DUYARLILIK ARTIŞINDA GLUTAMAT VE TAŞIYICILARININ ROLÜ

PAKLİTAKSELLE OLUŞAN AĞRI A DUYARLILIK ARTIŞINDA GLUTAMAT VE TAŞIYICILARININ ROLÜ Yrd. Doç.Dr. Ahmet Hacımüftüoğlu Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı, Erzurum 1 AKUT AĞRI AMPA/KAI reseptörlerinin aktivasyonu hızlı eksitatör postsinaptik potansiyeller(epsp) oluşturur 2 1

KRONİK AĞRI NMDA receptor Post translasyonel değişim ve santral sensitizasyon 3 Kronik Ağrı Büyük ekonomik giderlere sebep olmaktadır. Patofizyolojisi çok az anlaşılmıştır. Hiperaljezik hastalıklar kronik ağrı oluşturan hastalıklar arasında değerlendirilmektedir. 4 2

HİPERALJEZİYLE İLİŞKİLİ HASTALIKLAR -İrritable barsak hastalığı -Fibromiyalji -Göğüs ağrısı(kalp dışı) -Kronik yorgunluk sendromu -Herpes Zosterin oluşturduğu ağrılı nöropati -İlaç kullanımına bağlı gelişen hiperaljezi (antikanser ilaçlar) 5 BU HASTALIKLARDA Semptomlar santral sensitizasyonla gider; Azalmış ağrı eşiği (Allodini( Allodini) Ağrılı uyarana artmış cevap (Hiperaljezi( Hiperaljezi), Nosiseptif uyarı sonrası ağrı devam süresinde artış (persistan( ağrı) 6 3

Antikanser ilaçlar ve paklitaksel Kemoterapide önemli ilerlemeler ve yan etkiler Paklitaksel-solid solid tümörler Taxus brevifolia Beta-tübüline bağlanma, hücre bölünmesini önleme 7 Taxus brevifolia (Pasifik Porsuk Ağacı): Alaska ve Kalifornianın Pasifik Sahil Bölgelerinde sık 8 4

Mikrotübüllere ilaçların etkileri 9 Paklitakselin beta tübüline bağlanması 10 5

Paklitaksel hücre bölünmesini önler 11 Paklitaksel sık görülen yan etki Ağrılı periferik nöropati -Doz kısıtlayıcı etki -Hayat konforunu kısıtlama -Etkili bir tedavisi yok Kemik iliği toksisitesi (granülosit stimüle edici faktörle olumlu sonuçlar alınabilmektedir) 12 6

Nöropatik ağrı modelleri - Nöropatik ağrının mekanizmalarını aydınlatabilmek için hastalarda görülen semptomların hayvanlarda güvenilir bir şekilde modellenmesi gerekmektedir. Kronik sinir bağlama modeli Herpes Zosterin indüklediği ağrı modeli Metabolik değişimlerle oluşturulan ağrı modeli 13 Authier ve ark. 2000 yılında hayvanlarda taksol kullanımıyla oluşturulan nöropatik ağrı modelini tarif etmiştir. Nöropatik ağrı modellerinde, hasarlı periferik aferentlerin yolları boyunca elektriksel impulsların kendiliğinden üretildiği gözlemlenmiştir. Yapılan çalışmalar bu ektopik ateşlemelerin, allodini ve hiperaljeziye yol açan santral sensitizasyonun gelişiminden sorumlu olduğunu göstermektedir. Santral sensitizasyon omurilik arka boynuzda nosiseptif nöronların eksitabilitesindeki artışla karakterizedir. İnce miyelinli A delta lifleri, miyelinsiz C lifleri ve miyelinli A beta liflerinden gelen abartılmış sinyaller,, santral sensitizasyonla sonuçlanabilir. 14 7

Nöropatik ağrı modellerinde duyusal nöronların patofizyolojisi 1. Sinir yaralanması- spontan ektopik deşarjlar- nöron kaybı,reseptör ekspresyon değişimi,duyusal liflerde değişim- hipereksitabilite,, yapı reorganizasyonu- hiperaljezi,allodini allodini 2. Sinir yaralanması- Reseptör fonksiyonlarında değişim-spontan deşarjlar,duyarlaşma- hiperaljezi, allodini 15 Sinaptik iletimi sağlayan maddeler Aferent lifler ısı, mekanik ve kimyasal nosiseptif uyarılara cevap verirler. Bazıları aynı lifte de bulunabilen bir kaç peptit ve aminoasit yapıda transmiter içerir. Bundan dolayı bu liflerin uyarımı P maddesi, kalsitonin geniyle ilişkili peptit (CGRP), glutamat ve aspartatı içeren birkaç transmiteri omurilikte salar. Peptitler reseptörlerini uyararak arka boynuz nöronlarının yavaş depolarizasyon cevabını oluşturur. Eksitatör aminoasitler ise hızlı AMPA ve gecikmiş NMDA reseptör aracılı cevapları oluştururlar. Bunlar çıkan, lokal ve motor nöronları aktive ederek ağrı duyarlığına sebep olabilirler. 16 8

Glutamat-ağrı ağrı hipersensitivitesi Glutamatın sinaptik iletimde, sinaptik plastisitede ve sinirsel gelişimde rolü vardır. Glutamat glutamaterjik nöronların presinaptik membranından salgılanır, sinaptik aralığa difüze olur ve postsinaptik membrandaki N-metil- D- aspartat (NMDA), alfa-amino amino-3-hidroksi-5-metil-4- izoksazolpropiyonik asit (AMPA( AMPA)/ )/kainat ve metabotrobik glutamat reseptörleri üzerinde etki gösterir. Ekstraselüler glutamatı metabolize edebilen enzim bulunamamıştır. Bununla beraber, sinaptik aralıktaki glutamat konsantrasyonu, fizyolojik olarak güçlü bir şekilde kontrol edilmektedir. Glutamat reseptörlerinin aşırı veya uzun süre aktivasyonu eksitotoksisiteye ve nöron ölümüne yol açabilir. Hücrelerarası glutamat konsantrasyonu 1-33 µm ıµ aştığı zaman toksikasyon oluşturur. 17 (EAAC1) EAAT3 EAAT2 EAAT1 (GLT-1) (GLAST) 18 9

Glutamat-ağrı ağrı hipersensitivitesi 2 Glutamatın sinaptik aralıktan temizlenmesi, eksitatör sinapsların çevresindeki yüksek afiniteli sodyum bağımlı glutamat taşıyıcılarına bağlıdır. Glutamat taşıyıcıları için genler klonlanmıştır ve 5 alt-tip tip ayırt edilmiştir. Glutamat/aspartat aspartat taşıyıcısı (GLAST=EAAT1), glutamat taşıyıcısı 1 (GLT-1=EAAT2), eksitatör aminoasit taşıyıcısı 3 (EAAC1=EAAT3) eksitatör aminoasit taşıyıcısı 4 (EAAT4) ve EAAT5. Arka kök gangliyonundaki küçük ve orta ölçekli nöronlar bol miktarda glutamat içerir. Bu nöronların santral uzantıları omuriliğin arka boynuzunun yüzeyel kısımlarında sonlanan ince miyelinli A delta veya miyelinsiz C-lifleridir. Bu aferent sonlanmalar, major eksitatör nörotransmiter olarak glutamat salar. Bu da glutamat reseptörlerinin aktivasyonuna yol açarak ağrı hipersensitivitesinin oluşumu ve sürdürülmeside rol oynadığı düşünülmektedir. 19 Omurilikte glutamat taşıyıcıları Omurilikte GLAST, GLT-1 1 ve EAAC1 olarak 3 glutamat taşıyıcısı bildirilmiştir ve bunlar arka boynuz yüzeyel kısımda yoğunlaşmışlardır. Glutamat taşıyıcılarının omurilik seviyesindeki ağrı duyarlık artışında ve duyusal sinaptik iletiminin mekanizmasındaki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir ama normal duyusal iletimde spinal glutamat taşıyıcılarının çok önemli görevi vardır. DL-treo treo- beta-benziloksiaspartat benziloksiaspartat (TBOA) veya dihidrokainat ile spinal glutamat taşıyıcılarının intratekal injeksiyonu sonrası blokajı in vivo sıçanlarda yalama, titreme ve kuyruktan ısırma gibi doza bağımlı, intratekal glutamat reseptör agonistlerinin oluşturduklarına benzer spontan nosiseptif davranışlar oluşturmuştur. 20 10

Omurilikte glutamat taşıyıcıları 2 İntratekal TBOA, ısı ve mekanik uyarılara karşı ciddi hipersensitiviteye yol açmıştır. Bu davranışsal cevaplar MK-801 ve AP-5 5 gibi NMDA reseptör antagonistlerinin ve non-nmda reseptör antagonisti CNQX ve nitrik oksit sentaz inhibitörü L-NAME inl intratekal injeksiyonu ile anlamlı şekilde bloke edilebilmiştir. In vivo mikrodiyaliz, TBOA in intratekal injeksiyonu sonrası omurilikte ekstraselüler glutamat konsantrasyonunun kısa dönem yükselmesini tespit etmiştir. 21 Glutamat artışı ağrı mı oluşturmaktadır? Bir çalışmada, kronik siyatik sinir bağlama hasarı sonrası oluşan nöropatik ağrıda, omurilik arka boynuzda glutamat taşıyıcı proteinlerinin miktarının azaldığı gösterilmiştir. Bu azalmanın sinir hasarı sonrası görülen santral sensitizasyona katkıda bulunan artmış ekstraselüler glutamat düzeyine yol açtığı düşünülmüştür. 22 11

23 Omurilik arka boynuzda bulunan bulunan ağrıyla ilişkili duyu lifleri Hafif Miyelinli Miyelinsiz GLUTAMATE Miyelinli L5, L6 nin bağlanması sonrası A beta, A delta C liflerin aktivasyonuyla ağrı duyarlık artışı oluşturulduğu bildirilmiştir. 24 12

Morfin toleransı-ağrı ağrı ilişkisi Morfin kronik uygulanımı sonrası ağrı kesici etkisini kaybeder. Bunun azalmış glutamat taşıyıcı expresyonu ve artmış glutamatla ilişkili olduğu gözlemlenmiştir. 25 Sinir bağlanması sonrası oluşan nöropatik ağrı ve kronik opiat kullanımı glutamat taşıyıcı proteinleri azaltmıştır Kronik morfin Sinir bağlanması sonrası oluşan nöropatik ağrı Azalmış Glutamat Taşıyıcıları Sung, B. et al. J. Neurosci. 2003;23:2899-2910 26 13

x EAAT3 x EAAT2 EAAT1 27 Glutamat düzey değişimi ve glutamat taşıyıcıların aktivite tespiti Glutamat taşıyıcılarının uptake aktivitesi genellikle sinaptozomal preparasyonlarla (immünohistokimyasal) tarif edilmiştir. Bu preparasyonlar bilgi vermekle birlikte ekstraselüler sıvıyı, organelleri ve hücrelerin kimyasını karıştırmaktadır. Glutamat taşıyıcı aktivitenin yerinde saptanmasının, omurilik bölgelerinde glutamat taşıyıcı proteinler hakkında daha anlamlı ölçümler sağlama potansiyeli vardır. Mikrodiyaliz-HPLC ve voltametri bu amaçla kullanılabilir. Bu çalışmada voltametri tercih edilmiştir. 28 14

MİKRODİYALİZ(HPLC İLE BİRLİKTE) VOLTAMETRİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Probe büyüklüğü MİKRODİYALİZ Voltametri elektroduna göre en az 10 kat büyük VOLTAMETRİ Küçük Örnekleme oranı hızı Hücre dışı alanda değişiklik-zarar Tespit duyarlık düzeyi Birden fazla analizatın eşzamanlı ölçümü 1 20 dak. Var Pikomolar Var 1 200 Hz (saniyenin altında ında) Yok 25 50 nm Şimdilik yok 29 Çalışmanın Amacı 1. Paklitakselle oluşan ağrı duyarlık artışının deneklerde modellenebilmesi 2. Ağrı duyarlık artışının glutamatla olan ilişkisinin in vivo voltametri sistemiyle ortaya konmasıdır. 30 15

MATERYAL VE YÖNTEM Kullanılan Hayvanlar: 30 tane DBA/2 tipi fare,20-25gr, 25gr, Harlan Labaratuvarından ILACUC (Hayvan koruma kullanma komitesi kurumu-ohio State Universitesi) onayı 31 Hiperaljezinin Belirlenmesi Paklitaksel için 15 hayvana 0.1 mg/ml ilaç 1., 3., 5. ve 7. günlerde 4 ml/kg olacak şekilde intraperitoneal verilmiştir. 15 hayvana vehikül olarak serum fizyolojik aynı yoldan uygulanmıştır. Mekanik hiperaljezi testi için von Fray test telleri kullanılmıştır. Paklitaksel için bu test 0., 4. ve 7. günlerde yapılmıştır. Uygulanan ağrı uyarıcı 3 test teli (3.43, 3.65, 4.1 numaralı) sırasıyla 0.27 g, 0.45 g ve 1.25 g olarak kalibre edimiştir.. Test telleri, fare arka pençe yüzeyine uygulandıktan sonra, 5 saniye beklenmiş ve pençe çekme cevabı gözlemlenmiştir. 8. gün hayvanlar kloral hidratla (500 mg/kg intraperitoneal) ) anestezi edilmiş, laminektomi ameliyatı yapılmış, in vivo voltametri kayıtları alınmış ve glutamat düzey değişimi tesbit edilmiştir. 32 16

İn vivo ilaç uygulama Laminektomi ameliyatı sonrası glutamat 0.25 mm intratekal mikroinjeksiyon şeklinde tüm hayvanlara, TBOA 200 μm (200 μl) topikal ve tetradotoksin 200 μm (200 μl) topikal olarak kullanılmıştır. TBOA ve TTX 6 şar hayvana uygulanmıştır. 33 Platin Mikroelektrotların Hazırlanması ve Glutamat Ölçümleri Elektrot kaplanması-mpd mpd (m-fenilen diamin) ) veya nafion bariyeri Test gününden 1 gün önce mikroelektrotlar glutamat kaydı alma amacıyla hazırlanmıştır. %1 glutamat oksidaz, %1 sığır serum albumini ve %0.125 gluteraldehit içeren 10 μl solüsyon hazırlanmıştır. Solusyonla elektrotlar kaplanır 12-24 24 saat oda sıcaklığında beklenir 0.5 voltluk sabit voltaj altında 0.045 g mpd,, 40 ml PBS içinde 1 saat elektrokimyasal olarak kaplama yapılır. 34 17

Enzim aracılı Nafion veya mpd bariyeri Glutamate oksidaz GLU D E T E K T Ö R α-ketoglutarate + H 2 O 2 2e - yükseltici bilgisayar Görüntü kaydedici 2H + 2O 2 35 36 18

Cam mikropipet oluşturma Glutamat geri alım aktivitesinin tesbit edebilmesi için glutamatın ortama dışardan verilmesi gerekmektedir. Bunun için ince cam kapillerler,, pipet çekici ile çekilerek uzatılmış ve koparılmıştır. Cam, mikroskop altında çapı 20 μm olacak şekilde ustalıkla kırılmıştır. Bu sayede 10 nl düzeylerinde ilaç vermek çok kolay bir hal almaktadır. Cam pipet, elektrotla mum ve pastel sayesinde ölçülü bir şekilde biraraya getirilmiştir. Elektrot yüzeyi ile cam pipet arasındaki mesafenin 50-60 μm olması gerekmektedir. Sonra cam pipet 0.25 mm glutamat solüsyonu ile doldurulmuştur. 37 Elektrod-cam pipet 38 19

Cam pipetin elektroda göre duruş pozisyonları 39 Kalibrasyon Elektrot kaplamayı takiben mikroelektrotların elektrokimyasal özelliklerini değerlendirmek için in vitro kalibrasyon testleri yapılmıştır. Kalibrasyon testi FAST-16 (Fast( Analitical Sensor Technology, Quanteon L.L.C.) yardımıyla sabit voltaj uygulanarak yapılmıştır. FAST-16 software elektrokimyasal verileri, dijital olayları ve 4 kanaldaki glutamat aktivitesi hakkında bilgi vermektedir. Bir Ag/AgCl AgCl elektrodu referans elektrodu olarak sisteme ilave edilmiştir. Kalibrasyon testleri 0.1 M, 40 ml mikrokarıştırıcı ile karıştırılmakta olan fosfat tampon solüsyonu içinde yapılmıştır. H 2 O 2 oksidasyonu ile yüzeyde oluşan akım, dışardan verilen glutamat solüsyonu ile bire bir ilişkilidir. 40 20

Elektrodun kullanılabilme kriterleri Kalibrasyonda amaç, glutamatın askorbik aside göre selektivitesini, glutamata sensitivitesini değerlendirmektir. Doz-cevap eğrisinin düz bir eğimle çıkması (R( 2 ) ve tesbit limiti (LOD), FAST yazılımının sunduğu elektrodun kullanılabilirliğinin anlaşılmasını sağlayan değerlendirme kriterleridir: 1- LOD değerinin 1 μl ninμ altında ve R 2 değerinin %98 ve üstünde olması 2- Selektivite değerinin de en az 100 olması, bu elektrodun denek üzerinde kullanabileceğini göstermektedir. 41 Deneğe Pozisyon Verilmesi Denekte spinal laminektomi ameliyatı uygulandıktan sonra, stereotaksik frame mikroskop yardımıyla açılmış olan bölgenin hareketsizleştirilebilmesi için, stereotaksi cihazı kullanılmıştır. Mikroelektrot da stereotaksik cihaza adapte edilmiş ve ölçekli bir şekilde, ameliyatla açılmış olan omurilik bölgesine indirilmiştir. 42 21

In Vivo Voltametri Stereotaksik aletin yardımıyla mikroelektrot ve ona iliştirilmiş 0.25 mm glutamat doldurulmuş mikro cam pipet sinir dokusuna sokulmuştur. Referans elektrot aynı dokuya yerleştirilmiştir. Elektroda bağlı FAST-16 sistemi ile 0.7 volt değerinde sabit voltaj uygulanmıştır. 15-20 dakika sabit bir baseline elde edilebilmesi için beklenmiştir. 10-50 nl glutamat,, basınç enjeksiyonu yapan cihaz sayesinde cam pipetten sinir bölgesine enjekte edilmiştir. Enjekte edilen miktar stereomikroskop ile injeksiyon sonrası ölçülmüştür. FAST-16 nın bilgisayar programı glutamatı ortamda tesbit etmekte, ortamdan kaldırılışının birçok parametresini (ortadan kaybolma süresi, ortamdan uzaklaştırılma hızı gibi) sonuç olarak vermektedir. 43 İstatistiksel Analiz Analizlerde iki grup karşılaştırmalarında Mann-Whitney U testi kullanılmıştır. Veriler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. p<0.05 istatistiksel bakımdan anlamlı farklılık olarak kabul edilmiştir. 44 22

Voltametri S1 R1 15x333 μm 50x150 μm -Anesteziye hayvanlar (kemirgenler) -Beyin dilimleri/doku parçaları -Hücre kültürleri -Şuuru açık serbest hareket edebilen hayvanlar 45 1 2 3 4 50x50 μm 5 15x300 μm 6 15x300 μm 7 10x10 μm 8 20x20 μm 9 50x50 μm 20x333 μm 10 W1 50x50 μm 50x100 μm 25x100 μm Mikroelektrot Çeşitleri 8 aktif alanlı mikroelektrotlar 600 μm W2 1350 μm W3 50x150 μm 50x150 μm 25x300 μm R1 S1 15x333 μm 2X polyimide W4 S2 20x150 μm 20x150 μm 20x150 μm 20x150 μm 46 15x333 μm 23

Çalışmamızda DBA/2 tipi farelerde kullandığımız elektrot tipi W4 20x140 μm 47 DİREKT ETKİ analyte D E amplifier oxidized analyte T E e - K T Ö R computer chart recorder TANINMA 48 24

Enzim aracılı Glutamate oksidaz GLU Nafion veya mpd bariyeri D E T E K T Ö R α-ketoglutarate + H 2 O 2 2e - yükseltici bilgisayar Görüntü kaydedici 2H + 2O 2 49 Glutamatın omuriliğe mikroinjeksiyonu sonrası oluşan cevap } GLU 10μM T80 Total Time 50 25

Glutamatın omuriliğe mikroinjeksiyonu sonrası oluşan cevap T80 Total Time 51 Laminektomi sonrası elektrotların omuriliğe yerleştirilmesi 52 26

SONUÇLAR Şekil 1. Vehikül (a) ve paklitaksel (b) alan hayvanlarda Von Frey Test cevaplarının ilaç öncesiyle karşılaştırılması. 1. test ilaç öncesi, ikincisi 4. gün, sonuncusu ise 7. gün yapılmıştır. Veriler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. 30 ağrılı uyaran sonrası toplam cevaplar (3.43, 3.65, 4.1 numaralı tellere verilen toplam cevap), 4. gün vehikül= = 8.8±1.6, paklitaksel= = 16.2±2.1 (p< 0.05), 7. gün vehikül= = 12.0±1.6, paklitaksel=20.1±2.0 (p< 0.05) (na( na=15, nb=15). 53 Şekil 2. Vehikül (a) ve paklitaksel (b) almış DBA/2 farelerinde glutamat mikroinjeksiyonu sonrası in vivo voltametride oluşan cevaplar. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: Vehikül= = 55.75±17.58. Paklitaksel= = 219±97.78, Z: - 2.309 (p< 0.05) (na( na=15, nb=15). 54 27

Şekil 3. Paklitaksel verilmiş hayvanda self-referensing yöntemi ile pikin glutamata ait olduğunun gösterilmesi. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: Glu ox içeren grup= 151.40±7.57. Glo ox içermeyen grup= 8.40±3.78, Z: -2.619 (p< 0.01). 55 Şekil 4. 0.7 ve 0.2 volt altında glutamat mikroinjeksiyonuyla oluşan amplitütler. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: 0.7 volt için= 200±10.58. 0.2 volt için= 13.33±2.31, Z: -1.99 (p< 0.05). 56 28

Şekil 5. Paklitaksel alan farelerde glutamat (a) ve TTX+glutamat (b) amplitütleri. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: Glutamat alan grupta= 155.63±25.88. Glutamat+TTX alan grupta= 60.25±21.86, Z: -2.309 (p< 0.001). 57 Şekil 6. Glutamat taşıyıcı inhibitörü TBOA uygulaması sonrası eşit glutamat mikroinjeksyonu daha küçük amplitütler oluşturmuştur. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: Glutamat alan grupta= 162.0±47.7. Topikal TBOA sonrası glutamatın oluşturduğu değerler= 68.5±45.59, Z: -2.02 (p< 0.05). 58 29

TARTIŞMA Bu çalışmada, antikanser ilaçlardan olan paklitakselin oluşturduğu ağrı duyarlık artışının glutamatla olan ilişkisi in vivo voltametri sistemiyle araştırılmıştır. Çalışmamızda paklitakselin oluşturmuş olduğu ağrı duyarlık artışı 4. ve 7. günlerde artarak devam etmiştir. Paklitakselle dokunma ağrı duyarlık artışının gerçekleştirildiği Von Frey testleriyle ortaya konmuştur (Şekil 1). 59 Fare omuriliğine glutamat mikroinjeksiyonu, in vivo voltametride paklitaksel uygulanan hayvanda, kontrole göre yaklaşık 4 kat yüksek amplitüt oluşturmuştur (vehikül:: 56±9, paklitaksel: : 219±49) (Şekil 2). 60 30

Paklitaksel-aksonopati aksonopati? Paklitaksel antikanser etkisini beta-tübülinlere tübülinlere bağlanarak göstermektedir. Aksonal mikrotübüller de beta-tübülin tübülin içerir. Nöropatinin paklitaksel ve vinkristinin bu mikrotübüllere bağlanarak aksoplazmik transporta zarar verdiği ve geriye doğru ölüm gerçekleşerek aksonopati oluşturduğu düşünülmüştür. Fakat bunun doğru olmadığını gösteren çalışmalar da yapılmıştır. Sistemik paklitakselin yüksek dozlarda kullanıldığı çalışmalarda veya paklitakselin direkt olarak periferik sinire injeksiyonunda aksonal dejenerasyon görülmüştür, fakat paklitaksel ve vinkristin sistemik olarak düşük doz kullanıldığında, allodini ve hiperaljeziyi içeren ağrı hipersensitivitesi oluşurken bu dozlarda oluşan ağrılı periferik nöropatide ışık ve elektron mikroskobu incelemelerinde aksonal dejenerasyona rastlanamamıştır. Ayrıca, nöropatik ağrı durumuyla nöropati arasındaki ilişki de açık değildir. 61 Elde edilen yüksek piklerin glutamata ait olduklarının ispatı Self-referencing yöntemiyle elektrodun 2 yüzeyine glutamat oksidaz enzimi konulmuş, diğer 2 yüzeye bu enzim konulmamıştır. Oluşan pik elde ettiğimiz sonuçların glutamata ait olduğunu göstermektedir (Şekil 3). 62 31

Hascup et al,2006 63 Ayrıca, çalışmamızda 0.7 ve 0.2 volt değerinde akım uygulanmıştır. 0.7 volt glutamatın tesbiti için spesifik voltajdır. Pikin 0.2 voltta değil de, 0.7 voltta görülmesi, elde edilen pikin glutamata ait olduğunun bir delilidir (Şekil 4). 64 32

Omurilikte duyusal iletimi glutamat taşıyıcıları düzenlemektedir. Ekstraselüler glutamat konsantrasyonunun dengesi merkezi sinir sisteminde glutamat taşıyıcıları ile sağlanmaktadır. Glutamat taşıyıcılarının L-transL trans-pirolidin-2,4- dikarboksilik asit (PDC), TBOA veya dihidrokainatla blokajı ekstraselüler glutamat artışına yol açtığı bildirilmiştir. Sıçanlarda antisens oligonükleotidlerce indüklenen GLT-1 1 ve GLAST kaybı ekstraselüler glutamat konsantrasyonunu artırmıştır. Glutamattaki yükselme de nöronal eksitasyon ve nörotoksisiteye yol açmaktadır. Genetiği değiştirilmiş ve GLT-1 i olmayan farelerde ölümcül felçler görülmüştür. 65 Glutamat taşıyıcıları sonuçlarımız üzerinde ne kadar etkili? Küçük çaplı sinapslarda glutamat taşıyıcılarının inhibisyonu dışardan eklenen glutamatın etkilerini artırdığı ama eksitatör postsinaptik akımların azalmasını etkileyemediği, bu tip nöronlarda difüzyonun major rol oynadığı bildirilmiştir. 66 33

Fakat kompleks nöronlarda sinaptik aralık glial örtüyle kapatılmıştır, glutamat taşınımı inhibe olursa, amplitüt artar, postsinaptik membranda EPSC (Eksitatör( postsinaptik akım) ve EPSP (Eksitatör postsinaptik potansiyel) süreleri uzar. Buralarda sinaptik klirens glutamat taşıyıcılarına bağlıdır. Çalışmamızda paklitaksel farelerde mekanik ağrı hipersensitivitesi oluşturmuştur. Sonuçlara göre ekstraselüler glutamat düzeyi çok yükselmiş, eksitabilite artmış, periferik uyarılara karşı artmış cevaplılık oluşmuştur. Bu durumda glial taşıyıcıların da oluşan durumda rol oynadıkları düşünülmektedir. 67 Omurilikte glutamat taşıyıcılarının da bloklanmasının dışardan verilen glutamatın oluşturduğu amplitüdü artırdığı bildirilmiştir. In vivo mikrodiyalizle,, normal sıçanlarda TBOA nın intratekal injeksiyonu sonrası omurilikte ekstraselüler glutamat konsantrasyonunun yükseldiği tesbit edilmiştir. Daha ileri olarak omurilik arka yüzeyine TBOA nın topikal uygulanımı sonrası in vivo glutamat voltametriyle ekstraselüler glutamat konsantrasyonunun ciddi olarak yükseldiği gösterilmiştir. 68 34

Paklitaksel sonrası artmış ağrı duyarlık durumunda, artmış glutamat akımlarından glutamatın azalmış geri alımının sorumlu olabileceği düşünülerek bunu test etmek için glutamat mikroinjeksiyonu sonrasında güçlü non-selektif glutamat taşıyıcı inhibitörü TBOA (200 um) verilerek cevaplara bakılmıştır. Topikal TBOA injekte glutamata karşı azalmış amplitüt akımı oluşturmuştur (Şekil 6). Bu sonuç TBOA sonrası beklenen sonucun aksi bir durumdur dur.. Bu durumun glutamat otoreseptörlerinden kaynaklanab abileceğini düşünmekteyiz. 69 Sıçan asrosit kültüründe, yüksek konsantrasyonda glutamat uygulandığında GLAST ekpresyonunun arttığı bildirilmiştir. Glutamat taşıyıcılarının rolü, hücre yüzeyindeki taşıyıcıların sayısındaki değişiklikle ve taşıyıcı aktivitenin etkinliğindeki değişimle regüle edilebileceği ileri sürülmüştür. EAAC artışının nöronal taşıyıcıların yüzey ekspresyonunu ve aktivitesini artırdığı bildirilmiştir. Yaptığımız bu çalışmada da artmış glutamat düzeylerini geri alan taşıyıcıların sayısında bir artış olduğunu, bu artmış sayıdaki taşıyıcıların aktivitelerinin ise paklitakselle bloklandığını düşünmekteyiz. Şöyle ki, sodyum kanal blokeriyle fazla miktarda glutamat salıverilmesi önlendiğinde, glutamat taşıyıcı aktivitenin ne kadar yavaşladığı görülmektedir (Şekil 5). 70 35

Genetiği değiştirilmiş farelerde glutamat taşıyıcı proteinlerin yokluğunda, paklitakselin oluşturacağı etkilerin incelenmesi, glutamat taşıyıcıların bu olaydaki rollerini ortaya koymada daha aydınlatıcı olacaktır. 71 TTX uygulaması paklitaksel alan hayvan gruplarında oluşan artmış glutamat düzeyini geri çevirmiştir (Şekil 5). 72 36

SONUÇLAR Paklitakselin uygulandığı hayvanlarda, tedavi rejiminin 4. ve 7. günlerinde ağrı duyarlığında artma saptanmıştır. Fare omuriliğine glutamat mikroinjeksiyonu sonrası paklitaksel uygulanan hayvanlarda kontrole göre yaklaşık 4 kat yüksek amplitütler görülmüştür. Self-referencing ve voltaj değiştirme yaklaşımları, glutamat mikroinjeksiyonu sonrası artmış akımların kaynağının glutamat olduğunu göstermektedir. Glutamat+TTX injeksiyonu sonrası yüksek amplitütlü cevapların olmaması, glutamat mikroinjeksiyonu sonrası artmış ekstraselüler glutamatın salıverilmesinin TTX-duyarlı nöronlar tarafından düzenlendiğini düşündürmektedir. 73 Paklitaksel uygulanan hayvanlarda görülen artmış amplitüt,, güçlü glutamat taşıyıcı inhibitörlerince taklit edilememiştir. Sonuçlar bir araya getirildiğinde, paklitaksel tedavisinin TTX duyarlı nöronlarla düzenlenen artmış glutamatla indüklenen glutamat salıverilmesine yol açtığını düşündürmektedir. Bu bulgular, paklitakselin indüklediği ağrıda muhtemel mekanizmayı açığa çıkartmaktadır: Duyu aferentlerinin indüklediği omurilikte artmış glutamat salıverilmesi. 74 37

Destek Bu çalışma TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir. 75 Devam Etmekte Olan Çalışmalar Glutamat otoreseptörlerinin paklitakselle oluşan ağrı duyarlığında ve artmış glutamat piklerindeki rolü İntraplantar formalinin indüklediği ağrıda spinal glutamat salıverilmesinin uyarılması Omurilik travmasının glutamat ve taşıyıcıları üzerindeki etkileri 76 38

Gelecekte Yapılması Planlanan Çalışmalar Genetiği değiştirilmiş farelerde glutamat taşıyıcı proteinlerin yokluğunda, paklitakselin oluşturacağı etkilerin değişimi Paklitakselin oluşturduğu toksik etkilerin hücre kültür ortamında gösterilmesi Kapsaisinin indüklediği spinal glutamat salıverilmesi ve ağrı ilişkisi 77 TEŞEKKÜR Prof.Dr.. Robert Stephens Prof.Dr. Akçahan Gepdiremen Prof.Dr.. Fatma Göçer Doç.Dr. Halis Süleyman Yard.Doç.Dr. Zekai Halıcı Araş.Görv Görv.. Elif Çadırcı Prof.Dr. Şenol Dane Prof.Dr. Greg Gerhardt ve Kentucky Üniversitesi Sensor Teknolojisi Çalışanları Doç.Dr.. Kenan Gümüştekin Res.Ass Ass. Chalonda Handy Doç.Dr. Dursun Kaya Prof.Dr. Bahar Tunçtan 78 39

Erzurum 06/03/2007 79 80 40

Çaykara-Karaçam 81 41