Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi (Sequence Based Typing, SBT) Dr Klara Dalva AÜTF Hematoloji BD Lab

Yüksek Çözünürlükte HLA Tiplendirimi Akraba olmayan Kök Hücre nakillerinde Hasta Bankalara kayıtlı vericiler (adaylar/seçilmişler) Akrabadan Kök Hücre Nakillerinde Ebeveynlerden her ikisi incelenemiyor Aile verileri ile ailedeki 4 haplotip de belirlenemiyor Düşük çözünürlük çalışmalarda homozigotluk şüphesi var Solid organ Nakillerinde kabul edilebilir/edilemez antijen farklılıkların tespitinde (virtual XM) önem taşıyor

Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimi Kullanılan Yöntemler SSOP (Luminex ve Histo Spot, gelişmiş kitleri ile, ) SSP (Her alel için ayrı bir çalışma) Yukarıdaki yöntemlerin yeni bulunan alellere göre güncellenmesi zor ve çok sayıda prob, primer, kullanılmasını gerektirirler SBT Yeni Sekenslama Yöntemleri (Next Generation Sequencing )

Yöntemler Arasındaki Farklılıklar Tüm eksonlar değerlendirilebilir SSOP SSP SBT (generic) SBT (group specifique) - - + + Rezolüsyon Orta/yüksek Orta/yüksek Yüksek Yüksek ve Allel düzeyinde ve Karmaşık sonuçlar Var * Daha az ** Var *** Nadir*** *: Prob sayısı arttırılarak, tek alel amplifikasyonu ile karmaşık sonuçlar azaltılabilir **: Düşük çözünürlük yanı sıra her alel için ayrı çalışma(ssp) yapılırsa karmaşa az, ancak otomasyona uygun değil, daha fazla DNA gerektiriyor, daha zahmetli *** Ek çalışmalarla eklenen yeni verilerle (GSSP/ HARP, ek ekson, intron sekanslaması) karmaşık sonuçlar çözülebilir

SBT Yönteminin Basamakları DNA İzolasyonu PCR Amplifikasyonu PCR Ürününün Temizlenmesi Sekanslama Reaksiyonu (PCR) Ürünün saflaştırılması Ürünlerin Cihaza Yüklenmesi, elektroforez ANALİZ

DNA İzolasyonu İzolasyon için kan, ağızdan alınan sürüntü kullanılabilir (Hematolojik malinitelerde LOH, alel mutasyonları olabilir. Aile verileri, gerekirse farklı materyalle yeniden tiplendirme önem taşıyor! ) Farklı yöntemler kullanılabilir Haplotipe Özgün Ekstraksyon yapılması maliyeti arttırsa da karmaşayı çok azaltır DNA kalitesi önemli (A260/A280:1,8-2,0, <1,5 iken %50 prot, kontaminasyonu) Genellikle 50-100 ng/µl konsantrasyonda kullanılır

PCR ile Amplifikasyon Generic : Tek bir tüpte tek bir lokusa özgün problar ile Multiplex amplifikasyon yapılır (Class I için en az Exon 2 ve 3, 1-6 ya da hepsini içeren kitler var; Class II için en az Exon 2, exon 3, hepsini içeren kitler var) Generic sekanslama (biallelik sekanslama) Grup spesifik sekanslama (GSSP, HARPs.. ile mono allelik sekanslama) Grup spesifik Amplifikasyon (Ör: -B için 16 grup, -DRB1 için 16 grup için amp.) Amplifikasyon ürününde tespit edilen alele göre aleller ayrı ayrı sekanslanır Alel spesifik amplifikasyon Mevcut iki basamaklı sonuçlara göre (ör DRB1*04, DRB1*15 için ayrı ayrı) amplifikasyon ve takiben sekanslama yapılır

Antigen Recognition Site, ARS Antigen Recognition Site, ARS Kaynak: A.M Grenoble France, R Blasczyk, Hannover Germany 2007 Teaching Session 2

Biallelik Amplifikasyon ve sekanslamada kullanılan primerler : Örnek:Üretici A, Class I 5 UTR 1 2 3 4 5 6 7 3 UTR R1 3 h,ı,j,k,l,m 5 7 4 6 9 8 10 a, b,c,d,e,f,g F1 Amplifikasyon primeri (tek tüpte) Sekanslama primeri (her çift farklı tüpte, 4 tüp) GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor,geniş bir alanda lokalize olabilir

Piyasada bulunan kitlere örnekler AlleleSEQR (Abbott) SBTexcellerator (GENDX) SeCore (Life Technologies) Kapsamı Ortak motifler ARS dışındaki fark Amplifikasyon Gen skalası Allelik ayırım Exon Kapsamı Veri İşleme Alel tespiti Class I Class II PCR GSSP Yazılım +++ e1-4 +++ e1-8 +++ e1-6 S4 PROTRANS ++ e2-4 + E2 ++ e2-4 + e2, e2,3 e2-4 + e2, e2,3 e2 + +++ + AssignSBT + ++(DRB1) + ++(-B,-DRB1 ) +++ +++ SBTengine +++ + utype +++ + ++ SeqPilot

PCR Ürünlerinin Temizlenmesi Daha sonraki sekanslama basamağnı etkilememesi için kullanılmayan PCR primerleri ve dntp ler uzaklaştırılır Bu amaçla Kolonlar ile filtreleme ExoSAP-IT Exonuclease I: Primerleri parçalar Shrimp Alkaline Phosphatase: dntp leri parçalar kullanılabilir Bu işlemden sonra sekanslama reaksiyonuna geçmeden önce jel elektroforezi ile ürünlerin varlığı kontrol edilmelidir.

Sekanslama Reaksiyonu Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

dntp ve ddntp Farkı Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

Sekanslama Reaksiyonu Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

PCR Amplifikasyonu- Sekanslama Reaksyonu: Farklar PCR Amplifikasyonu Primer Her reaksyonda bir çift primer (forward ve reverse aynı tüpte ) dntp Kullanılır Kullanılır ddntp Kullanılmaz Kullanılır Thermal Cycling Uygulanır Sekanslama Reaksiyonu Her reaksiyon için tek primer(forward ve reverse ayrı tüpte) Uygulanır Çalışma Alanı Pre-PCR Post_PCR Ürün Çift sarmal Çift sarmal (denaturasyon ile tek sarmal hazırlanıp cihaza yüklenir )

Sekanslanan Ürünün Temizlenmesi Bağlanmamış floresan işaretli ddntp ler ortamdan uzaklaştırılır Bunlar Elektroforez sırasında DNA fragmanları ile birlikte hareket ederek veri kirliliğine sebep olurlar En sık kullanılan iki yöntem Jel filtrasyonu (Sephadex) Etanol ile çöktürme

Ürünlerin Elektroforez için Cihaza Yüklenmesi ------------------------------------------------------------------------ Floresan Dedektörü (CD kamera) DNA Fragmanlarının polimerdeki hareketi Tampon Katot) Lazer Tampon (Anot) Katot

Kapiller Elektroforez Cihazın performansı önemli Spatial Calibration Her kapiller için Sinyal Pixel pozisyonlarının belirlenmesi Spectral Calibration Floresan sinyallerin ayırımı (üst üste binmemesi) için gerekli

Verilerin Analizi: Prensip Elde edilen dizilimler, HLA veri tabanında bulunan sekanslar (Consensus) ile karşılaştırılarak olası alellerin tespit edilmesi Analiz aşamasında tüm dizilimin gözden geçirilmeli (genellikle hata /tutarsızlık şüphesi olan yerlerde kılavuz işaretler var) Concensus ile farklı olan pozisyonların kontroloü, düzeltilmesi Heterozigot pozisyonların kontrolü forward ve reverse dizilimler arasında tutarsızlık kontrolü, bazların gerekiyorsa güvenilir olana göre düzeltilmesi

International Union of Biochemistry Nomenclature Committee (IUB) Kodları R= A ve G (purine) Y= C ve T (pyrimidine) K= G ve T (Keto) M= A ve C (amino) S= G ve C (Strong, 3Hidrojen bağı) W= A ve T (Weak, 2 Hidrojen bağı) N= any base (A veya T veya C veya T)

HLA-C All ambiguities resolved!

Verilerin Analizi Kullanılan yazılım Programına göre farklılıklar gösteriyor Tümünde Olası Alel seçenekleri özetleniyor (varsa MM sırasına göre) Yapılan tüm müdahaleler izlenebiliyor Bir sonuç raporu oluşturulur Farklılık gösterenler Önerilen ek çalışmalar bildirilebilir ( ek olarak hangi lokus bilgisi gerekli, kullanılması önerilen GSSP) Sık (CWD) ve sık görülmeyen alellere göre veriler sınıflanabilir!!! Sonuçlar NMDP kodları ile verilebilir! ARS bölgesi ortak olan aleller birlikte sınıflanabilir(g group)!

Karşılaşılan Problemlerin Kaynakları Bir alellin tercihli amplifikasyonu Kullanılan Sekanslama primerlerinin bağlanmasını etkileyen yeni bir polimorfizm farklı bir kit ile farklı verim alınabilir HLA genlerindeki somatik mutasyonlar LOH ( tüm bir haplotip ya da tek bir lokusta olabilir, farklı yöntemlerle farklı sonuçlar alınabilir SBT daha duyarlı) HLA Allel polimorfizmi ( ör: indel mutasyonları, ortaya çıkan Null bir alel) Karmaşık Sonuçlar (ambiguity)

Tercihli amplifikasyon örneği: C*7 ve 17 olan bir bireyde C*17 de amp. avantajı var

Karmaşık Sonuçların Sebepleri Dizilim analizi yapılan bölgede gen sekanslarının ortak olması (Ör: C*04:o1-C*04:01N DRB1*14:01-14:54 Bu durum ifade edilen iki alel ya da ifade edilen bir alel ile null bir alel olarak karşımıza çıkabilir Bu sorun genellikle diğer lokusları sekanslayarak çözülür Serolojik tipleme, SSP ile ek testler yardımcı olur Belli motiflerin yer değiştirmiş olabilmesi olasılığı (cis-trans) nedeniyle görülen karmaşalar Mono allelik sekanslama (haplotip spesifik ekstraksyon) Allelerden birine özel primerlerin kullanılması (monoallelik sekanslama) grup spesifik amplifikasyona ek olarak HARP; GSSP kullanımı En başından seçilmiş bir alelle özgün sekanslama reaksiyonu

Ortak Gen Sekansları Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

ARS de Ortak Gen Sekansı -Örnekler Alel 1 Null Alel Polimorfizm yerleşimi A*0101 A*01010102N Intron 2 A*0301 A*01010102N İntron 4 A*2901 A*29010102N İntron 4 A*6801 A*6811N Exon 1 B*1501 B*15010102N Intron 1 B*1801 B*1817N Exon B*4402 B*4419N Exon 1 C*0301 C*0303N Exon 1 C*o401 C*0409N Exon 7 Alel 1 İfade edilen Alel 2 Polimorfizm yerleşimi A*7401 A*7402 Exon 1 B*0705 B*0706 Exon 5 B*2705 B*2713 Exon 1 B*8101 B*8102 Exon 1 C*0501 C*0503 Exon 4 C*0701 C*0706, 0718 Exon5,6 C*0704 C*0711 Exon7 DRB1*1201 DRB1*1206, 1210 Exon 1 ve3 DRB1*1401 DRB1*1454 Exon 3 Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

Motif Pozisyonlarının Önemi Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

Motiflerin yer değiştirme olasılığı Generic Karmaşa Allelik Karmaşa A B C DRB1 A B C DRB1 01/3604 07/4808 05/0802 03/1327 03/3204 35/53 05/0709 11/13 25/6601 38/39 07/0802 13/14 25/2603 4418/4501/ 5002 25/2601 4901/5001 32/7406 51/78 51/5301 52/7805 5602/5610 %9,7 %5,77 %4,34 %2,7 %79,7 %80,46 %54,6 %96,7 AM, Grenoble France 2007 EFI Teaching Session 2

Özet SBT, Yüksek çözünürlükte HLA tiplendirimi için kabul edilen Referans Yöntemdir Seçilecek olan yöntem ve kullanılacak donanım, amaca/kaynaklara göre farklılıklar gösterebilir Diğer HLA tiplendirme yöntemlerinde olduğu gibi Çalışma, Analiz ve Sonuçların Onaylanmasında başarılı olmak deneyim, konu ve incelenen toplumlar hakkında bilgi sahibi olmayı gerektirir Seri çalışmalar için Otomasyon mümkündür