Eriflim Tarihi Internet Eriflim Tarihi Willesmith, JW, Wells, GAH, Cranvwell, MP and Ryan, JBM. Bovine spongiform encephalopathy: Epidemiological studies. Vet Rec 1988; 123: Internet. cjdlink.htm Eriflim Tarihi Yaz c o lu, Ö. Seminer, 1997, s Collinge J. Variant Creutzfeld-Jakob Disease. Lancet 1999; 354: Ironside JW, Head MW, Bell JE, McCardle L, Will RG. Laboratory diagnosis of variant Creutzfeldt- Jakob disease. Histopathology 2000; 37: Mikol J. Neuropathology of prion disease. Biomed & Pharmacother 1999; 53: Schulz-Schaffer WJ, Giese A, Windl O, Kretzschmar HA. Polymorphysim at codon 129 of the prion protein gene determines cerebellar pathology in Creutzfeldt-Jakob disease. Clin Neuropathol 1996; 15: McLean CA, Ironside JW, Alpers MP, et al. Comparative neuropathology of kuru with the new variant of Creutzfeldt-Jakob disease: Evidence for strain of agent predominating over genotype of host. Brain Pathol 1998; 8: Hilton DA, Fathers E, Edwards P, Ironside JW, Zajicek J. Prion immunoreactivity in appendix before clinical onset of variant Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet 1998; 352: Ironside JW, Hilton DA, Ghani A,et al. Retrospective study of prion-protein accumulation in tonsil and appendix tissues. Lancet 2000; 355: Budka H, Aguzzi A, Brown P, et al. Tissue handling in suspected Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion Diseases). Brain Pathol 1995; 5: Schulz-Schaeffer WJ, Tschöke S, Kranefuss N, Dröse W, Hause-Reitner D, Giese A, Groschup MH, Kretzchmar HA. The paraffin-embedded tissue blot detects PrP Sc early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol 2000; 156: Asher DM, Padilla AM, Pocchiari M. Meeting Report: WHO consultation on diagnostic procedures for transmissible spongiform encephalopathies: need for reference reagents and reference panels. Biologicals 199; 27: MacGregor I, Hope J, Barnard G, Kirby L, Drummond O, Pepper D, Hornsey V, Barclay R,

10 Dalkara, Gürsoy - Özdemir, Söylemezo lu, Demirpençe, Haz ro lu: Prion hastal klar 147 Bessos H, Turner M, Prowse C. Application of a time-resolved fluoroimmunoassay for the analysis of normal prion protein in human blood and its components. Vox Sang 1999; 77: Scmerr MJ, Jenny AL, Bulgin MS, Miller JM, Hamir AN, Cutlip RC, Goodwin KR. Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with a transmissible spongiform encephalopathy. J Cromatogr A 1999; 853: Bieschke J, Giese A, Schulz-Schaeffer W, Zerr I, Poser S, Eigen M, Kretzchmar H. Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: Commission decision of 29 December Official Journal of the European Communities, Document number C 2000; Brown P, Cervenakova L, Diringer H. Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J Lab Clin Med 2001; 137: WJ, Kretzchmar HA, Felgenhauer K. How to improve the clinical diagnosis of Creutzfeldt- Jakob disease. Brain 1999; 122: Otto M, Wiltfang J, Schütz E, Zerr I, Otto A, Pfahlberg A, Gefeller O, Uhr M, Giese A, Weber T, Kretzchmar HA, Poser S. Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease by measurement of S100 protein in serum: prospective case-control study. Br Med J 1998; 316: Green AJE, Thompson EJ, Stewart GE, Zeidler M, McKenzie JM, MacLeod MA, Ironside JW, Will RG, Knight RSG. Use of and other brainspecific proteins in CSF in the diagnosis of variant Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001; 70 : Will RG, Zeidler M, Stewart GE, MacLeod MA, Ironside JW, Cousens SN, McKenzie J, Estibeiro K, Green AJE, Knight RSG. Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol 2000; 47: Cell death mechanisms in prion diseases. Cell Death and Diseases of Nervous Sytem. Humana Press, New Jersey, Ed by Vassilis E. Koliatsos, Rajiv R. Ratan: Poser S, Mollenhauer B, Krauss A, Zerr I, Steinhoff BJ, Schroeter A, Finkenstaedt M, Schulz-Schaeffer