SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi. Anahtar Kelimeler: SNARE proteinler, ekzositoz, botulizm, tetanoz.

DERLEME REVIEW Hacettepe T p Dergisi 2011; 42:133-140 SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi Asl Çakar 1, Cumhur Özkuyumcu 2 1 Uzm. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara 2 Prof. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara ÖZET SNARE proteinler maya ve memeli hücrelerinde 60 tan fazla çeşidi bulunan büyük bir protein süperailesidir. SNARE proteinlerin en önemli rolleri, veziküllerin plazma membranıyla ya da vezikülün diğer bir vezikülle füzyonuna aracılık ederek madde geçişini sağlamaktır. SNARE proteinler; veziküllerin membranında bulunan veziküler (v-snare) ve plazma membranı gibi hedef kompartımanda bulunan target (t-snare) olmak üzere iki sınıf altında toplanmaktadır. Veziküler SNARE proteinler hedef membranda bulunan target-snare proteinler ile etkileşime girerek SNARE kompleks oluşumuna ve membran füzyonuna neden olur. Bugüne kadar sinaptik vezikül ile presinaptik membran arasındaki sinir ileticilerinin geçişinde SNARE proteinlerin rolü üzerinde çok durulmuştur. Bu SNARE proteinler botulizm ve tetanoza neden olan bakteriyel nörotoksinlerin hedefidir. Anahtar Kelimeler: SNARE proteinler, ekzositoz, botulizm, tetanoz. ABSTRACT SNARE proteins and the interaction with the microorganisms SNARE proteins are a large protein superfamily consisting of more than 60 members in yeast and mammalian cells. The primary role of SNARE proteins is to mediate vesicle fusion, that is, the exocytosis of cellular transport vesicles with the cell membrane or with a target compartment. SNAREs can be divided into two categories: vesicle or v-snares, which are incorporated into the membranes of transport vesicles, and target or t-snares, which are located in the membranes of target compartments. Vesicular SNAREs (v-snares) interact with their target SNAREs (t-snares) to form SNARE complexes which mediate membrane fusion. The best-studied SNAREs are those that mediate docking of synaptic vesicles with the presynaptic membrane. These SNAREs are the targets of the bacterial neurotoxins responsible for botulism and tetanus. Key Words: SNARE proteins, exocytosis, botulism, tetanus. Prokaryot ile ökaryot hücreler arasındaki en büyük fark ökaryot hücrelerde organellerin bulunmasıdır. Hücre içinde gerek bu organeller arasında gerekse plazma membranıyla bu kompartımanlar arasında madde alışverişine dayanan sürekli bir trafik akışı vardır. Bu alışveriş iki membranın füzyonu ile meydana gelir [1]. Ökaryotik hücrelerde organeller arası ve organeller ile plazma membranı arasındaki füzyonda temel görev alan proteinler SNARE (soluble N-ethylmaleimidesensitive factor activating protein receptor) proteinlerdir [2]. Cilt 42 Say 3 2011 133

Çakar ve Özkuyumcu SNARE proteinler 18-32 kda ağırlığında integral membran proteinler olup, N terminal bölge, C terminal bölge ve ortada SNARE motif olarak adlandırılan tekrarlayan heptad ünitelerinden oluşan bir bölge olmak üzere üç kısımdan oluşmaktadır. SNARE proteinlerde C terminal kısım membranda, kısmen korunmuş olan amino terminal kısım sitoplazmada bulunmaktadır. Amino terminal sonrasında bulunan ve SNARE motif olarak adlandırılan yaklaşık 70 aminoasitten oluşan bölge korunmuş bölgedir [3]. SNARE proteinlerin özgüllük ve kompleks oluşturabilme olmak üzere iki önemli özelliği bulunmaktadır; Özgüllük: Her SNARE proteinin yer aldığı hücre ve hücredeki lokalizasyonu farklı ve özgüldür. Vezikülde bulunan SNARE proteini daima vezikülde, plazma membranında bulunan SNARE proteini ise daima plazma membranında yer alır. Bu nedenle hücredeki lokalizasyonlarına göre vezikülde bulunan SNARE proteinlerine v-snare, plazma membranında bulunan SNARE proteinlerine ise t-snare (target-snare) proteinleri adı verilir. SNARE proteinlerin özgüllüğü sadece lokalizasyonlarıyla sınırlı değildir. Bir SNARE proteini daima belirli SNARE proteinleriyle bağlanabilir [4]. Kompleks oluşturma: SNARE proteinlerin diğer bir özelliği de kompleks oluşturabilmeleridir. Bu fonksiyon da özgüllük gibi sıkı kurallara bağlıdır. Oluşan SNARE kompleksi her zaman dört SNARE proteininden oluşmaktadır. Bir SNARE proteini vezikül membranında, diğer üç SNARE proteini ise plazma membranında yer almaktadır. Kompleks oluşumu SNARE proteinin distal ucundan, diğer bir deyişle N- terminal bölgesinden başlar. SNARE proteinleri birbiri üzerine kıvrılarak çok sıkı bir sarmal oluşturur. Oluşan bu yapı sodyum dodesil sülfata (SDS) dirençli ve termostabildir. SNARE kompleksin erime derecesi 90 C dir. Oluşan SNARE kompleksinde 16 katman ayrıştırılmıştır. En ortadaki katman SNARE proteinlerinin motiflerinin biraraya gelmesinden oluşmaktadır. Bu bölgeye iyonik merkez ya da 0 noktası adı verilir. v- SNARE proteinlerinde motifin tam ortasında arjinin aminoasidi, diğer membranda bulunan SNARE proteinlerin motiflerinin tam ortasında ise glutamin aminoasidi bulunur. Dolayısıyla bir SNARE kompleksi oluştuğunda iyonik bölgede bir arjinin (R), üç glutamin (Q) aminoasidi bulunur. Bu oran yani 1R/3Q oranı tüm SNARE kompleksler için geçerlidir. Bu özellik göz önüne alınarak SNARE proteinleri farklı bir şekilde sınıflandırmak da mümkündür. İyonik bölgede arjinin aminoasidi içeren proteinlere R-SNARE, glutamin aminoasidi içeren proteinlere ise Q-SNARE adı verilebilir. Aslında bu sınıflama daha doğru bir yaklaşımdır. Zira füzyon her zaman vezikül ile plazma membranı arasında olmaz. İki vakuolün füzyonu sırasında bir vakuolde R- SNARE diğer vakuolde ise üç adet Q-SNARE proteini bulunmak zorundadır. Q-SNARE proteinlerinin membrandaki yerleşimleri de özgüldür. Üç protein her zaman aynı pozisyonda yer alır. Hedef membranda bulunan üç Q-SNARE proteininin lokalizasyonu a, b ve c olarak isimlendirilir. Bir protein eğer a pozisyonunda ise her zaman bu pozisyonda yer alır. Diğer bir deyişle SNARE proteinleri arasındaki hem bağlanma hem de lokalizasyonlar son derece özgüldür [5]. Kompleks oluşumu sırasında SNARE proteinleri membranın distal ucundan kıvrılmaya başlar. Transmembran domaine kadar devam eden bu kıvrılma iki membranı birbirine yaklaştırır. Oluşan kompleks, membranı strese sokarak füzyona hazırlar. SNARE kompleksler her zaman membrana paralel yer alır. Bu organizasyon füzyon reaksiyonunda lipid tabakaların birbirine yakınlaşması için önem taşımaktadır (Şekil 1). SNARE kompleks oluşumu sırasında açığa çıkan enerji transmembran domainlerden geçerek lipid tabakasının stabilizasyonunu bozar ve füzyonun gerçekleşmesine yardımcı olur [6]. Sinir hücrelerinde yer alan SNARE proteinleri SNARE proteinler, sinir hücreleri arasında sinir ileticilerinin iletilmesinde son derece önemli bir rol alır. Sinir ileticileri nöronlar içinde sinaptik veziküllerde bulunur ve diğer sinapsa ekzositoz yoluyla gönderilir. Nöronal aksonun presinaptik membranı hücre uyarımı ile hızlı ekzositik olayların meydana geldiği bölgedir. Uyarımı takiben sinir ileticisi taşıyan sinaptik veziküller presinaptik membranla füzyona girerek içeriklerini sinaptik boşluğa bırakır ve postsinaptik hücrede sinir ileticilerine özgül reseptörler aracılığıyla hücre içine girer [7]. Sinaptik veziküllerde bulunan SNARE proteini VAMP veya synaptobrevin adını alır. Plazma membranında ise Syntaxin ve SNAP-25 olmak üzere iki SNARE protein bulunmaktadır (Şekil 2). SNAP-25 proteini tam orta noktasında bulunan sistein aminoasidi ile membrana tutunur. N- ve C- terminal bölgeleri tekrarlayan heptad dizilimlerini içerir ve iki farklı SNARE proteini gibi işlev görür [8-10]. Füzyonun olabilmesi için ne kadar SNARE kompleksinin oluşmasına ihtiyaç vardır? Her oluşan SNARE kompleks 35 kcal/mol enerjinin açığa çıkmasına neden olur. Füzyon için gereken enerji ise yaklaşık 50-100 kcal/mol dür. Dolayısıyla oluşan yaklaşık üç SNARE kompleksi membran füzyonu için yeterlidir [11]. Füzyon hızını belirleyen etmenler SNARE proteinlerin oluşturduğu komplekse bağlı gelişen füzyonun hızı değişkendir. Bazı hücrelerde füz- 134 H ACETTEPE T IP D ERG S

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi Şekil 1. SNARE proteinlerine bağımlı membran füzyonu sırasında plazma membranında bulunan üç SNARE proteini ile veziküler membranda bulunan SNARE proteininin kompleks oluşturarak iki membranı füzyona hazırlaması [2]. Şekil 2. Sinaptik vezikül ve plazma membranında yer alan SNARE proteinleri [17]. yon kinetiği 1 milisaniye gibi çok kısa sürelerde gerçekleşirken, bazı hücrelerde 10 saniye ile dakikalar arasında değişmektedir. Bu farklılığın altta yatan sebebi, lokal membran yapısı ya da SNARE proteinlerinin konsantrasyonu olabileceği gibi, diğer regülatör proteinlerin de füzyonda rol oynadığı bir gerçektir. Konstütif yolakta, hücre içi veziküller plazma membranına ulaştıklarında spontan olarak ekzositoza yol açar. Oysa nöronal hücrelerde meydana gelen regülatif sekresyonda veziküller önce plazma membranında akümüle olarak füzyona hazırlanır ve bir uyarım sonucu (serbest kalsiyum miktarının lokal olarak artmasıyla) füzyon gerçekleşir. Füzyon sırasında veziküller içinde taşınan sinir ileticileri, vezikülle hedef membranın tamamen füzyonu yerine, geçici bir por oluşturularak salınır. Bu fenomene kiss and run fenomeni adı verilir. Bu şekilde sinir ileticileri 1 milisaniye içinde salınırken, konstütif yolakta bu süreç 1000 kat daha yavaş işler [12]. Kiss and run fenomeni dışında regülatif ekzositozun bu kadar hızlı olmasının farklı nedenleri de bulunmaktadır. SNARE proteinler füzyonun özünü oluşturmakla birlikte füzyonun gerçekleşebilmesi için başka proteinlere de ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle SNARE proteinlerine minimal füzyon makinesi adı verilmektedir [13]. Füzyonu kontrol eden diğer proteinler, füzyonu tetikleyen proteinler ve spontan füzyonun oluşmasını engelleyen proteinlerden oluşmaktadır [14]. Regülatif ekzositozda füzyonun gerçekleşmesi için bir uyarıma ihtiyaç vardır. Bu uyarım lokal kalsiyum miktarının artışıdır. Nöronal hücrelerde kalsiyum sensör proteini synaptotagmindir. Synaptotagminin kalsiyuma bağlanabilme yeteneği ekzositozu hızlandırır. Synaptotagminin N terminali vezikül membranına bağlıdır ve sitoplazmada iki kalsiyum bağlanma bölgesi bulundurur. Synaptotagmin kalsiyuma bağlandığında t-snare proteinlerine bir sinyal ileterek, bu proteinlerin v-snare proteini ile bağlanmalarını sağlar. Veziküller sinapslarda kalsiyum giriş bölgelerinin hemen yakınında toplanır. Bu lokalizasyon füzyonun hızlı olmasının nedenlerinden biridir. Synaptotagmin düşük hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda, SNARE kompleksine bağlanarak bir tür kıskaç görevi görür. Ancak dışarıdan kalsiyum sinyalinin alınması sonucu hücre içi kalsiyum yoğunluğu arttığında synaptotagmin SNARE kompleksinden ayrılarak kalsiyuma bağlanır ve Cilt 42 Say 3 2011 135

Çakar ve Özkuyumcu SNAP proteinlerin SNARE kompleksine bağlanmasına neden olur [15]. Synaptotagmin dışında SNARE proteinlerin yer aldığı membran füzyonunda SNARE proteinlerine bağlanarak füzyonu kontrol eden farklı proteinler de bulunmaktadır. Bunlardan biri SM proteinlerdir. SM proteinler isimlerini mayalarda bulunan Sec1 ve memeli proteini olan Munc18 den almıştır. Memeli hücrelerinde üç farklı Munc proteini bulunur. Munc18 nöronlarda bulunan izoformdur [16]. SM proteinleri, aynı SNARE proteinde farklı bölgelere bağlanarak füzyonu pozitif veya negatif yönde regüle eden proteinlerdir. SM protein, bir tür t-snare olan syntaxin in N terminal bölgesinde bulunan Habc bölgesine bağlanarak bu bölgenin geriye doğru katlanmasına ve SNARE motifine bağlanmasına neden olur. Bu bağlanma syntaxin proteinini kapalı konuma getirerek kompleks oluşturabilme kabiliyetini engeller. SM proteininin bu fonksiyonu füzyonu engeller ve negatif regülasyona neden olur. Ancak SM proteini aynı zamanda pozitif bir regülatör olarak da fonksiyon gösterebilir. SM proteini N-terminal ucu ile syntaxin in N- terminal bölgesine bağlanır. Bu bağlanma sonucu motifi kapalı olan Syntaxin üzerindeki inhibitör etki kalkarak syntaxin açık hale gelir ve kompleks oluşturmaya hazır durumdadır. Diğer bir deyişle SM proteinine bağlı negatif regülasyon; SM nin syntaxin in SNARE motifine bağlanmasıyla, pozitif regülasyon ise SM nin syntaxin in N-terminaline bağlanmasıyla gerçekleşir. Bu regülasyon SNARE kompleks oluşumunu her zaman tetikte tutmakta ve koşullar uygun olduğunda baskılayıcı etkinin ortadan kalkması sonucu füzyonun hızla gerçekleşmesine neden olmaktadır [17-19]. Diğer bir SM proteini de kompleksindir. Kompleksin, kalsiyum hücre içine girip synaptotagmine bağlanana kadar oluşmuş SNARE komplekse bağlanarak bu kompleksi dondurur. Synaptotagminin kalsiyuma bağlanmasını takiben SNARE kompleks üzerinden ayrılan kompleksin, hali hazırda oluşmuş olan SNARE kompleksinin hızlı bir şekilde füzyonu başlatmasına yol açar [20,21]. Özetle, kalsiyumun hücre içine girmesiyle uyarımı alan hücre, synaptotagminin pozitif etkisiyle füzyona hazır hale gelir. SNARE proteinler üzerindeki negatif regülasyonun ortadan kalkması sonucunda oluşan SNARE kompleksi ile sinir ileticilerinin ekzositozu gerçekleşmektedir. Ekzositozu takiben füzyona girmiş hücrenin ve SNARE proteinlerinin tekrar eski hallerine gelmeleri gerekmektedir. SNARE proteinlerin biraraya gelmesi ve tekrar ayrılması ATP ye bağımlı olarak gerçekleşir. Füzyonda SNARE kompleks oluşumu enerjinin açığa çıkmasına neden olmaktadır. Ancak SNARE kompleksin tekrar eski haline gelmesi için enerjiye ihtiyaç vardır. Hücre içinde kalsiyum konsantrasyonunun artması sitozolik proteinler olan α ve γ-snap ın [çözünür N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) bağlayan proteinler] SNARE kompleksine bağlanmasına ve NSF nin aktive olmasına yol açar. NSF tarafından hidrolize edilen ATP, SNARE kompleksin bozulmasına yol açarak SNARE proteinlerin eski haline dönmesini sağlar [1]. SNARE proteinler ve mikroorganizmalarla ilişkisi Günümüz bilgileri ışığında, birçok mikroorganizmanın konakta canlılığını sürdürebilmesi ve infeksiyon oluşturabilmesi için SNARE proteinlerine ihtiyaç duyduğu bilinmektedir. SNARE protein ve mikroorganizma ilişkisi söz konusu olduğunda öncelikli olarak Clostridium cinsi bakteriler akla gelmektedir. Clostridium cinsi içinde yer alan Clostridium botulinum ve Clostridium tetani konakta salgıladıkları toksinler ile infeksiyona yol açar. Bu toksinlerin işlev görmesi ise SNARE proteinlerine bağlıdır. C. botulinum tarafından üretilen botulinum toksini (BoNT), gerek hayvanlarda gerekse insanlarda gevşek paralizlerle seyreden hayatı tehdit edici nörolojik hastalığa neden olur. Botulinum toksinleri A, B, C1, D, E, F ve G olmak üzere yedi serotipten oluşmaktadır [22,23]. Sinir kas kavşağında asetilkolin salınımı meydana gelmektedir. Bu nedenle sinaptik veziküller devamlı oluşmakta, asetilkolin ile dolmakta, füzyona girerek asetilkolin salınımını gerçekleştirmekte ve tekrar döngüye katılmaktadır. Botulinum nörotoksini, periferal kolinerjik terminallere tutunarak içeri girer ve asetilkolin salınımını bloke ederek yumuşak paralizlere neden olur. Eğer paraliz solunum kaslarına kadar ilerlerse solunum yetmezliğinden hasta kaybedilir. Ancak dışarıdan solunumun desteklenmesiyle veya hafif olgularda hastalık geri dönüşümlüdür. C. tetani tarafından üretilen tetanoz toksini (TeNT) ise tek bir serotip içerir. Tetanoz toksini motor nöron terminale bağlanır ve retrograt yolla akson boyunca ilerleyerek spinal korda ulaşır. Spinal kordda periferal motor nöronların dendritlerinden inhibitör nöronlara geçer. Burada inhibitör sinir ileticilerinden olan glisin ve γ-aminobütirik asit (GABA) salınımını bloke ederek spastik paralizlere neden olur. Tetanoz toksini ile meydana gelen hastalık çoğu zaman fatal seyirli olup, ölüm solunum ya da kalp yetmezliği sonucu gelişir. Tetanoz ve botulinum toksinlerinin birbiriyle tam ters etki göstermelerine rağmen, nörotoksinler aynı nöronal fonksiyonu inhibe ederler; diğer bir deyişle nöroekzositoz inhibe olur [24-26]. 136 H ACETTEPE T IP D ERG S

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi Clostridium toksinlerinin yapısı Clostridium toksinleri (CNT) 150 kda ağırlığında tek bir polipeptid zinciri şeklinde sentez edilir. Bu zincir daha sonra bakteriyel ve doku proteazları tarafından 50 kda luk hafif zincire (LC) ve 100 kda luk ağır zincire (HC) ayrılır. Proteazlar ile kırılma sonrasında oluşan iki zincir birbirine disülfid bağlarıyla kovalent bağlı kalır. Bu bağlanma geri dönüşümlüdür ve toksin nöronal sitozole geçtiğinde birbirinden ayrılır. Toksinin ağır zincir (HC) bölgesi nöronlarda hücre yüzeyine bağlanarak hafif zincir (LC) parçasının sitozole girişine neden olur [27,28]. Metalloproteaz aktivitesine sahip olan bu toksinlerin aminoasit sekansları düşük homoloji göstermekle beraber her iki toksinin hafif zincirinde çinkoendopeptidazların katalitik bölgesinde yer alan ortak bir motif (His-Glu-x-x-His) bulunmaktadır. Çinko, nörotoksinlerin hücre içi aktivitesi için gereklidir. Toksin motifinde bulunan histidin çinko atomuna bağlanır. Glu234 ise su molekülünün polorizasyonunu gerçekleştirmektedir [29]. Toksinin sinir hücrelerinde etki göstermesi; membrana bağlanma, internalizasyon ve proteoliz aktivitesi basamaklarını içermektedir. Sinir hücre membranlarında bol miktarda bulunan glinkospingolipid sınıfında yer alan kompleks gangliyosidler CNT lerin bilinen reseptörleridir [30]. Polisialogangliyosidlerin oligosakkarid kısmı, toksinin ilk bağlanmasında görevlidir. Bu oligosakkaridler birer anten görevi görerek intersinaptik sıvıda bulunan toksin molekülünü yakalar. Toksinlerde bulunan HC bölgesi bu özgül bağlanmadan sorumludur. Daha sonra her bir toksin kendisi için özgül olan diğer bir reseptöre bağlanır. Bu çift reseptöre bağlanma, toksinin bağlanma afinitesi ve özgüllüğünü belirler. Bu özgül bağlanma TeNT ve BoNT için bundan sonraki hedefin belirlenmesinde önem taşır. TeNT nin bağlandığı özgül reseptörler, toksini vezikül içinde retrograt yolla motor nöronlara taşırken, BoNT synaptotagmin gibi transmembran sinaptik vezikül proteinlerine bağlanarak periferal sinir ucuna doğru ilerler. Toksin endositik vakuol içinde hücre içine alındıktan sonra etkisini gösterebilmesi için hafif zincirin sitoplazmaya ulaşması gerekmektedir. Vezikül içindeki asidik ph nedeniyle toksinde bulunan translokasyon bölgesi vezikül membranının hidrofobik yapısına ekspoze olmak amacıyla konformasyonel değişime uğrar ve bir iyon kanalı oluşturarak LC nin sitozole geçişini sağlar. Sitoplazmada toksinin hafif zincir kısmının ayrılmasıyla hedef SNARE proteinlerin proteolizi gerçekleşir [31]. Botulinum ve tetanoz toksinleri nöronal SNARE proteinlerde özgül peptid bağlarını kırar. BoNT/A ve BoNT/E özgül olarak SNAP-25, B, D, F ve G serotipleri, tetanoz toksini ise synaptobrevin üzerine etkilidir. BoNT/C1 ise syntaxin ve SNAP-25 olmak üzere iki SNARE proteinini substrat olarak kullanır. Görüldüğü gibi bazı botulinum toksinleri ile tetanoz toksini aynı protein üzerine etki göstermektedir. Etki mekanizması aynı iken tetanoz ve botulinum toksinlerinin etkilerinin farklı olmasının nedeni etki ettikleri hücrelerin farklı olmasından kaynaklanmaktadır [32,33]. Toksinlerdeki hafif zincirin aktif bölgeleri son derece benzer olmasına karşın, LC nin SNARE proteinleri kırma bölgeleri seçicilik gösterir. Örneğin; BoNT/A SNAP-25 te Gln197-Arg198 aminoasitler arasındaki bağı keserken, BoNT/C1 bir aminoasit sonra bulunan Arg198-Ala199 arasını keser. Bu seçiciliğin nedeni ne olabilir? SNARE protein toksinin etrafını sararak enzimle substratı arasındaki etkileşimin aktif bölge etkileşimiyle sınırlı kalmamasını sağlamaktadır. Ayrıca, SNAP- 25 in N-terminalinin alfa heliks yapısı ve C-terminalinin beta-sheet yapısı etkin substrat bağlanma ve kırılma bölgelerinin oluşmasına neden olmaktadır. Toksin tarafından kullanılan bu alışılmadık substrat enzim etkileşimi enzimin konformasyonel olarak kendini düzenleyerek SNARE proteinindeki hedef bölgeyi kesmesini sağlar [34]. Enzim seçiciliğinin diğer bir nedeni de hedef proteinde yüksek düzeyde korunmuş olan motiflerin bulunmasına bağlıdır. VAMP da V1 ve V2 olmak üzere iki motif, SNAP-25 te S1 den S4 e kadar dört motif, syntaxin de ise X1 ve X2 olmak üzere iki motif bulunmaktadır [35]. Botulinum toksinlerinde, toksinin aktivitesini gösterdiği aktivasyon bölgesi (AS) ve SNARE proteinlerine bağlanmadan sorumlu B bölgesi bulunmaktadır. Botulinum toksin serotip A ve serotip E, etkilerini aynı SNARE protein üzerinde göstermektedir. Diğer çinko proteazların aksine BoNT SNAP-25 te geniş bir bölgeyi substrat olarak tanıyabilir. Toksinin AS bölgesinde bulunan, P1, P2, P3, P4 ve P5 rezidüleri SNAP-25 için kesim bölgelerini oluşturur. Botulinum toksin serotip A, SNAP-25 in 156-202. aminoasitleri arasındaki dokuz aminoasitten oluşan bölgeyi keser. Kesim sonrasında SNAP-25 ten kopan dokuz aminoasitten oluşmuş C-terminal bölgesi toksinden uzaklaştırılır ve toksin yeni hedefine yönelir. Botulinum toksin serotip A ile kırılmış SNAP-25 in N- terminali syntaxin ile heterodimer oluşturabilir ancak oluşan bu heterodimer fonksiyonel değildir [36,37]. Botulinum toksin serotip E ise SNAP-25 in C-terminal bölgesinde 26 aminoasitlik bir bölgeyi keserek SNAP- 25 ten ayırır [38]. Botulinum A toksini ile intoksikasyonun iyileşme süreci 3-12 ay arasında değişirken, bu süreç E toksini ile Cilt 42 Say 3 2011 137

Çakar ve Özkuyumcu intoksikasyonda yaklaşık bir aydır. İyileşme süreçleri arasındaki bu farkın nedenine yönelik çeşitli yaklaşımlar bulunmakla birlikte, iki yaklaşım ön plana çıkmaktadır. BoNT/A ve BoNT/E ile meydana gelen ekzositoz inhibisyon sürelerinin farklı olmasının nedenlerinden biri toksinin hücre içindeki lokalizasyonu ile ilgili olabilir. Botulinum A ve E toksinleri nöronal hücrelerde farklı bölgelerde bulunur. En uzun etki süresine sahip olan A toksininin LC si plazma membranında, daha az süre etki gösteren E toksininin LC si ise sitoplazmada lokalizedir. Olası bir açıklama; BoNT/A toksinin LC sinin hücre içindeki lokalizasyonunun plazma membranında olması, nöronal hücrelerde var olan normal degredatif yolaktan kaçabilmesine neden olur [39]. Ancak bu farklılığın daha önemli bir nedeni bulunmaktadır. Botulinum A toksini tarafından kesilen SNAP-25, syntaxin ile heterodimer oluşturabildiği gibi SNARE kompleks oluşumunu da engellemez. Ancak oluşan bu kompleks fonksiyonel değildir. Ayrıca, hasarlı SNAP-25 in kompleks içinde olması hücre temizleme mekanizmaları tarafından ortamdan uzaklaştırılmasına engel olmaktadır. Diğer taraftan E toksini ile kesilen 26 aminoasitlik bölge nedeniyle hasara uğramış SNAP-25 syntaxin ile heterodimer oluşturamadığı gibi SNARE kompleks formasyonunda da yer alamaz. Savunmasız kalan hasarlı SNAP-25 hücrenin temizleme mekanizmalarıyla bölgeden uzaklaştırılır ve yerine yeni sentezlenen SNAP-25 gelir. BoNT/A ve BoNT/E intoksikasyonu sonucunda iyileşme sürelerindeki farklılığın en önemli nedeni olarak bu mekanizma düşünülmektedir [40-42]. SNARE proteinler ve diğer mikroorganizma etkileşimleri SNARE proteinler ile mikroorganizma ilişkisi üzerine yapılan çalışmaların büyük bir çoğunluğu Clostridium toksinleri ile ilgili olmakla birlikte son yıllarda diğer mikroorganizmalar ile SNARE protein arasındaki etkileşimi araştıran çalışmalar yayınlanmaya başlamıştır. SNARE proteinler ile mikroorganizma ilişkisi incelendiği zaman doğal olarak hücre içi yerleşim gösteren mikroorganizmalar akla gelmektedir. Hücre içi patojen mikroorganizmalar infekte ettikleri konak hücresinde mevcudiyetlerini sürdürebilmek için hücrenin degredatif enzimlerinden korunmak zorunda olduğu gibi bir taraftan da çoğalmak ve hücre içinde yaşamlarını sürdürebilmek için konak hücrenin bazı kompartımanlarıyla füzyona girerek kendileri için gerekli olan madde alışverişini yapmak zorundadır. Bu amaçla hücre içi patojenlerde bazı ökaryotik hücre kompartımanlarıyla füzyonu engelleyecek, bazılarıyla ise füzyona girebilecek SNARE benzeri proteinlerin bulunduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücrelerde zorunlu hücre içi patojenlerinden biri olan Chlamydia, plazma membranının invajinasyonu sonucunda oluşan inklüzyon içinde üremesine devam ederken bazı konak hücre kompartımanlarıyla füzyonu gerçekleştirken, bazılarıyla ise füzyonu engelleyerek kendini konak hücrenin degredatif fonksiyonundan korur. İnklüzyon membranında Chlamydia nın sentez ettiği IncA proteini bulunmaktadır. Vakuoler membran proteini olan IncA proteinleri SNARE proteinler ile etkileşime girmek için önemli bir aday olarak karşımıza çıkmaktadır. IncA proteini Chlamydia nın farklı türleri arasında düşük benzerliğe sahiptir. Ancak bu düşük benzerliğin aksine tüm IncA proteinlerinde SNARE proteinlerinde olduğu gibi tekrarlayan ve yüksek düzeyde korunmuş bir motif bulunmaktadır. Bu motifin merkezinde glutamin aminoasidi yer almaktadır. Bu nedenle IncA proteini bir tür Q-SNARE olarak değerlendirilebilir ve veziküler membranda bulunan R-SNARE proteini ile kompleks oluşturduğu düşünülmektedir [43]. IncA proteininin N-terminal bölgesinde bulunan SNARE benzeri motif Chlamydia nın içinde bulunduğu inklüzyon cisimciğinin endozomal ve lizozomal kompartımanlarla füzyonunu engeller [44]. Diğer taraftan Chlamydia hücre içinde gelişebilmek ve üreyebilmek için ekstra lipide ihtiyaç duymaktadır. Lipid kaynaklarından biri golgi cisimciğinde sentezlenen spingomiyelin, diğeri de kolesteroldür. IncA proteini oluşturduğu trimer ile golgi cisimciğinde bulunan ve R-SNARE özelliğine sahip VAMP 3 veya 7 ile kompleks oluşturarak füzyona girer ve sentezlenen spingomiyelinin ve kolesterolün inklüzyona geçmesine neden olur [45]. Benzer mekanizmaları kullanarak infekte ettiği konak hücresinde üremeye devam ederken, konak hücrenin degredatif enzimlerinden korunabilen diğer bir hücre içi patojen Legionella dır. Chlamydia ile benzer şekilde Legionella pneumophila vakuolleri de lizozomal füzyondan kaçarken mitokondri ve endoplazmik retikulum gibi hücrenin diğer kompartımanlarıyla füzyona girebilir. L. pneumophila da tanımlanmış pek çok SNARE benzeri protein bulunmaktadır. Bu proteinlerden Legionella ökaryotik gen benzeri (Leg) ailesinden LegC7, LegC2 ve LegC3 proteinleri Dot/Icm sekresyon sistemiyle bakterinin sitozolünden bakterinin içinde bulunduğu vakuol yüzeyine taşınır. Bu proteinler SNARE proteinler gibi kompleks oluşturabilmekte ve Legionella nın içinde bulunduğu vakuolün endolizozomal füzyonuna engel olmaktadır [46]. SNARE proteinleriyle etkileşim sadece bakterilere ait bir özellik değildir. Bugünkü bilgilerimiz ışığında bazı virüslerin de SNARE proteinler ile ilişkide oldukları ya da konak hücre membranı ile füzyona girebilmek için SNARE proteinleri taklit ettikleri bilinmektedir. 138 H ACETTEPE T IP D ERG S

SNARE proteinler ve mikroorganizma iliflkisi Zarflı virüsler konak hücre membranı ile füzyona girerek viral genomu konak hücreye transfer eder. Zarflı virüslerde bulunan glikoproteinler konak hücre ile füzyonu sağlayan peptidlerdir. Bu peptidlerde SNARE proteinlere benzer şekilde C-terminal bölge virüs membranında bulunmaktadır. Zarf glikoproteinlerini füzyon peptidleri olarak kullanan virüsler arasında ortomiksovirüslerden influenza ve parainfluenza, filovirüslerden ebola ve retrovirüslerden insan immünyetmezlik virüsü (HIV) sayılabilir. Bu virüslerde bulunan zarf glikoproteinleri füzyon öncesi proteolitik kırılmaya uğrar. Bu kırılma sonucu influenza virüsünde HA1 ve HA2, parainfluenza virüsünde F2 ve F1, Ebola da GP1 ve GP2, HIV da gp120 ve gp41 adı verilen peptidler oluşur. Glikopeptidlerin konak hücre membranında reseptörlerine tutunmalarını takiben virüs membranı ve konak hücre membranı birbirine yaklaşır. Füzyon peptidleri olarak adlandırılan HA2, F1, GP2 ve gp41 proteinleri füzyon sırasında, tıpkı SNARE proteinler gibi N-terminal bölgeden başlayarak birbirleri üzerine kıvrılarak sıkı bir sarmal oluşturarak konak hücre membranında bulunan reseptörleriyle kompleks bir yapı oluşturur. Bu kompleks yapı SNARE proteinlerde gördüğümüz gibi membrana paralel uzanmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi bu organizasyon füzyon reaksiyonunda lipid tabakaların birbirine yakınlaşması için önem taşımaktadır [47,48]. Zarfsız virüslerin hücrede infeksiyon oluşturma yolu; hücreye bağlanıp endositoz ile hücre içine alındıktan sonra hedef organele gitmesidir. Virüslerin endositoz sırasındaki primer amacı viral kapsidin soyulacağı uygun bir bölgeye gitmek ve kapsid soyulmasını takiben açığa çıkan viral DNA nın çekirdeğe ulaşmasıdır. Son yıllarda virionların endoplazmik retikuluma doğru hareket ettiği ve soyulmanın burada gerçekleştiği saptanmıştır. Syntaxin 18, endoplazmik retikulumda bulunan ve vezikülleri endoplazmik retikuluma ya da endoplazmik retikulumdan dışarı doğru yönlendiren bir SNARE proteinidir. Syntaxin 18 in hangi proteinler ile kompleks oluşturduğu henüz bilinmemektedir. Zarfsız bir virüs olup, kütanöz ve genital sistemde çeşitli lezyonlara yol açan papillomavirüslerde L1 ve L2 olmak üzere iki kapsid proteini bulunmaktadır. Viral infeksiyon için gerekli olan L2 proteininde 41-44. aminoasitler arasında korunmuş bir bölge bulunmaktadır. Bu bölgeden yoksun mutantlar infeksiyon oluşturamadıkları gibi, papillomavirüs ile gelişen infeksiyonun bu aminoasitlere karşı geliştirilen antikorlarla nötralize olduğu belirlenmiştir. Korunmuş olan bu dizi papillomavirüslerin tüm genotiplerinde bulunmaktadır [49]. Papillomavirüs virionunu endoplazmik retikuluma yönlendiren minör kapsid proteini olan L2 dir. L2 proteini ile syntaxin 18 arasındaki etkileşimin virüsün hücre çekirdeğine taşınmasında rolü olduğu düşünülmektedir. Elektron mikroskobik görüntüler sonucunda, minör kapsid proteini olan L2 nin syntaxin 18 ile etkileşime girerek virüsün endoplazmik retikuluma geçmesini sağladığı ve virionun endoplazmik veziküle ulaşması engellendiğinde infeksiyonun gelişmediği saptanmıştır [50]. Bazı mikroorganizmalarda SNARE benzeri proteinlerin bulunduğunun ya da etkilerini SNARE proteinler üzerinde gösterdiklerinin anlaşılması konak-mikroorganizma etkileşiminin çözümlenmesi konusunda büyük bir adım teşkil etmektedir. SNARE benzeri proteinler hakkında bilgi sahibi olmamız patogenez konusunda karanlıkta kalan kısımların açığa çıkmasına faydalı olacaktır. Patojenin hayatta kalabilmesi için SNARE benzeri proteinlere ihtiyaç duyuyor olması bu mikroorganizmaların eradikasyonunda ortak bir hedef belirlememize yardımcı olmaktadır. Terapötik ajan geliştirilmesinde hedef seçilecek SNARE benzeri proteinler, mikroorganizmanın konak hücre içinde savunmasız kalmasına neden olarak mikroorganizmayı fagozomal temizlemeye duyarlı kılabilir. Dolayısıyla SNARE benzeri proteinlerin ayrıntılı olarak araştırılması terapötik hedef seçiminde yol gösterici olacaktır. Kaynaklar 1. Shukla A, Berglund L, Nielsen LP, Nielsen S, Hoffmann HJ. Regulated exocytosis in immune function: are SNARE-proteins involved? Respiratory Medicine 2001; 95:773-80. 2. Martens S, McMahon HT. Mechanisms of membrane fusion: disparate players and common principles. Nature Rev 2008; 9:543-56. 3. Weimer RM, Jorgensen EM. Controversies in synaptic vesicle exocytosis. J Cell Science 2003; 116:3661-6. 4. Ungar D, Hughson FM. SNARE protein structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol 2003; 19:493-517. 5. Duman JG, Forte JG. What is the role of SNARE proteins in membrane fusion? Am J Physiol Cell Physiol 2003; 285:237-49. 6. Mayer A. Membrane fusion in eukaryotic cells. Annu Rev Cell Dev Biol 2002; 18:289-314. 7. Südhof TC, Rothman JE. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science 2009; 323:474-7. 8. Sorensen J. SNARE complexes prepare for membrane fusion. Trends in Neurosciences 2005; 28:453-5. 9. Jarousse N, Kelly R. Endocytotic mechanisms in synapses. Cur Opin in Cell Biol 2001; 13:461-9. 10. Montecucco C, Schiavo G, Pantano S. SNARE complexes and neuroexocytosis: how many, how close? Trends in Biochemical Sciences 2005; 30:367-72. 11. Zhang F, Chen Y, Su Z, Shin YK. SNARE assembly and membrane fusion, a kinetic analysis. J Biol Chem 2004; 279:38668-72. 12. Rizzoli S, Jahn R. Kiss-and-run, collapse and readily retrievable vesicles. Traffic 2007; 8:1137-44. Cilt 42 Say 3 2011 139

Çakar ve Özkuyumcu 13. Verhage M, Toonen R. Regulated exocytosis: merging ideas on fusing membranes. Curr Opin Cell Biol 2007; 19:402-8. 14. Giraudo CG, Garcia-Diaz A, Eng WS, Chen Y, Hendrickson WA. Alternative Zippering as an on-off switch for SNAREmediated fusion. Science 2009; 323:512-6. 15. Rickman C, Davletov B. Mechanism of calcium-independent synaptotagmin binding to target SNAREs. J Biol Chem 2003; 278:5501-4. 16. Burgoyne R, Barclay JW, Ciufo L, Graham M, Handley M, Morgan A. The functions of Munc18-1 in regulated exocytosis. Ann NY Acad Sci 2009; 1152:76-86. 17. Hay J. SNARE complex structure and function. Exp Cell Res 2001; 271:10-21. 18. Sun W, Yan Q, Vida T, Bean AJ. Hrs regulates early endosome fusion by inhibiting formation of an endosomal SNARE complex. J Cell Biol 2003; 162:125-37. 19. Ludger J, Galli T. Exocytosis: SNAREs drum up. Eur J Neurosci 1998; 10:415-22. 20. Cai H, Reim K, Varoqueaux F, Tapechum S, Hill K, Sorensen JB, et al. Complexin II plays a positive role in Ca2+-triggered exocytosis by facilitating vesicle priming. PNAS 2008; 105:19538-43. 21. Maximov A, Tang J, Yang X, Pang Z, Südhof TC. Complexin controls the force transfer from SNARE complexes to membranes in fusion. Science 2009; 323:516-21. 22. Whelchel D, Brehmer TM, Brooks P, Darragh N, Coffield JA. Molecular targets of botulinum toxin at the mammalian neuromuscular junction. Mov Dis 2004; 19:7-16. 23. Rosetto O, Seveso M, Caccin P, Schiavo G, Montecucco C. Tetanus and botulinum neurotoxins: turning bad guys into good by research. Toxicon 2001; 39:27-41. 24. Humeau Y, Doussau F, Grant N, Poulain B. How botulinum and tetanus neurotoxins block neurotransmitter release. Biochimie 2000; 82:427-46. 25. Brunger AT, Jin R, Breidenbach MA. Highly specific interactions between botulinum neurotoxins and synaptic vesicle proteins. Cell Mol Life Sci 2008; 65:2296-306. 26. Montecucco C, Rosetto O, Schiavo G. Presynaptic receptor arrays for clostridial neurotoxins. Trends in Microbiol 2004; 12:442-6. 27. Rossetto O, Rigoni M, Montecucco C. Different mechanism of blockade of neuroexocytosis by presynaptic neurotoxins. Toxicology Letters 2004; 149:91-101. 28. Tsukamato K, Kozai Y, Ihara H, Kodha T, Mukamoto M, Tsuji T, et al. Identification of the receptor-bindingsites in carboxyl-terminal half of the heavy chain of botulinum neurotoxin types C and D. Microbial Pathogenesis 2008; 44:484-93. 29. Rigoni M, Caccin P, Johnson E, Montecucco C, Rosetto O. Site-directed mutagenesis identifies active-site residues of the light chain of botulinum neurotoxin type A. Biochem Biophys Res Commun 2001; 288:1231-7. 30. Grumelli C, Verderio C, Pozzi D, Rossetto O, Montecucco C, Matteoli M. Internalization and mechanism of action of clostridial toxins in neurons. NeuroToxicology 2005; 26:761-7. 31. Fernandez-Salas E, Ho H, Garay P, Steward LE, Aoki KR. Is the light chain subcellular localization an important factor in botulinum toxin duration of action? Mov Disorders 2004; 19:23-34. 32. Baldwin M, Barbieri J. Associstion of botulinum neurotoxin serotypes A and B with synaptic vesicle protein complexes. Biochem 2007; 46:3200-10. 33. Foran P, Davletov B, Meunier FA. Getting muscles moving again after botulinum toxin: novel therapeutic challenges. Trends Mol Med 2003; 9:291-9. 34. Brunger A, Rummel A. Receptor and sustrate interactions of clostridial neurotoxins. Toxicon 2009; 1-11. 35. Chen S, Hall C, Barbieri J. Substrate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. J Biol Chem 2008; 283:21153-9. 36. Bajohrs M, Rickman C, Binz T, Davletov B. A molecular basis underlying differences in the toxicity of botulinum serotypes A and E. EMBO reports 2004; 5:1090-5. 37. Foran PG, Mohammed N, Lisk GO, Nagwaney S, Lawrence GW, Johnson E, et al. Evaluation of the therapeutic usefulness of botulinum neurotoxin B, C1, E, and F compared with the long lasting type A. Basis for distinct durations of inhibition of exocytosis in central neurons. J Biol Chem 2003; 278:1363-71. 38. Chen S, Kim J, Barbieri JT. Mechanism of substrate recognition by botulinum neurotoxin serotype A. J Biol Chem 2007; 282:9621-7. 39. Chen S, Barbieri JT. Multiple pocket recognition of SNAP 25 by botulinum neurotoxin serotype E. J Biol Chem 2007; 282:25540-7. 40. Bajohrs M, Rickman C, Binz T, Davletov B. A molecular basis underlying differences in the toxicity of botulinum serotype A and E. EMBO 2004; 5:1090-95. 41. Chen S, Barbieri JT. Unique substrate recognition by botulinum neurotoxins serotypes A and E. J Biol Chem 2006; 281:10906-11. 42. Rickman C, Meunier F, Binz T, Davletov B. High affinity interaction of syntaxin and SNAP-25 on the plasma membrane is abolished by Botulinum toxin E. J Biol Chem 2004; 279:644-51. 43. Delevoye C, Nilges M, Dautry-Varsat A, Subtil A. Conservation of the biochemical properties of Inc A from Chlamydia trachomatis and Chlamydia caviae. J Biol Chem. 2004;279:46896-906. 44. Paumet F, Weselowski J, Garcia-Diaz A, Delevoye C, Aulner N, Schuman H, et al. Intracellular bacteria encode inhibitory SNARE-like proteins. Plos One 2009; 4:e7375. 45. Delevoye C, Nilges M, Dehoux P, Paumet F, Perrinet S, Dautry-Varsat A, et al. SNARE protein mimicry by an intracellular bacterium. Plos Pathogens 2008; 4:e1000022. 46. de Felipe K, Glover R, Charpentier X, Anderson O, Reyes M, Pericone C, et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. Plos Pathogens 2008; 4:e1000117. 47. Söllner TH. Intracellular and viral membrane fusion: a uniting mechanism. Curr Opin Cell Biol 2004; 16:429-35. 48. Shekel JJ, Wiley DC. Coiled coils in both ıntracellular vesicle and viral membrane fusion. Cell 1998; 95:871-4. 49. Bossis I, Roden R, Gambhira R, Yang R, Tagaya M, Howley P, et al. Interaction of tsnare Syntaxin 18 with the Papillomavirus minor capsid protein mediates infection. J Virol 2005; 79:6723-31. 50. Laniosz V, Nguyen C, Meneses P. Bovine Papillomavirus Type 1 infection is mediated by SNARE Syntaxin 18. J Virol 2007; 81:7435-48. 140 H ACETTEPE T IP D ERG S