Busulfan Serum & Plasma LC-MS/MS Analysis Kit

Busulfan Serum & Plasma LC-MS/MS Analysis Kit ZV-3011-0200-10 200 2-8 C User Manual

Page 1. INTENDED USE:... 3 2. SUMMARY AND EXPLANATION:... 3 3. TEST PRINCIPLE... 3 4. WARNING AND PRECAUTIONS... 4 5. STORAGE AND STABILITY... 5 6. MATERIALS SUPPLIED... 5 7. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED... 6 8. PROCEDURE NOTES... 6 9. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE... 7 10. PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS... 7 Preparation of Calibrators:... 7 Preparation of Control:... 7 11. TEST PROCEDURE... 7 12. QUALITY CONTROL... 8 13. CALCULATION OF RESULTS... 8 14. INTERPRETATION OF RESULTS... 8 15. EXPECTED VALUES... 9 16. LC-MS/MS PARAMETERS... 9 17. MS SCAN PARAMETERS... 9 18. ANALYTICAL PERFORMANCE... 10 19. SAMPLE CHROMATOGRAM... 10

1. INTENDED USE: Quantitative LC-MS/MS analysis kit for busulfan in human serum & plasma samples. 2. SUMMARY AND EXPLANATION: Busulfan is an alkylating agent used to ablate bone marrow cells before hematopoietic stem cell transplant.(1) Busulfan is typically administered in intravenous (IV) doses of 0.8 mg/kg once every 6 hours over 4 days, a total of 16 doses. Dose-limiting toxicity of busulfan is hepatic veno- occlusive disease. To avoid toxicity while ensuring busulfan dose adequacy to completely ablate the bone marrow, IV dosing should be guided by pharmacokinetic (PK) evaluation of area under the curve (AUC) and clearance after the first dose.(2) The PK evaluation should be carried out at the end of the first dose, with results of PK testing available to facilitate dose adjustment before beginning the fifth dose. Zivak Busulfan LC-MS/MS Analysis Kit was developed for rapid, sensitive and reliable quantitative detection of the busulfan concentrations in human plasma & serum samples and it gives results in 5 minutes with minimal sample preparation. Main methods and procedures that we selected are based on EN ISO 13485 and 98/79/EC. 3. TEST PRINCIPLE Busulfan analytes are extracted from human samples using an organic extraction and deproteinization steps. After the extraction, analytes are diluted and analyzed by Zivak LC-MS/MS system.

4. WARNING AND PRECAUTIONS For in-vitro diagnostic use only. For professional use only. Read the instructions carefully, before you start. In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier. Do not use expired kits and components. Please check the batch no and expiry date before start. Protective gloves and goggles should be worn. Please take any necessary precautions to prevent infection with pathogens while working with biological fluids. Appropriate bio-safety precautions and disposal of biohazardous wastes should be followed. Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous material may cause eye and skin irritations. It s recommended to work in a fume hood for your safety as reagent 1-2 are volatile and please avoid inhaling. Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous material may cause eye and skin irritations.

5. STORAGE AND STABILITY Calibrators, Control must be stored at -20 C. R1 reagent can be stored at 2-8C, R2,R3 reagents can be stored at room temperature. All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended temperatures and used as described in this manual. 6. MATERIALS SUPPLIED ZV-3011-0200-10 Volume Symbol Component ZV-3011-02R1-10 1x 10ml R1 Reagent 1, Contains deuterated internal standart, ZV-3011-02R2-10 2x 40ml R2 Reagent 2, Contains precipatition reagent ZV-3011-02R3-10 4x 40ml R3 Reagent 3, Contains organic solvent ZV-3011-02MA-10 ZV-3011-02MB-10 ZV-3011-KK-10 1x 1000ml 1x 1000ml 1x 1pc MA Mobile Phase B, Contains organic solvent MB Mobile Phase A, Contains organic solvent User Guide

7. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED ZV-3011-02S1-10 1x 2,5ml CAL-1 Plasma Calibrator Level-1 Frozen ZV-3011-02S2-10 1x 2,5ml CAL-2 Plasma Calibrator Level-2 Frozen ZV-3011-02K1-10 1x 2,5ml CONT-1 Plasma Control Level-1 Frozen ZV-3011-02C1-10 Zivak Busulfan Analytical Column 20-200 µl pipette 200-1000 µl pipette Pipette tips Vortex mixer 2,0 ml eppendorf tube Eppendorf tube centrifuge Bidistilled or deionised water 1,8 ml autosampler vial 8. PROCEDURE NOTES Any inappopriate handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Leave aside all reagents and specimens to reach room temperature (18-25 C) and gently swirl each vial of liquid reagent and sample before use. Mix reagents without foaming.

Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps. Always keep vials closed when not been used. Do not re-use wells/tubes or reagents. Incubation time affects results. All tubes or wells should be handled in the same order and time sequences. 9. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Specimen collection and storage has a significant effect on the test results. Plasma samples from earlier days must be kept frozen before the analysis. 10. PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS Preparation of Calibrators: After preparation, calibrators must be aliquoted into 550 µl volumes and stored at -20 C. Preparation of Control: After preparation, Control Level I must be aliquoted into 550 µl volumes and stored at -20 C. 11. TEST PROCEDURE 1. Take 500 μl of patient sample (or calibrators and controls) into the tube. 2. Add 100 μl Reagent 1 and vortex for 10 seconds. 3. Add 400 μl Reagent 2 and vortex for 10 seconds. 4. Centrifuge at 4000 x rpm for 3 minutes. 5. Take 400 µl upper phase into the auto sampler vial 6. Add 800 μl Reagent 3 and vortex for 10 seconds. and inject 50 μl to the LC- MS/MS system. The prepared sample is stable at 2-4 C for 24 hours until the injection.

12. QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed by following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the QC Certificate. If the criterias are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 13. CALCULATION OF RESULTS The obtained area of the standard is plotted against their concentration. The standard curve is calculated by a linear regression or a weighted linear regression function. Using computer programs, the curve is best described by a 2-point linear regression fit with linear axes. For the calculation of the regression curve, apply each signal of the standards (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read directly from the regression function. Sample signals above the highest standard have to be confirmed by a reference method. 14. INTERPRETATION OF RESULTS Various societies recommend different Cut-Off values for repetition of the measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the application of patient samples from different populations, it is highly recommended that each laboratory establishes its own range of normal values and that this distribution of values is co-ordinated with the recommendations of the responsible society of this geographic region. The results themselves should not be the only reason for any therapeutical consequences. They have to be correlated to other clinical observations and diagnostic tests.

15. EXPECTED VALUES Arean Under The Curve 900-1,500 mcmol*minute Clearance 2.1-3.5 (ml/minute)/kg It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values. 16. LC-MS/MS PARAMETERS Device LC-MS/MS Analysis System Column Zivak-Busulfan Column Injection volume 50 µl Gradient 00.00 min 10% B 01:00 min 35% B 02:00 min 100% B 02:01 min 10% B 05:00 min 10% B Flow 0,35 ml/min Ionization Mode: vesi positive CID Gas 2,4 mtorr API Nebulizing Gas 55 psi Scan Time 0,4 sec SIM Width 1,5 amu Drying Gas 20 psi Drying Gas Temp. 350 C Vortex Gas 250 C Vortex Gas Temp. 20 psi Needle 5000V Shield 600V Capillary 40V Detector 1600 V 17. MS SCAN PARAMETERS Capillary (ev) CE (ev) No Analyte RT MH+ MS/M (min) (m/z) S 1 Busulfan 2,6 (+) 264.00 151 50V 10V 2 IS 2,6 (+) 272.00 159 50V 10V

18. ANALYTICAL PERFORMANCE No Analyte LOD (µg/l) LOQ (µg/l) Accuracy (%) Precision (%CV) Linearity (R 2 ) 1 Busulfan 0,15 0,45 99,1 3,5 0,997 Analytical Specificity (Cross Reactivity): No cross-reactivities were found with the typical substances tested. 19. SAMPLE CHROMATOGRAM

Serum ve Plazmada Busulfan LC-MS/MS Analiz Kiti ZV-3011-0200-10 200 2-8 C Kullanma Kılavuzu

İÇERİK Sayfa 1. KULLANIM AMACI:... 13 2. ÖZET VE AÇIKLAMA:... 13 3. TEST PRENSİBİ... 13 4. UYARILAR VE ÖNLEMLER... 14 5. SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK... 14 6. KİT İÇERİĞİ... 15 7. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER... 16 8. ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ... 16 9. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR... 17 10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR... 17 11. NUMUNE HAZIRLIĞI... 18 12. KALİTE KONTROL... 18 13. SONUÇLARIN HESAPLANMASI... 19 14. SONUÇLARIN YORUMLANMASI... 19 15. BEKLENEN DEĞERLER... 19 16. LC-MS/MS PARAMETERLERİ... 20 17. MS SCAN PARAMETRELERİ... 20 18. ANALİTİK PERFORMANS... 21 19. ÖRNEK KROMATOGRAM... 21 12

1. KULLANIM AMACI: Serum ve plazma numunelerinde Busulfanın LC-MS/MS yöntemiyle kantitatif analizi. 2. ÖZET VE AÇIKLAMA: Busulfan, hemopatik kök hücre naklinden önce kemik iliği hücrelerini çıkarmak için kullanılan bir alkilleme ajanıdır. Busulfan tipik olarak 4 gün boyunca her 6 saatte bir 0,8 mg/kg lık dozlar olmak üzere toplam 16 doz olarak damar içi yolu ile uygulanmaktadır. Busulfanın toksik etkisinden kaynaklanabilecek hepatik venöoklusif hastalığı nedeniyle limitli dozlarda uygulanmalıdır. Busulfan dozunun kemik iliğini tam olarak ayırabilmek ve aynı zamanda toksik etkiden kaçınmak için IV dozu eğri altında kalan alan (AUC) ve ilk uygulanan dozun atılımının farmakokinetik (PK) değerlendirmesi ile belirlenmelidir. Bu farmakokinetik değerlendirme ilk dozun uygulanmasından sonra yapılmalı ve 5. Dozun uygulanmasından önce doz ayarlaması yapılabilir olmalıdır. Zivak Busulfan LC-MS/MS Analiz kitit serum ve plazma örneklerinde busulfan konsantrasyonunun hızlı, hassas ve güvenilir olarak ölçülmesi için geliştirilmiştir ve minimal numune hazırlığı ile her numune için 5 dakikada analiz sonucu alınabilmektedir. Kullanılan yöntemler ve prosedürler EN ISO 13485 ve 98/97/EC standartlarına göre standardize edilmiştir. 3. TEST PRENSİBİ Busulfan analitleri organik ekstraksiyon ve deproteinizasyon işlemleri ile numulelerden ekstrakte edilirek analiz edilir. 13

4. UYARILAR VE ÖNLEMLER Sadece in-vitro kullanım amaçlıdır. Profesyonel kullanım içindir. Çalışmaya başlamadan önce, kullanım kılavuzunu dikkatlice okuyunuz. Kit ambalajının zarar görmüş olması durumunda, lütfen Zivak veya bayinizle irtibata geçiniz. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri veya bileşenlerini kullanmayınız. Kullanmadan önce seri numarasını ve son kullanma tarihini kontrol ediniz. Toksik bileşen konsantrasyonları çok düşük olmakla birlikte güvenlik amacıyla çeker ocak altında çalışılması önerilir. Çalışırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanılmalıdır. Çalışılan kan veya biyolojik örneklerden kaynaklanabilecek enfeksiyonlara karşı gerekli her türlü önlemi alınız. Biyo-zararlı atıklar için uygun biyo-güvenlik ve atık yönetimi koşullarını sağlayınız. Lütfen kullanmadan önce reaktif şişeleri üzerindeki etiketleri kontrol ediniz. Bu kitin reaktifleri göze ve cilde zarar verecek maddeler içerir. 5. SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK Kalibratör, Kontroller -20 C de saklanmalıdır. R1 2-8 C de, R2 ve R3 reaktifleri oda sıcaklığında saklanabilirler. Bütün bileşenler önerilen koşullarda saklandığı takdirde son kullanma tarihine kadar garantilidir. 14

6. KİT İÇERİĞİ ZV-3011-0200-10 Hacim Sembol İçerik ZV-3011-02R1-10 1x 10ml R1 Reaktif 1, Döteryum işaretli internal standart, ZV-3011-02R2-10 2x 40ml R2 Reaktif 2, Çöktürme Ajanı ZV-3011-02R3-10 4x 40ml R3 Reagent 3, Organik Çözücü ZV-3011-02MA-10 1x 1000ml MA Mobil Faz B, Organik Çözücü ZV-3011-02MB-10 1x 1000ml MB Mobil Faz A, Organik Çözücü ZV-3011-KK-10 1x 1 adet Kullanım Kılavuzu 15

7. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ZV-3011-02S1-10 1x 2,5ml Cal- 1 Serum Kalibratör Level-1 ZV-3011-02S2-10 1x 2,5ml Cal- 2 Serum Kalibratör Level-2 CONT-1 ZV-3011-02K1-10 1x 2,5ml Serum Kontrol Level-1 ZV-3011-02C1-10 Zivak Busulfan Analitik Kolonu 20-200 µl pipet 200-1000 µl pipet Pipet uçları Vorteks karıştırıcı 2,0 ml eppendorf tüp Eppendorf tüp tipi santrifüj Bidistile veya deiyonize su 1,8 ml autosampler vial 8. ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ Test prosedürün yanlış ve değiştirilerek uygulanması test sonucunu etkileyebilir. Pipetleme hacimleri, inkübasyon zamanları ve hazırlık aşamaları tam olarak belirtilen miktarlarda ve talimatlara uygun bir biçimde yapılmalıdır. Her zaman ve sadece kalibre edilmiş pipetler ve cihazlar kullanılmalıdır. Teste bir kere başlandığı zaman, herhangi bir kesintiye uğramadan tamamlanmalıdır. Bunu sağlamak için gerekli reaktiflerin, maddelerin ve cihazların zamanında hazır olduğundan emin olunuz. Çalışmaya başlamadan önce bütün 16

reaktiflerin ve numunlerin oda sıcaklığına (18-25 C) gelmesini bekleyiniz, sıvı reaktifleri ve örneklerini kullanmadan önce hafifçe çalkalayarak karıştırınız. Reaktifler, pipetler ve numune hazırlık tüplerinde kirlilik ve bulaşma olmamasına dikkat ediniz. Her reaktif, standart ve numune için ayrı ve yeni pipet ucu kullanınız. Vial kapaklarını kendi aralarında değiştirmeyiniz. Kullanılmadığı zaman vial kapaklarını her zaman kapalı tutunuz. Vialler, vial kapakları, numune hazırlık tüpleri ve pipet uçları tek kullanımlıktır. İnkübasyon süreleri sonuçları etkilemektedir. Bütün numune hazırlık işlemleri belirtilen sırada ve sürede yapılmalıdır. 9. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR Numune toplama ve saklama koşulları test sonuçlarını belirgin bir şekilde etkilemektedir. Daha sonraki günlerde çalışılacak serum numuneleri analiz yapılana kadar dondurulmuş olarak saklanmalıdır. 10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR Kalibratörün Hazırlanması : Kalibratörler 550 μl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır Kontrol Numunesinin Hazırlanması : Kontrol numunesi 550 μl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. 17

11. NUMUNE HAZIRLIĞI 1. 500 L hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) hazırlık tüpüne alınır. 2. 100 L Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 3. 400 L Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 4. 4000 x rpm de 3 dakika santrifüj edilir. 5. 400 µl üst faz viale alınır. 6. 800 μl Reaktif 3 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 50 L LC-MS/MS sistemine enjekte edilir. Hazırlanmış numune 2-4 C de 24 saat boyunca stabildir. 12. KALİTE KONTROL Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir. Kullanıcılar çalışırken GLP veya diğer kurumlar tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır. Bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda olmalıdır. Değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve tekrarlanmalıdır. Her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri kullanmalıdır. Bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi, saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır. Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir. 18

13. SONUÇLARIN HESAPLANMASI Standardın alanına karşı standart konsantrasyonu grafiği çizilir. Standart eğrisi lineer regresyon veya ağırlıklı lineer regresyon fonksiyonu ile hesaplanır. Regresyon eğrisini hesaplamak için, her bir standarda karşılık gelen sinyal değeri grafiğe alınır. Bilinmeyen konsantrasyonu regresyon eğrisinin fonksiyonundan direk olarak okunabilir. Standart eğrisinin üzerinde kalan konsantrasyon değerleri referans bir metot ile teyit edilmelidir. 14. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Farklı toplumlarda farklı Cut-Off değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır. Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri ile desteklenmelidir. 15. BEKLENEN DEĞERLER AUC 900-1,500 mcmol*minute Clearance 2.1-3.5 (ml/minute)/kg Her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir. 19

16. LC-MS/MS PARAMETERLERİ Cihaz Kolon LC-MS/MS Analiz Sistemi Zivak-Busulfan Analitik Kolonu Enjeksiyon Hacmi 50 µl Gradiyant 00.00 dk 10% B 01:00 dk 35% B 02:00 dk 100% B 02:01 dk 10% B 05:00 dk 10% B Akış 0,35 ml/dk Iyonizasyon Modu: vesi positive CID Gaz 2,4 mtorr API Nebulizing Gaz 55 psi Tarama Süresi 0,4 sec SIM Width 1,5 amu Drying Gaz 20 psi Drying Gaz Sıcaklığı 350 C Vorteks Gaz 250 C Vorteks Gaz sıc 20 psi İğne Voltajı 5000V Shield voltajı 600V Kapiler voltaj 40V Dedektör 1600 V 17. MS SCAN PARAMETRELERİ No Analit RT (dk) MH+ (m/z) MS/MS Capillary CE (ev) (ev) 1 Busulfan 2,6 (+) 264.00 151 50V 10V 2 IS 2,6 (+) 272.00 159 50V 10V 20

No 18. ANALİTİK PERFORMANS Analit LOD (µg/l) LOQ (µg/l) Doğruluk (%) Kesinlik (%CV) Doğrusallık (R 2 ) 1 Busulfan 0,15 0,45 99,1 3,5 0,997 Analitik Seçicilik (Çapraz reaksiyon): Analitler arasında çapraz reaksiyon veya bir interferans etkisi gözlenmemiştir. 19. ÖRNEK KROMATOGRAM 21