VİRAL AŞILARDA TLR LİANTLARININ AŞI ADJUVANTI OLARAK KULLANIMI İhsan ürsel Bilkent Üniversitesi, MB Bölümü (www.thorlab.bilkent.edu.tr)
İnokülasyon iğnesi Montagu nun mektubundan
Lady Montagu, İngiliz Büyükelçisinin Eşi
Tarihçe Dünya da kullanılan ilk aşı çiçek aşısıdır. (1796- Edward Jenner) Bu aşı 1801 yılında Jenner metoduyla İstanbul da üretilmiştir. Dünyadaki ikinci aşı kuduz aşısıdır. (1885- Louis Pasteur) 1977- WHO Çiçek hastalığının Dünyadan eradike edildiğini açıklamıştır.
Edward Jenner: Modern aşının babası
Aşıların başarısı ve önümüzdeki problemler Çiçek hastalığı eradike edildi. Polio birçok ülkede eradike edildi. Kanser aşısı olarak kullanılan HPV aşısı serviks kanseri insidansını aşının kullanıldığı ülkelerde çok geriletmiş durumdadır. Kızamık*
Bazı erçekler-i Aşılama ile her yıl 3 milyondan fazla çocuk ölümden kurtarılmaktadır Halen 1.5-2.0 milyon çocuk/yıl etkin aşılama programlarının uygulanamamasından dolayı kaybedilmektedir. Dünya genelinde 400 den fazla patojene karşı 120 den fazla aşı üretilmektedir. Ülkeler aşılamanın bir hak ve öncelik olduğunu kabul etmeli ve kazançlı olmasa da bazı aşıların üretimini sübvanse etmelidirler. Aşı için harcanan her 1 dolar için yaklaşık 16 dolar kazanç elde edilmektedir.
Bazı erçekler-ii Türkiye yıllık 250 milyon TL tutarında aşı ithal ediyor/kullanıyor. Ülkemizde yerli aşı üretimi yoktur. 1951 yılında 17 aşı üretiliyordu, bölgede örnek Lab olarak kabul ediliyordu ve en potent aşılar bölgeye buradan tedarik edilmekteydi. 1998 de yerli aşı üretimi durduruldu. Simdi aşı potens ve lot release testlerini bile yapamaz haldeyiz. ABD de 16 aşı ulusal aşı programda iken, Türkiye'de bu 13 antijene karşı yapılmaktadır. Kapsayıcılık %97 oranına ulaşmıştır.
Önemli Hususlar İmmün Yetmezlikli veya immün sistemi baskılanmış bireylerin aşılama programı yeniden düzenlenmelidir. Canlı aşılar bu bireylere yapılırsa toplumda enfeksiyon yayan bireyler haline gelebilirler. 3.5 milyon öçmen'in aşılama programı ve kayıtlarının tutulması gereklidir. <15 ve 15-49 yaş arasındaki bireylerin aşılanması ve sürveyansı gerçekleştirilmelidir.
Aşı Tipleri CANLI : BC (i.d) MMR (s.c) Oral Polio (p.o) Suçiçeği (s.c) Rota virus (p.o) İNAKTİVE : Hepatit A (i.m) İnfluenza (i.m) Boğmaca (i.m) TOKSOİD : Difteri (i.m) Tetanoz (i.m) POLİSAKKARİD : HiB (i.m) Menengokok (i.m) Pnömokok (i.m) REKOMBİNANT : Hepatit B (i.m)
Atenüe viral aşılar, inaktive aşılardan daha immünojen ve daha etkin aşı antijenidirler ve rdna teknolojisi ile daha güvenli kılınmaktadırlar. 1 2
AŞI BİLEŞENLERİ Antijen: aktif immünite oluşturur. Adjuvanlar: aşının immün uyarıcı komponentini oluşturur (alüminyum tuzları; hidroksit, fosfat) Prezervatif, stabilizatörler: thimerosal, fenol, albumin, glisin, antibiyotik Süspansiyon sıvıları: su, serum fizyolojik, proteinler,
YANLIŞ ANLAMALAR! Aşılar Otizm Yapar mı? HAYIR YAPMAZ
ADJUVANLARIN ÖZELLİKLERİ İmmün stimülan özelliği bulunur Antijenin etkin sunumunu yönlendirir. Antijen dozunun azaltılmasına olanak sağlar Antijenin depo etkisi ile salımını yönlendirir İmmün yolakları etkinleştirerek aşının potensini değiştirir.
1 2 Figure 2-17 (some adjuvants act by upregulating co-stimulatory molecules on APC and help establishing an immune response against protein antigens in vaccines)
Yeni nesil adjuvanların avantajları ve kullanım yelpazesi Aşı cevabının genişletilmesi (influenza, HIV, sıtma) Yaşlılar için aşılar (yaşlanmaya bağlı zayıflayan bağışıklama cevabının üstesinden gelebilmek için) Patojenlere karşı hızlı cevap verilmesi (bulaşma sonrası profilaksisine karşı) YENİ NESİL ADJUVANTLAR Aşılama sayısını azaltma Doz düşürme (daha az miktarda antijen kullanımı, dünyaya aşı dağıtım miktarının artması) Terapötik aşılar geliştirme (HPV, kanser vb.) Yeni T-hücresi aşıları geliştirme (tüberküloz, viral vb.)
Bağışıklık hücrelerinin ifade ettikleri TLRlar, onları uyaran agonistler, ürettikleri sitokin ve oluşturdukları T-hücre yanıtları Monosit Plazmasitoid dendritik hücre Miyeloid dendritik hücre BDCA3 + CD141 + dendritik hücre B hücresi Hematopoietik olmayan hücre (stromal) TLR4 TLR5 TLR8 TLR7 TLR9 TLR3 TLR4 TLR5 TLR8 TLR3 TLR1 TLR6 TLR7 TLR9 TLR10 RLR Ligandlar * Flagellin (TLR5) * Monofosforil lipid A (TLR4) * Imiquimod (TLR7) * Resiquimod (TLR7/8) * Cp (TLR9) * Poly(I:C) (TLR3) * Monofosforil lipid A (TLR4) * Resiquimod (TLR7/8) Poly(I:C) (TLR3) * Triaçil lipoproteinler (TLR1) * Diaçil lipoproteinler (TLR6) * Imiquimod (TLR7) * Cp (TLR9) Poly(I:C) (TLR3) Sitokinler TNF-α, IL-6 IFN-β, Tip I IFN TNF-α, IL-6, IL-12 IL-1, IL-6, IL-12, IFN-β TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12 Tip I IFN Th1 hücrelere antijen sunumu + ++ +++ +++ + CD8 hücrelere çapraz sunum ++ + ++
İMMÜNİTE Doğal İmmünite Enflamatuvar İmmün Etki Hafıza (Yok) Edinsel İmmünite Antijene Özgü Hafıza (Var) ranülositler, Makrofajlar TLRs NLRs RLRs Sitokinler Kemikonler İnterferonlar IgM T hücre, B hücre Dendritik hücre (DC) Doğal Öldürücü hücre (NK) Antijen sunumu NK yollu ölüm Antijene özgü 1) Antikorlar (Ig, A, E) 2) Hücresel immün yanıt (CTL, Th, Treg) dakika saat gün ay yıl
NEDEN BAKTERİ DNAsı? Bakteri DNAsı doğal bağışıklık hücrelerince Tehlike Sinyali olarak algılanır. -NNNAACpTTNNN- Cp Motifi > 25X TLR9 Algacı
Cp ODN lerin terapötik uygulamaları 1 2 3 4
Değişik Cp ODN Tipleri C T A C T T C T C B/K-Tipi C T A C T T C T C C T A C T T C T C T C A T C A T C A T C A T C A T C A - 1 Cp motifi -poly -PS-PO-PS karışık omurgalı ->1 Cp motifi -poly yoksunu - PS omurgalı A/D-Tipi
PROBLEM Sınırlı Cp ODN yarılanma ömrü (serum proteinleri + nükleazlar) SONUÇ Düşük biyolojik etki ÇÖZÜM?
Nükleik Asit Temelli Nanoparçacıklar Fuat Exosomes Nükleik Asit Nanopaçacıkları Polysaccharide Nanocomplexes
Şap Hastalığı Nedir? Çift tırnaklı besi hayvanlarında görülen akut ve bulaşıcı viral (FMDV) bir hastalık. Enfekiyon genellikle virüsün solunması ya da temas ile bulaşmakta. Hastalık yüksek ateş, kilo kaybı, ayak ve ağız çevresinde oluşan yaralar ile karakterize. Virüsün 7 farklı serotipi bulunmakta (A, O, C, Asia1, Southern African Territories [SAT] 1, SAT2 and SAT3)
Şap Hastalığının Önemi Şap Salgını = Ekonomik Kayıp En son 2001 yılında İngiltere de görülen Şap salgını 7 milyon hayvanın telef olmasına ve yaklaşık 11.7-18.4 milyar dolar ekonomik kayba neden olmuştur.
PROBLEM Ülkemizin ihtiyacı olan miktarda Şap aşısını üretememesi Mevcut aşının uzun süreli bağışıklık sağlayamaması SONUÇ İhtiyaç duyulan aşı miktarının yabancı firmalardan karşılanması Türkiye nin halen hastalık sebebiyle yılda 150-180 milyon TL ekonomik zarara uğraması ÇÖZÜM?
ÇÖZÜM Yurtiçinde üretilebilecek etkili adjuvan(lar) geliştirerek Şap aşısının etkinliğinin arttırılması KAZANIM Kullanılan antijen miktarı azaltılarak toplam aşı dozunu 3-5 kat daha fazla şişeleyebilecek bir formülasyon geliştirilmesi Aşının etkinliğinin ve koruyuculuğunun artırılması Fazladan üretilebilecek olan aşı dozunun ihracatından ekstra gelir elde edilebilmesi
Deney Dizaynı Dişi BALB/c fare (5-8 fare/group) i.p enjeksiyon OD: Optimum Doz (3 µg/fare) LD: Düşük Doz (0.5 µg/fare) Cp: 1555 PS ODN (10 µg/fare) Ag: ŞAP Serotip O Antijeni Mono: Ticari Monovalan ŞAP Aşısı ( Serotip O+ Montanide) Commercial Hayvanlar 5 ay süre ile takip edilmiştir. 1. Kontrol 2. OD Ag 3. LD Ag 4. OD Ag+Cp 5. LD Ag+Cp 6. OD Mono 7. LD Mono 8. OD Mono+Cp 9. LD Mono+Cp Deney rupları Çalışılan Parametreler: TOTAL Ig Ig1 Ig2a Serumdan IFNg yanıtları FMDV nötralizasyon yanıtları
Ig1 @405nm Ig1 Cp ODN serum anti FMDV Ig1 seviyelerini düşürmüştür 1.4 1.2 FMDV Ag ile immünize edilen fareler Ig1 @405nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 Untreated OD Ag LD Ag Untreated OD Ag LD Ag OD Ag+Cp OD Ag+Cp LD Ag+Cp LD Ag+Cp OD @ 450 nm 0 2 4 6 8 12 16 20 1.6 Weeks 1.4 900 2700 8100 24300 1.2 Ab Titer 1 (1/N) 0.8 0.6 0.4 0.2 ŞAP Aşısı ile immünize edilen fareler Untreated OD Mono LD Mono OD Mono+Cp LD Mono+Cp Untreated OD Mono LD Mono OD Mono+Cp LD Mono+Cp 0 2 4 6 8 12 16 20 Weeks 300 900 2700 Weeks 8100 24300 *Patent Pending
Ig2a @405nm 0.5 OD @ 450 nm Ig2a @405nm Ig2a Cp ODN serum anti FMDV Ig2a seviyelerini arttırmıştır FMDV Ag ile immünize edilen fareler 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.8 0.7 0.6 0.4 0.3 0.2 0.1 2 4 6 8 12 16 20 Weeks 300 0.5 900 2700 8100 24300 Ab Titer (1/N) p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 Untreated OD Ag LD Ag OD Ag+Cp LD Ag+Cp Untreated OD Mono LD Mono Untreated OD Mono LD Mono OD Mono+Cp LD Mono+Cp Untreated OD Ag LD Ag OD Ag+Cp LD Ag+Cp ŞAP Aşısı ile immünize edilen fareler OD Mono+Cp LD Mono+Cp 0 2 4 6 8 12 16 20 Weeks Weeks *Patent Pending
Ig2a Titreleri (immünizasyondan 1 ay sonra) OD-Mono grup Optimum Monovalent Vaccine (3.0ug/mice) OD-Mono grup + Cp adjuvan Optimum Dose Monovalent Vaccine + Cp (10ug) OD@405nm 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100 300 900 2900 8100 24300 1.8 1.6 1.4 1 1.2 2 1 3 0.8 4 0.6 5 0.4 0.2 0 100 300 900 2900 8100 24300 Titer (1/N) Titer (1/N) OD@405nm 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 LD-Mono grup Low dose Monovalent Vaccine (0.5 ug/mice) 100 300 900 2900 8100 24300 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Low dose Monovalent Vaccine + Cp LD-Mono grup + Cp adjuvan 100 300 900 2900 8100 24300 Titer (1/N) Titer (1/N)
Total Ig @405nm Total Ig Total Ig @405nm Cp ODN serum anti FMDV Total Ig seviyelerini arttırmıştır 1.4 1.2 FMDV Ag ile immünize edilen fareler OD @ 450 nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 2 4 6 8 12 16 20 Weeks 300 900 2700 8100 24300 Ab Titer (1/N) p<0.01 p<0.01 p<0.01 p<0.01 Untreated OD Ag LD Ag Untreated OD Mono LD Mono OD Ag+Cp LD Ag+Cp OD Mono+Cp LD Mono+Cp Untreated OD Ag LD Ag OD Ag+Cp LD Ag+Cp ŞAP Aşısı ile immünize edilen fareler Untreated OD Mono LD Mono OD Mono+Cp LD Mono+Cp 0 2 4 6 8 12 16 20 Weeks Weeks *Patent Pending
Repel aşılamadan 20 hafta sonra nötralizan antikor titreleri YANIT VEREN (%) Kontrol 0 OD Ag 25 OD Ag+Cp 87,5 LD Ag 0 LD Mono+Cp 75 OD Mono 62,5 OD Mono+Cp 100 Kontrol OD Ag OD Ag+Cp LD Ag LD Ag+Cp OD Mono OD Mono+Cp LD Mono LD Mono+Cp LD Mono 25 LD Mono+Cp 62,5 *Patent Pending İkincil aşılamadan 5 ay sonra Cp ODN içeren formülasyonlar gerek anti-fmdv antikor yanıtları gerekse nötralizan antikor titreleri bakımından değerlendirildiğinde ticari ŞAP aşısına kıyasla daha etkin bir performans sergilemişlerdir.
IFN γ Fold Induction İkincil aşılamadan 24 saat sonra serum IFNγ seviyeleri *Patent Pending
Özet Cp ODN in ŞAP aşı formülasyonlarında adjuvant olarak kullanımı sayesinde 6 kat daha fazla aşı dozunun üretilmesi mümkündür. (Yılda 90 milyon doz) Cp ODN ile indüklenen uzun süreli nötralizan antikor seviyesi sık sık yeniden aşılama ihtiyacını ortadan kaldırmıştır. Aşılamadan 24 saat sonra ortaya çıkan yüksek IFNγ seviyeleri Cp içeren formülasyonların hızlı hücresel immün yanıt oluşturduğunu göstermektedir. Cp ODN ticari ŞAP aşısı ile ilgili problemlerin aşılabilmesinde etkin bir adjuvant adayıdır.
THORLAB Üyelerine Teşekkürler