ÖZEL EGE LİSESİ METOTREKSAT BİYOKONJUGATI ile HEDEFLİ KANSER TEDAVİSİ Gökberk YAMAK Danışman Öğretmen: Ayşe TÜRKER 2013 İZMİR
İÇERİK LİSTESİ 1.GİRİŞ... 3 2. MATERYAL VE METOD... 6 2.1 Materyal... 6 2.2 Metotreksat İlacının Uygun Formda Hazırlanması... 7 2.3 Folat Esterinin Sentezlenmesi... 7 2.4 Folat Esteri ile Metotreksatın Konjugasyonu... 9 2.5 Folat-Metotreksat Bileşiğinin Saflaştırılması... 9 2.6 Hücre Kültürü Denemeleri..... 10 2.6.1 Stok LNCaP hücrelerinin çözülmesi... 10 2.6.2 LNCaP hücrelerinin pasajlanması.. 10 2.6.3 Hücre canlılık testi. 11 2.6.4 Biyokonjugatın hücreler üzerindeki sitotoksisitesinin belirlenmesi 12 3. SONUÇLAR ve TARTIŞMA. 14 3.1 Folat Esterinin Sentezlenmesi... 14 3.2 Folat Esteri ile Metotreksatın Konjugasyonu... 14 3.3 Folat-Metotreksat Bileşiğinin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu...... 15 3.4 Hücre Kültürü Denemeleri... 16 4.TEŞEKKÜR... 17 5.KAYNAKLAR... 18 2
1. GİRİŞ Prostat kanseri, 2012 yılı istatistik verilerine göre Amerika Birleşik Devletleri nde ölüme neden olan ikinci kanser türüdür (Siegel ve ark., 2012). İstatistik yüzdeleri Şekil 1 de verilmektedir. Şekil 1. Amerika Birleşik Devletleri nde erkeklerde ölüme neden olan kanser türleri ve yüzdeleri (Siegel ve ark., 2012) Prostat kanseri tanısı konulan hastaların %30 unda ileri evre hastalık mevcuttur. Bununla beraber %25 hasta da takipleri sırasında ileri evre hastalık grubuna girmektedir. Prostat kanseri tedavisinde kemoterapi uygulamasının ilk adımları, 1989 yılında Tannock ve arkadaşlarının sistemik prednizon tedavisinin dirençli hale gelmiş prostat kanseri hastalarında, ağrı ve hayat kalitesi üzerinde olumlu etkilerini göstermeleriyle atılmıştır. 2004 yılına kadar yapılan çalışmalarda prostat kanseri tedavisinde kemoterapinin yeri palyasyondan öteye gidememiştir. Fakat bu tarihten sonra yayınlanan iki faz III çalışmada dosetaksel içeren kemoterapi rejimlerinin sağ kalımı uzatabileceği bildirilmiştir. Bunlara ilave olarak daha birçok klinik çalışma yapılmış ve yapılmaktadır. Hepsinde temel amaç sağ kalımı uzatmak veya palyatif yararlar sağlamak olsa da çalışmaların büyük bir bölümünde yüksek yan etki oranları ve istenilen sonuçların elde edilemediği görülmüştür. Bu durum nedeniyle yeni kemoterapötik ajanlar ve hedefe yönelik tedaviler büyük bir merak ve araştırma konusudur (Akınsal ve Sofikerim, 2010). Metotreksat (4-amino-4-deoksi-N10-metil pteroil glutamik asit, MTX) çeşitli kanser tiplerinin tedavisinde kullanılan bir antifolat bileşiktir (Şekil 2). Kanser tedavisi yanı sıra 3
romatoid artirit gibi inflamasyon hastalıklarında da kullanılabilmektedir (Santos ve ark., 2007). Metotreksat, antineoplastik bir antimetabolit olan metotreksat folik asit redüktaza bağlanarak enzim aktivitesini inhibe eder ve folik asitin tetrahidrofolata dönüşümünü engeller. Dolayısıyla tetrahidrofolattan türevlenen koenzimlerin görev aldığı tek karbon transfer reaksiyonları; nükleotid biyosentez reaksiyonları gerçekleşmez. Böylelikle DNA nın sentezini ve hücresel replikasyonu durdurmuş olur. Sahip olduğu bu etki mekanizması ile anti-kanser ajan özelliği taşır. Metotreksat, seçimli olarak hızlı çoğalan hücreleri etkiler. Yan etkileri başlıca kemik iliği baskılanması ve gastrointestinal toksisitedir (Drug Bank, 2012). İlacın hücre içindeki etkinliği ilaç direnç mekanizmaları tarafından azaltılır. İlaç direncinin kırılması için hedefli ilaçların oluşturularak yeni antifolatların geliştirilmesi gerekmektedir (Santos ve ark., 2007). Şekil 2. Metotreksat yapısı (DrugBank, 2012). Kullanılan çoğu antikanser ajan tümör hücreleri ile sağlıklı hücreleri birbirinden ayıramaz, dolayısıyla sistemik toksisiteye ve yan etkilere neden olur. Bu durum ilacın alınabilen maksimum dozunu sınırlar. Ayrıca hızlı eliminasyon ve geniş bir alana yayılım ilacın fazla miktarda uygulanmasını gerektirir ancak bu durum ekonomik değildir ve istenmeyen etkilerin ortaya çıkmasına sebep olur. Nanoboyutlu farmasötik ilaç taşıyıcı sistemlerin daha etkili ve daha az zararlı olması bu problemlerin bazılarını ortadan kaldırır (Ak, 2010). Hedeflendirmenin amacı genel olarak; Konvansiyonel tedavide gözlenen olumsuzlukları elimine etmek ya da en aza indirgemek, Hücresel düzeylere taşınımı artırmak, İlaçların dolaşımda ya da diğer biyolojik sıvılardaki konsantrasyonunu ve salım kinetiklerini optimize etmek, İlaçların farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklerini değiştirmek, Düşük ya da yüksek dozlarda etkin ve güvenli tedavi sağlamak, Toksik ve immunojenik özellikleri gidermek ya da en aza indirgemek, 4
İlaçların stabilitesini artırmak, Vücudun diğer bölgelerinde herhangi bir istenmeyen etkileşmeye neden olmadan hedef bölgede istenilen düzeyde farmakolojik yanıt elde etmektir (Kaş ve Eldem; Gürsoy dan 2002). Aktif hedefleme genellikle hedefle yönelecek molekülün nanopartiküle konjugasyonu ile elde edilir, böylece ilacın tümör dokuda birikiminin yanı sıra kanser hücrelerinde, intrasellüler organellerde veya spesifik moleküllerde birikimi sağlanır (Sinha ve ark., 2006). Tümör hücrelerinde aktif hedefleme hücre yüzeyindeki karbohidratlar, reseptörler ve antijenler hedef alınarak gerçekleştirilir. Aktif hedeflemede karbohidrat-lektin, reseptör-ligand, antijen-antikor ilişkisi temel alınmaktadır. Hücre membranlarında bulunan folat reseptörleri, folat ve metotreksat gibi folat analoglarının hücre içine alımından sorumludur. Folat ve antifolat bileşikler (metotreksat vb.), folat reseptörüne yüksek affinite ile bağlanır dolayısıyla folat reseptör pozitif hücrelerde birikebilir (Okarvi ve Jammaz, 2006). Folat reseptörleri over, meme bezi, kolon, akciğer, prostat, burun, boğaz ve beyin kanser epitel hücrelerinde fazla miktarda sentezlenir. Folat bağlı yapıların reseptör aracılı endositoz ile hücre içine girişi birkaç adımdan oluşmaktadır. Öncelikle konjugat reseptöre bağlanır, membran çöküntüsü oluşur ve endositik vezikül oluşturmak üzere sitoplazmaya girer. Endozomal kompartmanında asidifikasyon (ph ~5) gerçekleşir ve reseptörün konformasyon değiştirmesiyle folat bağlı konjugat reseptörden ayrılır, bilinmeyen bir mekanizma ile konjugat sitoplazmaya geçer. Reseptör membrana doğru yeniden kullanılmak üzere yol alır (Şekil 3). Düşük molekül kütlesi (441 g/mol), çeşitli solventlere, ph ve ısıya olan dayanıklılığı, konjugasyonunun kolay olması, immunojenitesinin olmaması ve reseptörüne olan ilgisinin yüksek oluşu folik asiti ilaç hedeflemede önemli bir ligand yapar (Ak, 2010). 5
Şekil 3. Folat-ilaç konjugatının reseptör aracılı endositoz ile hücre içine girişi 2012 yılında yayınlanan, Ak ve arkadaşları tarafından erkek sıçanlar üzerinde yapılan bir çalışmada radyoişaretli folat bağlı konjugatın prostatta yüksek oranda biriktiği bulunmuştur. Folat bağlı konjugatın folat içermeyen türevine göre prostatta 12 kat daha fazla biriktiği saptanmıştır (Ak ve ark., 2012). Literatür taramalarında prostat kanserine hedefli ve folat takılı başka sistemler de görülmektedir (Hattori ve Maitani, 2004; 2005; Zhao ve ark., 2010). 2009 yılındaki bir çalışmaya göre birçok kanser tipinde miktarı artan insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü hedef alınıp yeni bir metotreksat konjugatı oluşturulmuş ve etkinliği incelenmiştir. İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) bağlı metotreksatın serbest metotreksata göre MCF7 meme kanseri ve LNCaP prostat kanseri hücrelerine daha sitotoksik olduğu ve terapötik etkinliğinin arttığı belirtilmiştir (Mctavish ve ark., 2009). Leurs ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada gonadropin salan hormon-iii dekapeptiti ile reseptörüne hedeflendirilen daunorubisin ve metotreksat multifonksiyonel biyokonjugatları hazırlanmış ve MCF7 meme kanseri, HT-29 kolon kanseri ve LNCaP prostat kanseri hücrelerin üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Hücreler üzerinde monofonksiyonel biyokonjugat formlarına göre daha sitotoksik etki yarattığı bulunmuştur (Leurs ve ark., 2012). Çalışmamızın amacı prostat kanser hücrelerine folat ile hedeflendirilen metotreksat içeren ilaç konjugatı oluşturmak ve in vitro çalışmalar ile etkinliğini incelemektir. Oluşturulan biyokonjugatın kanser hücrelerine reseptör affinitesi ile bağlanarak özellikle kanser hücrelerinde daha çok sitotoksik etki yaratması böylece de terapötik etkinliğinin artırılması hedeflenmiştir. 2. MATERYAL VE METOT 2.1 Materyal Folik asit, N-hidroksisuksinimid (NHS), disiklokarbodiimid (DCC) Sigma; dimetilsülfoksit (DMSO) Merck firmasından sağlandı. Çalışmada kullanılan diğer kimyasallar analitik saflıktadır. Hücre kültürü çalışmaları Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ABD laboratuarlarında gerçekleştirildi ve gerekli sarf malzemeler Biological Industries firmasından sağlandı. Hücre kültürü çalışmalarında İnsan prostat karsinomu lenf nodu metastazı ve yüzeye bağımlı LNCaP hücre serisi kullanıldı. 6
2.2 Metotreksat ilacının uygun formda hazırlanması Metotreksat ilacı, ticari formu olan enjektabl solüsyon olarak alındı. Çalışmalarda kuru form gerektiğinden solüsyon flakon tüplere alındı ve kurutulmak üzere -20ºC ye kaldırıldı. Dondurulan örnek liyofilizatör cihazında gece boyu kurutuldu. Kuruyan örnek çalışmalarda kullanılmak üzere -20ºC de saklandı. 2.3 Folat esterinin sentezlenmesi Folat-NHS esterinin sentezi Ak ve Hamarat Sanlier in (2012) kullandıkları yönteme göre gerçekleştirildi. Özetle, 1 gram folik asit 50 ml DMSO içerisine yavaş yavaş eklenerek çözüldü. Üzerine 2,6 g NHS ve ardından 4,53 g DCC ilave edilerek 16 saat oda sıcaklığında ve ışıksız ortamda karıştırıldı. Süre sonunda filtre kağıdıyla süzülen çözelti liyofilize edilerek - 20 C de depolandı. Folat-NHS esteri oluşum reaksiyonu Şekil 4 te verilmiştir. 7
N OH N NH O NH COOH + O OH N O N H 2 N N folik asit COOH NHS N C N DCC N OH N NH O COOH NH N H 2 N N folat-nhs O O N O O Şekil 4. Folat-NHS esteri oluşum reaksiyonu 8
2.4 Folat esteri ile metotreksatın konjugasyonu Sentezlenen ve kurutulan folat-nhs ile toz hale getirilen metotreksatın uygun koşullar oluşturularak kovalent bağlanması sağlandı. Folat-NHS ve metotreksat 5:1 mol oranında 3 ml DMSO içerisinde karıştırılarak 4 saat azot gazı altında reaksiyona sokuldu. Süre sonunda reaksiyon karışımı liyofilize edilmek üzere -20 C ye kaldırıldı. 2.5 Folat-metotreksat bileşiğinin saflaştırılması Folat-metotreksat bileşiğinin reaksiyon karışımındaki diğer bileşenlerden ayırmak ve saflaştırmak için 100-500 Da por çapına sahip Spectra Por Float A lyzer diyaliz tüpleri kullanıldı. Diyaliz tüpleri ilk olarak d-suya karşıya diyalizlenerek temizlendi ardından ise 9
tüplerin içerisine liyofilizasyondan alınan ve d-su ile karıştırılan reaksiyon karışımı eklendi. Gece boyu diyaliz işleminin ardından diyaliz tüpü içeriği alındı ve 3000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatanttaki bileşiğin yapısı Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü nde gerçekleştirilen fourier dönüşümlü kızıl ötesi spektroskobu (FTIR, Perkin Elmer FTIR Spectrum One-B Spectrometer) analizi ile belirlendikten sonra hücre kültürü çalışmalarında kullanılmak üzere liyofilize edilip kurutuldu. 2.6 Hücre kültürü denemeleri 2.6.1 Stok LNCaP hücrelerinin çözülmesi -86ºC den çıkarılan LNCaP hücre serisi 37 o C su banyosunda 1-2 dakika bekletilerek, falkon tüp içerisine aşağıda belirtilen ortam ile ilave edildi. 2000 rpm / 5 dk santrifüj (Heraus) sonrasında elde edilen pellet üzerine taze ortam ilave edilerek hücreler flaska aktarıldı ve 37 o C de karbondioksit inkübatöründe (Thermo) inkübasyona bırakıldı. LNCaP hücre serisi %10 FBS (fetal sığır serum), %1 L-glutamin ve %1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 ortamında çoğaltıldı. 2.6.2 LNCaP hücrelerinin pasajlanması Ortam otomatik pipet yardımıyla uzaklaştırıldı. Kalan serum ve ortamı da uzaklaştırmak için steril PBS (tuzlu fosfat tamponu) ile bir kez yıkandı. PBS uzaklaştırıldıktan sonra Tripsin EDTA solüsyonu ilave edildi ve inkübatörde 1-2 dakika hücreler flask dan 10
kalkana kadar bekletildi. Tripsinin en az iki katı kadar taze ortam ilave edilerek 2000 rpm / 5 dk santrifüj edildi. Elde edilen pellet üzerine taze ortam ilave edilerek ve hücre yoğunluğuna bağlı olarak flasklara dağıtıldı. Hücreler 37 o C de inkübasyona bırakıldı. 2.6.3 Hücre canlılık testi Kültüre edilen hücrelerin canlılıklarını ve sayılarını takip etmek amacıyla, Tripan mavisi boyası testi kullanılmıştır. Buna göre, 50 µl hücre ile 50 µl boya karıştırılarak, ışık mikroskobu (Olympos) altında hücrelerin canlılığı ve sayısı Neubayer lam kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu amaçla, Neubayer lamda bulunan 4x4 lük karelerden oluşmuş 4 alan sayılmıştır. Tripan mavisi boyası testi gereğince boyayı içine alıp mavi renkte görünen hücreler ölü, boyayı içine almayanlar ise canlı olarak değerlendirilmiştir. Canlı hücre toplamının ortalaması alınarak 20.000 ile çarpılmasıyla, ml başına düşen canlı hücre sayısı saptanmıştır. Aynı işlem ölü hücreler için de gerçekleştirildiğinde, ml başına düşen ölü hücre sayısı belirlenmiştir. Hücre canlılığı ise, toplam hücre sayısının canlı hücrelere % olarak oranlanmasıyla belirlenmiştir. 11
2.6.4 Biyokonjugatın hücreler üzerindeki sitotoksisitesinin belirlenmesi Folat-metotreksat bileşiğinin LNCaP hücreleri üzerindeki sitotoksisiteyi belirlemek amacıyla ilk olarak ilaç ve hücrelerin inkübe edileceği plate in kullanılacak her bir kuyucuğunda 5000 hücre olacak şekilde LNCaP hücreleri eklendi ve plate 37ºC deki karbondioksit inkübatörüne kaldırıldı. 2 günlük yüzeye tutunma süresi sonunda inkübatörden çıkarılan plate in her bir kuyucuğundan ortamlar uzaklaştırılarak ilaç ile muamele için hazırlanmış oldu. 12
Biyokonjugat ise 10, 50, 100, 200 µm metotreksat içerecek şekilde hücre ortamı ile çözülüp seyreltildi, böylelikle biyokonjugat da hücre kültürü çalışmalarına hazırlanmış oldu. Ardından üç tekrarlı olacak şekilde kuyucuklar üzerine bu karışımlardan 200 µl eklendi ve aynı inkübasyon koşullarında olacak şekilde bekletildi. Kontrol setinde kuyucuklara sadece ortam uygulandı. 24 ve 48. saatlerde canlı hücre sayısını belirlemek ve sitotoksisiteyi saptamak amacıyla WST-1 kiti ile analizler yapıldı. Sitotoksisite tayininde kullanılan WST-1 kit içeriği aşağıda verilmektedir. WST-1 Cell Proliferation Kit (Roche) İçeriği: İçerisinde WST-1 (4-(3-(4-iyodofenil)-2- (4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolyum-1,3-benzen disülfonat) ve elektron eşitleme reaktifi bulunan kullanıma hazır solüsyon bulunmaktadır. Wst-1 kiti ile hücre sayısı ve canlılığı kalorimetrik olarak belirlenebilmektedir (Şekil 5). Organik madde ve radyoaktif içermeyen bu hazır kit bu çalışmada kullanıldı. Şekil 5. WST-1 reaktifinin çalışma prensibi 13
EC: elektron eşitleme reaktifi RS: Mitokondriyal suksinat-tetrazolyum redüktaz enzimi WST-1 analizlerinde kit manueline göre, solüsyondan tüm kuyucuklara 20 µl dağıtıldı ve 4 saat süreyle karbondioksit inkübatöründe inkübe edildi. Süre sonunda WST-1 sonuçları ELIZA (Thermo) cihazında spektrofotometrik olarak okutuldu ve yapılan hesaplamalar ile değerlendirildi. 3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 3.1 Folat esterinin sentezlenmesi Folik asitin, metotreksatın amin grubu ile reaksiyona girebilmesi için karboksilik asit grubu ester formuna çevrildi. Folat-NHS sentezi için NHS ve DCC kullanıldı. 16 saat süren karıştırmanın ardından oluşan disiklohekzilüre süzülerek ortamdan uzaklaştırıldı. Özetle, folik asit yapısındaki γ-karboksil grubu, amin ile daha reaktif olarak tepkime verebilen dolayısıyla biyokonjugasyona imkan sağlayan NHS türevine dönüştürüldü. Folik asitin reseptörü ile etkileşiminde görev alan α-karboksil grubu yapısının ise herhangi bir dönüşüme uğramadığı literatürde bildirilmektedir (Ak ve Sanlier, 2012). 3.2 Folat esteri ile metotreksatın konjugasyonu Folat NHS esteri oldukça reaktif bir yapı olduğundan metotreksat yapısındaki amin grubuna kolaylıkla bağlandığı ve amid bağı oluşturduğu düşünülmektedir. Bu reaksiyon 14
mekanizmasının baz alındığı Ak ve Şanlıer tarafından yapılan çalışmada folat-nhs esteri NH 2 -PEG-COOH ile bağlanmış ve başarılı bir sonuç alınmıştır (Ak ve Sanlier, 2012). 3.3 Folat-metotreksat bileşiğinin saflaştırılması ve karakterizasyonu Folat-metotreksat bileşiğinin reaksiyon sonunda, birbiri ile bağlanmayan folat esteri, metotreksat ve çözgenden ayrılması ve saflaştırılması amacıyla ilk olarak yapının tamamen kurutulması için liyofilize edildi. Liyofilizasyondan sonra geçilen diyaliz işleminde por çapı oldukça küçük (100-500Da) membranlar kullanıldı. Molekül kütlesi 500 Da dan küçük olan serbest metotreksatın karışımdan diyaliz ortamına çıkacağı düşünüldü. Folat esteri ise çözünürlüğünün oldukça az olması dolayısıyla membran içerisinde çöküntü olarak kaldı. Folat-metotreksat bileşiği ise 500 Da luk porlardan çıkamayacağı için membran içerisindeki sıvı fraksiyon olduğu düşünüldü. Diyaliz işlemi sonunda membran içeriği santrifüj edilerek üst ve alt faz birbirinden ayrıldı. Çözünürlüğü oldukça az olan folat esteri santrifüj sonrası pelleti oluştururken üst fazda folat-metotreksat bileşiği olduğu tahmin edildi. Folat-metotreksat bileşiği böylelikle saflaştırılmış oldu ve hücre kültürü çalışmalarında kullanılmak üzere liyofilize edilip kurutuldu. Sentezlenen biyokonjugatın karakterizasyonu amacıyla Folik asit, Metotreksat ve biyokonjugatın FTIR analizi gerçekleştirildi(şekil 6). Şekil 6. FTIR analiz sonuçları Şekil 6 da FOL, MTX ve FOL- MTX e ait IR spektrumları görülmektedir. Spektrumda 2900-3100 cm -1 arasındaki pikler CH 3 ve CH 2 gruplarina ait alifatik C-H gerilmesi, şiddetli pik 15
olarak yaklaşık 1720 cm -1 de C=O gerilmesi, 16300 cm -1 de C=C gerilmesi, 1453-1403 cm -1 de alifatik C-H düzlem içi eğilmesi (CH 2 için), 1379-1297 cm -1 de alifatik C-H düzlem içi eğilmesi (CH 3 için), ve C-C tekli bağına ait pikler 1200-800cm -1 de görülmektedir. O H gerilimine ilişkin pikler 3650-3200 cm -1 civarında gözükmektedir. Birincil ve ikincil aminler N-H bağı içermektedir. N-H bağı O-H bağına göre daha az polar olduğu için şiddeti daha az ve ince pik vermektedir. Birincil aminlerin N-H gerilme pikleri 3500-3000cm -1 iken ikincil aminlerin 3450-3300cm -1 de göstermektedirler. Moleküllerimizin yapısında bulunan OH ve NH 2 grubularına ait pikler 3500 ila 3300 cm -1 arasındadır. Benzen halkasında bulunan C=C grubu iki pik vermektedir. Bunlardan birincisi 1625-1575 cm -1 diğeri ise 1525-1475 cm -1 dir. Bu pikleri moleküllerimizin IR spektrumlarında gözlemlemekteyiz. Genel olarak C=O grubuna ait şiddetli pik 1840-1630cm -1 aralığında C=O grubuna bağlı grupların polaritesine göre değişmektedir. Birincil ve ikincil amitler, aminler gibi N-H grubu içermektedir. Birincil amitler yapılarında 2 tane N-H bağı bulunması nedeniyle, simetrik ve asimetrik gerilmelerine ilişkin ~3350 cm -1 ve ~3180 cm -1 pik verirler. İkincil amitler N-H gruplarına iliksin sadece bir piki ~3300 cm -1 de göstermektedirler. Birincil ve ikincil amitler ayrıca 1640-1550 cm -1 aralığında da pik vermektedirler. Karbonil ve N-H grubu gerilmeleri benzer frekansta pik vermeleri sebebiyle amit yapısının analizinde overlop olabilmekte ve bir tek pik olarak gözükmektedirler. Bu piki ilaca bağladığımız MTX molekülü için alınan IR spektrumunda 1713 cm -1 de tek bir pik olarak görülmektedir. Ayrıca yapıdaki C-N gerilme piki 1510 cm -1 civarında zayıf bir pik olarak gözükmektedir. 3.4 Hücre kültürü denemeleri Hücre kültürü çalışmalarında LNCaP hücreleri kullanılarak hazırlanan bileşiğin prostat hücreleri üzerindeki sitotoksik etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla ilk olarak -86ºC den çıkartılan LNCaP hücreleri uygun ortamlarda aktifleştirilmiş ve flasklarda uygun sayıya ulaştıklarında pasajlanarak hücrelerin canlılıkları sürdürülmüştür. Yeterli sayıdaki hücre platedeki kuyucuklara eklenerek ilaç uygulamasına hazırlanmıştır. İlaç uygulanan hücrelerin canlılıkları mitokondriyal enzim aktivitesi üzerinden aşağıda verilen reaksiyona göre WST-1 kiti ile belirlenmiştir. Serbest metotreksatın LNCaP hücreleri için IC50 (maksimum ölüm oranının %50 sini sağlayan ilaç konsantrasyonu) değeri yapılan bir çalışmaya göre 0,4 µm olarak bulunmuştur. Aynı çalışmada insülin benzeri büyüme faktörüne (IGF) kovalent bağlı metotreksatın IC50 değeri ise 1 µm olarak saptanmıştır. Bununla birlikte in vivo araştırmalarda IGF bağlı metotreksatın serbest metotreksata göre daha düşük dozlarda tümör boyutunu küçülttüğü belirlenmiş, dolayısıyla metotreksat bileşiğinin serbest metotreksata göre kanser hücreleri üzerinde hedefli olarak etkili olduğu ve sağlıklı hücrelerde daha az yan etki oluşturduğu 16
Hücre canlılığı(%) düşünülmüştür (Mctavish et al., 2009). Çalışmamızda herhangi bir ilaç ile muamele edilmemiş kontrol grubuna göre 10 µm ilaç konsantrasyonundaki folat-metotreksat bileşiği 24.saatte canlı LNCaP hücrelerinin yaklaşık %20 si için; 48.saatte ise yaklaşık %30 u için toksik etki göstermektedir (Şekil 7). Artan metotreksat konsantrasyonunda ise hücre canlılığı giderek azalmaktadır. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24 saat 48 saat kontrol 10 50 100 200 Metotreksat(µM) Şekil 7. Folat-metotreksat bileşiğinin LNCaP hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi Metotreksat folik asite amit bağı ile bağlı olduğundan ilacın fizyolojik ph da yapıdan ayrılmayacağı düşünülmektedir. Yapılacak ileri çalışmalar ile folat-metotreksat bileşiğinin hedefi olan folat reseptörüne yönelişi ve sağlıklı ve tümör hücreleri üzerindeki sitotoksisitesi in vivo sistemde araştırılabilir, böylece bileşiğin, metotreksatın sistemik yan etkilerini azaltabilirliği ve terapötik etkinliğini artırabilirliği belirlenebilir. 4. TEŞEKKÜR Proje Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Laboratuarları ve Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Laboratuarlarında gerçekleştirilmiştir. Teorik ve laboratuar desteklerinden dolayı Doç.Dr.Şenay Şanlıer, Asistan Güliz Ak, Habibe Yılmaz, Uzm.Dr.Nur Selvi ve Çağdaş Aktan a, çalışmalarım sırasında bana danışmanlık yapan Bilim Kurulu Eş 17
Başkanı Dr. Ayşe Baran Türker e, bana her konuda destek olan okul yöneticileri ve aileme teşekkür ederim. 5. KAYNAKLAR 1. Siegel et al., Cancer statistics, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 62: 10-29, 2012. 2. Akınsal E., Sofikerim M., Prostat Kanseri ve Kemoterapi, Turk Urol Sem, 1: 207-10, 2010. 3. Santos M.A. et al., Methotrexate γ-hydroxamate derivatives as potential dual target antitumor drugs, Bioorganic & Medicinal Chemistry 15 (2007) 1266 1274. 4. http://www.drugbank.ca/drugs/db00563, Erişim tarihi 19Aralık2012. 5. Ak G., Folat-PEG-Doxorubicin türevinin sentezlenerek teknesyumla işaretlenmesi ve kanser görüntüleme ajanı olarak kullanım olanaklarının araştırılması, Ege Üniversitesi Yüksek Lisans tezi, danışman Doç.Dr.Şenay Şanlıer, 2010. 6. Kaş, H.S. ve Eldem, T., 2002, Kontrollu salım sistemlerinin hedeflendirilmesi, 299-316, Kontrollu Salım Sistemleri, Gursoy, A.Z. (Der.), Kontrollu Salım Sistemleri Derneği Yayını, 1, İstanbul, 406s. 7. Sinha, R. et al., Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery, Molecular Cancer Therapeutics, 5(8):1909-1917, 2006. 8. Okarvi S.M. and Jammaz I.A., Preparation and In Vitro and In Vivo Evaluation of Technetium-99m-Labeled Folate and Methotrexate Conjugates as Tumor Imaging Agents, Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals, 21(1), 49-60, 2006. 9. Ak G., Yurt Lambrecht F., Hamarat Sanlier S., Radiolabeling of folate targeted multifunctional conjugate with Technetium-99m and biodistribution studies in rats, Journal of Drug Targeting, 20:6, 509 514, 2012. 10. Hattori Y. and Maitani Y., Enhanced in vitro DNA transfection efficiency by novel folate-linked nanoparticles in human prostate cancer and oral cancer. J Control Release, 97, 173 183, 2004. 11. Hattori Y. and Maitani Y., Folate-linked nanoparticle-mediated suicide gene therapy in human prostate cancer and nasopharyngeal cancer with herpes simplex virus thymidine kinase. Cancer Gene Ther, 12, 796 809, 2005. 12. Zhao et al., Preparation, characterization, and in vitro targeted delivery of folatedecorated paclitaxel-loaded bovine serum albumin nanoparticles, International Journal of Nanomedicine 5: 669 677, 2010. 13. Mctavish et al., Novel insulin-like growth factor-methotrexate covalent conjugate inhibits tumor growth in vivo at lower dosage than methotrexate alone, Translational Research, 153:275 282, 2009. 18
14. Leurs et al., GnRH-III based ultifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate, European Journal of Medicinal Chemistry, 52: 173-183, 2012. 15. Ak G., Hamarat Sanlier S., Synthesis of folate receptor targeted and doxorubicin coupled chemotherapeutic nanoconjugate and research into its medical applications, Prep Biochem Biotech, 42:6, 551-563, 2012. 19