GĐRĐŞ Buğdayın öğütülmesi prosesinde nişasta granülleri fiziksel olarak zarar görmekte olup zarar gören nişasta granülleri zedelenmiş nişasta olarak tanımlanmaktadır. Zedelenmiş nişasta miktarı unun su soğurma ve hamurun yoğurma özelliklerini doğrudan etkilemektedir. Bu nedenle un sanayinde zedelenmiş nişasta oranının bilinmesi teknolojik olarak büyük önem arz etmektedir. Zedelenmiş nişasta granülleri suyu hızlı bir şekilde soğurmakta ve α ve/veya β-amilaz enzimleri tarafından parçalanabilmektedir. Fırıncılık ürünlerinde fermantasyon prosesinde mayaların kullanabileceği doğal şekerlerin yanı sıra mayaların kullanabileceği enzimatik reaksiyon sonucu üretilen şekerlere de gereksinim duyulmaktadır. Zedelenmiş nişasta oranının düşük olması durumunda enzimatik reaksiyon ürünleri yeterince üretilemeyeceği için bu tür unlardan üretilen ekmekler düşük hacimli olmaktadır. Zedelenmiş nişasta oranı yüksek unların işlenmesinde ise mayaların kullanabileceği şeker oranının yüksek olması ve uzun süreli fermantasyon gerçekleştirilmesi sonucu aşırı hacimli ve/veya şekilsiz ürünler üretilebilmektedir. Biyozim Zedelenmiş Nişasta Analiz Kiti nde Amerikan Hububat Kimyası Birliği (AACC) tarafından resmi metot olarak kabul edilen (AACC#76-31) zedelenmiş nişastanın küf kaynaklı yüksek saflıkta α-amilaz enzimi ile parçalanması ve sonrasında reaksiyon ürünlerinin maltoz/glukoz analiz kiti kullanılarak saptanmasını temel alan yöntem kullanılmıştır. Yöntemin doğru sonuç üretmesinde tayinde kullanılan α-amilazın yüksek saflıkta olması, zedelenmiş nişasta granülleriyle maksimum, zedelenmemiş nişasta granülleriyle minimum düzeyde reaksiyona girmesi gerekmektedir. Uygun kaynaktan temin edilmiş α-amilaz enziminin kullanılması yöntemin başarısını büyük ölçüde etkilemektedir. Ayrıca reaksiyon ürünlerinin doğru ve hassas biçimde saptanması yöntemin başarısını belirleyen bir diğer etkendir. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Mikro pipet (20-200 µl) -1-
Balon joje (100-250 ml) Makro küvet (3 ml) 1 Cam tüp (16X100 mm) Santrifüj (3000 rpm) Analitik terazi Spektrofotometre (505 nm) Vorteks Su banyosu (40ºC) Spektrofotometre (505 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Zedelenmiş nişasta analiz kiti; küf kaynaklı α-amilaz, amiloglukozidaz, kontrol örneği, glukoz analiz reaktifi, glukoz analiz tamponu ve glukoz standardından oluşmaktadır. 1 nolu şişe (#01-050-1): Glukoz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Glukoz oksidaz 10,000 IU/şişe Peroksidaz 1,000 IU/şişe 4-Aminoantipirin 0.2 mm 2 nolu şişe (#01-125-2): Glukoz analiz tamponu (Derişik, 50 ml) 400 mm Potasyum dihidrojen fosfat 0.2 mm fenol 2 3 nolu şişe (#01-001-3): Glukoz standardı Glukoz 0.5 g (MA=180.42 g/gmol) 4 nolu şişe (#06-050-1): α-amilaz enzimi (10,000 IU) 5 nolu şişe (#06-050-2): Amiloglukozidaz enzimi (1,000 IU) 6 nolu şişe (#06-050-3): Nişasta analiz tamponu (Derişik, 2.5 ml) Sodyum asetat (ph 5-250 mm) Kalsiyum klorür (10 mm) Sodyum azid (% 0.2) 7 nolu şişe (#06-050-4): Seyreltik asit çözeltisi Sülfürik asit (% 2 v/v) 8 nolu şişe (#06-001-5): Kontrol örneği 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. 2 Fenol toksik bir madde olup bu çözelti kullanılırken dikkatli olunmalıdır. -2-
ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Zedelenmiş Nişasta Analiz Kiti nde tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilmektedir. α-amilaz Çözeltisi: 5 nolu şişe üzerine 2 ml nişasta analiz tamponu (6 nolu şişe), 2 ml saf su ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Amiloglukozidaz çözeltisi: 5 nolu şişe üzerine 1 ml nişasta analiz tamponu (6 nolu şişe), 1.5 ml saf su ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Nişasta analiz tamponu: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Seyreltik asit çözeltisi: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Glukoz analiz reaktifinin hazırlanması: 1 nolu şişe üzerine 2.5 ml glukoz analiz tamponu ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Zedelenmiş nişasta analiz reaktifleri hazırlandıktan sonra 2-8 C de 1 ay süre ile saklanabilir. Çözeltiler hazırlandıktan sonra dondurulmamalıdır. 3 Glukoz analiz tamponu: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Glukoz standart çözeltisinin hazırlanması: 3 nolu şişe içerisinde bulunan glukoz standardı kullanılarak 0.25 g/l, 0.50 g/l, 0.75 g/l ve 1 g/l derişimlerindeki glukoz çözeltilerini saf su kullanarak hazırlayınız. Dört farklı derişimdeki glukoz çözeltileri kalibrasyon grafiğinin üretilmesinde kullanılacaktır. 3 Đhtiyacınıza göre 50 analizlik hacimler halinde hazırlayınız. Analiz reaktifinin muhafazası süresince pembe renk oluşumu gözlenebilir. Analiz reaktifi 1/25 oranında saf su ile seyreltildikten sonra 505 nm de ölçülen absorbans değerinin 0.05 in üzerinde olması durumunda analiz reaktifi kullanılmamalıdır. -3-
STABĐLĐTE Analiz kimyasalları belirtilen koşullarda saklanması durumunda 12 ay süre içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. Analiz çözeltisi hazırlandıktan sonra 2-8ºC de muhafaza edilmesi durumunda 1 ay saklanabilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin üretilmesi aşamasında kullanılmak üzere hazırlanan glukoz çözeltilerinin günlük olarak hazırlanması gerekmektedir. Hazırlanan çözeltilerin uzun süre kullanımı için koruyucu ilave edilmeli ve/veya 2-8ºC de muhafaza edilmelidir. Analiz sayısına göre gerekli miktarda analiz çözeltisini hazırlayınız. Bu sayede analiz kimyasalları daha verimli olarak kullanılabilecektir. Glukoz ölçümü için bir seferde 50 adedin üzerinde analiz yapılması gerekiyorsa 50 analiz için gerekli kimyasalların yer aldığı şişe içerikleri daha büyük hacimli amber renkli cam bir şişe içerisinde birleştirilmelidir. Bu sayede her bir analiz şişesi için ayrı bir kalibrasyon grafiği hazırlamaksızın tek bir kalibrasyon grafiği ile ölçümler gerçekleştirilebilecektir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örnek ile α-amilaz enziminin etkileşmesi sonrasında örneğin santrifüj edilmesi ve süpernatantın berrak ve homojen olarak elde edilmesi gerekmektedir. Katı veya bulanık olması durumunda santrifüj hızını ve/veya süresini arttırınız. Örneğin zedelenmiş nişasta içeriğinin çok yüksek olması (%15 den fazla) durumunda süpernatantın seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Zedelenmiş Nişasta Oranı (%) Örnek + Saf Su Seyreltme Faktörü < 15-1 15-100 1 + 9 10-4-
ANALĐZ BĐLGĐLERĐ Spekrofotometre dalga boyu : 505 nm Küvet : 1 cm standart (Plastik veya cam) Ölçüm sıcaklığı : 25ºC veya 40ºC Spekrofotometre sıfır ayarı UYARILAR : Kör çözeltisi Analiz çözeltilerini hazırladıktan sonra dondurmayınız. Analiz çözeltilerini çapraz-kontamine etmeyiniz. Zedelenmiş nişasta analiz kitinde sülfürik asit kullanılmaktadır. Sülfürik asit korozif olup, deride şiddetli yanıklara neden olabilmektedir. Analiz kimyasallarının ve çözeltilerinin gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Yaklaşık 50 mg un örneğini santrifüj tüpü (10-12 ml) içerisine tartınız ve tartım değerini kaydediniz (ÖM) 3. Örneği içeren tüpün, saf suyun ve α-amilaz enzim çözeltisinin sıcaklığının 40 C olmasını sağlayınız. 4. Örnek üzerine 920 µl saf su ve 80 µl α-amilaz enzim çözeltisinden ilave ediniz, kuvvetli bir şekilde vorteks kullanarak çalkalayınız (3-5 s) ve sonrasında 40 C de 10 dk inkübe ediniz. 4 5. Bu süre sonunda enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için 80 µl sülfürik asit çözeltisi ve 3920 µl saf su ilave ediniz. Test tüpünü 3,000 RPM de 5 dk santrifüj ediniz. 5 4 Reaksiyon sıcaklığının ve süresinin belirtilen sıcaklık ve sürede olmasında dikkat edilmelidir. 5 Santrifüj kullanımının mümkün olmaması durumunda süspansiyon filtre (Whatman No:41 veya benzeri filtre kağıdı) edilerek elde edilen berrak filtrat analizde kullanılabilir. -5-
6. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 7. Test tüplerine 50 µl süpernatant veya standart çözelti koyunuz. 8. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. 9. Örnek içeren tüplere 50 µl amiloglukozidaz enzim çözeltisi ilave ediniz ve 40 C de 10 dk inkübe ediniz. 6 10. Đnkübasyon sonrasında 50 µl glukoz analiz reaktifini ilave ediniz. 11. 400 µl glukoz analiz tamponu ilave ediniz. 12. Son hacim 2.50 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. 13. 25ºC de 40 dk veya 40ºC de 20 dk inkübe ediniz. 14. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız. 15. 505 nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 7 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar aşağıda özetlenmiştir. Çözünür nişasta parçalanma ürünlerinin ekstraksiyonu α-amilaz çözeltisi (80 µl) Un örneği (50 mg) Saf su (920 µl) Kuvvetli karıştırma Đnkübasyon (40 C de 10 dk) Sülfürik asit çözeltisi (80 µl) Santrifüj (3,000 RPM de 5 dk) Süpernatant (Çözünür nişasta parçalanma ürünleri) 6 Örneğinizin ve amiloglukozidaz enziminin tam olarak karışmasını sağlayınız. 7 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. -6-
Çözünür nişasta parçalanma ürünlerinin miktarının saptanması KÖR ÖRNEK Örnek veya standart - 50 µl Tüplerin ve analiz çözeltilerinin 40ºC de olmasını sağlayınız. Amiloglukozidaz çözeltisi 50 µl 50 µl 40 C de 10 dk inkübe ediniz. Glukoz analiz reaktifi 50 µl 50 µl Glukoz analiz tamponu 8 400 µl 400 µl Saf su 2.00 ml 1.95 ml 25ºC de 40 dk veya 40ºC de 20 dk inkübe ediniz. Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 505 nm de absorbans artışını ( A) ölçünüz. GLUKOZ KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE ÖRNEĞĐN ZEDELENMĐŞ NĐŞASTA DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan glukoz standart çözeltileri kullanılarak derişim-absorbans grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orjinden geçiriniz. 9, 10 Eğilim çizgisinin eğimini (M, L abs x g glukoz ) saptayınız. 8 Analiz tamponunu ölçüm sıcaklığına gelmesini sağladıktan sonra ilave ediniz. 9 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 10 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) 0.985 in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz -7-
Absorbans artışı ( A) 162 100 Zedelenmiş Nişasta Oranı (%) = x x 5 x x SF Glukoz kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) 180 ÖM SF : Seyreltme faktörü ÖM : Örnek miktarı (mg) 5 : Santrifüj öncesi toplam çözelti hacmi 162/180 : Çevirme faktörü (Nişasta molekülündeki glukozun molekül ağırlığı/serbest glukozun molekül ağırlığı) AACC 76-31 sonuçlarının zedelenmiş nişasta tayininde kullanılan diğer metot sonuçlarına çevirim formülleri [] %ZN (AACC 76-30A) = 1.4 x %ZN (AACC 76-31) - 0.09 %ZN (Wooster) = 1.2 x %ZN (AACC 76-31) + 0.5 %ZN (Farrand) = 5.2 x %ZN (AACC 76-31) - 10.3 %ZN (Barnes) = 1.5 x %ZN (AACC 76-31) + 0.44 DOĞRUSALLIK SINIRI Hazırlanan zedelenmiş nişasta analiz kitinin doğrusallık sınırının % 15 olduğu saptanmıştır. Daha yüksek oranda zedelenmiş nişasta içeren örneklerin seyreltme tablosu kullanılarak süpernatantın seyreltilmesi veya daha düşük miktarda örnek kullanılarak ekstraksiyonun tekrarlanması gerekmektedir. HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Zedelenmiş nişasta analiz kiti; % 0.01 ölçüm hassasiyetine ve % 0.05 ölçüm sınırı değerlerine sahiptir. 11 aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. 11 Ölçüm sınırı spekrofotometre gürültü seviyesinin 3 katı absorbans değerine eşdeğer zedelenmiş nişasta oranı olarak hesaplanmıştır. -8-
DOĞRULUK Zedelenmiş nişasta analiz kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı glukoz derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK=ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki zedelenmiş nişasta oranı için de %DK değerinin % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Zedelenmiş nişasta oranı (%) Standart Sapma % DK 7.5 ± 0.26 3.47 14.2 ± 0.15 1.06 Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. GÜVENLĐK α-amilaz enziminin reaksiyonunu sonlandırmak için sülfürik asit kullanılmaktadır. Sülfürik ait korozif olup, deride şiddetli yanıklara neden olabileceğinden bu çözelti ile çalışılırken dikkatli olunmalıdır. Glukoz analiz tamponu içerisinde fenol bulunmaktadır. Fenolün organik toksik bir madde olması nedeniyle analiz sürecinde dikkatli olunmalıdır. Fenol içeren çözeltilerin koklanmaması, içilmemesi, vücuda temas -9-
ettirilmemesi gerekmektedir. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. GĐRĐŞĐM FAKTÖRLERĐ Geliştirilen yöntemde zedelenmiş nişasta glukoza kadar parçalanmakta ve sonrasında glukoz miktarı glukoz oksidaz ve peroksidaz enzimleri varlığında saptanmaktadır. Analiz ortamında glukoz, hidrojen peroksit, yapısında glukoz ve hidrojen peroksit içeren bileşikler ve bu bileşiklerin parçalanmalarını katalizleyen kimyasalların bir arada bulunması durumunda zedelenmiş nişasta analiz kiti yanlış sonuç verecektir. Böyle bir durumla karşılaşıldığında üretici firma ile temasa geçiniz. Gerekli teknik destek üretici firma tarafından sağlanacaktır. REFERANSLAR 1. Holvey, D.N. ed.: The Merck Manual of Diagnostic and Therapy, Merck and Co., Inc. Rahyway, N.J. (1972). 2. Cooper, G.R., CRC Crit Rev. Clin Lab. Sci. 4:101 (1973). 3. Keston, A.S., Colorimetric, "Enzymatic Reagents for glucose" Abstracts of Papers, 129th Meeting ACS, 131C (1956). 4. Trinder, P., "Determination of Blood Glucose Using 4- Aminophenazone.".J. Clin. Path., 22:246 (1959). 5. Tietz, N.W., Fundamentals of Clin. Chem., Philadelphia, W.B. Saunders (1970). 6. http://www.saglik.gov.tr/sb/extras/mevzuat/teb_sekerler_anal iz.pdf 7. http://www.food-diagnostics.se/data/menu/produkter/rbiopharm/boehringermannheim/pdf/e0716251_pi.pdf -10-
UYARI Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almakta ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan, analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. -11-
NOTLAR -12-