ASPERGİLLOZ MİKROBİYOLOJİK K TANI Dr. Asuman İnan HNH İnfeksiyon Hastalıklar kları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği
SIK RASTLANAN İNSAN MİKOZLARI M VE ETYOLOJİK K AJANLARININ SINIFLANDIRILMASI Derin mikozlar Oppurtunistik Mikozlar Subkutanöz Mikozlar Yüzeyel Mikozlar Blastomycosis Aspergillosis Maduromycosis Black piedra Blastomyces dermatitis Coccidioidomycosis Coccidiotes immitis Histoplasmosis Histoplasma capsilatum Paracoccidioidomycosis Paracoccidioides brasiliensis Sporotrichosis Sporothrix schenckii Aspergillus fumigatus A. flavus A. niger A. terreus Candidosis Candida albicans Candida sp. Geotrichosis Geotrichum candidum Phaeohyphomycosis Alternia sp. Curvularia sp. Drechslera sp. Exophiala sp. Wangiella sp. Hyalohyphomycosis Acremonium sp. Fusarium sp. Paecilomyces sp. Scedosporium sp. (Pseudallesheria sp.) Zigomycosis Rhizopus sp. Mucor sp. Cunninghamella sp. Acremonium sp. Exophiala jeanselmei Pseudallescheria boydii Nocardia sp Chromoblastomycosis Cladosporium carionii Fonsecaea sp. Phialophora sp. Phaeohyphomycosis (cutaneous) Alternia sp. Cladosporium sp. Xylohypha emmonsii Exophiala sp. Phialophora sp. Wangiella dermatitis Sporotrichosis Sporothrix schenckii Piedraia hortae Tinea nigra Phaeoannelomyces wernickii Tinea versicolor Malassezia furfur Dermatomycosis Microsporum sp. Trichophyton sp. Epidermophyton floccosum Mycotic keratitis Fusarium sp. Aspergillus sp. Candida sp. Onychomycosis Candida sp. Aspergillus sp. Trichosporon bigelii Geotrichum candidum Tinea unguium Trichophyton sp. Epidermophyton floccosum
TIBBİ OLARAK ÖNEM TAŞIYAN MANTARLARIN BASİT T TAKSONOMİK ŞEMASI Class:Zygomycetes Order: Mucorales Genera: Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia, Cunninghamella, Saksenea Order:Endomophthorales Genera: Basidiobolus, Conidiobolus Class: Ascomycetes Order: Endomycetales Genera: Saccaromyces, Pichia Bazı Candida türlerinin telemorfları Order: Onygenales Genera: Arthroderma (Trichophyton ve Microsporum türlerinin telemorfları) Ajellomyces (Histoplasma ve Blastomyces türlerinin telemorfları) Aspergillus ve Penicillium türlerinin telemorfları Class: Deuteromycetes Order: Cryptococcales Genera: Candida, Cryptococcosus, Trichosporon, Pityrosporum Order: Moniliales Family : Moniliaceae Genera: Epidermophyton, Coccidioides, Paracoccidioies, Sporothrix, Aspergillus Family:Dematiaceae Genera: Phialophora, Fonsecaea, Exophiala, Wangiella, Xylohpha,bipolaris bipolaris, Alternia Order: Sphaeropsidales Genera: Phoma Class:Oomycetes Genera: Pythium
Raper ve Fennel in sınıflamasında 700 Aspergillus türü tanımlanm mlanmış, Rinaldi bunlardan 19 unun insan infeksiyonlarında nda etken olduğunu saptamış ıştır. Aspergillus infeksiyonlarında nda sıklıklakla 4 tür izole edilmektedir: A.fumigatus (~%90) A.flavus (~%10) A.niger (~%2 ) A.terreus (~%2 ), oranında nda invaziv infeksiyonlara neden olurlar. İnsanda İnfeksiyon Etkeni olan Diğer Aspergillus Türleri A.nidulans nidulans,, A.amstelodami amstelodami,, A.avenaceus avenaceus, A. caesiellius,, A. candidus,, A. carneus, A. chevalieri,, A. clavatus,, A.glaucus glaucus, A. granulosus,, A. oryzae A. quadirilineatus, A.restrictus restrictus,, A. sydowi,, A.ustus ustus, A. versicolor,, A.wentii wentii,, A.(neosartorya neosartorya) fisheri
Ajello tarafından hifamiçetler genel bir adlandırma ile Hyalohyphomycetes Phaeohyphomycetes, adı altında toplanmış ışlardır. Aspergilluslar, hyalohyphomycetes grubunda yer alırlar rlar. Hifleri septalı olup invivo pigmentsizdir. Phaeohyphomycetes hifleri dokuda koyu renkte pigment (melanin) oluştururlar tururlar. Aspergillus cinsinin adlandırılmas lması konidiyal özellik ve cinsel yapılar ların (klaystotesiyum ve askosporlar) varlığı ığına dayanır. Aspergilluslar genellikle eşeysiz, bazen de eşeyli çoğalırlar. Sabouroud dekstroz agarda eşeysizeysiz şekillerini, Czapek-dox besiyerlerinde telemorfları (eşeylieyli şekillerini) geliştirir ve bu şekilde sınıflandırılırlar.
Makroskopik görünüm: Aspergilluslar 3-5 gün içindeinde genellikle sarı, yeşil il, kahverengi,siyah renklerde, keskin kenarlı, çevresi beyaz renkte bordürl rlü, yüzeyi granüler koloniler yaparlar. Koloni morfolojisi besiyerinin yapısına bağlı olarak değişebilir ebilir. Klasik morfoloji Raper ve Fennell in tanımlad mladığı şekilde Czapek agarda belirir
Mikroskopik Görünüm: Aspergillus türleri mikroskopik olarak 4-64 µm lik hyalin,, paralel duvarlı septalı hifalar oluştururlar.d tururlar.düzenli dallanmaları 45ºC lik açı ile çıkar. Bu özellik diğer hifalı mantarlardan ayrımında önemlidir. Hif bölümlerinin bazılar farklıla laşır. lik bir ları konidiyofor şeklinde da ayak Konidiyoforlar ya vejetatif hif ya da hücresi denilen hifal hücrelerden kökenken alır. Buradan çıkan konidiyaların ucu yuvarlaklaşarakarak sonlanır.. Bu uç oluşuma denir. uma vezikül de Konidiyoforların renk, uzunluk, genişlik lik, duvarlarının donanımı türlere göre değişir.vezik ir.veziküller küre, yarımk mküre görünümündende ya da sivrimsi uçludur. fiyalit denen Yüzeylerindeki fiyalit denen lobut şeklindeki oluşumlar umlar ile fiyalovezikül adını alırlar rlar. ralı (uniseriate) çift Fyalitler tek sıral ift sıralı (biseriate) ya da A.flavusta olduğu gibi iki durumun kombinasyonu şeklinde olur.
Konidiyumlar: Konidiyumlar cinsel olmayan sporlardır. Konidiyumlar fiyalitlerin ucundan itibaren zincir şeklinde dizilirler.. Bu şekilleri ile güneş ışınlar nlarınana benzetilirler. Bazı türlerde konidiyumlar vezikül üzerine yığılır. Elipsoit, küresel şekillidirler. Cinsel çoğalma: askosporlarla olur. Klaystotesiyum (cleistothcium) denilen keseye benzer oluşumlar umlar, küresel yapılard lardır.(hüllelle hücreleri) İçlerinde askus ve askosporlar bulunur.(a..(a.nidulans, A.glaucus glaucus). Renk, duvar yapısı, büyüklüklerikleri türlere göre değişir ir. İzolatlarda telemorf oluşumu umu ancak üç hafta gibi uzun bir sürede tamamlanır.
Hastalığ ığa sebep olan mantarın başar arılı bir şekilde tanımlanabilmesi içinin örnek alınımından ndan kültür sonuçlar larının değerlendirimine erlendirimine kadar tüm işlemlerin standartlara uygun şekilde yapılmas lması gerekir. Mantarların cins ve türleri ancak kültür yöntemi ile belirlenebilir. Tür düzeyinde tanımlama ekoloji ve epidemiyolojinin belirlenmesinin yanında nda uygun ve etkin tedaviye de yol gösterecektir. g
ÖRNEKLERİN N ALINMASI, SAKLANMASI VE İŞLENMES LENMESİ Mikozların başar arılı olarak tanısının yapılmas lması laboratuvar çalışanlarının deneyimine laboratuvara getirilen örneklerin kalitesine bağlıdır. Klinisyen ile laboratuvar arası diyalog kaçınılmazd lmazdır. Mantar örneklerinin farklı infeksiyonlar nedeni ile değişik ik bölgelerden alınmas nması gerekir. Bunlar transtrakeal aspirat, balgam, biyopsi,, BOS, vb. materyalleri olabilir
Balgam: Balgam taze olmalı ve sabah erken alınmal nmalıdır. Balgam dışıd ışındaki solunum örnekleri trakeal aspirasyon, bronşiyal lavaj, akciğer biyopsi materyali, klinisyen tarafından alınır r ve hızlh zlıca laboratuvara ulaştırılır. Kan : Kan aseptik şartlarda alınmal nmalıdır. Kan tüplerine t veya direkt kan kültk ltürü şişelerine alınır, antikoagülan olarak sodyum polianetol sülfonat (SPS) kullanılır. Mantar kültk ltürü için in lizis santrifügasyon sistemi idealdir. Bu sistemde 10 ml kan alınmal nmalıdır. Püy, eksüda da: Steril bir iğne i veya enjektör r ile abseden aspirat alınarak steril bir kaba konulur.
BOS: Alınabilecek kadar BOS örneği i toplanır üç steril tüpe t ayrılır. r. Göz örnekleri: Keratomikoz olgularında korneal kazınt ntı,, mantar endoftalmiti tanısında nda vitrektomi örnekleri alınmal nmalıdır. Kulak sürüntü kültürleri alınabilir. İdrar: drar: Kateterle alınan idrar örneği i en uygundur. Sabah erken orta akım m idrarı kullanılır r ve santrifüj j edilerek sedimentten ekim yapılır. Çift ift örnekle çalışmak izolasyonu daha fazla arttırır. r.
KLİNİK ÖRNEKLERİN N DİREKT D İNCELENMESİ Klinik örneklerden KOH veya Kalkoflor beyazı, dokuda Gomori-metanamin metanamin gümüş boyası,, PAS gibi özel mantar boyası ile hif morfolojisi incelenir. Lezyondaki nekrotik, irinli, kanlı ya da kazeöz alanlar ve buralardan alınan örnekler, mantarın mikroskopik olarak saptandığı ve üreme olasılığı ığının en yüksek olduğu yerlerdir. Örnek alımı ve direkt inceleme içinin bu alanlar seçilmelidir ilmelidir.
Potasyum hidroksit (KOH) : KOH ile incelemenin avantajı,, her türlü klinik örnekten doku ve hücresel artıklar kların mantar hücrelerine zarar vermeden temizlenmesi; dezava avantajı ise hif ya da tomurcuklanma formlarını yüzeysel olarak andıran artık faktörler oluşturabilmesidir turabilmesidir. Klinik örnek %10-25 25 lik KOH çözeltisiyle karış ıştırıldıktan sonra lamel kapatılır, hafifçe bastırılır. 5-10 dakika oda ısısında,, 5-105 dakika hafifçe alttan ısıtılarak, nemli ortamda bekletilir tilir. Normal ışık mikroskobunda önce küçük, daha sonra büyük büyütmeli objektifte incelenir. Bazı türler oksalik asit üretir ve kalsiyum oksalatın n lokal olarak depolanmasına na neden olarak, infekte ettikleri dokularda mektup zarfı görünümlerine yol açarlara arlar. Balgamın n direkt incelenmesinde 45 ºC lik tipik hifal dallanmalara eşlik e lik eden eozinofiller ve Charcot- Leyden kristalleri ön n tanı için in yeterlidir.
Kalkoflor beyazı-koh : Kalkoflor boyası, polisakkaridlere ( sellüloz loz ve kitin gibi ) bağland landığından klinik örneklerde mantar hücrelerinin gösterilmesinde kullanılmaktad lmaktadır. %10 luk KOH ( bir damla), %0.1 lik kalkoflor beyazı (bir damla) örnekle karış ıştırıldıktan sonra lamelle kapatılır, hafifçe bastırılır ve floresan mikroskopta küçük büyütme ile incelenir. Kullanılan lan filtreye bağlı olarak maya hücreleri, psödohifler ve hif yapılar ları tebeşir beyazı veya sarı renkli floresan verirler.
KÜLTÜR R VASATLARININ SEÇİMİ VE EKİM Mantar ekimi içinin ilk vasat nonselektif olup, hemen tüm fungal cinsleri üretir.sabouraud nun dekstroz agarı bu amaçla kullanılabilir labilir.. Bu agar aynı zamanda, mantarların subkült ltürlerinin zenginleştirilmi tirilmiş ortamda elde edilmesi, sporulasyonun arttırılmas lması ve daha karakteristik koloni morfolojisi oluşturulmas turulması içinin kullanılabilir labilir. Aspergillus türleri, Sabouraud nun dektroz agarı ( aktidiyonsuz) patates dekstroz agar, koyun kanlı Brain-Heart infüzyon agar, Brain-Heart infüzyon agar da üreyebilir. Subkült ltürler içinin ise Czepak agar kullanılır. Czepak agar içeriği:sodyum i:sodyum nitrat 3.0 gr, Potasyum fosfat 1.0 gm,, Mg sülfat s 0.5 gr, KCL 0.5 gr, Demir sülfat s 0.01 gr, Glukoz 30.0 gr, Agar 15.0 gr, Distile su 1 litre)
Laboratuvarda ayrılan alana göre ekim içinin uygun kaplar kullanılabilir labilir. Özellikle geniş tüpler (150-25 mm) ve vidalı kapaklı olanlar tercih edilir. Petriler geniş yüzeyleriyle büyüme ve kültür incelemeleri ve subkült ltürler içinin daha uygundur. Petrilerde, karışı ışık kültürlerin ayrımı daha kolaydır.. 6-86 mm kalınl nlığında agar içeren petrilere konularak kenarları parafinle kapatılır. Tüm fungal kültürler, negatif olarak değerlendirilmeden erlendirilmeden önce, kontaminasyon olsa bile 30 gün inkübe edilmelidir. En az % 50 nemli ortamda ( hem tüpler hem petriler) inkübasyon boyunca tutulur. Bunun içinin etüvün dibine su dolu bir kap konarak nemlilik arttırılmal lmalıdır.
Üreme olduğunda unda: Koloninin görünüşü, Üreme zamanı Koloni pigmentasyonu ve şekli Antifungal içeren besiyerinde üreme, Dimorfik üreme, değerlendirilmelidir erlendirilmelidir
Klinik örneklerden izole edil ilen bir Aspergillus un un patojen olduğunu unu söylemek güçtür. r.çünkü Aspergillus her zaman solunum örneklerinden, deri kazınt ntısı ve diğer örneklerden izole edilebilir. Direkt mikroskopi ve kültk ltür kombinasyonu, yalnız z kültk ltürle karşı şılaştırıldığında izolasyon oranının %15-20 arttığı gösterilmiştir. tir.
Etken kabul edilme kriterleri şunlardır: Direkt incelemede hifal elementlerin görülmesi, İzolezole edilen küfle direkt incelemenin uyumu, Birden fazla sayıda aynı mantar kolonisinin bulunuşu Değişik ik örneklerden aynı küfün izolasyonu İzolezole edilen küfün 37ºC de üreyebilmesi gereklidir.
Üreme olduğunda unda, Flamentöz Hifler içinin 3 şekilde ön inceleme yapılabilir labilir: 1- Islak Preparat İğne ne veya aplikatör çubukla kazarak, besiyerinin küçük bir parças ası kaldırılır. Daha öncence lam üzerine damlatılan lan laktofenol anilin mavisinin üzerine koloni parçalanarak alanarak konulur. Üzeri lamelle kapatılıp, sivri bir cisimle bastırılarak 10X, 40X ve 100X (immersiyon yağı ile) büyütmede incelenir. Parçalanm alanmış kolonilerde özellikle flamentöz yapılar ları görmek kolay, ancak sporları görmek zordur.
2- Şeffaf Bant Yöntemi Uygun uzunlukta selofan bant, iki ucundan tutularak koloni üzerine hafifçe bastırılır. Daha sonra bu bant, üzerine laktofenol anilin mavisi damlatılm lmış lam üzerine hava kabarcığı oluşturmadan yapış ıştırılır. Bu işlemler sırasında mutlaka eldiven giyilmeli ve işlem biyolojik kabinde yapılmal lmalıdır. Selofan bantın eldivene yapış ışmamasına dikkat edilmelidir. Ucuz, hızlı, basit ve çoğu zaman doğru identifikasyon yapılabilen bir yöntemdir
3- Mikroslayt Kültür Tekniği Bunun içinin içineine ıslak gazlı bez veya kurutma kağı ğıdı yerleştirilmi tirilmiş petri kutusuna, üzerine lam koymak içinin iki cam veya tahta çubuk yerleştirilir tirilir. Mısırlı veya patatesli dekstroz agarda bir tüp yardımıyla yla dairesel besiyerleri kesilir ve lam üzerine konur. Üreyen kolonilerden alınarak lam üzerindeki agarın içineine 2-3 yere inokülasyon yapılır. üzerine hafifçe ısıtılmış lamel kapatılır. Petri kutusunun kapağı kapatılıp, oda ısısı veya etüvde 3-5 gün bekletilir. Büyüme gözle görülür olunca lamel bir forseps yardımıyla yla alınarak narak, laktofenollü lamın üzerine konulur ve incelenir. Daha sonra agar plağı ğı lamın üzerinden kaldırılarak larak ( dekontamine edilip) atılır. İlk lamın üzerine anilin mavisi damlatılarak larak, lamelle kapatılıp, incelenir.
A.fumigatus Makroskopik olarak Kolonileri: Granüler ler, pamuksu yapıda olup, genellikle yeşil il, yeşil il- gri, yeşil il-kahverengi pigmentasyon gösterirler. Etraflarında beyaz bir halka vardır, sınırları belirgindir. Mikroskopik olarak: Konidiyoforları uzun olup ( 300-500µm m ), vezikülleri (30-50 µm) çapında, sopa şeklinde, tepesi yuvarlaktır. Tek sıra dizilmiş fyalidler ve oradan çıkan sferik,, ovoid santral eksene doğru yönelmiş, konidya zincirlerinden oluşmu muştur
A.flavus Makroskopik olarak: Mikroskopik olarak: Koloniler granüler ler, pamuksu yapıda da, sarı veya sarı- kahverengidir. konidiyoforları uzun olup(400-800 µm), veziküller 25-45 µm çapında ve düzensiz kenarlıdır.vezik r.vezikül yüzeyinden 1 sıra, daha karakteristik olarak 2 sıra fyalidler çıkar. Konidiyalar sferik,düzg zgün ve nisbeten uzun zincirlidir.
A.niger Makroskopik olarak Koloniler yüzeyindeki siyah konidiyalardan dolayı karabiber dökülmüş görünümleriyle karakteristiktir. Koloninin alt tarafları parılt ltılı ve sarı- gri olarak görülür. Mikroskopik olarak: Oldukça yoğun un veziküller 3-5 µm çapında olup, agrege olmuşlard lardır. Sferik siyah konidiyalarla pürtüklü olarak çevrilmişlerdir.veziküllerller görülebildiği zaman yuvarlak
A.terreus Makroskopik olarak: Kolonileri tarçın, kahverengi ve turuncumsu- kahverengidir. Koloninin merkezinden çıkan kat kat radyal katmanlar görülür. Mikroskopik olarak: veziküller küçük (10-16 16µm) ve kubbe şeklindedir. Fyalidler 2 sıralı olup, uzun zincirler yaparlar. Daha büyük ve tek tek duran konidiyaları da vardır.
Türler Fyalid dizilimi Tek Çift sıralı sıralı Koloni özellikleri Konidiyofor Mikroskopik Özellikler Vezikül Konidiyum A.Fumigatus + Koyu yeşil Grimsi, kahve Beyaz bordürle rle sınırlı 300-500 µm m uzunlukta Renksiz Düzgün n duvarlı 20-30 µm çapta Lobut şeklinde Fyalit ucunda zincir şeklinde dizilim Küresel,2-3.5 µm büyüklüktekte Eşit çaplı Güneş ışını görünüm A. flavus + + Sarı Sarıms msı- yeşil 400-800 µm m uzunlukta Renksiz Düzgün n olmayan çeperli 25-45 µm çapta Küresel Küresel, elipsoit Düzgün n yüzeyliy Zincir şeklinde dizilim A. niger A.terreus + + Siyah renkte Sarı bordürle rle sınırlı Siyah granüler yüzey Taba rengi Turuncu- kahve Koloni merkezinden perifere radyal oluklu 400-3000 µm m uzunlukta Renksiz- açık kahverengi 100-250 µm m uzunlukta Renksiz Düzgün n duvarlı 30-75 µm çapta Küresel Açık k kahverengi 10-16 16 µm çapta Küçük k küreselk Sferik,, 3-53 µm çapta Düzgün n olmayan yüzeyli Kalın n duvarlı Siyah renkte Vezikül üzerine yığıy ığın halinde çöker Sferik,2,2-2.52.5 µm çapta Düzgün n yüzeyliy Uzun zincirler yapar
Teşekk ekkür r Ederim