Metschnikowia pulcherrima Türü Mayaların İzolasyonu ve Pulcherrimin in Antimikrobiyal Aktivitelerinin Araştırılması Prof. Dr. Sezai Türkel Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı. 16059-Bursa.
Mayalar ile Biyokontrol Yer ve besin için yarışma/rekabet Killer Toksin üretimi Hücre dışı litik enzim üretimi Diğer mekanizmalar
Metschnikowia pulcherrima Bazı suşları Biyokontrol maya olarak Penicillium ve Botrytis e etkili Etki mekanizması tam olarak bilinmiyor (Fe ++ immobilizasyonu??) Doğal habitatı Çiçek ve bazı meyvelerdir. Bitkiler/meyveler Arasında Çoğunlukla Apis ve Drosophiloid lerce taşınmaktadır. Bazı suşları Pulcherrimin pigmenti üretir.
Araştırmalarımızın amacı: 1-) Metschnikowia pulcherrima türü mayaları izole edip türlerini tanımlamak 2-) M. pulcherrima türü mayaların antagonistik özelliklerini araştırmak 2-) Endüstriyel önemi olan yeni maya türleri izole etmek, türlerini tanımlamak 3-) Saflaştırılıp türleri belirlenen mayaların endüstriyel amaçlar için kullanılabilirliklerini test etmek
Kullanılan Yöntemler Meyve homojenatlarının hazırlanması YGC Agar (Maya özütü-glukoz-kloramfenikol-agar) petrilerine ekim Pozitif maya kolonilerin Seçimi Pulcherrimin Üreten kolonilerin saf kültür olarak eldesi Fermentasyon/Assimilasyon testleri API ID 32c ile türlerin yaklaşık olarak belirlenmesi Genomik DNA izolasyonu ve ITS1-5.8s rdna-its2 Dizilerinin belirlenmesi Antifungal ve Antibakteriyel aktiviteler için testler Antimikrobiyal aktivitesi olan M. pulcherrima türlerinin detaylı analizi.
SONUÇLAR Maya türleri dağılımı (Tür tayini API ID 32c ile yapılmıştır) Maya türleri Örneklerdeki frekansları Pichia norvegensis %56 M. pulcherrima %18 Kloeckere japonica %13 Kloeckere apis %13
Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi (pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu-ygc Agar Petrileri)
Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi (pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu YPD Petrileri)
Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi (pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu- YPD Petrileri-)
Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi (pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu- YPD Petrileri-)
M. pulcherrima suşlarının ITS1-5.8s rdna-its2 Bölgelerinin Genomik DNA dan PCR ile çoğaltılmaları M: Marker, 1-3: Sırasıyla UMY12, UMY14 ve UMY15 kodları ile verilen M. pulcherrima suşları genomik DNA örneklerinden ITS1 ve ITS4 primerleri ile elde edilen PCR sonuçları.
Metschnikowia pulcherrima suşlarının rdna dizileri ve BLAST analizi UMY12 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS4 primeri ile sekanslanmıştır. >99862- M4-98989 sequence exported from 8-ITS4-21Nov2007[1].ab1 NNAAATCGGAGCTCGAGGTGAGGAGAAGATGGGGCTAAACTTATTCTAGCGC CGTTGATATTAGGCCGAAGCAGGACCAAACCGGAGGTTTGAGAGTAAATATCG CTCACCCACGCATGCCCTGGGGAATACCCCGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGA TTCAATGATTCACGTCTGCAAGTCATATTACGTATCGCAATTCGCTGCGTTCTT CATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTTAATTGAGTTATT GAAGAATAAGATGTAGAGTGTGTGCCCAAAAGGGTGTAAAAATGTTTTTAAAG AGCCCTCCCCACGTGCACCCTACAGAAAAGNNNNNNNNNNN BLAST Analizi Sonucu: Metschnikowia pulcherrima isolate MB510, ITS1-5.8S rrna -ITS2, Length=327 Score = 478 bits (241), Expect = 7e-132 Identities = 262/269 (97%), Gaps = 0/269 (0%) Strand=Plus/Minus
Metschnikowia pulcherrima suşlarının rdna dizileri analizi UMY14 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS4 primeri ile sekanslanmıştır.>99864- M4-98989 sequence exported from 9-ITS4-21Nov2007[1].ab1 NNCCTAGACCGTACTCGAGGTGAGGAGAGATGGGGCTAAACTTATTCTAGCGC CGTTGATATTAGGCCGAAGCAGGACCAAACCGGAGGTTTGAGAGTAAATATCG CTCACCCACGCATGCCCTGGGGAATACCCCGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGA TTCAATGATTCACGTCTGCAAGTCATATTACGTATCGCAATTCGCTGCGTTCTT CATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTTAATAGAGTATT TGACGGATAAGATGTAAAGTGTGTGCCTAAAAGGGTGTAAAAATGATTTTAAT GATCCTTCCCCACGTGCACCTACAGAAGAGNNNNNNNNNNN BLAST Analizi Sonucu: Metschnikowia pulcherrima isolate MB510, ITS1-5.8S rrna -ITS2,, Score = 478 bits (241), Expect = 7e-132 Length=327 Score = 486 bits (245), Expect = 3e-134 Identities = 263/269 (97%), Gaps = 0/269 (0%) Strand=Plus/Minus
Metschnikowia pulcherrima suşlarının rdna dizileri analizi UMY15 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS1 primeri ile sekanslanmıştır. >99866-M4-98988 sequence exported from 10-ITS1-15Nov2007[1].ab1 NNNGGATATGTTTCCCCTTTAGGCCAACTCTAAATCTAACCGTCAATATCTTTA TCAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA GCGAATTGCGATACGTAATATGACTTGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGCATGCGTGGGTGAGCGATATTT ACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCCTAATATCAACGGCGCTAGAA TAAGTTTTAGCCCCATTCTTTTTCCTCACCCTCGTAAGACTACCCGCTGAACTT AAGCATATCAATAAGCGCGAGGAAAANNNNNN BLAST Analizi Sonucu: Metschnikowia pulcherrima strain BIO126, ITS1-5.8S rrna -ITS2, Length=377 Score = 567 bits (286), Expect = 9e-159 Identities = 292/294 (99%), Gaps = 0/294 (0%) Strand=Plus/Plus
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri A- Bakteri ve Mayalar Üzerine etkileri (İnhibisyon Zonları mm olarak verildi) Mikroorganizma M. pulcherrima Suşları ve inhibisyon zonları (mm) UMY12 UMY14 UMY15 E. coli 4 NZ NZ Proteus vulgaris 5 4 4 S. cerevisiae 2 3 3 D. occidentalis 3 4 4 K. marxianus NZ 2 5 C. albicans 2346 NZ 2 4 C. parapsilosis 2 4 5 C. krusei 1 3 4 C. dupliensis 1 2 2 C. tropicalis NZ 2 2 Tricosporon mucoides 1 4 4
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri (Proteus vulgaris üzerine etkileri Nutrient Agar petrileri)
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri Bazı Küfler Üzerine etkileri (İnhibisyon Zonları mm olarak verildi) Mikroorganizmalar M. pulcherrima suşları ve/ İnhibisyon Zonları (mm) UMY12 UMY14 UMY15 A. niger 16604 2 2 2 A. flavus 22293 1 2 3 A. terreus 1 2 2 A. fumigatus 1 3 3 Paecilomyces spp 2 3 3 Mucor spp 1 3 3 Bipolaris spp 1 4 3
K. lactis türlerinde Laktaz (β-galaktozidaz) sentezinin glukoz baskılaması Metschnikowia Laktaz ( a β-galaktozidaz) pulcherrima aktiviteleri suşlarının Miller Ünitesi Antimikrobiyal olarak verilmiştir. (SD: aktiviteleri +/- %10) (M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Paecilomyces spp ye etkileri)
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri (M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Mucor spp ye etkileri)
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri (M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Trichoderma spp ye etkileri)
Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri (M. pulcherrima UMY14 suşunun Aspergillus terreus a etkileri)
Pulcherrimin Pigmenti Fe ++ Bağlamaktadır (PNAS, 39, 583-593, 1953)
Metschnikowia pulcherrima suşlarına Fe ++ iyonlarının etkileri (YNB Glukoz + Fe ++ Petrileri)
Metschnikowia pulcherrima suşlarına Fe ++ iyonlarının etkileri (Fe ++ iyonları Antagonistik etkiyi bloke etmektedir)
Genel Sonuçlar Saflaştırılan Metschnikowia pulcherrima türleri ayrı ırklara ait olabilir Metschnikowia pulcherrima türlerinin sentezlediği Pulcherrimin pigmentinin demir bağlama özellikleri türe göre değişmektedir. Metschnikowia pulcherrima türleri hasat sonrası ürün korumada (post harvest protection) biyoajan olarak kullanılabilir. Pulcherrimin antibakteriyel/antifungal etken madde olarak topikal uygulamalar için geliştirilebilir. Pulcherrimin ortamdaki Fe ++ iyonlarının mikroorganizmalar tarafından kullanımını bloke ederek etkisini göstermektedir.
TEŞEKK EKKÜRLER, Proje desteği için Uludağ Üniversitesi BAP a TÜBİTAK a Teknik yardımlarından dolayı Yrd. Doç. Dr. Tülay Turgut Genç e (ÇOMU) Teşekkürler ederim.