Salmonella Serotip Enteritidis İzolatlarının Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile İncelenmesi

Özgün Çalışma/Original Article Mikrobiyol Bul 2011; 45(2): 210-227 Salmonella Serotip Enteritidis İzolatlarının Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile İncelenmesi Investigation of Salmonella Serotype Enteritidis Isolates By Plasmid Profile Analysis and Pulsed Field Gel Electrophoresis Ebru US, Birsel ERDEM, Alper TEKELİ, Devran GERÇEKER, Begüm SARAN, Mehseti BAYRAMOVA, Fikret ŞAHİN Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara. Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey. Geliş Tarihi (Received): 18.10.2010 Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 14.02.2011 ÖZET Bu çalışmada, Salmonella serotip Enteritidis in moleküler epidemiyolojisinin aydınlatılması amacıyla, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Enterobakteri Laboratuvarının kültür koleksiyonlarından seçilen 122 Salmonella Enteritidis suşu, Kado ve Liu yöntemine göre plazmid profil analizi (PPA) ile ve Dünya Sağlık Örgütü protokollerine göre, SpeI ve XbaI enzimleri kullanılarak pulsed field jel elektroforezi (PFGE) ile incelenmiştir. Çalışmaya dahil edilen suşlar, 2000 yılından sonra 10 farklı ildeki klinik mikrobiyoloji laboratuvarında, salgın (n= 13) ve sporadik (n= 109) olgulara ait klinik örneklerden (103 dışkı, 16 kan ve birer adet safra, idrar ve beyin omurilik sıvısı) izole edilen suşlardır. PFGE ile elde edilen bant sayı ve ilişkileri GeneDirectory (Syngene, İngiltere) jel analiz programı kullanılarak; küme analizi Dice benzerlik katsayısı ve UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average) ilişki kuralı parametreleriyle değerlendirilmiştir. Çalışmada, plazmid taşıyan 110 (%90) suşun, büyüklükleri 2.0 ile 100 kb arasında değişen 1-4 plazmid taşımakta olduğu ve 14 ten fazla plazmid profili (p1-p14) gösterdiği belirlenmiştir. Seksen beş (%69.7) izolatın, 57 kb büyüklüğündeki plazmidi tek olarak ya da başka plazmidlerle birlikte bulundurduğu izlenmiştir. PFGE yönteminde SpeI ve XbaI enzimleri ile 11 er farklı PFGE modeli elde edilmiş; SpeI ile oluşan modeller A-K; XbaI ile oluşanlar a-k şeklinde adlandırılmıştır. SpeI ile model A da 93 (%76.2) suşun; XbaI ile model a da 53 (%43.4) ve model b de 42 (%34.4) suşun kümelendiği belirlenmiştir. İki enzim birlikte değerlendirildiğinde ortaya çıkan 17 farklı PFGE kümesi içinde, suşların çoğunluğunun Aa (50 suş, %40.9) ve Ab (42 suş, %34.4) kümelerinde toplandığı görülmüştür. PFGE yönteminde SpeI ve XbaI enzimlerinin bir- İletişim (Correspondence): Dr. Ebru Us, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 06100 Sıhhiye, Ankara, Türkiye. Tel (Phone): +90 312 508 3179, E-posta (E-mail): Ebru.Us@medicine.ankara.edu.tr

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. likte kullanılması ile ayırım gücünün arttığı belirlenmiş ve bulgularımız Türkiye de dolaşımdaki S. Enteritidis izolatlarının çoğunluğunun benzer PFGE modelleri gösteren suşlar olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle S. Enteritidis suşlarının PFGE ile araştırılması durumunda, en azından plazmid profil analizi gibi bir başka yöntemle beraber uygulanması, izolatların ilişkilerini ortaya çıkarmak için daha yararlı olacaktır. Anahtar sözcükler: Salmonella serotip Enteritidis; plazmid profil analizi; PFGE. ABSTRACT In this study a total of 122 Salmonella serotype Enteritidis stock strains selected from the culture collection of Enterobacteriaceae Laboratory of Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, were investigated by plasmid profile analysis with the method defined by Kado and Liu and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) according to World Health Organization protocols using SpeI and XbaI macrorestriction enzymes, for better understanding of the molecular epidemiology of S. Enteritidis. The study strains were selected from a collection of previously isolated epidemic (n= 13) and sporadic (n= 109) strains (103 stool, 16 blood and one each bile, urine and cerebrospinal fluid) obtained from 10 different cities after the year 2000. PFGE patterns were analyzed with Gene Directory software (Syngene, UK) and a similarity index was determined by using Dice coefficient and the unweighted pair group method with mathematical averaging (UPGMA). Plasmid-carrying 110 (90%) strains that harbored 1-4 plasmids with sizes ranging from 2.0 to 100 kb were separated into patterns more than 14 (p1-p14). A total of 85 (69.7%) isolates harbored the 57 kb plasmid solely or in combination with other plasmids. By PFGE, 11 distinct patterns were shown with each enzyme SpeI and XbaI. S. Enteritidis strains after digestion with macrorestriction enzyme SpeI generated 11 different PFGE patterns (A to K), whereas XbaI generated also 11 different PFGE patterns (a to k). PFGE pattern A consisted of 93 strains (76.2%) after digestion with macrorestriction enzyme SpeI, while PFGE pattern a consisted 53 (43.4%) and PFGE pattern b 42 strains (34.4%) after digestion with macrorestriction enzyme XbaI. Using two macrorestriction enzymes two PFGE cluster profiles Aa (50 strains, 40.9%) and Ab (42 strains, 34.4%) were found to be predominating among 17 different PFGE clusters. Our results confirmed the clonal nature of S. Enteritidis strains in Turkey. The use of two enzymes in PFGE analysis appeared to increase the discriminatory power of PFGE, leading to greater diversity among strains. PFGE analysis performed by SpeI and XbaI enzymes combined with plasmid profiling could be established as a useful tool for detection of genetic relationship between isolates. Key words: Salmonella serotype Enteritidis; plasmid profile analysis; PFGE. GİRİŞ Salmonella enfeksiyonları Türkiye de önemli bir halk sağlığı sorunudur 1. Dünyada son 25 yılda Salmonella serotiplerinden Salmonella enterica subsp. enterica ser. Enteritidis belirgin bir şekilde yaygınlaşırken, Türkiye de de 1990 lı yıllardan beri insan enfeksiyonlarında en sık karşılaşılan serotip olmuştur 2,3. Salmonella serotip Enteritidis gastroenteritli olguların örneklerinden sıklıkla izole edilen serotip olduğu gibi, bağırsak dışı invazif enfeksiyonlara da yol açabilen önemli bir etkendir. Gıda kaynaklı salgınlara neden olduğu kadar sporadik olgularda da en sık rastlanan Salmonella serotipidir 3. S. Enteritidis in, Batı Avrupa da Enterik Enfeksiyonların Ulusal Sürveyans Ağı (Enter-net) na ait ulusal referans laboratuvarlarında en sık tanımlanan serotip olduğu bildirilmektedir 4,5. 211

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi Salmonella cinsindeki bakteriler, lipopolisakkarid O (somatik) antijenleri ve protein H (kirpik) antijenlerinin farklılıklarına dayanılarak, 1926 yılında White ın düzenlediği ve 1972-1978 yıllarında Kauffmann ın genişlettiği şemaya göre serogruplara ve serotiplere ayrılır 1. Salmonella izolatları, Türkiye de çoğu çalışmada serotiplendirme ve antimikrobiyal duyarlılık testleriyle araştırılmıştır 6. İzolatların çoğunun benzer antibiyogramlar gösterdiği epidemiyolojik çalışmalarda, bu fenotipik yöntem Salmonella serotiplerini tiplendirmede yeterli ayırt edici güce sahip değildir. Epidemiyolojik çalışmalarda Salmonella serotiplerinin alttiplendirmesi (subtyping) için ve izolatların aralarındaki ilişkinin gösterilebilmesi amacıyla standart tekniklere ihtiyaç vardır. Son yıllarda Salmonella izolatlarının ileri ayırımı için moleküler tiplendirme yöntemleri geliştirilmiştir 7. Plazmid ve kromozom DNA sının incelenmesine dayanan plazmid analizi, ribotiplendirme, pulsed field jel elektroforezi (PFGE) gibi moleküler yöntemler her geçen gün geliştirilmekte ve yeni yöntemler eklenmektedir 8. PFGE, Salmonella suşlarının ayırımında kullanılan moleküler yöntemler içinde yaygın olarak önerilen ve Amerika Birleşik Devletleri nde 1996 yılından beri Salmonella alttiplendirmesinde uygulanan başlıca yöntemdir 9. Bu çalışmada, S. Enteritidis in moleküler epidemiyolojisine katkıda bulunmak üzere Türkiye de salgın ve sporadik olgulardan izole edilen S. Enteritidis suşlarının plazmid profil analizi (PPA) ve iki enzim (SpeI ve XbaI) kullanılarak PFGE yöntemleriyle araştırılması amaçlanmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM Suşlar Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Enterobakteri Laboratuvarının kültür koleksiyonlarında bulunan 122 S. Enteritidis suşu çalışmaya alındı. Bu suşlar, daha önceki bir çalışma kapsamında 3 2000 yılından itibaren, 10 ildeki [Ankara (n= 43), Antalya (n= 2), Bursa (n= 12), Edirne (n= 27), Eskişehir (n= 7), İstanbul (n= 2), İzmir (n= 2), Kayseri (n= 17), Konya (n= 8), Trabzon (n= 2)] klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında, salgın (n= 13) ve sporadik (n= 109) olgulara ait klinik örneklerden [dışkı (n= 103), kan (n= 16), safra (n= 1), idrar (n= 1), beyin omurilik sıvısı (BOS) (n= 1)] standart yöntemlerle izole edilmiş; Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında serotiplendirilmiş; Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; eski adı ile NCCLS) kılavuzunda açıklandığı şekilde agar dilüsyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılıkları belirlendikten sonra, mikrobank kültür saklama tüpleri içinde -80 C de saklanmakta olan izolatlardı. Bu suşlar, yaşları 1-90 yıl arasında değişen 101 gastroenterit, 13 sepsis, 8 paratifo olgusundan (38 kadın, 84 erkek) izole edilmişti. Bu izolatların 13 ü, Edirne yakınlarındaki bir askeri birlikte meydana gelen gıda kaynaklı bir salgın sırasında 20-22 yaşlarındaki gastroenteritli olguların dışkı kültürlerinden elde edilen suşlardı. Plazmid Eldesi ve Plazmid Profil Analizi Plazmidler, Kado ve Liu nun 10 yönteminde küçük değişiklikler yapılarak elde edildikten sonra, 0.5 X Tris-borik asit-edta (TBE) solüsyonundaki 0.5 µg etidyum bromür ml -1 212

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. içeren %0.7 lik horizontal agaroz jelde (Serva, Heidelberg, Almanya) 100 V da iki saat yürütülerek ayrıldı. İncelenen suşların plazmid büyüklükleri, plazmid büyüklükleri bilinen Escherichia coli V517 suşu (53.7, 7.2, 5.6, 5.1, 3.9, 3.0, 2.7, 2.1 kb), Salmonella Typhimurium 020255-Ankara suşu (90 kb), Salmonella Enteritidis 006956-Ankara (57, 5.8, 4.8 kb) suşu ve bir moleküler büyüklük belirteci (gene ruler 1 kb DNA Ladder, Fermentas, Vilnius, Litvanya) ile birlikte elektroforez uygulanarak belirlendi. Plazmid DNA bantları, UV ışığı altında (TFX 20M-Vilber Lourmat, Marna la Vallee, Fransa) görüntülendi. Kontrol suşları (E.coli V517, S. Typhimurium 020255-Ankara ve S. Enteritidis 006956-Ankara) Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölümünden sağlandı. İzolatların plazmid DNA içerikleri kilobaz (kb) şeklinde molekül ağırlıklarına uygun olarak tanımlandı. PFGE PFGE, Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) protokolüne göre uygulandı 11. Bu yönteme göre her bir izolat SpeI ve XbaI enzimleri (Fermentas, Vilnius Litvanya) ile ayrı ayrı kesim işlemine tabii tutuldu. Tüm izolatlar bir gece 37 C de üretildikten sonra %1.3 lük düşük erime ısılı agaroz ile agaroz kalıpları hazırlandı. Genomik DNA, 20 U lik kesim enzimleri SpeI ve XbaI ile üreticinin önerileri doğrultusunda dört saat inkübe edildi. CHEF DR II (Bio- Rad, Hercules, CA, USA) sisteminde, %1.3 lük agaroz jel ile uygulanan elektroforez koşulları başlangıç vuruş süresi 2.2 saniye, bitiş vuruş süresi 63.8 saniye, akım 6 V/cm, sıcaklık 14 C, süre 18 saat olacak şekilde ayarlandı. Jeller etidyum bromür (0.2 µg/ml) solüsyonunda boyandı ve UV ışığı altında görüntülendi. Elektroforez sonrasında jel fotoğrafları DigiGenius görüntüleme sistemi (Syngene-UK) kullanılarak çekildi. PFGE paternleri, hem Tenover ve arkadaşları 12 tarafından tarif edildiği şekilde gözle, hem de Gene Directory (Syngene, Cambridge, İngiltere) programı kullanılarak değerlendirildi. Unweighted Pair Group Method with Mathematical Averaging (UPGMA) yöntemi ve Dice benzerlik katsayısı kullanılarak PFGE paternlerinin %1 lik bant toleransı ile dendrogramı oluşturuldu ve kümelenme analizi yapıldı. Kontrol olarak bir moleküler büyüklük belirteci (M) [N0340S, New England Biolabs, Hetfordshire, İngiltere (Band büyüklüğü 48.5-1018.5 kb)] kullanıldı. Kontrol suşu (Salmonella Braenderup H9812) Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölümünden sağlandı. BULGULAR İzolatların antimikrobiyal duyarlılıkları, plazmid profilleri, PFGE modelleri (paternleri) ve diğer özellikleri Tablo I-VII de gösterilmiştir. İncelenen 122 S. Enteritidis suşunun 12 (%10) sinin plazmidsiz suşlar olduğu görülmüştür. Plazmid taşıyan 110 (%90) izolatın, büyüklükleri 2.0-100 kb arasında değişen 1-4 plazmid taşıdığı belirlenmiştir (Tablo I-VII). Seksen beş (%69.7) izolat 57 kb büyüklüğündeki plazmidi tek olarak ya da başka plazmidlerle birlikte taşımaktadır (Tablo I-IX). Plazmidli suşların 14 ten fazla plazmid profili (p1-p14) gösterdiği belirlenmiştir (Tablo VI- II). Plazmid profillerinin çoğunda (p1-p5, p7, p9-p11, p13) 57 kb lık plazmid bulunmaktadır ve izolatların çoğu (n= 34, %27.9) p1 profiline sahiptir (Tablo VIII). Ankara da S. 213

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi Tablo I. Edirne de Salgından ve Sporadik Olgulardan İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 1* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 2* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 3* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 4* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 5* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 6* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 7* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 8* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 9* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 10* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 B j 11* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 12* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 13* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 14 Ge Dışkı S 57 p1 A a 15 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 16 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 17 Ge Dışkı S - B j 18 Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 19 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 20 Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 21 Ge Dışkı A 57, 2.5 p9 A b 22 Ge Dışkı A 57 p1 A b 23 Ge Dışkı AA/CT 57, 5.8, 4.8 p4 A a 24 Ge Dışkı AA/CG 90, 57, 3.0, 2.0 pd A b 25 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 26 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 27 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b * Salgın suşu. a Kümeler (3 tip): Aa (2); Ab (23); Bj (2). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, G: Gentamisine dirençli, T: Tetrasikline dirençli, pd: Diğer plazmid profilleri. Enteritidis suşlarından elde edilen altı plazmid (85, 70, 60, 55, 4.0, 3.5 kb), diğer illerin izolatlarında görülmemiştir (Tablo II ve IX). Sadece Edirne de belirlenen p2 profili (57, 40, 3.0 kb) gösteren suşların 13 ü gıda kaynaklı salgın suşlarıdır (Tablo I). Ayrıca, p5 profili (100, 57 kb) sadece Kayseri suşlarında belirlenmiştir (Tablo VI). 214

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. Tablo II. Ankara da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 28 Se Kan S 57 p1 C a 29 Ge Dışkı C - K h 30 Pt Kan S 57 p1 A a 31 Ge Dışkı C - A a 32 Ge Dışkı S 57, 3.5 p10 A b 33 Ge Dışkı S 57 p1 A a 34 Ge Dışkı C 57 p1 A a 35 Ge Dışkı C 6.0 p12 B c 36 Ge Dışkı S 57, 2.5 p9 A b 37 Ge Dışkı AA/CT 6.0, 2.0 pd G f 38 Se Kan A 57 p1 A a 39 Pt Kan AA/CCT 90 p6 C e 40 Ge Dışkı S 57 p1 A a 41 Ge Dışkı A 90 p6 F e 42 Ge Dışkı C 57 p1 A a 43 Ge Dışkı AA/CCT - F e 44 Ge Dışkı T 57, 4.0, 3.0 pd A a 45 Ge Dışkı C 85 pd H g 46 Ge Dışkı AA/CT 30 pd H a 47 Ge Dışkı AA/C 57 1 H d 48 Ge Dışkı A 57, 3.5, 2.5 pd H d 49 Ge Dışkı GCT 100, 57, 5.8, 4.8 p13 A a 50 Ge Dışkı GCT 90, 5.0 pd A a 51 Se Safra ACT - G f 52 Ge Dışkı AT - A a 53 Se Kan AC - J k 54 Ge Dışkı AA/C 57 p1 A a 55 Ge Dışkı AT 57 p1 I d 56 Pt Dışkı A 70 pd A b 57 Ge Dışkı A 57, 3.5 p10 A a 58 Se Kan A 2.0 p14 A b 59 Ge Dışkı A 2.0 p14 A a 60 Ge Dışkı AA/CG 100, 55 pd A b 61 Pt Kan CT 60 pd A b 62 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 63 Ge Dışkı S 57, 4.5 p11 A a 64 Ge Dışkı S 57, 4.5 p11 A b 65 Ge Dışkı C 90, 3.5 pd A b 66 Ge Dışkı T 55 pd A a 67 Ge Dışkı S 57 p1 A a 68 Ge Dışkı S 57 p1 A a 69 Ge Dışkı S 57 p1 A a 70 Se Dışkı S 57 p1 A a a Kümeler (13 tip): Aa (21); Ab (8); Ca (1); Kh (1); Bc (1); Gf (2); Ce (1); Fe (2); Hg (1); Ha (1); Hd (2); Jk (1); Id (1). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, Pt: Paratifo, pd: Diğer plazmid profilleri, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, G: Gentamisine dirençli, T: Tetrasikline dirençli. 215

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi Tablo III. Antalya, İstanbul, İzmir ve Trabzon da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Şehir Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 71 Antalya Ge Dışkı TT/S 90 p6 A b 72 Antalya Ge Dışkı A 57 p1 A a 73 Istanbul Ge Dışkı A - A a 74 İstanbul Ge Dışkı AA/C - B c 75 Izmir Pt Kan C 57 p1 A a 76 Izmir Ge Dışkı S 57 p1 A i 77 Trabzon Pt Kan S 57 p1 A a 78 Trabzon Ge Dışkı S 57, 40 pd A a a Kümeler (4 tip): Aa (5); Ab (1); Bc (1); Ai (1). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Pt: Paratifo, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli, T/S: Trimetoprim/sülfametoksazole dirençli, pd: Diğer plazmid profilleri. Tablo IV. Bursa da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 79 Ge Dışkı GC 100, 57, 5.8, 4.8 p13 A a 80 Se Kan S 57 p1 A a 81 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 82 Se Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 83 Ge Kan S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 84 Ge Dışkı S 57 p1 A a 85 Se Kan A 57, 3.0 pd A b 86 Ge Dışkı AT 57, 40, 30, 3.0 pd A b 87 Ge Dışkı S 90, 57, 4.5 pd A b 88 Se İdrar A 57, 2.0 pd A b 89 Ge Dışkı S 57 p1 A a 90 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a a Kümeler (2 tip): Aa (6); Ab (6). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli, G: Gentamisine dirençli, pd: Diğer plazmid profilleri. 216

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. Tablo V. Eskişehir de İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 91 Ge Dışkı S 2.6 pd D c 92 Ge Dışkı S 6.0 p12 B c 93 Ge Dışkı S 57 p1 C a 94 Ge Dışkı C 5.8 pd B c 95 Ge Dışkı A 5.0 pd B c 96 Ge Dışkı S 57 p1 A a 97 Ge Dışkı S 57 p1 A a a Kümeler (4 tip): Aa (2); Bc (3); Dc (1); Ca (1). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, pd: Diğer plazmid profilleri. Tablo VI. Kayseri de İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 98 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 99 Ge Dışkı S 57 p1 A a 100 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 101 Ge Dışkı S 100, 57 p5 A a 102 Ge Dışkı C - B c 103 Se Kan C - B c 104 Ge Dışkı AA/CCT 90 p6 F e 105 Ge Dışkı AC 7.0 pd B c 106 Ge Dışkı A 57 p1 A a 107 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 108 Pt Kan AA/C 90, 3.0, 2.0 pd A b 109 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A b 110 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 111 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 112 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 113 Ge Dışkı AA/CGCT/S 40 p8 B c 114 Pt Kan AA/CGCT/S 40 p8 B c a Kümeler (4 tip): Aa (7); Ab (4); Bc (5); Fe (1). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, Pt: Paratifo, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli, G: Gentamisine dirençli, T/S: Trimetoprim/sülfametoksazole dirençli, pd: Diğer plazmid profilleri. 217

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi Tablo VII. Konya da İzole Edilen S. Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri PFGE a Kümeler Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli 115 Se Kan S - E i 116 Ge Dışkı S 57 p1 A a 117 Ge Dışkı AA/CCT 57 p1 A a 118 Ge Dışkı S 57 p1 A a 119 Ge Dışkı S 57 p1 A a 120 Ge Dışkı S 57 p1 A a 121 Se BOS AA/C 40 p8 A a 122 Ge Dışkı S 57 p1 A a a Kümeler (2 tip): Aa (7); Ei (1). PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, BOS: Beyin omurilik sıvısı, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli. S. Enteritidis suşlarının PFGE yöntemi ile SpeI ve XbaI makrorestriksiyon enzimleri ile kesimlerinin ardından, molekül büyüklükleri her iki enzimle de 48.5-1018.5 kb arasında değişen 8-13 adet bant elde edilmiştir. Dice benzerlik katsayısı ve UPGMA yöntemi kullanılarak oluşturulan PFGE modellerinin dendogramları sırasıyla Şekil 1 ve 3 te gösterilmiştir. SpeI enzimi ile kesilen S. Enteritidis suşları 8-13 bant içeren 11 farklı PFGE modeli (A- K) oluşturmuştur. İki ana PFGE modeli olan A ve B nin genetik benzerliklerinin %38 olduğu gösterilmiştir. İzolatların 93 (%76.2) ü PFGE modeli A yı, 12 (%9.8) si PFGE model B yi oluşturmuştur (Şekil 1, Tablo X). Kalan 17 izolatın oluşturduğu dokuz PFGE modeli (C-K) üçten fazla bant farkı ve %80 in altında benzerlik göstermiştir. S. Enteritidis suşlarının SpeI enzimi ile kesiminin ardından elde edilen PFGE modellerine ait örnekler Şekil 2 de verilmiştir. XbaI enzimi ile kesilen S. Enteritidis suşları 8-13 bant içeren 11 farklı PFGE modeli (ak) oluşturmuştur. Üç ana PFGE modeli a, b ve c, sırasıyla tüm izolatların %43.4, %34.4 ve %9 unda saptanmıştır (Şekil 1, Tablo X). Kalan sekiz PFGE modeli 16 izolattan elde edilmiş; bu modeller arasında üçten fazla bant farkı ve %80 in altında benzerlik gözlenmiştir. PFGE model a ve model b arasındaki genetik benzerlik %91 den fazladır. Bu iki PFGE modeli ile model c arasındaki genetik benzerlik ise %10 dur (Şekil 3). S. Enteritidis suşlarının XbaI enzimi ile kesiminin ardından elde edilen PFGE modellerine ait örnekler Şekil 4 te gösterilmiştir. İki enzim birlikte değerlendirildiğinde, S. Enteritidis suşlarının 17 farklı PFGE kümesine ayrıldığı görülmüştür (Tablo X). Üç ana küme olan Aa, Ab, Bc nin tüm izolatlar arasındaki dağılımı sırasıyla %40.9, %34.4 ve %8.1 olarak belirlenmiştir. 218

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. Tablo VIII. S. Enteritidis Suşlarında Plazmid Profillerini Oluşturan Plazmidler ve Profilleri Bulunduran İzolat Sayısı Profiller Plazmidler (kb) Suş sayısı p1 57 34 p2 57, 40, 3.0 15 p3 57, 40, 6.5, 4.5 7 p4 57, 5.8, 4.8 5 p5 100, 57 5 p6 90 4 p7 57, 6.5, 4.5 3 p8 40 3 p9 57, 2.5 2 p10 57, 3.5 2 p11 57, 4.5 2 p12 6.0 2 p13 100, 57, 5.8, 4.8 2 p14 2.0 2 Diğer plazmid profilleri 57, 4.0, 3.0 1 57, 3.5, 2.5 1 90, 5.0 1 57, 40, 30, 3.0 1 57, 2.0 1 90, 57, 3.0, 2.0 1 6.0, 2.0 1 90, 3.0, 2.0 1 100, 55 1 90, 3.5 1 55, 85 1 70, 60 1 57, 40 1 57, 3.0 1 30 1 90, 57, 4.5 1 2.6 1 5.8 1 5.0 1 7.0 1 Plazmidsiz 12 Toplam 122 219

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi Tablo IX. S. Enteritidis Suşlarında Bulunan Plazmidlerin Büyüklükleri Plazmid büyüklüğü (kb) Suş sayısı (%) 57 85 (69.7) 40 27 (22.1) 3.0 20 (16.3) 4.5 13 (10.6) 6.5 10 (8.2) 90 9 (7.3) 100 8 (6.5) 5.8 8 (6.5) 4.8 7 (5.7) 2.0 6 (4.9) 3.5 4 (3.2) Ankara* 6.0 3 (2.4) Ankara, Eskişehir* 2.5 3 (2.4) Ankara, Edirne* 55 2 (1.6) Ankara* 30 2 (1.6) Ankara, Bursa* 5.0 2 (1.6) Ankara, Eskişehir* 85 1 (0.8) Ankara* 70 1 (0.8) Ankara* 60 1 (0.8) Ankara* 7.0 1 (0.8) Kayseri* 4.0 1 (0.8) Ankara* 2.6 1 (0.8) Eskişehir* * Sadece belirtilen şehirlerdeki izolatlarda bulunan plazmidler. 38 44 50 57 63 69 75 81 88 94 100 PFGE modeli A B Şekil 1. S. Enteritidis izolatlarının başlıca PFGE SpeI bant modellerine ait Gene Directory programı ve UPGMA yöntemi kullanılarak oluşturulan dendogramlar. 220

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. M 42 43 103 104 105 37 Şekil 2. S. Enteritidis suşlarının SpeI enzimi ile kesimin ardından oluşan PFGE modellerine ait örnekler (M: Lambda ladder PFGE belirteci; 42, 43, 103, 104, 105, 37 suş noları; suşların PFGE modelleri, sırasıyla; A, F, B, F, B, G). Tablo X. S. Enteritidis Suşlarının PFGE Modellerine ve Her İki Enzimin (SpeI ve XbaI) Birlikte Değerlendirilmesiyle Oluşturulan PFGE Kümelerine Dağılımı Suş Suş Kümeler Suş Spel sayısı (%) XbaI sayısı (%) (SpeI/XbaI) sayısı (%) A 93 (76.2) A 53 (43.4) Aa 50 (40.9) B 12 (9.8) B 42 (34.4) Ab 42 (34.4) C 3 (2.4) C 11 (9) Bc 10 (8.1) D 1 (0.8) D 3 (2.4) Ai 1 (0.8) E 1 (0.8) E 4 (3.2) Bj 2 (1.6) F 3 (2.4) F 2 (1.6) Ca 2 (1.6) G 2 (1.6) G 1 (0.8) Ce 1 (0.8) H 4 (3.2) H 1 (0.8) Dc 1 (0.8) I 1 (0.8) I 2 (1.6) Ei 1 (0.8) J 1 (0.8) J 2 (1.6) Fe 3 (2.4) K 1 (0.8) K 1 (0.8) Gf 2 (1.6) Ha 1 (0.8) Hd 2 (1.6) Hg 1 (0.8) Id 1 (0.8) Jk 1 (0.8) Kh 1 (0.8) 11 model 11 model 17 küme 122 PFGE: Pulsed field jel elektroforezi. 221

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100 PFGE modeli b a c Şekil 3. S. Enteritidis izolatlarının başlıca PFGE XbaI bant modellerine ait Gene Directory programı ve UPGMA yöntemi kullanılarak oluşturulan dendogramlar. 38 95 117 41 45 44 M Şekil 4 S. Enteritidis suşlarının XbaI enzimi ile kesimin ardından oluşan PFGE modellerine ait örnekler (M: Lambda ladder PFGE belirteci; 38, 95, 117, 41, 45, 44, suş no ları; suşların PFGE modelleri, sırasıyla; a, c, a, e, g, a) TARTIŞMA Türkiye de en sık izole edilen Salmonella enterica serotipi S. Enteritidis dir 1,3. Dünyanın pek çok bölgesinde de yaygın olduğundan S. Enteritidis enfeksiyonları küresel bir pandemi olarak kabul edilmektedir 13. 1997 yılında Avrupa da bildirilen tüm insan salmonelloz olgularının %85 i S. Enteritidis kaynaklı iken, bu yüksek seviyeden itibaren insidansın düştüğü gözlenmiştir 7. Avrupa da gıda kaynaklı enfeksiyonların en sık nedeni Salmonella lardır ve S. Enteritidis de en sık tanımlanan serotiptir 2. İngiltere ve İspanya dan yapılan son çalışmalar S. Enteritidis in sırasıyla %60 ve %86 insidans ile en sık rastlanan se- 222

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. rotip olduğunu göstermiştir. 2000-2002 yılları arasında S. Enteritidis Avrupa da Enternet e bildirilen suşların %53 ünü oluşturmuştur 14. Avrupa da salgınların incelemesinde, Salmonella serotiplerinde suşların ileri ayırımı (alttiplendirme) gerektiğinde, DNA parmak izi incelemesiyle beraber yapılan Ward ve arkadaşlarının 15 yöntemine dayanan faj tiplendirme, uluslararası standart bir yöntem olarak kullanılmaktadır 2. Geniş konak çeşitliliğine sahip bir patojen olan S. Enteritidis faj tipleri, çeşitli bölgelerde ve hayvan türlerinde bildirilmiştir 13. Erdem ve arkadaşları 16 1994 yılında Türkiye de faj tip 4 e (PT4) ait suşların hakimiyetini göstermişlerdir. Daha sonra Avrupa da 1998-2003 yılları arasında insan izolatlarına ait faj tiplerinde değişiklik olduğu, PT4 te azalma ve PT8 ile PT21 in yaygınlığında artış olduğu bildirilmiştir 5. Plazmid ve kromozom DNA sının incelenmesine dayanan yöntemler, faj tiplendirmeye ek olarak kullanılmaktadır 16-18. Geleneksel faj tiplendirme yöntemi zaman alıcıdır, faj süspansiyonlarının devam ettirilmesi güçtür ve belirli referans merkezlerinde uygulanabilmektedir 13. Günümüzde etkenin belli bölgelerde endemik olması nedeniyle, epidemiyolojik sürveyans için duyarlı ve standart yöntemler gereklidir 19. Moleküler tiplendirme, Salmonella sürveyansının duyarlılık ve özgüllüğünü büyük ölçüde artırmakta 8,20 ve geleneksel sürveyans yöntemleriyle saptanamayacak salgınları belirleme ve halk sağlığı için önemli özel klonları hızla tanımlama olanağı sağlamaktadır 13. PPA (plasmid profile analysis), RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), IS200 RFLP (restriction fragment length polymorphism), ribotiplendirme ve PFGE muhtemel genetik ilişkileri belirleme ve tanımlamada kullanılan yöntemlerdir 21. Plazmidler, çoğunlukla kovalan olarak kapalı, dairesel yapıda, çift iplikçikli kromozom DNA molekülleridir ve bakteri kromozomundan bağımsız olarak replike olur. Epidemiyolojik amaçlar için uygulanan PPA, suşlardaki plazmid DNA sının ekstraksiyonundan sonra her bir suşun taşıdığı plazmidlerin sayı ve moleküler ağırlıklarının belirlenmesi temeline dayanır. Çeşitli Salmonella salgınlarının aydınlatılmasını sağlamasına karşın PPA, plazmid taşıyan suşlarla sınırlıdır. S. Enteritidis izolatlarının çoğu çevresel konaklarda devam edebilmesi için önemli olduğu düşünülen 38 MDa luk serovara özgül virülans plazmidini taşımaktadır. Salmonella serotiplerinin alttiplendirmesinde, suşların plazmid taşımadığı; suşların sadece serotipe özgü plazmid taşıdığı ya da suşların çok azının plazmidi olduğu durumlarda PPA faydalı olamamaktadır 16,22. Çalışmamızda PPA, incelenen 122 S. Enteritidis izolatının 110 (%90) unun plazmidli izolatlar olduğunu göstermiştir. S. Enteritidis suşlarının çoğunun taşıdığı bilinen 38 MDa luk serovara özgül virülans plazmidine karşılık gelen büyüklükteki 57 kb lık plazmidin, çalışmamızda 34 (%27.9) izolatta tek başına (plazmid profili p1) bulunduğu gösterilmiştir (Tablo VIII). Buna karşın incelenen izolatların 14 ten fazla plazmid profiline dağıldıkları belirlenmiştir. Bununla birlikte PFGE modellerinin her zaman tek bir plazmid profiline karşılık gelmediği görülmüştür. Plazmid profillerinden p1 (57 kb) ve p4 (57, 5.8 ve 4.8 kb) ile PFGE kümesi Aa arasında; Edirne de görülen plazmid profili p2 (57, 40, 3.0 kb) ile PFGE kümesi Ab arasında; ayrıca plazmid profili p3 (57, 40, 6.5, 4.5 kb) ile PFGE kümesi Ab arasında güçlü bir ilişki bulunduğu düşünülmektedir (Tablo I-VII). 223

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi PFGE, ilk tarif edildiği 1983 yılından sonra birçok bakteri için kullanılan moleküler epidemiyolojik yöntemler içinde, suşlar arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koymada güvenilir standart bir yöntem haline gelmiştir. PFGE, günümüzde Salmonella serotipleri için de standart bir yöntem olarak kabul edilmektedir 14. Bu teknikte, megabaz büyüklüğündeki kromozom DNA sı, seyrek olarak, aralıklı kesen makrorestriksiyon enzimleriyle kesilmekte; kesilen büyük DNA parçaları, farklı yönlerden elektrik akımı uygulayabilen elektroforez aygıtı ile jel üzerinde yürütüldükten sonra görüntülenebilmektedir 12. PFGE, ABD de ve çeşitli Avrupa ülkelerinde Salmonella salgın araştırmalarında elde edilen bulguları karşılaştırabilmek amacıyla standart protokolle uygulanmaktadır 8,14. PFGE nin XbaI ile kullanımı, Salmonella serotipleri için yaygın olarak kabul görmektedir 23,24. Bazı çalışmalarda, kontamine etten insana Salmonella bulaşının gösterilmesi örneğinde olduğu gibi enfeksiyon zinciri PFGE ile doğrulanmıştır 7,16. 2001 yılında kurulan uluslararası bir proje olan Avrupa Birliği DG Araştırma-Fonu girişimi Salm-gene tarafından, PFGE modellerinin (paternlerinin) gerçek zamanlı olarak onaylanması ve ileri sürveyans için kriterlerin belirlenmesi amacıyla, dokuz Avrupa ülkesindeki insan izolatlarından elde edilen PFGE modellerine ait taranabilir bir veri bankası geliştirilmiştir. En sık rastlanan PFGE modelleri olan SENTXB.0001 (%56), SENTXB.0002 (%16) ve SENTXB.0005 (9.5%) veri bankasına gönderilen tüm S. Enteritidis izolatlarının neredeyse %82 sini oluşturmaktadır. Peters ve arkadaşlarına 2 göre, PFGE modellerinin yüksek derecede benzerliği ve dağılımının ortaya koyduğu bu veriler, S. Enteritidis in klonal yapısını vurgulamaktadır 2. Bu bulgu, tüm hayvan ve insan izolatlarının %64 ünün tek bir PFGE modelinde toplandığının belirlendiği diğer bir çalışma ile uyumlu bulunmaktadır 25. Çalışmamızda da, Salm-gene projesinde görüldüğü gibi S. Enteritidis izolatlarının belirli PFGE kümelerinde (Aa ve Ab) toplanması (Tablo X), bu izolatlarının klonal olduğunu düşündüren verilerle uyumludur. Çeşitli çalışmalar, PFGE de BlnI gibi ikinci bir enzim veya birden fazla teknik kullanıldığında S. Enteritidis izolatlarının daha fazla ayırt edilebildiğini göstermiştir 2,26. PFGE de ikinci bir kesim enziminin kullanılması, belli serotiplerde ve S. Enteritidis in PT4 gibi hakim faj tiplerinin ayırt edilmesinde faydalı görülmektedir 2. Çalışmamızda da, S. Enteritidis klinik izolatlarının tiplendirilmesinde iki kesim enziminin kullanılmasının, tek bir enzimin kullanılmasına göre biraz daha ayırt edici olduğu görülmüştür. Çalışmamızda SpeI ve XbaI enzimlerinin her biri ile 11 PFGE modeli; her iki enzim birlikte değerlendirildiğinde ise 17 farklı PFGE kümesi elde edilmiştir. SpeI enzimi ile 11 farklı model arasında bir model (A) esas olarak hakimken (93 izolat; %76.2); XbaI enzimi ile elde edilen bantların dendogramında %91 den fazla genetik benzerliğe (muhtemel ilişkili) sahip olduğu belirlenen iki modelin (a ve b) hakim olduğu görülmüştür (sırasıyla; 53 izolat, %43.4 ve 42 izolat, %34.4). Her iki enzim birlikte değerlendirildiğinde ise 17 farklı PFGE kümesi içinde iki kümenin (Aa ve Ab) hakim olduğu ortaya çıkmıştır (sırasıyla; 50 izolat, %40.9 ve 42 izolat, %34.4) (Tablo X). Çalışmamızda, 2000 yılında Edirne yakınlarındaki askeri birlikte meydana gelen gıda kaynaklı salgından elde edilen, antibiyotiklere duyarlı 13 izolatın tümünün benzer 224

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. plazmid profilini (p2) gösteren ve biri dışında benzer PFGE kümesine (Ab) ait olan izolatlar olduğu görülmüştür. Çalışmada elde edilen bu moleküler bulgular, PFGE kümesi Bj ye ait suşun (suş no. 10) gerçek bir salgın izolatı olmadığını, izole edildiği olgunun aynı yerde, aynı zaman diliminde benzer semptomları göstermesinden dolayı izolatın salgın şüpheli suşlara dahil edildiğini göstermiştir. Bu bulgular, S. Enteritidis e ait salgın suşlarının ayırt edilmesinde, PPA ve PFGE nin yararlı olduğunu göstermiştir (Tablo I). Türkiye de izole edilen suşların incelendiği bir çalışmada, 2001-2004 yılları arasında toplanan ve genetik olarak benzer olmayan 26 S. Enteritidis suşunun %92 sinin aynı plazmidi (38 MDa) taşıdığı görülürken, XbaI enzimi ile kesimin ardından tip I, II, III ve IV olmak üzere dört PFGE kümesi elde edilmiştir 21. Rivoal ve arkadaşlarının 7 çalışmasında, üç örnekleme periyodu boyunca üç farklı yumurta fabrikasından toplanan 144 sıvı yumurta örneğinden elde edilen S. Enteritidis izolatları, genomik DNA nın XbaI ve SpeI enzimleri ile kesimini takiben PFGE ile tiplendirilmiş ve S. Enteritidis in klonal yapıda olduğunu doğrulayacak şekilde benzerlik oranları yüksek olan (%88) üç küme belirlenmiştir. Bu durum pek çok çalışmada da gösterilmiştir 27-31. Pang ve arkadaşları 32,33 Tayvan ve Almanya da S.Enteritidis insan izolatlarına ait genomların 13 yıl boyunca (1991-2002) çok iyi korunduğu sonucuna varmışlardır. Murase ve arkadaşları 34 ise, Salmonella serotiplerinin PFGE alt tiplendirmesinde iki makrorestriksiyon enzimiyle yapılan incelemenin daha ayırt edici olduğunu göstermişlerdir. Çalışmamızda da, iki enzimi (SpeI ve XbaI) bir arada değerlendirdiğimizde daha fazla sayıda PFGE kümeleri ortaya çıkmıştır. Ayrıca benzer direnç modeli gösteren S. Enteritidis suşlarının, PPA ve iki enzimli PFGE ile kolayca ayrılabildiği görülmüştür (Tablo I-VII). Yapılan çalışmalarda, farklı kaynaklardan elde edilen S.Enteritidis izolatlarının alttiplendirilmesinde PPA ve PFGE nin faydalı yöntemler olduğu rapor edilmektedir 13,33. Çalışmamızda, sırasıyla tüm izolatların %40.9, %34.4 ve %8.1 ini oluşturan Aa, Ab ve Bc kümelerindeki S.Enteritidis izolatları, antibiyotik direnç modelleri ve plazmid profilleri açısından farklı bulunmuştur (Tablo I-VII). Direnç modelleri ve genotipler arasında ilişki saptanmazken, antibiyotiklere çoklu direnç gösteren izolatların farklı PFGE kümelerine ve farklı plazmid profillerine dağıldığı belirlenmiştir. Sunulan bu çalışma, SpeI ve XbaI enzimleri ile uygulanan PFGE nin, PPA ile birlikte değerlendirildiğinde, benzer direnç fenotipine sahip izolatların ayırt edilmesinde ve farklı direnç modellerine sahip izolatlar arasındaki genetik ilişkiyi saptamada yararlı olduğunu; iki enzimle elde edilen modellerin birlikte değerlendirilmesiyle, PFGE yönteminin S. Enteritidis için ayırt ediciliğinin arttığını göstermektedir. Ayrıca bulgularımız, Türkiye de dolaşımdaki S. Enteritidis izolatlarının çoğunluğunun benzer PFGE modelleri gösteren suşlar olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bulgular, S. Enteritidis suşlarının klonal yapısını doğrular niteliktedir. S. Enteritidis izolatlarının incelenmesinde SpeI ve XbaI enzimleri ile yapılan PFGE, plazmid profilleri ile beraber ele alındığında ayırt ediciliği yüksek, güvenilir bir yöntem olarak değerlendirilmekle birlikte, S. Enteritidis suşlarının moleküler epidemiyolojisi ile ilgili bilgilerin güncellenmesi için sürekli yeni çalışmaların yapılması gereklidir. 225

Salmonella Serotip Enteritidis zolatlar n n Plazmid Profil Analizi ve Pulsed Field Jel Elektroforezi ile ncelenmesi TEŞEKKÜR Çalışmada izolatları sağlayan öğretim üyelerine [A.D. Aysev, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi (ÜTF); G. Hasçelik, D. Gür ve S. Ercis, Hacettepe ÜTF; S. Gedikoğlu, Uludağ ÜTF; B. Sümerkan ve D. Eşel, Erciyes ÜTF; İ. Tuncer, Selçuk ÜTF; M. Tuğrul ve M. Tatman-Otkun, Trakya ÜTF; A. Tünger, Ege ÜTF; Y. Akgün, Osmangazi ÜTF; M. Gültekin, Akdeniz ÜTF; İ. Köksal, Karadeniz Teknik ÜTF; G. Söyletir, Marmara ÜTF] ve kontrol suşlarını [Salmonella Braenderup (H9812), E.coli (V517), Salmonella Typhimurium (020255- Ankara) ve Salmonella Enteritidis (006956-Ankara)] sağlayan Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölümünden B. Esen ve B. Levent e teşekkür ederiz. KAYNAKLAR 1. Toreci K, Ang O. Türkiye de saptanmış olan Salmonella serovarları ve salmonellozların genel değerlendirilmesi. Türk Mikrobiyol Cem Derg 1991; 21(1): 1-18. 2. Peters TM, Berghold C, Brown D, et al. Relationship of pulsed-field profiles with key phage types of Salmonella enterica serotype Enteritidis in Europe: results of an international multi-centre study. Epidemiol Infect 2007; 135(8): 1274-81. 3. Erdem B, Hasçelik G, Gedikoğlu S, et al. Salmonella enterica serotipleri ve Salmonella enfeksiyonları: Türkiye de on ili kapsayan çok merkezli bir çalışma. Mikrobiyol Bul 2004; 38(3): 173-86. 4. Fisher IS. The Enter-net international surveillance network-how it works. Euro Surveill 1999; 4(5): 52-5. 5. Fisher IS and Enter-net participants. Dramatic shift in the epidemiology of Salmonella enterica serotype Enteritidis phage types in western Europe, 1998-2003-results from the Enter-net international salmonella database. Euro Surveill 2004; 9(11): 43-5. 6. Aysev AD, Güriz H, Erdem B. Drug resistance of Salmonella strains isolated from community infections in Ankara, Turkey, 1993-99. Scand J Infect Dis 2001; 33(6): 420-2. 7. Rivoal K, Protais J, Quéguiner S, et al. Use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize the heterogeneity and clonality of Salmonella serotype Enteritidis, Typhimurium and Infantis isolates obtained from whole liquid eggs. Int J Food Microbiol 2009; 129(2): 180-6. 8. Liebana E, Garcia-Migura L, Breslin MF, Davies RH, Woodward MJ. Diversity of strains of Salmonella enterica serotype enteritidis from English poultry farms assessed by multiple genetic fingerprinting. J Clin Microbiol 2001; 39(1): 154-61. 9. Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV, CDC PulseNet Task Force. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States. Emerg Infect Dis 2001; 7(3): 382-9. 10. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981; 145(3): 1365-73. 11. Hendriksen RS (2003). A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health Organization: Laboratory Protocols Level 1 Training Course Identification of Salmonella. 2003, 4 th ed. http://www.antimicrobial resistance.dk/data/images/salmonella2-pdf.pdf 12. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33(9): 2233-9. 13. Chu C, Wong DW, Wang MH, et al. Genotyping, plasmid analysis, and antimicrobial susceptibility of Salmonella enterica serotype Enteritidis isolates from humans and chickens in central Taiwan. J Formos Med Assoc 2009; 108(10): 765-71. 14. Gatto AJ, Peters TM, Green J, et al. Distribution of molecular subtypes within Salmonella enterica serotype Enteritidis phage type 4 and S. Typhimurium definitive phage type 104 in nine European countries, 2000-2004: results of an international multi-centre study. Epidemiol Infect 2006; 134(4): 729-36. 15. Ward LR, de Sa JD, Rowe B. A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiol Infect 1987; 99(2): 291-4. 226

Us E, Erdem B, Tekeli A, Gerçeker D, Saran B, Bayramova M, fiahin F. 16. Erdem B, Threlfall EJ, Schofield SL, Ward LR, Rowe B. Plasmid profile typing provides a method for the differentiation of strains of Salmonella enteritidis phage type 4 isolated in Turkey. Lett Appl Microbiol 1994; 19(4): 265-7. 17. Threlfall EJ, Hampton MD, Ward LR, Rowe B. Application of pulsed-field gel electrophoresis to an international outbreak of Salmonella agona. Emerg Infect Dis 1996; 2(2): 130-2. 18. Threlfall EJ, Ward LR, Hampton MD, et al. Molecular fingerprinting defines a strain of Salmonella enterica serotype Anatum responsible for an international outbreak associated with formula-dried milk. Epidemiol Infect 1998; 121(2): 289-93. 19. Stanley J, Goldsworthy M, Threlfall EJ. Molecular phylogenetic typing of pandemic isolates of Salmonella enteritidis. FEMS Microbiol Lett 1992; 69(2): 153-60. 20. Cardinale E, Perrier Gros-Claude JD, Rivoal K, et al. Epidemiological analysis of Salmonella enterica ssp. enterica serovars Hadar, Brancaster and Enteritidis from humans and broiler chickens in Senegal using pulsedfield gel electrophoresis and antibiotic susceptibility. J Appl Microbiol 2005; 99(4): 968-77. 21. Aktas Z, Day M, Kayacan CB, Diren S, Threlfall EJ. Molecular characterization of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis by plasmid analysis and pulsed-field gel electrophoresis. Int J Antimicrob Agents 2007; 30(6): 541-5. 22. Helmuth R, Stephan R, Bunge C, Hoog B, Steinbeck A, Bulling E. Epidemiology of virulence-associated plasmids and outer membrane protein patterns with seven common Salmonella serotypes. Infect Immun 1985; 48(1): 175-82. 23. Lukinmaa S, Schildt R, Rinttila T, Siitonen A. Salmonella Enteritidis phage types 1 and 4: pheno- and genotypic epidemiology of recent outbreaks in Finland. J Clin Microbiol 1999; 37(7): 2176-82. 24. Liebana E, Guns D, Garcia-Migura L, Woodward MJ, Clifton-Hadley FA. Molecular typing of Salmonella serotypes prevalent in animals in England: assessment of methodology. J Clin Microbiol 2001; 39(10): 3609-16. 25. Liebana E, Clouting C, Garcia-Migura L, et al. Multiple genetic typing of Salmonella Enteritidis phage-types 4, 6, 7, 8 and 13a isolates from animals and humans in the UK. Vet Microbiol 2004; 100(3-4): 189-95. 26. Fernandez J, Fica A, Ebensperger G, et al. Analysis of molecular epidemiology of Chilean Salmonella enterica serotype enteritidis isolates by pulsed-field gel electrophoresis and bacteriophage typing. J Clin Microbiol 2003; 41(4): 1617-22. 27. Avery SM, Liebana E, Hutchison ML, et al. Pulsed field gel electrophoresis of related Escherichia coli O157 isolates associated with beef cattle and comparison with unrelated isolates from animals, meats and humans. Int J Food Microbiol 2004; 92(2): 161-9. 28. Chung YH, Kwon YI, Kim SY, Kim SH, Lee BK, Chang YH. Antimicrobial susceptibilities and epidemiological analysis of Salmonella enteritidis isolates in Korea by phage typing and pulsed-field gel electrophoresis. J Food Prot 2004; 67(2): 264-70. 29. De Cesare A, Manfreda G, Dambaugh TR, Guerzoni ME, Franchini A. Automated ribotyping and random amplified polymorphic DNA analysis for molecular typing of Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium strains isolated in Italy. J Appl Microbiol 2001; 91(5): 780-5. 30. Selander RK, Beltran P, Smith NH, et al. Evolutionary genetic relationship of clones of Salmonella serovars causing human typhoid and other enteric fevers. Infect Immun 1990; 58(7): 2262-75. 31. Tsen HY, Lin JS. Analysis of Salmonella enteritidis strains isolated from food-poisoning cases in Taiwan by pulsed field gel electrophoresis, plasmid profile and phage typing. J Appl Microbiol 2001; 91(1): 72-9. 32. Pang JC, Chiu TH, Chiou CS, et al. Pulsed-field gel electrophoresis, plasmid profiles and phage types for the human isolates of Salmonella enterica serovar Enteritidis obtained over 13 years in Taiwan. J Appl Microbiol 2005; 99(6): 1472-83. 33. Pang JC, Chiu TH, Helmuth R, Schroeter A, Guerra B, Tsen HY. A pulsed field gel electrophoresis (PFGE) study that suggest a major world-wide clone of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Int J Food Microbiol 2007; 116(3): 305-12. 34. Murase T, Okitsu T, Suzuki R, et al. Evaluation of DNA fingerprinting by PFGE as an epidemiologic tool for Salmonella infections. Microbiol Immunol 1995; 39(9): 673-6. 227